Analiza ex vivo zmian w tętnicach z modeli zwierzęcych chorób sercowo-naczyniowych klasycznie opiera się na technikach histologicznych i immunohistochemicznych. Zapewniają one 2-wymiarowe pomiary w 3-wymiarowych zmianach. W artykule opisano generowanie zmian tętniczych do analizy ilościowej w 3 wymiarach z wykorzystaniem optycznej tomografii projekcyjnej.
Artykuł metodologiczny
Generowanie i 3-wymiarowa ocena ilościowa zmian w tętnicach u myszy za pomocą optycznej tomografii projekcyjnej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Generowanie i analiza zmian naczyniowych w odpowiednich modelach zwierzęcych jest kamieniem węgielnym badań nad chorobami sercowo-naczyniowymi, dostarczając ważnych informacji na temat patogenezy powstawania zmian i działania nowych terapii. Wykorzystanie myszy podatnych na miażdżycę, chirurgicznych metod indukcji zmian chorobowych i modyfikacji diety znacznie poprawiło zrozumienie mechanizmów, które przyczyniają się do rozwoju choroby i potencjału nowych metod leczenia.
Klasycznie, analiza zmian jest przeprowadzana ex vivo przy użyciu dwuwymiarowych technik histologicznych. W artykule opisano zastosowanie optycznej tomografii projekcyjnej (OPT) do trójwymiarowej oceny ilościowej zmian tętniczych. Ponieważ technika ta jest nieniszcząca, może być stosowana jako uzupełnienie standardowych analiz histologicznych i immunohistochemicznych.
Zmiany w neointymach były wywoływane przez wprowadzenie drutu lub podwiązanie tętnicy udowej myszy, podczas gdy zmiany miażdżycowe były generowane przez podawanie diety aterogennej myszom z niedoborem apoE.
Zmiany zostały zbadane za pomocą obrazowania OPT emisji autofluorescencji, a następnie uzupełniającej analizy histologicznej i immunohistochemicznej. OPT wyraźnie odróżniał zmiany chorobowe od leżącej pod nimi ściany naczyniowej. Wielkość zmiany obliczono w przekrojach 2-wymiarowych za pomocą planimetrii, co umożliwiło obliczenie objętości zmiany i maksymalnego pola przekroju poprzecznego. Dane wygenerowane za pomocą OPT były zgodne z pomiarami uzyskanymi za pomocą histologii, potwierdzając dokładność techniki i jej potencjał jako uzupełnienia (a nie alternatywy) tradycyjnych metod analizy.
Ta praca pokazuje potencjał OPT do obrazowania zmian miażdżycowych i neointimalnych. Zapewnia szybką, bardzo potrzebną technikę ex vivo do rutynowej trójwymiarowej kwantyfikacji przebudowy naczyń krwionośnych.
Wprowadzenie
Powstawanie zmian w tętnicach ma kluczowe znaczenie dla wysokiej zachorowalności i śmiertelności związanej z chorobami układu krążenia1. Uważa się, że powstawanie zmian jest spowodowane nieskrępowaną reakcją zapalną na uszkodzenie tętnic2. Zmiany miażdżycowe tworzą się powoli w odpowiedzi na przewlekłe uszkodzenie ściany tętnicy, natomiast zmiany restenotyczne rozwijają się szybko po ostrym uszkodzeniu mechanicznym (np. po wszczepieniu stentu). Mechanizmy, które przyczyniają się do rozwoju zmian w tętnicach, zostały znacznie wyjaśnione dzięki zastosowaniu odpowiednich modeli zwierzęcych, często w połączeniu z odpowiednimi manipulacjami genetycznymi1.
Analiza wielkości i składu zmiany klasycznie zależała głównie od ex vivo, dwuwymiarowej histologii (chociaż to się zmienia wraz z rozwojem ulepszonych metod wykrywania i analizy zmian u małych zwierząt in vivo i ex vivo 3). Analiza histologiczna zmian tętniczych jest pracochłonna, czasochłonna i dostarcza ograniczonych informacji o strukturze trójwymiarowej. Na przykład obciążenie zmianami chorobowymi jest zwykle oceniane poprzez pomiar pola przekroju poprzecznego zmiany (albo w losowo wybranych miejscach, albo w miejscu maksymalnej okluzji). Zapewnia to niepełną analizę całkowitego obciążenia zmianami chorobowymi. Technologia obrazowania trójwymiarowego z pełnym montażem zapewnia możliwe rozwiązanie tego problemu, ale zaskakująco niewiele odpowiednich podejść zostało opisanych. Może to wynikać głównie z wielkości tętnic myszy, które są zbyt duże do mikroskopii konfokalnej z pojedynczym fotonem, ale zbyt małe do obrazowania metodą rezonansu magnetycznego (MRI)4 i rentgenowskiej tomografii komputerowej (CT)5. Zastosowanie rezonansu magnetycznego ex vivo i mikrotomografii komputerowej do badania zmian miażdżycowych u myszy sugeruje, że oferują one ograniczoną rozdzielczość, nawet w stosunkowo dużych tętnicach. Do tego dochodzą stosunkowo długie czasy akwizycji, które ograniczają przepustowość (i zwiększają koszty skanowania)4,6.
Rozwój nowych metod obrazowania optycznego (takich jak optyczna koherentna tomografia3,7 i fotoakustycznatomografia 8) oferuje duży potencjał do poprawy obrazowania zmian w tętnicach mysich. Podobny potencjał wykazuje optyczna tomografia projekcyjna (OPT), która została opracowana w celu umożliwienia analizy zarodków myszy. OPT został zaprojektowany do obrazowania próbek o średnicy od ~0,3 do 10 mm9. Obrazowanie transmisyjne rejestruje nieprzezroczystość półprzezroczystej próbki w polichromatycznym świetle widzialnym i może być wykorzystywane do identyfikacji struktur anatomicznych. Obrazowanie emisyjne rejestruje emisję światła po wzbudzeniu na określonych długościach fal z endogennych (np. kolagenu, elastyny) i egzogennych fluoroforów w próbce. Może to również dostarczyć informacji anatomicznych (ponieważ różne składniki tkanek mogą różnić się rodzajem i gęstością obecnych gatunków autofluorescencyjnych). Ponadto rozkład immunoreaktywności lub ekspresję genów można określić za pomocą odpowiednich sond fluorescencyjnych10. W każdym trybie obrazowania (transmisyjnym lub emisyjnym) światło jest skupiane na urządzeniu sprzężonym z ładunkiem, aby umożliwić iteracyjne przechwytywanie obrazu w miarę obracania się próbki (zwykle 400 obrazów w krokach co 0,9°). Można je wykorzystać do obliczania objętości za pomocą standardowych metod rekonstrukcji tomograficznej (takich jak filtrowana projekcja wsteczna (przy użyciu algorytmu stożka) lub rekonstrukcja iteracyjna).
Ten film demonstruje nasze nowatorskie zastosowanie OPT do szybkiej, mierzalnej i efektywnej kosztowo trójwymiarowej analizy zmian miażdżycowych i neointimalnych, jak to wcześniej opisano w Kirkby et al.11. Wykazano, że technika ta jest odpowiednia do ilościowego określania wielkości zmiany w trzech powszechnie stosowanych modelach: (i) uszkodzenie drutu tętnicy udowej; (ii) podwiązanie tętnicy udowej i (iii) miażdżyca tętnic wywołana dietą u myszy z niedoborem apolipoproteiny E (apoE-/-).
Protokół
1. Chirurgiczna indukcja zmian neointymalnych w tętnicy udowej myszy
- Doświadczenia na zwierzętach powinny być przeprowadzane zgodnie z krajowymi i instytucjonalnymi wymogami etycznymi. Wszystkie zabiegi chirurgiczne powinny być wykonywane przy użyciu odpowiedniej techniki aseptycznej. Indukcję zmian w neointymale uzyskuje się za pomocą modyfikacji techniki opisanej przez Roque i wsp.12 oraz Sata i wsp.Rozdział 13.
- Zważ samce myszy C57Bl6/J (wiek 10-12 tygodni; waga 25-30 g), a następnie znieczulenie, podając 4-5% izofluranu w komorze indukcyjnej. Po wywołaniu znieczulenia przenieś mysz na podgrzewaną matę, aby utrzymać temperaturę ciała na poziomie 37 °C. Kontynuuj podawanie izofluranu (2-3%) przez maskę.
- Po wywołaniu odpowiedniego poziomu znieczulenia (brak reakcji na uszczypnięcie palca u nogi) należy zapewnić ochronę przeciwbólową poprzez podanie buprenorfiny (0,1 mg/kg-1). Następnie umieść mysz w pozycji leżącej na plecach i ogol brzuszną powierzchnię lewej kończyny tylnej.
- Wykonaj nacięcie, aby odsłonić mięśnie górnej kończyny tylnej i między rozwidleniem z tętnicą podkolanową a ścianą brzucha użyj rozwarstwienia, aby odizolować tętnicę i żyłę udową od nerwu udowego. W razie potrzeby przepłukać ranę za pomocą 1% w/v lignokainy.
- Umieść proksymalne (blisko ściany brzucha) i dystalne (bezpośrednio pod gałęzią z tętnicą podkolanową) tymczasowe ligatury (6/0 Mersilk) wokół tętnicy udowej i żyły, aby kontrolować przepływ krwi. Następnie należy odizolować tętnicę podkolanową (na około 2-5 mm dystalnie do gałęzi z tętnicą udową) i podwiązać dystalnie. Umieść drugą, niezawiązaną ligaturę pod tętnicą podkolanową.
- Wykonaj małe nacięcie (arteriotomia) w tętnicy podkolanowej, bezpośrednio dystalnie do gałęzi z tętnicą udową, zapobiegając krwawieniu poprzez wywieranie nacisku na bliższą tymczasową ligaturę. Przesuń prostą, sprężynującą prowadnik 0,014" 1-1,5 cm wzdłuż tętnicy udowej w kierunku ściany brzucha i pozostaw na miejscu na 30 sekund (ryc. 1A).
- Usunąć prowadnik i podwiązać tętnicę podkolanową powyżej arterionomii, używając umieszczonej w tym celu ligatury i uważając, aby nie zatkać tętnicy udowej.
UWAGA: W przypadku urazów spowodowanych podwiązaniem. Przebudowa neointymalna bez uszkodzenia śródświetlnego może być wywołana przez podwiązanie tętnic udowych lub podkolanowych (ryc. 1B i 1C). Aby to osiągnąć, wykonaj kroki 1.1-1.5. Nie należy jednak wykonywać arteriotomii, ale (unikając kroku 1.6) albo (i) podwiązać tętnicę podkolanową bezpośrednio dystalnie do tętnicy udowej lub (ii) podwiązać tętnicę udową wspólną w punkcie rozgałęzienia z tętnicą podkolanową. Następnie przejdź do kroku 1.8. - Usunąć tymczasowe ligatury, zamknąć ranę nieciągłym szwem zewnętrznym (5/0 Mersilk) i nałożyć krem EMLA (2,5% lidokainy, 2,5% prylokainy). Pozwól zwierzętom odzyskać przytomność (zwykle 5-10 minut) i upewnij się, że swobodnie poruszają się po klatce (lekka kulawizna może być widoczna w chorej nodze, ale powinna ustąpić w ciągu pierwszych 2-3 dni po operacji) przed powrotem do pomieszczeń trzymania. Myszy po operacji nie muszą być trzymane pojedynczo.
- Pozwól zwierzętom dojść do siebie przez okres do 3 miesięcy. Małe zmiany zaczną pojawiać się ~7 dni po urazie drutu i osiągną stabilny maksymalny rozmiar po ~ 21-28 dniach.
2. Indukcja zmian miażdżycowych u myszy E-/- z apolipoproteiną
- Podawać dietę zachodnią (0,2% cholesterolu; Research Diets, USA) do samców, 6-tygodniowych myszy ApoE-null (hodowanych w domu) przez 12 tygodni.
- Zmiany miażdżycowe są często widoczne przy wnikliwych oględzinach łuku aorty i jej głównych odgałęzień (ryc. 2).
3. Analiza zmian tętniczych za pomocą optycznej tomografii projekcyjnej (OPT)
UWAGA: Obrazy OPT zmian w mysich tętnicach udowych i próbkach łuku aorty zostały uzyskane za pomocą tomografu z projekcją optyczną.
- Eutanazja myszy przez przekrwienne utrwalenie perfuzji i wykrwawienie w znieczuleniu końcowym (80 mg/kg pentobarbitalu sodu), przy użyciu heparynizowanej (10 U/ml) soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS), a następnie 10% neutralnej buforowanej formaliny.
- W razie potrzeby odizolować tętnice udowe lub łuk aorty i jej główne gałęzie (lewa tętnica szyjna, lewa tętnica podobojczykowa, pień ramienno-głowowy) i usunąć obcy materiał okołoprzybyszowy. Po utrwaleniu w 10% buforowanej formalinie O/N, przed przechowywaniem w 70% etanolu do czasu, gdy będzie potrzebny.
- Osadź tętnice w 1,5% agarozie o niskiej temperaturze topnienia, wstępnie przefiltrowanej przez papier Whatman 113 V. Przymocuj każdą próbkę do magnetycznego uchwytu OPT za pomocą kleju cyjanoakrylowego tak, aby oś naczynia była zgodna z osią uchwytu. Nadmiar agarozy przyciąć do stożkowatego kształtu. Odwodnić w 100% metanolu przez co najmniej 12 godzin.
- Wyczyść naczynia przez zanurzenie (na 12-24 godziny) w mieszaninie alkoholu benzylowego i benzoesanu benzylu (1:2 v/v).
- Oczyszczone próbki umieścić w skalibrowanym tomografie. Ustaw rozdzielczość na 1 024 x 1 024 i określ powiększenie optyczne, które pozwoli zobaczyć cały obszar zainteresowania. Objętość OPT jest izotropowa, oś z jest rekonstruowana do tej samej rozdzielczości (tj. 1,024 x 1,024 x 1,024), rozmiar woksela ~200 μm. Może to oznaczać zawyżenie rozdzielczości, ponieważ prawdopodobnie pojawią się artefakty rekonstrukcyjne. Dostosuj położenie próbki tak, aby obracała się wokół własnej osi w środku pola widzenia w jasnym polu kanału transmisyjnego.
- W kanale emisyjnym filtra GFP1 (filtr wzbudzający 425 nm z pasmem przepustowym 40 nm; filtr emisyjny: 475 nm długości przepustowej) ustaw ostrość próbki i dostosuj czas ekspozycji, aby zmaksymalizować zakres dynamiczny uzyskanego obrazu (uniknąć nadmiernego nasycenia). Skanuj naczynie tylko w kanale emisyjnym GFP1, z krokiem obrotu o 0.9°.
- Po zakończeniu potwierdź jakość pozyskiwania danych za pomocą oprogramowania DataViewer. Wyjmij próbkę ze skanera.
- Aby umożliwić późniejszą analizę histologiczną, umieść próbkę w 100% metanolu na >24 godziny przed normalnym przetworzeniem na wosk parafinowy.
4. Rekonstrukcja i analiza obrazu
Rekonstrukcja tomograficzna za pomocą filtrowanej projekcji wstecznej jest wykonywana przy użyciu oprogramowania NRecon lub podobnego. Rekonstrukcje mogą być wykonywane bez nadzoru, partiami.
- Popraw jakość obrazu, kompensując niewspółosiowość i dostosowując poziomy intensywności obrazu.
- Sprawdź jakość rekonstrukcji obrazu za pomocą oprogramowania DataViewer.
- Zidentyfikuj odpowiednią sekcję próbki do analizy. Długość ta powinna być spójna między naczyniami, jeżeli mają być rejestrowane wymiary światła.
- Zdefiniuj kontur zmian chorobowych, ręcznie wyznaczając odpowiednią granicę dla 1 na 50 zrekonstruowanych przekrojów.
- Sprawdź każdy przeplatany przekrój, aby upewnić się, że interpolacje generowane komputerowo są poprawne. W razie potrzeby ręcznie dostosuj obramowanie.
- Ustaw próg szarości tak, aby wybrana była tylko zmiana chorobowa i wyeksportuj dane pomiarowe.
- Dla każdego skanu zdefiniuj pionowy obszar zainteresowania zawierający zmianę i prześledź granicę między pochodną a neointimą (tj. położenie wewnętrznej elastycznej blaszki) dla każdej 50linii skanowania. Interpoluj obramowania błony wewnętrznej/środkowej dla przeplatanych linii skanowania w oprogramowaniu, a następnie sprawdź i skoryguj dopasowanie w razie potrzeby. Dalej segmentuj tę zdefiniowaną trójwymiarową objętość do ręcznie zdefiniowanego progu intensywności, aby uzyskać binarny zestaw obrazów, w którym białe piksele reprezentują neointimę, a czarne piksele reprezentują światło patentowe.
- Wykonywane pomiary obejmują: całkowitą objętość zmiany (objętość obiektu), objętość światła (objętość całkowita – objętość obiektu) oraz rozkład pola przekroju poprzecznego zmiany i światła wzdłuż długości osiowej badanego naczynia.
Wyniki
Wstępne skanowanie zdrowych (bezzranionych) tętnic udowych myszy (n = 5) wykazało, że obrazowanie transmisyjne nie dostarcza użytecznych obrazów. Było to następstwem zbyt wysokiej przezroczystości (zamiast zbyt wysokiej nieprzezroczystości) oczyszczonych tętnic dla obrazowania transmisyjnego. Jest to jednak korzystne dla obrazowania emisyjnego, ponieważ nie występuje absorpcja ani rozpraszanie emitowanego sygnału. Z kolei tętnice udowe wykazują silną autofluorescencję w kanale emisji, przy czym najsilniejszy sygnał uzyskano po wzbudzeniu w zakresie 405–445 nm (co jest zgodne z pikiem wzbudzenia elastyny przy 410 nm14). Dwuwymiarowe przekroje zrekonstruowane z tych obrazów pozwoliły na wyraźne odróżnienie błony środkowej od światła naczynia oraz błony zewnętrznej i światła naczynia.
W tętnicach udowych myszy pobranych 28 dni po urazie wywołanym drutem (n = 6) lub podwiązaniem (n = 5) widoczne było pogrubienie neointimy w nietomograficznych projekcjach emisji (Rycina 3A). W zrekonstruowanych przekrojach 2-wymiarowych koncentryczne zmiany neointimalne można było odróżnić od błony środkowej na podstawie ich słabszej emisji (Rycina 3B oraz Rycina S1).
Obrazy emisji OPT próbek całych preparatów łuku aorty i jego głównych odgałęzień od myszy z miażdżycą (n = 8) pozwoliły zidentyfikować zmiany o spodziewanym rozkładzie anatomicznym (t.j. w mniejszej krzywiźnie łuku aorty, tętnicy szyjno-obojczykowej oraz w ujściach lewej tętnicy szyjnej i lewej tętnicy podobojczykowej (Rysunek 4A). Obrazy w przekroju poprzecznym wskazały, że były to zazwyczaj zmiany ekscentryczne, które można było łatwo odróżnić od błony środkowej i światła naczynia (Rysunek 4B, Rysunki S2 i S3).
Przetwarzanie tętnic do analizy histologicznej po zastosowaniu OPT potwierdziło nieniszczący charakter OPT, a przekroje zostały pomyślnie zabarwione przy użyciu technik histologicznych (United States Trichrome, czerwień Picrosiriusa) oraz immunohistochemicznych (α-SMA, Mac-2) (Ryciny 3C i 4C).
Wykazano, że pomiar wielkości zmiany za pomocą OPT jest spójny z pomiarami uzyskanymi dzięki analizie obrazu przekrojów histologicznych pobranych z tej samej tętnicy11.
Pomiary planimetryczne powierzchni zmian uzyskane za pomocą OPT i histologii były ściśle skorelowane za pomocą regresji liniowej dla zmian neointimalnych wywołanych przez drucik (R2 = 0.92) i ligaturę (R2 = 0.89), a także dla blaszek miażdżycowych (R2 = 0.85). Istotną zaletą OPT jest możliwość przeprowadzenia analizy trójwymiarowej. Dzięki opracowaniu wolumetrycznej ilościowej oceny zmian za pomocą tej techniki, możliwe było zarejestrowanie objętości zmian w tętnicach udowych po uszkodzeniu drucikiem (0.1100 ± 0.0091 mm3; n = 6) i po ligaturze (0.0200 ± 0.0089 mm3; n = 5), a także w miażdżycowych tętnicach szyjno-głowowych (0.180 ± 0.018 mm3; n = 8). Pomiary charakteryzowały się wysoką powtarzalnością (współczynniki zmienności odpowiednio 5.4%, 11.4% i 4.8%, n = 4) dla wszystkich typów zmian. Zmiany neointimalne w naczyniach uszkodzonych drucikiem były większe (p <0.0001) niż te powstałe w wyniku ligatury, co jest zgodne z większym stopniem uszkodzeń wywołanych przez pierwszą z tych metod.
Wygenerowane dane można również przedstawić w formie profili zmian (Rysunek 5) oraz opracować w celu dynamicznej oceny jakościowej (patrz Rysunki S1-S3). Podejście to wyraźnie wykazało zakres powstawania zmian w odpowiedzi na różne procedury uszkadzania oraz uwypukliło nierównomierny rozkład zmian w uszkodzonych naczyniach.
Rysunek 1: Metody inicjowania tworzenia się zmian w tętnicy udowej myszy. (A) Wprowadzenie wstecznie drucika prowadzącego do angioplastyki do tętnicy udowej poprzez arteriotomię tętnicy podkolanowej stymuluje powstawanie zmian w odpowiedzi na uraz rozciągania i usunięcie śródbłonka. Przepływ krwi zostaje przywrócony nad uszkodzonym odcinkiem naczynia. (B) Proliferację neointimy wywołaną bez rozciągania wewnątrzluminalnego, denudacji lub przerwania przepływu krwi można zaindukować poprzez podwiązanie albo tętnicy udowej, albo tętnicy podkolanowej bezpośrednio dystalnie od rozgałęzienia tętnicy udowej. (C) Silniejszą odpowiedź w postaci proliferacji/urazu bez denudacji można wywołać poprzez podwiązanie zarówno tętnicy udowej, jak i podkolanowej w obrębie punktu rozgałęzienia wspólnej tętnicy udowej. Technika ta zablokuje również przepływ krwi w dystalnej części tętnicy udowej.
Rycina 2: Charakterystyczne złogi miażdżycowe w łuku aorty myszy.Myszom predysponowanym do miażdżycy (z deficytem apolipoproteiny E), karmionym dietą typu western z wysoką zawartością cholesterolu przez 12 tygodni, rozwija się charakterystyczny wzór rozmieszczenia zmian w łuku aorty i jego głównych odgałęzieniach. Jak pokazano, zmiany są widoczne (strzałki) podczas oględzin makroskopowych pod mikroskopem dissectingowym w łuku aorty, tętnicy szyjno-obojczykowej oraz w ujściach lewej tętnicy szyjnej i lewej tętnicy obojczykowej.
Rysunek 3: Powstawanie zmiany po podwiązaniu lewej tętnicy udowej.(A) Nietomograficzne obrazy emisji fluorescencyjnej (odwrócone w celu zwiększenia przejrzystości – ciemne obszary odpowiadają silniejszej emisji) pozwalają na identyfikację pogrubienia intima (czerwone groty strzałek). (B) W rekonstrukcjach tomograficznych można rozróżnić wyraźne obszary naczyniowe oraz światło naczynia. (C) Analiza histologiczna (barwienie trichrome United States) podkreśla wyraźne podobieństwo do obrazów uzyskanych metodą OPT. Paski skali na (A-C) wynoszą 200 mm. Adaptacja z Kirkby et al.11 Paski skali na (A-C) wynoszą 200 µm.
Rycina 4: Obrazowanie miażdżycy w łuku aorty u myszy podatnych na miażdżycę. (A) Miażdżyca (czerwone groty strzałek) jest wyraźnie widoczna na obrazach nietomograficznych (odwróconych tak, aby ciemniejsze obszary wskazywały silniejszą emisję, co poprawia przejrzystość) łuku aorty, w miejscach uznanych za objęte zmianami miażdżycowymi podczas oględzin pod mikroskopem świetlnym (patrz Rycina 2). (B) Ten wzorzec rozmieszczenia zostaje potwierdzony w przekrojach tomograficznych. (C) Barwienie histologiczne (trichrom amerykański) wykazuje bliskie podobieństwo do przekrojów tomograficznych, a immunohistochemia z użyciem kilku różnych przeciwciał podkreśla komplementarny charakter OPT względem tradycyjnych metod analizy zmian. Paski skali na (A–B) wynoszą 1 mm; pasek skali na (C) wynosi 250 µm. RSA, prawa tętnica podobojczykowa; RCA, prawa tętnica szyjna; LCA, lewa tętnica szyjna; LSA, lewa tętnica podobojczykowa; BCA, tętnica szyjno-obojczykowa; AAo, aorta wstępująca; DAo, aorta zstępująca. Adaptacja z Kirkby et al.11
Rycina 5: Analiza profili zmian i światła naczynia wskazuje na zróżnicowany zakres proliferacji neointimy w odpowiedzi na różne metody uszkodzenia tętnicy. Tomografia projekcyjna (OPT) umożliwia przedstawienie pomiarów przekroju zmiany i światła naczynia w funkcji odległości wzdłuż tętnicy udowej. Wyraźnie pokazuje to, że w porównaniu z tętnicą nieuszkodzoną (A), ligacja częściowa (B) powoduje powstanie małych, stosunkowo odseparowanych zmian, natomiast ligacja całkowita (C) prowadzi do pełnego zamknięcia światła w miejscu ligacji, lecz zmiana ta nie rozciąga się daleko wzdłuż tętnicy. Uraz drutem wewnątrznaczyniowym (D) powoduje powstanie zmiany, która niemal całkowicie zamyka dystalną część próbki i rozciąga się wzdłuż całej długości skanowanego odcinka tętnicy. Adaptowano z Kirkby et al.11
Rycina S1. Animowana rekonstrukcja obrazów przekrojowych uzyskanych z tętnicy udowej myszy po urazie wywołanym podwiązaniem. Ten rodzaj animowanego obrazu jest użyteczny zarówno w analizie jakościowej, jak i ilościowej. W miarę przesuwania się animacji od sekcji proksymalnych do dystalnych tętnicy, wyraźnie widoczny jest stopniowy rozwój zamykającej światło neointimy, którą można odróżnić od światła naczynia oraz błony środkowej. Łatwo można zidentyfikować odgałęzienia boczne, a wraz ze wzrostem rozmiaru zmiany widoczne jest zamykanie światła naczynia oraz przebudowa zewnętrzna tętnicy. Całkowite zamknięcie naczynia następuje po dotarciu do miejsca podwiązania. Adaptowano z Kirkby et al.11
Rysunek S2. Animowana rekonstrukcja obrazów przekrojowych łuku aorty u myszy predysponowanej do miażdżycy. Animacja rozpoczyna się od przekrojów aorty wstępującej (po lewej – pojawia się jako pierwsza) i zstępującej (po prawej). W miarę przesuwania skanu w kierunku łuku aorty w aorcie wstępującej pojawiają się niewielkie zmiany chorobowe. Następnie obrazy przesuwają się przez łuk, ukazując silnie zmienione zmiany w ujściach tętnicy szyjno-głowowej (po lewej), lewej tętnicy szyjnej (na środku) i lewej tętnicy podobojczykowej (po prawej). W miarę przesuwania skanu dystalnie wzdłuż tych odgałęzień zmiany stopniowo się zmniejszają i zanikają – najpierw w tętnicy podobojczykowej, następnie w tętnicy szyjnej, a na końcu w tętnicy szyjno-głowowej. Co ciekawe, zmiana w tętnicy szyjno-głowowej przesuwa się na rozwidlenie przepływu w miejscu, gdzie naczynie to dzieli się na prawą tętnicę szyjną i prawą tętnicę podobojczykową. Adaptacja z Kirkby et al.11
Rycina S3. Animowany obraz z renderowaniem objętościowym łuku aorty myszy predysponowanej do miażdżycy. Tomografia projekcyjna pozwala na generowanie obrazów trójwymiarowych, w tym przypadku wykazujących rozmieszczenie zmian w łuku aorty myszy z niedoborem apolipoproteiny E. (A) Miażdżyca występuje w przewidywanych miejscach (w całej tętnicy szyjno-głowowej, w ujściach lewej tętnicy szyjnej i podobojczykowej oraz w mniejszej krzywiźnie łuku aorty). (B) Segmentacja i renderowanie zmian (zaznaczonych na czerwono) z naniesionymi przekrojami poprzecznymi podkreślają rozmieszczenie blaszek miażdżycowych po nałożeniu na obraz oryginalny. Adaptacja z Kirkby et al.11
Dyskusja
Analiza trójwymiarowa ma ogromny potencjał w zakresie zastąpienia lub uzupełnienia dwuwymiarowych technik histologicznych, które nadal stanowią podstawę większości badań nad powstawaniem zmian w tętnicach. Tutaj OPT jest pokazany w małych tętnicach mysich (przy czym mysie tętnice udowe prawdopodobnie reprezentują najmniejsze naczynia, które można z powodzeniem analizować przy użyciu tej techniki). Nadaje się jednak również do stosowania z tętnicami (i uszkodzeniami) innych gatunków, w tym małych i średnich naczyń ludzkich; nasza grupa z powodzeniem wykorzystała tę technikę do analizy zmian w aorcie królika (Bezuidenhout i wsp.; niepublikowane). OPT obiecuje szybszą analizę i większą ilość informacji strukturalnych w porównaniu z tradycyjną histologią i ma tę zaletę, że nie uniemożliwia późniejszej analizy próbki przy użyciu zarówno technik histologicznych, jak i immunohistochemicznych.
Obrazy wykonane za pomocą OPT dostarczyły szczegółów anatomicznych, pokazując miejsca powstawania zmian i wielkość zmian w tych obszarach. Tętnice używane w tych badaniach są prawdopodobnie bliskie granicy rozdzielczości dla tej techniki, a zatem jakość obrazu jest w pewnym stopniu pogarszana przez artefakty (prawdopodobnie wynikające z niewspółosiowości rotacji, niepełnego oczyszczania, odbicia/załamania w wierzchołkach agarozy i problemów z ogniskowaniem). Mimo to wymagane szczegóły (tj. warstwy ścianki naczynia) pozostają dostrzegalne, a zatem technika ta jest niezwykle przydatna do ilościowego oznaczania poszczególnych warstw. Rzeczywiście, obrazy można było szybko i powtarzalnie określić ilościowo, aby zapewnić pomiary zmiany chorobowej i objętości światła w sekcjach naczynia zawierających płytkę nazębną, a także obszarów przekroju poprzecznego zmiany i światła w wybranych miejscach próbki. Za pomocą tej metody z powodzeniem przeanalizowano duże (aorta) i średniej wielkości (udowe, szyjne, podobojczykowe) tętnice mysie – zwykle wykorzystywane do analizy powstawania zmian miażdżycowych i neotintimalnych u myszy. Rzeczywiście, wykorzystaliśmy teraz OPT, aby zademonstrować wpływ interwencji farmakologicznych i manipulacji genetycznych na wielkość zmian miażdżycowych i neowewnętrznych. Na przykład blokada receptora endoteliny zmieniła powstawanie zmian w neodincie, podczas gdy selektywna delecja receptora endoteliny B ze śródbłonka naczyniowego nie15. U myszy podatnych na miażdżycę wykazano, że genetyczna delecja enzymów 11β-HSD116 lub galektyny 317 zmniejsza rozmiar zmian miażdżycowych.
Kwantyfikacja objętości zmiany jest oczywistą zaletą OPT. Daje bardziej pouczające wskazanie całkowitego obciążenia zmianą w tętnicy4 niż zwykle uzyskuje się metodami histologicznymi. Analiza całej zmiany zmniejsza błąd systematyczny i błąd, które nieuchronnie wystąpią, gdy do analizy zostaną wybrane dyskretne odcinki naczynia. Wytwarzanie podłużnych profili zmian jest kolejnym atutem OPT, podkreślonym przez porównanie zmian wywołanych różnymi typami urazów13,16 (ryc. 5). Na przykład, zarówno całkowite podwiązanie, jak i wprowadzenie drutu indukowały prawie całkowitą okluzję w pobliżu bifurkacji femero-podkolanowej. Uraz drutu powodował jednak zmiany chorobowe, które rozciągały się na całej długości skanowanego odcinka, podczas gdy zmiany wywołane podwiązaniem tętnic szybko zmniejszały się i znikały. Ten wzór jest zgodny z większym zakresem urazu spowodowanego wprowadzeniem prowadnika angioplastyki. Uzyskanie podobnych wyników za pomocą wycinków histologicznych jest kosztowne, czasochłonne i pracochłonne.
Do zalet OPT należy jakość tworzonych obrazów oraz jego względna szybkość i prostota (rutynowo skanowaliśmy 20 statków dziennie). Jakość obrazu wydaje się lepsza lub przynajmniej porównywalna z innymi metodami generowania trójwymiarowych obrazów ex vivo (takimi jak MRI i mikrotomografia komputerowa), jednak OPT wymaga krótszego czasu skanowania (czas integracji w naszych badaniach wynosił zwykle 1-2 sekundy / obraz) i jest tańszy. Przygotowanie próbki trwa kilka dni, ale wymaga niewielkiego nakładu pracy, naczynia można przygotowywać partiami, a dane można pozyskać podczas jednej sesji. Dzięki temu przepustowość jest wysoka i nie wymaga długotrwałego korzystania ze skanera. Co ważne, nieniszczący charakter OPT oznacza, że można go wykorzystać do identyfikacji miejsc zainteresowania do badania immunohistochemicznego; zmniejszając w ten sposób ilość wymaganego cięcia i barwienia. Możliwe, że opracowanie ultrasonografii o wysokiej rozdzielczości zapewni alternatywną metodę wolumetrycznej kwantyfikacji zmian w tętnicach tej wielkości, ale autorzy nie są świadomi żadnych publikacji, które demonstrują to zastosowanie.
Być może nie jest zaskoczeniem, że jakość obrazu w OPT jest gorsza od technik mikroskopowych (które oczywiście można wykonać tylko na mniejszych próbkach). Proponowane udoskonalenia w zakresie rekonstrukcji danych mogą rozwiązać ten problem, umożliwiając przyszłą poprawę jakości obrazu19,20. Innym problemem metodologicznym jest to, że przetwarzanie tkanek zmienia charakterystykę próbki. Na przykład lipofilowy charakter środka usuwającego, alkoholu benzylowego/benzoesanu benzylu (BABB), prawdopodobnie usunie lipidy ze zmian miażdżycowych, podczas gdy wcześniejsze odwodnienie może spowodować skurcz (chociaż, oczywiście, etapy odwadniania i usuwania lipidów są również cechą przygotowania próbki do zatopienia w wosku parafinowym). W badaniach wykorzystano BABB, ponieważ w porównaniu z hydrofilowymi środkami czyszczącymi (np. glicerolem 21) powoduje on jedynie niewielkie zmiany w morfologii.
Istnieje kilka możliwości dalszego rozwoju i udoskonalania OPT, szczególnie w odniesieniu do śledzenia trójwymiarowego układu kluczowych komórek i czynników sygnalizacyjnych zaangażowanych w przebudowę tętnic. Silna autofluorescencja tkanki tętniczej, która jest tak korzystna w generowaniu obrazów anatomicznych, nie jest tłumiona przez istniejące metody wybielania22 i może ograniczać stosowanie sond fluorescencyjnych do oceny wzorców dystrybucji RNA i białek. Zastosowanie sond kolorymetrycznych (np. β-galaktozydazy) uwidocznionych za pomocą obrazowania transmisyjnego może przezwyciężyć to ograniczenie.
Podsumowując, OPT ma ogromny potencjał w trójwymiarowym obrazowaniu zmian chorobowych w błonie wewnętrznej tętnic mysich. Stanowi to znaczny postęp w stosunku do metod dwuwymiarowych, które są na ogół pracochłonne i nie reprezentują skutecznie całkowitej objętości zmiany. OPT jest stosunkowo szybki, wygodny i nieniszczący. Nowe osiągnięcia w analizie obrazu dają nadzieję na dalsze zwiększenie mocy i użyteczności tej techniki.
Oświadczenia
Autorzy nie mają konkurencyjnego interesu finansowego.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez stypendia z University of Edinburgh (NSK) i Carnegie Trust (LL; Henry Dryerre) oraz finansowanie z British Heart Foundation (PWFH, BRW, DJW; RG/05/008; PG/05/007; PG/08/068/25461) oraz Wellcome Trust (JRS, BRW, DJW; 08314/Z/07/Z). Autorzy są wdzięczni za wsparcie ich pracy w postaci nagrody Centrum Doskonałości Badawczej ufundowanej przez BHF dla Centrum Nauk o Układzie Sercowo-Naczyniowym.
Autorzy są szczególnie wdzięczni za rady profesora Masataka Sata (Uniwersytet Tokushima) i dr Igora Chersehneva (w grupie dr Ernane Reis w Mount Sinai School of Medicine) na temat tworzenia modeli chirurgicznych wytwarzania zmian w neodincie. Film wyprodukowany i udostępniony przez Sata et al.(http://plaza.umin.ac.jp/~msata/english.htm) była szczególnie przydatna.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Mikroskop operacyjny | Zeiss, Niemcy | OPMI Pico i | |
| Anesthetic Machine | Vet Tech, Wielka Brytania | ||
| Fluovac | Harvard Apparatus Wielka Brytania | 340387 | |
| Fluosorber | Harvard Apparatus Wielka Brytania | 340415 | |
| Sterylizator koralików | Fine Science Tools, Wielka Brytania | 1800-45 | |
| Podgrzewana mata | Fine Sceince Narzędzia, Wielka Brytania | 21061-10 | |
| Balance | Mettler Toledo | MS1602S PB1502 lub równoważne | |
| szwy | Ethicon, UK | 5/0 Mersilk | |
| Guidewire | Cook Inc, USA | C-PMS-251 | 0,014" |
| Szyj jedwab | Fine Science Tools, Wielka Brytania | 18020-60 | 6/0 |
| Narzędzia chirurgiczne | Narzędzia do nauki pięknej, Wielka Brytania | 14058-09 | Nożyczki do tęczówki Toughcut |
| Nożyczki sprężynowe Cohan-Vannas | Narzędzia do nauki pięknej, Wielka Brytania | 15000-01 | |
| Dumont #5/45 Kleszcze | Narzędzia do nauki pięknej, Wielka Brytania | 11251-35 | |
| Kleszcze Moria Irys | Narzędzia do nauki pięknej, Wielka Brytania | 11370-31 | |
| Halsted-Mosquito Hemostat | Fine Science Tools, Wielka Brytania | 13008-12 | |
| Klipsy Bulldog | Fine Science Tools, Wielka Brytania | 18050-35 | |
| Bioptonics 3001 Tomograf | Bioptonics, Wielka Brytania | ||
| Magnetyczny uchwyt OPT | Bioptonics, Wielka Brytania | ||
| Computer | Dell Inc, Wielka Brytania | ||
| Pompa perystaltyczna | Oprogramowanie Gilson | F117606 | Minipuls |
| 3 DataViewer | Skyscan, Belgia | v.1.4.4 | |
| Oprogramowanie NRecon | Skyscan, Belgia | v.1.6.8 | |
| Oprogramowanie CTan | Skyscan, Belgia | v.1.12 | |
| Isoflurane | Merial Animal Health Ltd, Wielka Brytania | AP/Drugs/220/96 | 100% para inhalacyjna, płynny |
| tlen medyczny | BOC Medical, UK | UN1072 | |
| Vetergesic | Alstoe Animal Health Ltd, Wielka Brytania | 0,3 mg/ml | |
| 1% Lignokaina | Hamlen Pharmaceuticals, Wielka Brytania | LD1010 | 10 ml ampułka |
| EMLA Krem | Astra Zeneca, Wielka Brytania | ||
| Pentobarbital sodu | Ceva Animal Health Ltd, Wielka Brytania | ||
| Western Diet | Research Diets, USA | D12079B | 0,2% |
| cholesterolu Sól fizjologiczna buforowana fosforanem | Sigma UK | P4417 | |
| Heparyna (śluzowa) | Leo Laboratories, Wielka Brytania | PL0043/003GR | 250 000 jednostek |
| Neutralna buforowana formalina | Sigma, Wielka Brytania | HT501128 | 10% |
| etanolu | VWR BDH Prolabo, Wielka Brytania | 20821.33 | Absolute AnalaR |
| Agarose | Invitrogen, Wielka Brytania | 16020050 | niskiej temperaturze topnienia |
| GE Healthcare, Wielka Brytania | 113v | Klej | |
| cyjanoakrylowy | Henkel, Wielka Brytania | 4304 | Loctite |
| Alkohol benzylowy | Sigma, Wielka Brytania | B6630 | |
| Benzoesan benzylu | Sigma, Wielka Brytania | 402834 | |
| Metanol | VWR BDH Prolabo, Wielka Brytania | 20856.296 | 100% |
Bibliografia
- Luis, A. J. Atherosclerosis. Nature. 407, 233-241 (2000).
- Ross, R. Atherosclerosis–an inflammatory disease. N Engl J Med. 340, 115-126 (1999).
- Deuse, T. Imaging In-Stent Restenosis: An Inexpensive, Reliable, and Rapid Preclinical Model. J Vis Ex. (31), (2009).
- McAteer, M. A. Quantification and 3D reconstruction of atherosclerotic plaque components in apolipoprotein E knockout mice using ex vivo high-resolution MRI. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24, 2384-2390 (2004).
- Martinez, H. G. Microscopic Computed Tomography-Based Virtual Histology for Visualization and Morphometry of Atherosclerosis in Diabetic Apolipoprotein E Mutant Mice. Circulation. 120, 821-822 (2009).
- Langheinrich, A. C. Atherosclerotic Lesions at Micro CT: Feasibility for Analysis of Coronary Artery Wall in Autopsy Specimens. Radiology. 231, 675-681 (2004).
- Ambrosi, C. M. Virtual histology of the human heart using optical coherence tomography. J Biomed Opt. 14, 054002(2009).
- Ku, G. Photoacoustic microscopy with 2-micron transverse resolution. J Biomed Opt. 15, 021302(2010).
- Sharpe, J. Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies. Science. 296, 541-545 (2002).
- Sharpe, J. Optical projection tomography. Annu Rev Biomed Eng. 6, 209-228 (2004).
- Kirkby, N. S. Quantitative 3-Dimensional Imaging of Murine Neointimal and Atherosclerotic Lesions by Optical Projection Tomography. PloS ONE. 6 (2), e16906(2011).
- Roque, M. Mouse model of femoral artery denudation injury associated with the rapid, accumulation of adhesion molecules on the luminal surface and recruitment of neutrophils. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 20, 335-342 (2000).
- Sata, M. A mouse model of vascular injury that induces rapid onset of medial cell apoptosis followed by reproducible neointimal hyperplasia. J Mol Cell Cardiol. 32, 2097-2104 (2000).
- Richards-Kortum, R., Sevick-Muraca, E. Quantitative optical spectroscopy for tissue diagnosis. Annu Rev Phys Chem. 47, 555-606 (1996).
- Kirkby, N. S. Non-endothelial cell endothelin-B receptors limit neointima formation following vascular injury. Cardiovascular Research. 95, 19-28 (2012).
- Kipari, T., et al. 11-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 deficiency in bone marrow-derived cells reduces atherosclerosis. FASEB J. 27 (4), 1519-1531 (2013).
- Mackinnon, A. C. Inhibition of galectin-3 reduces atherosclerosis in apolipoprotein E deficient mice. Glycobiology. 23 (6), 654-663 (2013).
- Kumar, A., Lindner, V. Remodeling with neointima formation in the mouse carotid artery after cessation of blood flow. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 17, 2238-2244 (1997).
- Walls, J. R. Correction of artefacts in optical projection tomography. Phys Med Biol. 50, 4645-4665 (2005).
- Walls, J. R. Resolution improvement in emission optical projection tomography. Phys Med Biol. 52, 2775-2790 (2007).
- Bucher, D. Correction methods for three-dimensional reconstructions from confocal images: I. tissue shrinking and axial scaling. Journal of Neuroscience Methods. 100, 135-143 (2000).
- Alanentalo, T. Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs. Nat Methods. 4, 31-33 (2007).
Przedruki i uprawnienia
