Generowanie i 3-wymiarowa ocena ilościowa zmian w tętnicach u myszy za pomocą optycznej tomografii projekcyjnej

Podsumowanie

Analiza ex vivo zmian w tętnicach z modeli zwierzęcych chorób sercowo-naczyniowych klasycznie opiera się na technikach histologicznych i immunohistochemicznych. Zapewniają one 2-wymiarowe pomiary w 3-wymiarowych zmianach. W artykule opisano generowanie zmian tętniczych do analizy ilościowej w 3 wymiarach z wykorzystaniem optycznej tomografii projekcyjnej.

Streszczenie

Generowanie i analiza zmian naczyniowych w odpowiednich modelach zwierzęcych jest kamieniem węgielnym badań nad chorobami sercowo-naczyniowymi, dostarczając ważnych informacji na temat patogenezy powstawania zmian i działania nowych terapii. Wykorzystanie myszy podatnych na miażdżycę, chirurgicznych metod indukcji zmian chorobowych i modyfikacji diety znacznie poprawiło zrozumienie mechanizmów, które przyczyniają się do rozwoju choroby i potencjału nowych metod leczenia.

Klasycznie, analiza zmian jest przeprowadzana ex vivo przy użyciu dwuwymiarowych technik histologicznych. W artykule opisano zastosowanie optycznej tomografii projekcyjnej (OPT) do trójwymiarowej oceny ilościowej zmian tętniczych. Ponieważ technika ta jest nieniszcząca, może być stosowana jako uzupełnienie standardowych analiz histologicznych i immunohistochemicznych.

Zmiany w neointymach były wywoływane przez wprowadzenie drutu lub podwiązanie tętnicy udowej myszy, podczas gdy zmiany miażdżycowe były generowane przez podawanie diety aterogennej myszom z niedoborem apoE.

Zmiany zostały zbadane za pomocą obrazowania OPT emisji autofluorescencji, a następnie uzupełniającej analizy histologicznej i immunohistochemicznej. OPT wyraźnie odróżniał zmiany chorobowe od leżącej pod nimi ściany naczyniowej. Wielkość zmiany obliczono w przekrojach 2-wymiarowych za pomocą planimetrii, co umożliwiło obliczenie objętości zmiany i maksymalnego pola przekroju poprzecznego. Dane wygenerowane za pomocą OPT były zgodne z pomiarami uzyskanymi za pomocą histologii, potwierdzając dokładność techniki i jej potencjał jako uzupełnienia (a nie alternatywy) tradycyjnych metod analizy.

Ta praca pokazuje potencjał OPT do obrazowania zmian miażdżycowych i neointimalnych. Zapewnia szybką, bardzo potrzebną technikę ex vivo do rutynowej trójwymiarowej kwantyfikacji przebudowy naczyń krwionośnych.

Wprowadzenie

Powstawanie zmian w tętnicach ma kluczowe znaczenie dla wysokiej zachorowalności i śmiertelności związanej z chorobami układu krążenia¹. Uważa się, że powstawanie zmian jest spowodowane nieskrępowaną reakcją zapalną na uszkodzenie tętnic². Zmiany miażdżycowe tworzą się powoli w odpowiedzi na przewlekłe uszkodzenie ściany tętnicy, natomiast zmiany restenotyczne rozwijają się szybko po ostrym uszkodzeniu mechanicznym (np. po wszczepieniu stentu). Mechanizmy, które przyczyniają się do rozwoju zmian w tętnicach, zostały znacznie wyjaśnione dzięki zastosowaniu odpowiednich modeli zwierzęcych, często w połączeniu z odpowiednimi manipulacjami genetycznymi¹.

Analiza wielkości i składu zmiany klasycznie zależała głównie od ex vivo, dwuwymiarowej histologii (chociaż to się zmienia wraz z rozwojem ulepszonych metod wykrywania i analizy zmian u małych zwierząt in vivo i ex vivo ³). Analiza histologiczna zmian tętniczych jest pracochłonna, czasochłonna i dostarcza ograniczonych informacji o strukturze trójwymiarowej. Na przykład obciążenie zmianami chorobowymi jest zwykle oceniane poprzez pomiar pola przekroju poprzecznego zmiany (albo w losowo wybranych miejscach, albo w miejscu maksymalnej okluzji). Zapewnia to niepełną analizę całkowitego obciążenia zmianami chorobowymi. Technologia obrazowania trójwymiarowego z pełnym montażem zapewnia możliwe rozwiązanie tego problemu, ale zaskakująco niewiele odpowiednich podejść zostało opisanych. Może to wynikać głównie z wielkości tętnic myszy, które są zbyt duże do mikroskopii konfokalnej z pojedynczym fotonem, ale zbyt małe do obrazowania metodą rezonansu magnetycznego (MRI)⁴ i rentgenowskiej tomografii komputerowej (CT)⁵. Zastosowanie rezonansu magnetycznego ex vivo i mikrotomografii komputerowej do badania zmian miażdżycowych u myszy sugeruje, że oferują one ograniczoną rozdzielczość, nawet w stosunkowo dużych tętnicach. Do tego dochodzą stosunkowo długie czasy akwizycji, które ograniczają przepustowość (i zwiększają koszty skanowania)^4,6.

Rozwój nowych metod obrazowania optycznego (takich jak optyczna koherentna tomografia^3,7 i fotoakustyczna^{tomografia 8}) oferuje duży potencjał do poprawy obrazowania zmian w tętnicach mysich. Podobny potencjał wykazuje optyczna tomografia projekcyjna (OPT), która została opracowana w celu umożliwienia analizy zarodków myszy. OPT został zaprojektowany do obrazowania próbek o średnicy od ~0,3 do 10 mm⁹. Obrazowanie transmisyjne rejestruje nieprzezroczystość półprzezroczystej próbki w polichromatycznym świetle widzialnym i może być wykorzystywane do identyfikacji struktur anatomicznych. Obrazowanie emisyjne rejestruje emisję światła po wzbudzeniu na określonych długościach fal z endogennych (np. kolagenu, elastyny) i egzogennych fluoroforów w próbce. Może to również dostarczyć informacji anatomicznych (ponieważ różne składniki tkanek mogą różnić się rodzajem i gęstością obecnych gatunków autofluorescencyjnych). Ponadto rozkład immunoreaktywności lub ekspresję genów można określić za pomocą odpowiednich sond fluorescencyjnych¹⁰. W każdym trybie obrazowania (transmisyjnym lub emisyjnym) światło jest skupiane na urządzeniu sprzężonym z ładunkiem, aby umożliwić iteracyjne przechwytywanie obrazu w miarę obracania się próbki (zwykle 400 obrazów w krokach co 0,9°). Można je wykorzystać do obliczania objętości za pomocą standardowych metod rekonstrukcji tomograficznej (takich jak filtrowana projekcja wsteczna (przy użyciu algorytmu stożka) lub rekonstrukcja iteracyjna).

Ten film demonstruje nasze nowatorskie zastosowanie OPT do szybkiej, mierzalnej i efektywnej kosztowo trójwymiarowej analizy zmian miażdżycowych i neointimalnych, jak to wcześniej opisano w Kirkby et al.¹¹. Wykazano, że technika ta jest odpowiednia do ilościowego określania wielkości zmiany w trzech powszechnie stosowanych modelach: (i) uszkodzenie drutu tętnicy udowej; (ii) podwiązanie tętnicy udowej i (iii) miażdżyca tętnic wywołana dietą u myszy z niedoborem apolipoproteiny E (apoE^-/-).

Protokół

1. Chirurgiczna indukcja zmian neointymalnych w tętnicy udowej myszy

1. Doświadczenia na zwierzętach powinny być przeprowadzane zgodnie z krajowymi i instytucjonalnymi wymogami etycznymi. Wszystkie zabiegi chirurgiczne powinny być wykonywane przy użyciu odpowiedniej techniki aseptycznej. Indukcję zmian w neointymale uzyskuje się za pomocą modyfikacji techniki opisanej przez Roque i wsp.¹² oraz Sata i wsp.^{Rozdział 13}.
2. Zważ samce myszy C57Bl6/J (wiek 10-12 tygodni; waga 25-30 g), a następnie znieczulenie, podając 4-5% izofluranu w komorze indukcyjnej. Po wywołaniu znieczulenia przenieś mysz na podgrzewaną matę, aby utrzymać temperaturę ciała na poziomie 37 °C. Kontynuuj podawanie izofluranu (2-3%) przez maskę.
3. Po wywołaniu odpowiedniego poziomu znieczulenia (brak reakcji na uszczypnięcie palca u nogi) należy zapewnić ochronę przeciwbólową poprzez podanie buprenorfiny (0,1 mg/^kg-1). Następnie umieść mysz w pozycji leżącej na plecach i ogol brzuszną powierzchnię lewej kończyny tylnej.
4. Wykonaj nacięcie, aby odsłonić mięśnie górnej kończyny tylnej i między rozwidleniem z tętnicą podkolanową a ścianą brzucha użyj rozwarstwienia, aby odizolować tętnicę i żyłę udową od nerwu udowego. W razie potrzeby przepłukać ranę za pomocą 1% w/v lignokainy.
5. Umieść proksymalne (blisko ściany brzucha) i dystalne (bezpośrednio pod gałęzią z tętnicą podkolanową) tymczasowe ligatury (6/0 Mersilk) wokół tętnicy udowej i żyły, aby kontrolować przepływ krwi. Następnie należy odizolować tętnicę podkolanową (na około 2-5 mm dystalnie do gałęzi z tętnicą udową) i podwiązać dystalnie. Umieść drugą, niezawiązaną ligaturę pod tętnicą podkolanową.
6. Wykonaj małe nacięcie (arteriotomia) w tętnicy podkolanowej, bezpośrednio dystalnie do gałęzi z tętnicą udową, zapobiegając krwawieniu poprzez wywieranie nacisku na bliższą tymczasową ligaturę. Przesuń prostą, sprężynującą prowadnik 0,014" 1-1,5 cm wzdłuż tętnicy udowej w kierunku ściany brzucha i pozostaw na miejscu na 30 sekund (ryc. 1A).
7. Usunąć prowadnik i podwiązać tętnicę podkolanową powyżej arterionomii, używając umieszczonej w tym celu ligatury i uważając, aby nie zatkać tętnicy udowej.
   UWAGA: W przypadku urazów spowodowanych podwiązaniem. Przebudowa neointymalna bez uszkodzenia śródświetlnego może być wywołana przez podwiązanie tętnic udowych lub podkolanowych (ryc. 1B i 1C). Aby to osiągnąć, wykonaj kroki 1.1-1.5. Nie należy jednak wykonywać arteriotomii, ale (unikając kroku 1.6) albo (i) podwiązać tętnicę podkolanową bezpośrednio dystalnie do tętnicy udowej lub (ii) podwiązać tętnicę udową wspólną w punkcie rozgałęzienia z tętnicą podkolanową. Następnie przejdź do kroku 1.8.
8. Usunąć tymczasowe ligatury, zamknąć ranę nieciągłym szwem zewnętrznym (5/0 Mersilk) i nałożyć krem EMLA (2,5% lidokainy, 2,5% prylokainy). Pozwól zwierzętom odzyskać przytomność (zwykle 5-10 minut) i upewnij się, że swobodnie poruszają się po klatce (lekka kulawizna może być widoczna w chorej nodze, ale powinna ustąpić w ciągu pierwszych 2-3 dni po operacji) przed powrotem do pomieszczeń trzymania. Myszy po operacji nie muszą być trzymane pojedynczo.
9. Pozwól zwierzętom dojść do siebie przez okres do 3 miesięcy. Małe zmiany zaczną pojawiać się ~7 dni po urazie drutu i osiągną stabilny maksymalny rozmiar po ~ 21-28 dniach.

2. Indukcja zmian miażdżycowych u myszy E^-/- z apolipoproteiną

1. Podawać dietę zachodnią (0,2% cholesterolu; Research Diets, USA) do samców, 6-tygodniowych myszy ApoE-null (hodowanych w domu) przez 12 tygodni.
2. Zmiany miażdżycowe są często widoczne przy wnikliwych oględzinach łuku aorty i jej głównych odgałęzień (ryc. 2).

3. Analiza zmian tętniczych za pomocą optycznej tomografii projekcyjnej (OPT)

UWAGA: Obrazy OPT zmian w mysich tętnicach udowych i próbkach łuku aorty zostały uzyskane za pomocą tomografu z projekcją optyczną.

1. Eutanazja myszy przez przekrwienne utrwalenie perfuzji i wykrwawienie w znieczuleniu końcowym (80 mg/kg pentobarbitalu sodu), przy użyciu heparynizowanej (10 U/ml) soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS), a następnie 10% neutralnej buforowanej formaliny.
2. W razie potrzeby odizolować tętnice udowe lub łuk aorty i jej główne gałęzie (lewa tętnica szyjna, lewa tętnica podobojczykowa, pień ramienno-głowowy) i usunąć obcy materiał okołoprzybyszowy. Po utrwaleniu w 10% buforowanej formalinie O/N, przed przechowywaniem w 70% etanolu do czasu, gdy będzie potrzebny.
3. Osadź tętnice w 1,5% agarozie o niskiej temperaturze topnienia, wstępnie przefiltrowanej przez papier Whatman 113 V. Przymocuj każdą próbkę do magnetycznego uchwytu OPT za pomocą kleju cyjanoakrylowego tak, aby oś naczynia była zgodna z osią uchwytu. Nadmiar agarozy przyciąć do stożkowatego kształtu. Odwodnić w 100% metanolu przez co najmniej 12 godzin.
4. Wyczyść naczynia przez zanurzenie (na 12-24 godziny) w mieszaninie alkoholu benzylowego i benzoesanu benzylu (1:2 v/v).
5. Oczyszczone próbki umieścić w skalibrowanym tomografie. Ustaw rozdzielczość na 1 024 x 1 024 i określ powiększenie optyczne, które pozwoli zobaczyć cały obszar zainteresowania. Objętość OPT jest izotropowa, oś z jest rekonstruowana do tej samej rozdzielczości (tj. 1,024 x 1,024 x 1,024), rozmiar woksela ~200 μm. Może to oznaczać zawyżenie rozdzielczości, ponieważ prawdopodobnie pojawią się artefakty rekonstrukcyjne. Dostosuj położenie próbki tak, aby obracała się wokół własnej osi w środku pola widzenia w jasnym polu kanału transmisyjnego.
6. W kanale emisyjnym filtra GFP1 (filtr wzbudzający 425 nm z pasmem przepustowym 40 nm; filtr emisyjny: 475 nm długości przepustowej) ustaw ostrość próbki i dostosuj czas ekspozycji, aby zmaksymalizować zakres dynamiczny uzyskanego obrazu (uniknąć nadmiernego nasycenia). Skanuj naczynie tylko w kanale emisyjnym GFP1, z krokiem obrotu o 0.9°.
7. Po zakończeniu potwierdź jakość pozyskiwania danych za pomocą oprogramowania DataViewer. Wyjmij próbkę ze skanera.
8. Aby umożliwić późniejszą analizę histologiczną, umieść próbkę w 100% metanolu na >24 godziny przed normalnym przetworzeniem na wosk parafinowy.

4. Rekonstrukcja i analiza obrazu

Rekonstrukcja tomograficzna za pomocą filtrowanej projekcji wstecznej jest wykonywana przy użyciu oprogramowania NRecon lub podobnego. Rekonstrukcje mogą być wykonywane bez nadzoru, partiami.

1. Popraw jakość obrazu, kompensując niewspółosiowość i dostosowując poziomy intensywności obrazu.
2. Sprawdź jakość rekonstrukcji obrazu za pomocą oprogramowania DataViewer.
3. Zidentyfikuj odpowiednią sekcję próbki do analizy. Długość ta powinna być spójna między naczyniami, jeżeli mają być rejestrowane wymiary światła.
4. Zdefiniuj kontur zmian chorobowych, ręcznie wyznaczając odpowiednią granicę dla 1 na 50 zrekonstruowanych przekrojów.
5. Sprawdź każdy przeplatany przekrój, aby upewnić się, że interpolacje generowane komputerowo są poprawne. W razie potrzeby ręcznie dostosuj obramowanie.
6. Ustaw próg szarości tak, aby wybrana była tylko zmiana chorobowa i wyeksportuj dane pomiarowe.
7. Dla każdego skanu zdefiniuj pionowy obszar zainteresowania zawierający zmianę i prześledź granicę między pochodną a neointimą (tj. położenie wewnętrznej elastycznej blaszki) dla każdej 50^linii skanowania. Interpoluj obramowania błony wewnętrznej/środkowej dla przeplatanych linii skanowania w oprogramowaniu, a następnie sprawdź i skoryguj dopasowanie w razie potrzeby. Dalej segmentuj tę zdefiniowaną trójwymiarową objętość do ręcznie zdefiniowanego progu intensywności, aby uzyskać binarny zestaw obrazów, w którym białe piksele reprezentują neointimę, a czarne piksele reprezentują światło patentowe.
8. Wykonywane pomiary obejmują: całkowitą objętość zmiany (objętość obiektu), objętość światła (objętość całkowita – objętość obiektu) oraz rozkład pola przekroju poprzecznego zmiany i światła wzdłuż długości osiowej badanego naczynia.

Wyniki

Wstępne skanowanie zdrowych (nieuszkodzonych) mysich tętnic udowych (n = 5) wykazało, że obrazowanie transmisyjne nie dostarczyło użytecznych obrazów. Była to konsekwencja tego, że oczyszczone tętnice stawały się zbyt przezroczyste (a nie zbyt nieprzezroczyste) dla obrazowania transmisyjnego. Jest to jednak korzystne dla obrazowania emisji, ponieważ nie ma absorbancji/rozpraszania emitowanego sygnału. Natomiast tętnice udowe silnie autofluoryzują w kanale emisyjnym, przy czym największy sygnał następuje po wzbudzeniu przy 405–445 nm (co jest zgodne z pikiem wzbudzenia 410 nm dla elastyny¹⁴). Dwuwymiarowe wycinki zrekonstruowane z tych obrazów wyraźnie odróżniały media od światła i przydanki oraz światła.

W tętnicach udowych myszy pobranych 28 dni po urazie wywołanym drutem (n = 6) lub podwiązaniem- (n = 5), pogrubienie neointymary były widoczne w nietomograficznych projekcjach emisji (Rysunek 3A). W zrekonstruowanych dwuwymiarowych wycinkach koncentryczne zmiany neointimalne można było odróżnić od podłoża po ich słabszej emisji (ryc. 3B i ryc. S1).

Obrazy emisji OPT całych próbek łuku aorty i jej głównych odgałęzień od myszy miażdżycowych (n = 8) zidentyfikowały zmiany o przewidywanym rozmieszczeniu anatomicznym (tj. w mniejszej krzywiźnie łuku aorty, tętnicy ramienno-głowowej oraz początki lewej tętnicy szyjnej i lewej tętnicy podobojczykowej (Rysunek 4A). Obrazy przekrojowe wykazały, że były to zmiany typowo ekscentryczne i można je było łatwo odróżnić od podłoża i światła (ryc. 4B, ryc. S2 i S3).

Przetwarzanie tętnic do analizy histologicznej po OPT potwierdziło nieniszczącą naturę OPT, z odcinkami pomyślnie wybarwionymi przy użyciu technik histologicznych (Stany Zjednoczone Trichrome, czerwień Picrosirius) i immunohistochemicznej (α-SMA, Mac-2) (Ryc. 3C i 4C).

Wykazano, że pomiar wielkości zmiany za pomocą OPT jest zgodny z pomiarami uzyskanymi za pomocą analizy obrazu odcinków histologicznych pobranych z tej samej tętnicy¹¹.

Planimetryczne pomiary obszaru zmiany uzyskane przez OPT i histologię ściśle skorelowane przez regresję liniową dla zmian neointimalnych i blaszek miażdżycowych (R² = 0,92) i indukowanych podwiązaniem (R² = 0,89). Ważną zaletą OPT jest jego zdolność do umożliwienia analizy trójwymiarowej. Opracowując wolumetryczną kwantyfikację zmian za pomocą tej techniki, byliśmy w stanie zarejestrować objętość zmian w tętnicach drucianych (0,1100 ± 0,0091 mm³; n = 6) i uszkodzonych przez podwiązanie (0,0200 ± 0,0089 mm³; n = 5), a także w miażdżycowych tętnicach ramienno-głowowych (0,180 ± 0,018 mm³; n = 8). Pomiary były wysoce powtarzalne (współczynniki zmienności odpowiednio 5,4%, 11,4% i 4,8%, n = 4) dla wszystkich typów zmian. Zmiany w neointrumencie w naczyniach z uszkodzeniem drutu były większe (p <0,0001) niż te powstałe w wyniku podwiązania, co odpowiada większemu stopniowi uszkodzeń spowodowanych przez to pierwsze.

Wygenerowane dane mogą być również wyrażone jako profile zmian (Rysunek 5) i renderowane do dynamicznej, jakościowej oceny (patrz Rysunki S1-S3). Podejście to wyraźnie pokazało zakres powstawania zmian w odpowiedzi na różne procedury urazowe i uwypukliło nierównomierny rozkład powstawania zmian w uszkodzonych naczyniach.

Rycina 1: Metody inicjowania powstawania zmian w tętnicy udowej myszy. (A) Wsteczne wprowadzenie prowadnika angioplastyki do tętnicy udowej za pomocą arterytomii w tętnicy podkolanowej stymuluje powstawanie zmian w odpowiedzi na uraz rozciągający i usunięcie śródbłonka. Przepływ krwi zostaje przywrócony nad uszkodzonym odcinkiem naczynia. (B) Proliferacja neointimalu przy braku rozciągnięcia śródświetlnego, denudacji lub przerwania przepływu krwi może być wywołana przez podwiązanie tętnicy udowej lub podkolanowej bezpośrednio dystalnie do rozwidlenia tętnicy udowej. (C) Poważniejsze urazy bez denudacji odpowiedź na proliferację można wywołać przez podwiązanie zarówno tętnic udowych, jak i podkolanowych w poprzek punktu rozgałęzienia wspólnej tętnicy udowej. Ta technika zablokuje również przepływ krwi w dystalnej części tętnicy udowej.

Rycina 2: Charakterystyczne odkładanie się miażdżycy w łuku aorty myszy. Myszy podatne na miażdżycę (myszy z niedoborem Apolipopoteiny E) karmione zachodnią dietą o wysokim poziomie cholesterolu przez 12 tygodni rozwijają charakterystyczny wzór odkładania się zmian w łuku aorty i jej głównych gałęziach. Jak wykazano, zmiany są widoczne (strzałki), po ogólnym oględzinach pod mikroskopem preparacyjnym, w łuku aorty, tętnicy ramienno-głowowej oraz w ujściach lewej tętnicy szyjnej i lewej tętnicy podobojczykowej.

Rycina 3: Powstawanie zmian po podwiązaniu lewej tętnicy udowej. (A) Nietomograficzne obrazy emisji fluorescencji (odwrócone w celu zwiększenia przejrzystości – ciemne obszary odpowiadają silniejszej emisji) pozwalają na identyfikację pogrubienia błony wewnętrznej (czerwone groty strzałek). (B) W rekonstrukcjach tomograficznych można wyróżnić wyraźne obszary naczyniowe i światło. (C) Analiza histologiczna (trichrom w Stanach Zjednoczonych) podkreśla wyraźne podobieństwo do obrazów uzyskanych za pomocą OPT. Podziałka liniowa w (A-C) wynosi 200 mm. Na podstawie Kirkby i wsp. ¹¹ Podziałka liniowa w (AC) wynosi 200 μm.

Rycina 4: Obrazowanie miażdżycy w łuku aorty myszy podatnych na miażdżycę.(A) Miażdżyca (czerwone groty strzałek) jest łatwo widoczna na obrazach nietomograficznych (odwróconych tak, że ciemniejsze obszary wskazują na silniejszą emisję, poprawiając w ten sposób przejrzystość) łuku aorty, w miejscach przewidywanych jako zawierające miażdżycę przez inspekcję pod mikroskopem świetlnym (patrz ryc. 2). (B) Ten wzorzec rozmieszczenia jest potwierdzony w przekrojach tomograficznych. (C) Barwienie histologiczne (trichromowe w Stanach Zjednoczonych) wykazuje bliskie podobieństwo do wycinków tomograficznych, a immunohistochemia z użyciem kilku różnych przeciwciał podkreśla komplementarny charakter OPT z tradycyjnymi podejściami do analizy zmian. Podziałka w (A–B) wynosi 1 mm; Podziałka w (C) wynosi 250 μm. RSA, prawa tętnica podobojczykowa; RCA, prawa tętnica szyjna; LCA, lewa tętnica szyjna; LSA, lewa tętnica podobojczykowa; BCA, tętnica ramienno-głowowa; AAo, aorta wstępująca; DAo, aorta zstępująca. Na podstawie Kirkby i wsp. ¹¹

Rycina 5: Analiza zmian chorobowych i profili światła wskazuje na różny stopień proliferacji neointimalu w odpowiedzi na różne metody uszkodzenia tętnic. Tomografia projekcji optycznej umożliwia wykreślenie pomiarów przekroju poprzecznego zmiany i światła w zależności od odległości wzdłuż tętnicy udowej. To wyraźnie pokazuje, że w porównaniu z nieuszkodzoną tętnicą (A), częściowe podwiązanie (B) powoduje małe, stosunkowo dyskretne zmiany, podczas gdy całkowite podwiązanie (C) powoduje całkowite zamknięcie w miejscu podwiązania, ale zmiana nie rozciąga się daleko wzdłuż tętnicy. Uraz drutu śródświetlnego (D) powoduje zmianę, która prawie całkowicie zamyka dystalną część próbki i rozciąga się na całej długości skanowanego odcinka tętnicy. Na podstawie Kirkby i wsp. ¹¹

Rysunek S1.Animowana rekonstrukcja obrazów przekrojowych uzyskanych z tętnicy udowej myszy po urazie podwiązania.Ten typ animowanego obrazu jest przydatny zarówno do analizy jakościowej, jak i ilościowej. Gdy animacja przesuwa się od bliższego do dystalnego odcinka tętnicy, łatwo zauważyć stopniowy rozwój okluzyjnej neointimy, dostrzegalnej ze światła i środka. Boczne gałęzie można łatwo zidentyfikować, a wraz ze wzrostem rozmiaru zmiany widoczna jest okluzja świetlna i przebudowa tętnicy na zewnątrz. Całkowite zamknięcie naczynia następuje po osiągnięciu miejsca podwiązania. Na podstawie Kirkby i wsp. ¹¹

Rysunek S2.Animowana rekonstrukcja przekrojowych obrazów łuku aorty od myszy podatnej na miażdżycę. Animacja rozpoczyna się od przekrojów poprzecznych aorty wstępującej (po lewej – która pojawia się jako pierwsza) i opadającej (po prawej). Małe zmiany pojawiają się w aorcie wstępującej, gdy skan przesuwa się w kierunku łuku aorty. Obrazy następnie przesuwają się przez łuk, aby pokazać silnie zmienione ujścia tętnic ramienno-głowowych (po lewej), lewej tętnicy szyjnej (w środku) i lewej podobojczykowej (po prawej). W miarę jak skan przesuwa się dystalnie wzdłuż tych gałęzi, zmiany stopniowo zmniejszają się i znikają, najpierw w tętnicy podobojczykowej, następnie w tętnicy szyjnej, a na końcu w tętnicy ramienno-głowowej. Co ciekawe, zmiana w tętnicy ramienno-głowowej przesuwa się na rozdzielacz przepływu, gdy naczynie to dzieli się na prawą tętnicę szyjną i prawą tętnicę podobojczykową. Na podstawie Kirkby i wsp. ¹¹

Rysunek S3.Animowany, renderowany objętościowo obraz łuku aorty od myszy podatnej na miażdżycę. Optyczna tomografia projekcyjna umożliwia generowanie trójwymiarowych obrazów, w tym przypadku pokazujących rozkład zmian w łuku aorty myszy z niedoborem apolipoproteiny E. (A) Miażdżyca występuje w oczekiwanych miejscach (w całej tętnicy ramienno-głowowej, w ujściach lewej tętnicy szyjnej i podobojczykowej oraz w mniejszej krzywiźnie łuku aorty). (B) Segmentacja i odwzorowanie zmian (pokazanych na czerwono) zawierających przekroje poprzeczne podkreśla rozmieszczenie blaszek po nałożeniu na oryginalny obraz. Na podstawie Kirkby i wsp. ¹¹

Dyskusja

Analiza trójwymiarowa ma ogromny potencjał w zakresie zastąpienia lub uzupełnienia dwuwymiarowych technik histologicznych, które nadal stanowią podstawę większości badań nad powstawaniem zmian w tętnicach. Tutaj OPT jest pokazany w małych tętnicach mysich (przy czym mysie tętnice udowe prawdopodobnie reprezentują najmniejsze naczynia, które można z powodzeniem analizować przy użyciu tej techniki). Nadaje się jednak również do stosowania z tętnicami (i uszkodzeniami) innych gatunków, w tym małych i średnich naczyń ludzkich; nasza grupa z powodzeniem wykorzystała tę technikę do analizy zmian w aorcie królika (Bezuidenhout i wsp.; niepublikowane). OPT obiecuje szybszą analizę i większą ilość informacji strukturalnych w porównaniu z tradycyjną histologią i ma tę zaletę, że nie uniemożliwia późniejszej analizy próbki przy użyciu zarówno technik histologicznych, jak i immunohistochemicznych.

Obrazy wykonane za pomocą OPT dostarczyły szczegółów anatomicznych, pokazując miejsca powstawania zmian i wielkość zmian w tych obszarach. Tętnice używane w tych badaniach są prawdopodobnie bliskie granicy rozdzielczości dla tej techniki, a zatem jakość obrazu jest w pewnym stopniu pogarszana przez artefakty (prawdopodobnie wynikające z niewspółosiowości rotacji, niepełnego oczyszczania, odbicia/załamania w wierzchołkach agarozy i problemów z ogniskowaniem). Mimo to wymagane szczegóły (tj. warstwy ścianki naczynia) pozostają dostrzegalne, a zatem technika ta jest niezwykle przydatna do ilościowego oznaczania poszczególnych warstw. Rzeczywiście, obrazy można było szybko i powtarzalnie określić ilościowo, aby zapewnić pomiary zmiany chorobowej i objętości światła w sekcjach naczynia zawierających płytkę nazębną, a także obszarów przekroju poprzecznego zmiany i światła w wybranych miejscach próbki. Za pomocą tej metody z powodzeniem przeanalizowano duże (aorta) i średniej wielkości (udowe, szyjne, podobojczykowe) tętnice mysie – zwykle wykorzystywane do analizy powstawania zmian miażdżycowych i neotintimalnych u myszy. Rzeczywiście, wykorzystaliśmy teraz OPT, aby zademonstrować wpływ interwencji farmakologicznych i manipulacji genetycznych na wielkość zmian miażdżycowych i neowewnętrznych. Na przykład blokada receptora endoteliny zmieniła powstawanie zmian w neodincie, podczas gdy selektywna delecja receptora endoteliny B ze śródbłonka naczyniowego nie¹⁵. U myszy podatnych na miażdżycę wykazano, że genetyczna delecja enzymów 11β-HSD1¹⁶ lub galektyny 3¹⁷ zmniejsza rozmiar zmian miażdżycowych.

Kwantyfikacja objętości zmiany jest oczywistą zaletą OPT. Daje bardziej pouczające wskazanie całkowitego obciążenia zmianą w tętnicy⁴ niż zwykle uzyskuje się metodami histologicznymi. Analiza całej zmiany zmniejsza błąd systematyczny i błąd, które nieuchronnie wystąpią, gdy do analizy zostaną wybrane dyskretne odcinki naczynia. Wytwarzanie podłużnych profili zmian jest kolejnym atutem OPT, podkreślonym przez porównanie zmian wywołanych różnymi typami urazów^13,16 (ryc. 5). Na przykład, zarówno całkowite podwiązanie, jak i wprowadzenie drutu indukowały prawie całkowitą okluzję w pobliżu bifurkacji femero-podkolanowej. Uraz drutu powodował jednak zmiany chorobowe, które rozciągały się na całej długości skanowanego odcinka, podczas gdy zmiany wywołane podwiązaniem tętnic szybko zmniejszały się i znikały. Ten wzór jest zgodny z większym zakresem urazu spowodowanego wprowadzeniem prowadnika angioplastyki. Uzyskanie podobnych wyników za pomocą wycinków histologicznych jest kosztowne, czasochłonne i pracochłonne.

Do zalet OPT należy jakość tworzonych obrazów oraz jego względna szybkość i prostota (rutynowo skanowaliśmy 20 statków dziennie). Jakość obrazu wydaje się lepsza lub przynajmniej porównywalna z innymi metodami generowania trójwymiarowych obrazów ex vivo (takimi jak MRI i mikrotomografia komputerowa), jednak OPT wymaga krótszego czasu skanowania (czas integracji w naszych badaniach wynosił zwykle 1-2 sekundy / obraz) i jest tańszy. Przygotowanie próbki trwa kilka dni, ale wymaga niewielkiego nakładu pracy, naczynia można przygotowywać partiami, a dane można pozyskać podczas jednej sesji. Dzięki temu przepustowość jest wysoka i nie wymaga długotrwałego korzystania ze skanera. Co ważne, nieniszczący charakter OPT oznacza, że można go wykorzystać do identyfikacji miejsc zainteresowania do badania immunohistochemicznego; zmniejszając w ten sposób ilość wymaganego cięcia i barwienia. Możliwe, że opracowanie ultrasonografii o wysokiej rozdzielczości zapewni alternatywną metodę wolumetrycznej kwantyfikacji zmian w tętnicach tej wielkości, ale autorzy nie są świadomi żadnych publikacji, które demonstrują to zastosowanie.

Być może nie jest zaskoczeniem, że jakość obrazu w OPT jest gorsza od technik mikroskopowych (które oczywiście można wykonać tylko na mniejszych próbkach). Proponowane udoskonalenia w zakresie rekonstrukcji danych mogą rozwiązać ten problem, umożliwiając przyszłą poprawę jakości obrazu^19,20. Innym problemem metodologicznym jest to, że przetwarzanie tkanek zmienia charakterystykę próbki. Na przykład lipofilowy charakter środka usuwającego, alkoholu benzylowego/benzoesanu benzylu (BABB), prawdopodobnie usunie lipidy ze zmian miażdżycowych, podczas gdy wcześniejsze odwodnienie może spowodować skurcz (chociaż, oczywiście, etapy odwadniania i usuwania lipidów są również cechą przygotowania próbki do zatopienia w wosku parafinowym). W badaniach wykorzystano BABB, ponieważ w porównaniu z hydrofilowymi środkami czyszczącymi (np. glicerolem ²¹) powoduje on jedynie niewielkie zmiany w morfologii.

Istnieje kilka możliwości dalszego rozwoju i udoskonalania OPT, szczególnie w odniesieniu do śledzenia trójwymiarowego układu kluczowych komórek i czynników sygnalizacyjnych zaangażowanych w przebudowę tętnic. Silna autofluorescencja tkanki tętniczej, która jest tak korzystna w generowaniu obrazów anatomicznych, nie jest tłumiona przez istniejące metody wybielania²² i może ograniczać stosowanie sond fluorescencyjnych do oceny wzorców dystrybucji RNA i białek. Zastosowanie sond kolorymetrycznych (np. β-galaktozydazy) uwidocznionych za pomocą obrazowania transmisyjnego może przezwyciężyć to ograniczenie.

Podsumowując, OPT ma ogromny potencjał w trójwymiarowym obrazowaniu zmian chorobowych w błonie wewnętrznej tętnic mysich. Stanowi to znaczny postęp w stosunku do metod dwuwymiarowych, które są na ogół pracochłonne i nie reprezentują skutecznie całkowitej objętości zmiany. OPT jest stosunkowo szybki, wygodny i nieniszczący. Nowe osiągnięcia w analizie obrazu dają nadzieję na dalsze zwiększenie mocy i użyteczności tej techniki.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Mikroskop operacyjny	Zeiss, Niemcy		OPMI Pico i
Anesthetic Machine	Vet Tech, Wielka Brytania
Fluovac	Harvard Apparatus Wielka Brytania	340387
Fluosorber	Harvard Apparatus Wielka Brytania	340415
Sterylizator koralików	Fine Science Tools, Wielka Brytania	1800-45
Podgrzewana mata	Fine Sceince Narzędzia, Wielka Brytania	21061-10
Balance	Mettler Toledo		MS1602S PB1502 lub równoważne
szwy	Ethicon, UK		5/0 Mersilk
Guidewire	Cook Inc, USA	C-PMS-251	0,014"
Szyj jedwab	Fine Science Tools, Wielka Brytania	18020-60	6/0
Narzędzia chirurgiczne	Narzędzia do nauki pięknej, Wielka Brytania	14058-09	Nożyczki do tęczówki Toughcut
Nożyczki sprężynowe Cohan-Vannas	Narzędzia do nauki pięknej, Wielka Brytania	15000-01
Dumont #5/45 Kleszcze	Narzędzia do nauki pięknej, Wielka Brytania	11251-35
Kleszcze Moria Irys	Narzędzia do nauki pięknej, Wielka Brytania	11370-31
Halsted-Mosquito Hemostat	Fine Science Tools, Wielka Brytania	13008-12
Klipsy Bulldog	Fine Science Tools, Wielka Brytania	18050-35
Bioptonics 3001 Tomograf	Bioptonics, Wielka Brytania
Magnetyczny uchwyt OPT	Bioptonics, Wielka Brytania
Computer	Dell Inc, Wielka Brytania
Pompa perystaltyczna	Oprogramowanie Gilson	F117606	Minipuls
3 DataViewer	Skyscan, Belgia	v.1.4.4
Oprogramowanie NRecon	Skyscan, Belgia	v.1.6.8
Oprogramowanie CTan	Skyscan, Belgia	v.1.12
Isoflurane	Merial Animal Health Ltd, Wielka Brytania	AP/Drugs/220/96	100% para inhalacyjna, płynny
tlen medyczny	BOC Medical, UK	UN1072
Vetergesic	Alstoe Animal Health Ltd, Wielka Brytania		0,3 mg/ml
1% Lignokaina	Hamlen Pharmaceuticals, Wielka Brytania	LD1010	10 ml ampułka
EMLA Krem	Astra Zeneca, Wielka Brytania
Pentobarbital sodu	Ceva Animal Health Ltd, Wielka Brytania
Western Diet	Research Diets, USA	D12079B	0,2%
cholesterolu Sól fizjologiczna buforowana fosforanem	Sigma UK	P4417
Heparyna (śluzowa)	Leo Laboratories, Wielka Brytania	PL0043/003GR	250 000 jednostek
Neutralna buforowana formalina	Sigma, Wielka Brytania	HT501128	10%
etanolu	VWR BDH Prolabo, Wielka Brytania	20821.33	Absolute AnalaR
Agarose	Invitrogen, Wielka Brytania	16020050	niskiej temperaturze topnienia
	GE Healthcare, Wielka Brytania	113v	Klej
cyjanoakrylowy	Henkel, Wielka Brytania	4304	Loctite
Alkohol benzylowy	Sigma, Wielka Brytania	B6630
Benzoesan benzylu	Sigma, Wielka Brytania	402834
Metanol	VWR BDH Prolabo, Wielka Brytania	20856.296	100%