Artykuł metodologiczny

Analiza zawartości i składu kwasów tłuszczowych w mikroalgach

60.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50628

⸱

1 października 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Bioprocess Engineering, Wageningen University and Research Center, 2AlgaePARC, Wageningen University and Research Center, 3Food and Biobased Research, Wageningen University and Research Center

W tym artykule

Podsumowanie

Opisano metodę oznaczania zawartości i składu kwasów tłuszczowych w mikroalgach na podstawie mechanicznego rozbijania komórek, ekstrakcji lipidów na bazie rozpuszczalnika, transestryfikacji oraz kwantyfikacji i identyfikacji kwasów tłuszczowych za pomocą chromatografii gazowej. Wewnętrzny wzorzec tripentadekaniny służy do kompensacji ewentualnych strat podczas ekstrakcji i niepełnej transestryfikacji.

Streszczenie

Opisano metodę określania zawartości i składu całkowitej ilości kwasów tłuszczowych obecnych w mikroalgach. Kwasy tłuszczowe są głównym składnikiem biomasy mikroglonów. Te kwasy tłuszczowe mogą być obecne w różnych klasach acylolipidów. Szczególnie kwasy tłuszczowe obecne w triacyloglicerolu (TAG) mają znaczenie komercyjne, ponieważ mogą być wykorzystywane do produkcji paliw transportowych, chemikaliów luzem, nutraceutyków (kwasów tłuszczowych ω-3) i artykułów spożywczych. Aby opracować zastosowania komercyjne, potrzebne są wiarygodne metody analityczne do ilościowego oznaczania zawartości i składu kwasów tłuszczowych. Mikroalgi to pojedyncze komórki otoczone sztywną ścianą komórkową. Metoda analizy kwasów tłuszczowych powinna zapewnić wystarczające rozerwanie komórek w celu uwolnienia wszystkich lipidów acylowych, a zastosowana procedura ekstrakcji powinna być w stanie wyekstrahować wszystkie klasy lipidów acylowych.

Dzięki przedstawionej tutaj metodzie, wszystkie kwasy tłuszczowe obecne w mikroalgach mogą być dokładnie i powtarzalnie zidentyfikowane i oznaczone ilościowo przy użyciu małych ilości próbki (5 mg), niezależnie od ich długości łańcucha, stopnia nienasycenia lub klasy lipidów, do której należą.

Ta metoda nie dostarcza informacji o względnej obfitości różnych klas lipidów, ale może być rozszerzona o oddzielenie klas lipidów od siebie.

Metoda opiera się na sekwencji mechanicznego rozbijania komórek, ekstrakcji lipidów na bazie rozpuszczalnika, transestryfikacji kwasów tłuszczowych do estrów metylowych kwasów tłuszczowych (FAME) oraz kwantyfikacji i identyfikacji FAME za pomocą chromatografii gazowej (GC-FID). Przed procedurą analityczną dodaje się wzorzec wewnętrzny TAG (tripentadekanainę) w celu skorygowania strat podczas ekstrakcji i niepełnej transestryfikacji.

Wprowadzenie

Kwasy tłuszczowe są jednym z głównych składników biomasy mikroglonów i zazwyczaj stanowią między 5-50% suchej masy komórek1-3. Występują głównie w postaci glicerolipidów. Te glicerolipidy z kolei składają się głównie z fosfolipidów, glikolipidów i triacyloglicerolu (TAG). Szczególnie kwasy tłuszczowe obecne w TAG mają znaczenie handlowe, ponieważ mogą być wykorzystywane jako surowiec do produkcji paliw transportowych, chemikaliów luzem, nutraceutyków (kwasów tłuszczowych ω-3) i artykułów spożywczych3-6. Mikroalgi mogą rosnąć w podłożach uprawowych na bazie wody morskiej, mogą mieć znacznie wyższą produktywność powierzchniową niż rośliny lądowe i mogą być uprawiane w fotobioreaktorach w miejscach nieodpowiednich dla rolnictwa, być może nawet na morzu. Z tych powodów mikroalgi są często uważane za obiecującą alternatywę dla roślin lądowych do produkcji biodiesla i innych produktów masowych3-6. Potencjalnie do ich produkcji nie są potrzebne żadne grunty rolne ani słodka woda (w przypadku uprawy w zamkniętych fotobioreaktorach lub przy użyciu mikroalg morskich). Dlatego biopaliwa pochodzące z mikroalg są uważane za biopaliwa 3. generacji.

Całkowita zawartość kwasów tłuszczowych w komórkach (% suchej masy), skład klasy lipidów, jak również długość i stopień nasycenia kwasów tłuszczowych są bardzo zróżnicowane między gatunkami mikroalg. Ponadto właściwości te różnią się w zależności od warunków uprawy, takich jak dostępność składników odżywczych, temperatura, pH i natężenie światła1,2. Na przykład, gdy są narażone na głód azotu, mikroalgi mogą gromadzić duże ilości TAG. W optymalnych warunkach wzrostu TAG zazwyczaj stanowi mniej niż 2% suchej masy, ale pod wpływem głodu azotu zawartość TAG może wzrosnąć nawet do 40% suchej masy mikroglonów1.

Mikroalgi głównie produkują kwasy tłuszczowe o długości łańcucha 16 i 18 atomów węgla, ale niektóre gatunki mogą wytwarzać kwasy tłuszczowe o długości do 24 atomów węgla. Zarówno nasycone, jak i wysoko nienasycone kwasy tłuszczowe są wytwarzane przez mikroalgi. Te ostatnie obejmują kwasy tłuszczowe o właściwościach odżywczych (kwasy tłuszczowe ω-3), takie jak C20:5 (kwas eikozapentaenowy; EPA) i C22:6 (kwas dokozaheksaenowy; DHA), dla których nie istnieją alternatywy roślinne1,2,4,7. Długość łańcucha kwasów tłuszczowych i stopień nasycenia (rozkład) ich nasycenia decyduje również o właściwościach i jakości biopaliw i olejów jadalnych pochodzących z alg4,8.

Aby rozwinąć komercyjne zastosowania kwasów tłuszczowych pochodzących z mikroalg, potrzebne są wiarygodne metody analityczne do ilościowego oznaczania zawartości i składu kwasów tłuszczowych.

Jak również zauważyli Ryckebosch i inni.9, analiza kwasów tłuszczowych w mikroalgach odróżnia się od innych substratów (np. oleju roślinnego, produktów spożywczych, tkanek zwierzęcych itp.), ponieważ: 1) mikroalgi są pojedynczymi komórkami otoczonymi sztywnymi ścianami komórkowymi, co komplikuje ekstrakcję lipidów; 2) Mikroalgi zawierają szeroką gamę klas lipidów, a rozkład klas lipidów jest bardzo zmienny7. Te różne klasy lipidów mają szeroką gamę pod względem struktury chemicznej i właściwości, takich jak polarność. Wytwarzane są również klasy lipidów inne niż lipidy acylowe; 3) Mikroalgi zawierają szeroką gamę kwasów tłuszczowych o długości od 12 do 24 atomów węgla i zawierających zarówno nasycone, jak i wysoce nienasycone kwasy tłuszczowe. W związku z tym metody opracowane do analizy kwasów tłuszczowych w podłożach innych niż mikroalgi mogą nie być odpowiednie do analizy kwasów tłuszczowych w mikroalgach.

Sprawdzone przez Ryckebosch et al.9, główna różnica między powszechnie stosowanymi procedurami ekstrakcji lipidów polega na stosowanych systemach rozpuszczalnikowych. Ze względu na dużą różnorodność klas lipidów obecnych w mikroalgach, z których każda różni się polarnością, wyekstrahowana ilość lipidów będzie się różnić w zależności od użytych rozpuszczalników10-12. Prowadzi to do niespójności w zawartości i składzie lipidów prezentowanych w literaturze9,10. W zależności od zastosowanego systemu rozpuszczalnikowego, metody oparte na ekstrakcji rozpuszczalnikiem bez rozrywania komórek poprzez na przykład ubijanie kulek lub sonikację, mogą nie ekstrahować wszystkich lipidów ze względu na sztywną strukturę niektórych gatunków mikroalg9,13. W przypadku niepełnej ekstrakcji lipidów skuteczność ekstrakcji różnych klas lipidów może się różnić14. Może to mieć również wpływ na mierzony skład kwasów tłuszczowych, ponieważ skład kwasów tłuszczowych jest zmienny w obrębie klas lipidów7.

Nasza metoda opiera się na sekwencji mechanicznego rozbijania komórek, ekstrakcji lipidów na bazie rozpuszczalnika, transestryfikacji kwasów tłuszczowych do estrów metylowych kwasów tłuszczowych (FAME) oraz kwantyfikacji i identyfikacji FAME za pomocą chromatografii gazowej w połączeniu z detektorem płomieniowo-jonizacyjnym (GC-FID). Przed procedurą analityczną dodaje się wzorzec wewnętrzny w postaci triacyloglicerolu (tripentadekanoiny). Ewentualne straty podczas ekstrakcji i niepełna transestryfikacja mogą być następnie skorygowane. Metoda może być stosowana do oznaczania zawartości, a także składu kwasów tłuszczowych obecnych w biomasie mikroglonów. Wszystkie kwasy tłuszczowe obecne w różnych klasach acylolipidów, w tym kwasy tłuszczowe spichrzające (TAG), jak również lipidy błonowe (glikolipidy, fosfolipidy), są wykrywane, identyfikowane i oznaczane ilościowo dokładnie i powtarzalnie za pomocą tej metody przy użyciu tylko niewielkich ilości próbki (5 mg). Metoda ta nie dostarcza informacji na temat względnej obfitości różnych klas lipidów. Jednak metodę można rozszerzyć, aby oddzielić od siebie klasy lipidów1. Stężenie i skład kwasów tłuszczowych w różnych klasach lipidów można następnie określić indywidualnie.

W literaturze opisano kilka innych metod analizy lipidów w mikroalgach. Niektóre metody koncentrują się na całkowitych składnikach lipofilowych15, podczas gdy inne metody koncentrują się na całkowitych kwasach tłuszczowych9,16. Alternatywy te obejmują grawimetryczne oznaczanie całkowitej wyekstrahowanej lipidów, bezpośrednią trans-estryfikację kwasów tłuszczowych połączoną z oznaczaniem ilościowym za pomocą chromatografii oraz barwienie komórek lipofilowymi barwnikami fluorescencyjnymi.

Powszechnie używaną alternatywą dla oznaczania ilościowego kwasów tłuszczowych za pomocą chromatografii jest oznaczanie lipidów za pomocą oznaczenia grawimetrycznego17,18. Zaletą oznaczania grawimetrycznego jest brak wymagań dotyczących zaawansowanego i drogiego sprzętu, takiego jak chromatograf gazowy; łatwość konfiguracji procedury ze względu na dostępność znormalizowanego sprzętu analitycznego (np. Soxhlet); Oznaczanie grawimetryczne jest mniej czasochłonne niż metody oparte na chromatografii. Z drugiej strony główną zaletą stosowania metod opartych na chromatografii jest to, że w takiej metodzie mierzone są tylko kwasy tłuszczowe. W oznaczeniu grawimetrycznym w oznaczeniu uwzględnia się również kwasy beztłuszczowe zawierające lipidy, takie jak pigmenty lub steroidy. Te lipidy zawierające kwasy tłuszczowe mogą stanowić dużą część (>50%) wszystkich lipidów. Jeśli interesuje kogoś tylko zawartość kwasów tłuszczowych (na przykład do zastosowań w biodieslu), zostanie ona przeszacowana, gdy stosuje się oznaczenie grawimetryczne. Ponadto w przypadku oznaczania grawimetrycznego dokładność wagi analitycznej używanej do ważenia wyekstrahowanych lipidów określa wielkość próbki, którą należy zastosować. Ilość ta jest zazwyczaj znacznie większa niż ilość potrzebna, gdy stosowana jest chromatografia. Wreszcie, kolejną zaletą stosowania chromatografii w porównaniu z oznaczaniem grawimetrycznym jest to, że chromatografia dostarcza informacji o składzie kwasów tłuszczowych.

Inną alternatywą dla naszej metody jest bezpośrednia transesteryfikacja16,19,20. W tej metodzie ekstrakcja lipidów i transestryfikacja kwasów tłuszczowych do FAME są połączone w jednym etapie. Ta metoda jest szybsza niż oddzielny etap ekstrakcji i transestryfikacji, ale połączenie tych etapów ogranicza rozpuszczalniki, które można użyć do ekstrakcji. Może to negatywnie wpłynąć na wydajność ekstrakcji. Kolejną zaletą oddzielnego etapu ekstrakcji lipidów i transestryfikacji jest to, że pozwala on na dodatkowe rozdzielenie klas lipidów między tymi etapami1. Nie jest to możliwe, gdy stosowana jest transestryfikacja bezpośrednia.

Inne powszechnie stosowane metody określania zawartości lipidów w mikroalgach obejmują barwienie biomasy lipofilowymi barwnikami fluorescencyjnymi, takimi jak czerwień nilowa lub BODIPY i pomiar sygnału fluorescencji21,22. Zaletą tych metod jest to, że są mniej pracochłonne niż metody alternatywne. Wadą tych metod jest to, że odpowiedź fluorescencyjna jest z różnych powodów zmienna w zależności od gatunku, warunków uprawy, klas lipidów i procedur analitycznych. Na przykład kilka z tych zmian jest spowodowanych różnicami w pobieraniu barwnika przez mikroalgi. W związku z tym konieczna jest kalibracja przy użyciu innej metody ilościowej, najlepiej przeprowadzona dla wszystkich różnych warunków uprawy i etapów wzrostu. Wreszcie, metoda ta nie dostarcza informacji o składzie kwasów tłuszczowych i jest mniej dokładna i odtwarzalna niż metody oparte na chromatografii.

Przedstawiona metoda opiera się na metodzie opisanej przez Lamers et al.23 oraz Santos i wsp.24 i był również stosowany przez różnych innych autorów1,25-27. Dostępne są również inne metody, które opierają się na tych samych zasadach i mogą dostarczyć podobnych wyników9,28.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie próbki

Istnieją dwa alternatywne protokoły przygotowania próbek zawarte w krokach 1.1 i 1.2. Obie metody są równie odpowiednie i dają podobne wyniki, ale jeśli dostępna jest ograniczona ilość kultury glonów, zalecana jest metoda 1.1.

UWAGA: Dla każdego protokołu, przygotuj dwie dodatkowe rurki do ubijania koralików zgodnie z całym protokołem, ale bez dodawania do nich glonów, które będą używane jako półfabrykat. W ten sposób można zidentyfikować i określić ilościowo piki na chromatogramie GC wynikające z ekstrakcji składników z użytych materiałów.

1.1. Protokół przygotowania próbki Opcja 1: Zalecane, gdy dostępna jest ograniczona ilość hodowli glonów

  1. Określić stężenie suchej masy glonów (g/l) w bulionie hodowlanym, na przykład zgodnie z opisem Breuera i wsp.Rozdział 1.
  2. Przenieś objętość bulionu hodowlanego, który zawiera 5-10 mg suchej masy glonów, do szklanej probówki wirówkowej. Obliczyć dokładną ilość przenoszonej biomasy, stosując stężenie biomasy określone w kroku 1.1.1.
  3. Wirować 5 minut przy 1 200 x g.
  4. Odrzucić część supernatantu, pozostawić około 0,25 ml w probówce.
  5. Ponownie zawiesić glony w pozostałym supernatancie, delikatnie pipetując osad w górę i w dół, a następnie przenieść cały osad komórkowy do rurki z ubijakiem do kulek za pomocą pipety o pojemności 200 μl.
  6. Przepłukać probówkę wirówkową i szklaną pipetę ±0,15 ml miliQ wody i przenieść płyn do tej samej probówki do ubijania.
  7. Odwiruj probówki ubijakowe przez jedną minutę przy maksymalnej prędkości obrotowej, aby upewnić się, że na dnie probówek nie pozostały pęcherzyki powietrza. Możliwe jest przechowywanie zamkniętych rur ubijanych do kulek w temperaturze -80 °C.
  8. Liofilizować probówki z ubijakiem do kulek zawierające próbkę. Zamknięte rurki ubijakowe można przechowywać w temperaturze -80 °C.

1.2. Protokół przygotowania próbki Opcja 2

  1. Odwirować nieokreśloną objętość bulionu z hodowli glonów i odrzucić supernatant. Nie jest konieczne określanie stężenia biomasy ani mierzenie użytej objętości.
  2. Zmierzyć lub obliczyć osmolarność pożywki hodowlanej, wykorzystując stężenie głównych soli obecnych w pożywce.
  3. Przepłukać osad komórkowy poprzez ponowne zawieszenie osadu komórkowego w tej samej objętości, jaka została użyta w kroku 1.2.1, roztworu mrówczanu amonu, który jest zbliżony do osmolarności pożywki hodowlanej. Równostopowy roztwór mrówczanu amonu zapobiega lizie komórek podczas mycia komórek.

UWAGA: Mycie komórek jest konieczne, aby usunąć sole obecne w pożywce. Jest to szczególnie ważne w przypadku analizy kwasów tłuszczowych w mikroalgach morskich ze względu na wysokie stężenie soli w ich pożywce. Gdyby sole były nadal obecne, spowodowałoby to przeszacowanie ilości suchej masy komórek, która zostanie określona w dalszej części niniejszego protokołu. Mrówczan amonu służy do mycia komórek, ponieważ roztwór ten całkowicie odparuje podczas liofilizacji i nie pozostawi żadnych pozostałości.

  1. Odwirować zawiesinę glonów i odrzucić supernatant.
  2. Liofilizuj osad komórkowy.
  3. Zważyć 5-10 mg liofilizowanego proszku z mikroalg do rurki z ubijakiem do kulek. Zapisz dokładną wagę.

2. Rozbijanie komórek i ekstrakcja lipidów

UWAGA: Ta sekcja opisuje obszerną procedurę rozbijania komórek. Możliwe, że niektóre etapy rozrywania komórek są zbędne, a mniej rozległe rozrywanie komórek może przynieść takie same wyniki dla niektórych gatunków mikroalg lub dla biomasy pochodzącej z określonych warunków uprawy. Wymagałoby to jednak walidacji dla każdej konkretnej sytuacji. Dlatego proponowany protokół rozległego rozerwania jest zalecany jako uniwersalna metoda odpowiednia dla wszystkich materiałów mikroglonów.

  1. Odważyć dokładną ilość tripentadekanoiny (triacyloglicerolu zawierającego trzy kwasy tłuszczowe C15:0) i dodać ją do dokładnie znanej ilości chloroformu:metanolu w proporcji 4:5. W ten sposób stężenie tripentadekanoiny jest dokładnie znane. Dążyć do stężenia 50 mg/L. Tripentadekanoina służy jako wewnętrzny wzorzec do oznaczania ilościowego kwasów tłuszczowych.
  2. Dodać 1 ml chloroformu:metanolu 4:5 (v/v) zawierającego tripentadekanoinę do każdej probówki do ubijania (określonej w tabeli odczynników i sprzętu). Sprawdź, czy w nasadce rurki ubijaka nie pozostały żadne koraliki, spowoduje to wyciek rurek. Użyj pipety wyporowej do dokładnego dodawania rozpuszczalników.
  3. Koralik uderzał w rurki bijakowe 8x przy 2,500 obr./min przez 60 sekund, za każdym razem z 120-sekundową wewnętrzną przerwą między każdym dudnieniem.
  4. Przenieś roztwór z probówek do ubijania kulek do czystej, żaroodpornej szklanej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml z zakrętkami teflonowymi. Pamiętaj, aby przenieść wszystkie koraliki z rurki ubijacza do koralików.
  5. Aby umyć probówkę z ubijakiem do kulek, dodać 1 ml chloroformu:metanolu 4:5 (v/v) zawierającego tripentadekanoninę do ubijania kulek, zamknąć nakrętkę i wymieszać, a następnie przenieść ten roztwór do tej samej szklanej probówki z kroku 2.4. Przemyć probówkę trzy razy (w sumie na próbkę stosuje się 4 ml chloroformu: metanolu 4:5 (v/v) zawierającego tripentadekanoinę - 1 ml dodaje się w kroku 2.2 i 3 ml w 3 etapach przemywania ).
  6. Wirować szklane rurki przez 5 sekund i sonikować w kąpieli sonikacyjnej przez 10 minut.
  7. Dodać 2,5 ml wody MilliQ, zawierającej 50 mM 2-amino-2-hydroksymetylo-propano-1,3-diolu (Tris) i 1 M NaCl, którą ustawia się na pH 7 przy użyciu roztworu HCl. Spowoduje to rozdzielenie faz między chloroformem a metanolem: woda. 1 M NaCl służy do poprawy równowagi lipidów w kierunku fazy chloroformowej.
  8. Wiruj przez 5 sekund, a następnie sonikuj przez 10 minut.
  9. Wirować przez 5 minut przy 1 200 x g.
  10. Przenieść całą fazę chloroformu (faza dolna) do czystej szklanej probówki za pomocą szklanej pipety Pasteura. Upewnij się, że nie przenosisz żadnej fazy międzyfazowej ani górnej.
  11. Ponownie wyekstrahować próbkę, dodając 1 ml chloroformu do starej probówki (zawierającej roztwór metanol:woda).
  12. Wiruj przez 5 sekund, a następnie sonikuj przez 10 minut.
  13. Wirować przez 5 minut przy 1 200 x g.
  14. Zebrać fazę chloroformową (faza dolna) za pomocą szklanej pipety Pasteura i połączyć ją z pierwszą frakcją chloroformu z kroku 2.10.
  15. Jeśli wystąpią trudności z zebraniem całej frakcji chloroformu w poprzednim kroku, powtórz kroki 2.11-2.14. W przeciwnym razie przejdź do kroku 2.16.
  16. Odparować chloroform z probówki w strumieniu azotu gazowego. Po tym etapie próbki mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C w atmosferze azotu gazowego.

3. Transestryfikacja do estrów metylowych kwasów tłuszczowych

  1. Dodać 3 ml metanolu zawierającego 5% (v/v) kwasu siarkowego do probówki zawierającej wysuszone wyekstrahowane lipidy (probówka pierwotnie zawierająca frakcję chloroformową) i szczelnie zamknąć probówkę.
  2. Wiruj przez 5 sekund.
  3. Inkubować próbki przez 3 godziny w temperaturze 70 °C w bryle grzewczej lub łaźni wodnej. Okresowo (co ±30 min) upewnij się, że próbki nie wrzą (spowodowane nieprawidłowo zamkniętą pokrywką) i rurki wirowe. Podczas tej reakcji kwasy tłuszczowe są metylowane do estrów metylowych kwasów tłuszczowych (FAME).
  4. Schłodzić próbki do temperatury pokojowej i dodać 3 ml wody MilliQ i 3 ml n-heksanu.
  5. Wiruj przez 5 sekund i mieszaj przez 15 minut za pomocą rotatora do probówek.
  6. Wirować przez 5 minut przy 1 200 x g.
  7. Zebrać 2 ml fazy heksanowej (górnej) i umieścić w świeżej szklanej probówce za pomocą szklanej pipety Pasteura.
  8. Dodaj 2 ml wody MilliQ do zebranej fazy heksanu, aby ją przepłukać.
  9. Wirować przez 5 sekund i wirować przez 5 minut przy 1 200 x g. Po tym etapie możliwe jest przechowywanie próbek w temperaturze -20 °C w atmosferze azotu gazowego (separacja faz nie jest konieczna).

4. Kwantyfikacja FAME za pomocą chromatografii gazowej

  1. Napełnij fiolki GC fazą heksanową (faza górna) za pomocą szklanej pipety Pasteura.
  2. Umieścić nakrętki na fiolkach GC. Upewnij się, że nakrętki są całkowicie zamknięte i nie można ich przekręcić, aby zapobiec parowaniu z fiolki.
  3. Uzupełnij rozpuszczalniki do płukania GC (heksan), opróżnij fiolki z odpadami i umieść fiolki z próbkami w automatycznym próbniku. Przed uruchomieniem rzeczywistych próbek na GC należy najpierw uruchomić 2 ślepe próby zawierające tylko heksan na GC.
  4. Próbki należy umieścić na GC-FID z kolumną Nukol (30 m x 0,53 mm x 1,0 μm). Stosować temperaturę wlotową 250 °C i hel jako gaz nośny, ciśnienie 81,7 kPa i współczynnik podziału 0,1:1, całkowite natężenie przepływu: 20 ml/min. Temperatura detektora FID wynosi 270 °C przy natężeniu przepływu H2 40 ml/min, natężeniu przepływu powietrza 400 ml/min i natężeniu przepływu He 9,3 ml/min. Ustawić objętość iniekcji na 1 μl/próbkę. Wtryskiwacz przed i po myciu z n-heksanem. Początkową temperaturę pieca ustawia się na 90 °C na 0,5 minuty, a następnie zwiększa o 20 °C/min, aż do osiągnięcia temperatury piekarnika 200 °C. Następnie temperatura pieca jest utrzymywana na poziomie 200 °C przez 39 minut. Całkowity czas trwania to 45 min.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Typowy chromatogram uzyskany za pomocą tej metody przedstawiono na Rysunku 1. FAME są rozdzielane przez kolumnę GC oraz zastosowany protokół według wielkości i stopnia nasycenia. Krótsze łańcuchy kwasów tłuszczowych oraz kwasy tłuszczowe bardziej nasycone (z mniejszą liczbą wiązań podwójnych) charakteryzują się krótszymi czasami retencji. Zastosowana kolumna GC i protokół nie mają na celu rozdzielenia izomerów kwasów tłuszczowych (o tej samej długości łańcucha i stopniu nasycenia, ale różnych pozycjach w...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisana metoda może być wykorzystana do oznaczenia zawartości, a także składu kwasów tłuszczowych ogółem obecnych w biomasie mikroglonów. Wykrywane są kwasy tłuszczowe pochodzące ze wszystkich klas lipidów, w tym tłuszcze magazynujące (TAG), a także lipidy błonowe (fosfolipidy i glikolipidy). Można wykryć i rozróżnić wszystkie długości łańcuchów kwasów tłuszczowych i stopnie nasycenia, które są obecne w mikroalgach. Metoda opiera się na mechanicznym rozbijaniu komórek, ekstrakcji lipidów na bazie rozpuszczalników, transe...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Część tej pracy była wspierana finansowo przez Instytut Promocji Innowacji przez Naukę i Technologię - projekt Strategiczne Badania Podstawowe (IWT-SBO) Światło słoneczne i ogniwa biosłoneczne. Erik Bolder i BackKim Nguyen zostali docenieni za swój wkład w optymalizację procedury ubijania ściegu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
tripentadekanoina (C15:0 TAG)Sigma AldrichT4257Numer CAS 7370-46-9
TAG lub FAME standardy wszystkich kwasów tłuszczowych oczekiwanych w próbceSigma Aldrich
TAG lub standardy FAME wszystkich kwasów tłuszczowych oczekiwanych w próbceLipidox
TAG lub standardy FAME wszystkich kwasów tłuszczowych oczekiwanych w próbceLarodan
BeadbeaterBertin TechnologiesPrecellys 24
rurki do ubijania koralikówMP BiomedicalsMatryca lizująca E
116914500
GC-FIDHewlett-PackerHP6871
GC kolumnaSupelcoNukol 25357
Pipeta wyporowa 100-1000μ lMETTLERTOLEDO MR-1000
C-1000 Końcówki do pipetMettler ToledoC-1000
pompa Pipetvuller, pompa Pi-Pump 2 mlRurki szklane VWR612-1925
VWRSCERE5100160011G1
RURKA 16 X 100 MM BOROKRZEMIAN 5,1 1 * 1.000VWRSCERE5100160011G1
nakrętkipowlekane teflonemRotatorSCERKSSR15415BY10
STUART SCIENTIFIC SB2VWR445-2101
Podgrzewany parownik/koncentratorCole-ParmerYO-28690-25
Końcówki do pipet wyporowych , probówek VWR

Bibliografia

  1. Breuer, G., Lamers, P. P., Martens, D. E., Draaisma, R. B., Wijffels, R. H. The impact of nitrogen starvation on the dynamics of triacylglycerol accumulation in nine microalgae strains. Bioresource Technology. 124, 217-226 (2012).
  2. Hu, Q., Sommerfeld, M., et al. Microalgal triacylglycerols as feedstocks for biofuel production: perspectives and advances. The Plant Journal. 54 (4), 621-639 (2008).
  3. Chisti, Y. Biodiesel from microalgae. Biotechnology Advances. 25 (3), 294-306 (2007).
  4. Draaisma, R. B., Wijffels, R. H., et al. Food commodities from microalgae. Curr. Opin. Biotechnol. 24 (2), 169-177 (2012).
  5. Wijffels, R. H., Barbosa, M. J. An outlook on microalgal biofuels. Science. 329 (5993), 796-799 (2010).
  6. Wijffels, R. H., Barbosa, M. J., Eppink, M. H. M. Microalgae for the production of bulk chemicals and biofuels. Biofuels, Bioprod. Bioref. 4 (3), 287-295 (2010).
  7. Guschina, I. A., Harwood, J. L. Lipids and lipid metabolism in eukaryotic algae. Progress in Lipid Research. 45 (2), 160-186 (2006).
  8. Schenk, P. M., Thomas-Hall, S. R., et al. Second Generation Biofuels: High-Efficiency Microalgae for Biodiesel Production. BioEnergy Research. 1 (1), 20-43 (2008).
  9. Ryckebosch, E., Muylaert, K., Foubert, I. Optimization of an Analytical Procedure for Extraction of Lipids from Microalgae. Journal of the American Oil Chemists' Society. 89 (2), 189-198 (2011).
  10. Laurens, L. M. L., Dempster, T. A., et al. Algal Biomass Constituent Analysis: Method Uncertainties and Investigation of the Underlying Measuring Chemistries. Analytical Chemistry. 84 (4), 1879-1887 (2012).
  11. Iverson, S. J., Lang, S. L. C., Cooper, M. H. Comparison of the bligh and dyer and folch methods for total lipid determination in a broad range of marine tissue. Lipids. 36 (11), 1283-1287 (2001).
  12. Grima, E. M., Medina, A. R., et al. Comparison Between Extraction of Lipids and Fatty Acids from microalgal biomass. JAOCS. 71 (9), 955-959 (1994).
  13. Lee, J. Y., Yoo, C., Jun, S. Y., Ahn, C. Y., Oh, H. M. Comparison of several methods for effective lipid extraction from microalgae. Bioresour Technol. 101, Suppl 1 ement. 75-77 (2010).
  14. Guckert, J. B., Cooksey, K. E., Jackson, L. L. lipid solvent systems are not equivalent for analysis of lipid classes in the micro eukaryotic green alga. Journal of Microbiological Methods. 8, 139-149 (1988).
  15. Pruvost, J., Van Vooren, G., Cogne, G., Legrand, J. Investigation of biomass and lipids production with Neochloris oleoabundans in photobioreactor. Bioresource Technology. 100 (23), 5988-5995 (2009).
  16. Griffiths, M. J., Hille, R. P., Harrison, S. T. L. Selection of Direct Transesterification as the Preferred Method for Assay of Fatty Acid Content of Microalgae. 45 (11), 1053-1060 (2010).
  17. Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. S. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. J Biol. Chem. 226, 497-509 (1956).
  18. Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian Journal of Biochemistry and Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).
  19. Lepage, G., Roy, C. C. Improved recovery of fatty acid through direct transesterification without prior extraction or purification. Journal of Lipid research. 25, 1391-1396 (1984).
  20. Welch, R. W. A micro-method for the estimation of oil content and composition in seed crops. J. Sci. Food Agric. 28 (7), 635-638 (1002).
  21. Chen, W., Zhang, C., Song, L., Sommerfeld, M., Hu, Q. A high throughput Nile red method for quantitative measurement of neutral lipids in microalgae. Journal of Microbiological Methods. 77 (1), 41-47 (2009).
  22. Cooper, M. S., Hardin, W. R., Petersen, T. W., Cattolico, R. A. Visualizing "green oil" in live algal cells. Journal of Bioscience and Bioengineering. 109 (2), 198-201 (2010).
  23. Lamers, P. P., van de Laak, C. C., et al. Carotenoid and fatty acid metabolism in light-stressed Dunaliella salina. Biotechnology and Bioengineering. 106 (4), 638-648 (2010).
  24. Santos, A. M., Janssen, M., Lamers, P. P., Evers, W. A., Wijffels, R. H. Growth of oil accumulating microalga Neochloris oleoabundans under alkaline-saline conditions. Bioresour Technol. 104, 593-599 (2012).
  25. Mulders, K. J. M., Weesepoel, Y., et al. Growth and pigment accumulation in nutrient-depleted Isochrysis aff. galbana T-ISO. J. Appl. Phycol. , (2012).
  26. Kliphuis, A. M., Klok, A. J., et al. Metabolic modeling of Chlamydomonas reinhardtii: energy requirements for photoautotrophic growth and maintenance. J. Appl. Phycol. 24 (2), 253-266 (2012).
  27. Lamers, P. P., Janssen, M., De Vos, R. C. H., Bino, R. J., Wijffels, R. H. Carotenoid and fatty acid metabolism in nitrogen-starved Dunaliella salina, a unicellular green microalga. Journal of Biotechnology. 162 (1), 21-27 (2012).
  28. Wang, Z., Benning, C. Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography (TLC) Coupled with Gas-Liquid Chromatography (GLC). J. Vis. Exp. (49), e2518(2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Analiza kwas w t uszczowychbiomasa mikroalgekstrakcja lipid wchromatografia gazowaestry metylowe kwas w t uszczowychtransestryfikacjarozbijanie kom rekekstrakcja rozpuszczalnikowag odzenie azotowetripentadekanoina

Powiązane artykuły