Ten artykuł opisuje trzy preparaty układu nerwowego za pomocą pijawek: wewnątrzkomórkowy zapis z neuronów w brzusznych zwojach, hodowlę neuronów z brzusznych zwojów oraz zapis z plamy unerwionej skóry do mapowania pól czuciowych.
Artykuł metodologiczny
Zapis wewnątrzkomórkowy, mapowanie pola sensorycznego i hodowla zidentyfikowanych neuronów w pijawce, Hirudo medicinalis
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Pijawka słodkowodna, Hirudo medicinalis, jest wszechstronnym organizmem modelowym, który był używany do rozwiązywania problemów naukowych w dziedzinie neurofizjologii, neuroetologii i biologii rozwojowej. Celem tego raportu jest konsolidacja technik eksperymentalnych z układu pijawek w jednym artykule, który będzie przydatny dla fizjologów posiadających doświadczenie w innych preparatach układu nerwowego lub dla studentów biologii z niewielkim lub żadnym doświadczeniem w elektrofizjologii. Pokazujemy, jak przeanalizować pijawkę w celu rejestracji wewnątrzkomórkowej ze zidentyfikowanych obwodów nerwowych w zwoju. Następnie pokazujemy, w jaki sposób pojedyncze komórki o znanej funkcji mogą zostać usunięte ze zwoju w celu hodowli na szalce Petriego i jak rejestrować z tych neuronów w hodowli. Następnie pokazujemy, jak przygotować fragment unerwionej skóry, który zostanie wykorzystany do mapowania pól czuciowych lub motorycznych. Te preparaty pijawek są nadal szeroko stosowane w leczeniu podstawowych właściwości elektrycznych sieci neuronowych, zachowania, synaptogenezy i rozwoju. Są również odpowiednim modułem szkoleniowym dla laboratoriów dydaktycznych neuronauki lub fizjologii.
Wprowadzenie
Preparat na pijawkę jest przydatny do badania funkcji identyfikowalnych (czuciowych, motorycznych i międzyneuronalnych) w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) zwierzęcia. Użyteczną właściwością neuronów pijawek jest to, że kształt ich potencjałów czynnościowych i właściwości biofizyczne są charakterystyczne dla danego typu komórki (tj. P, N, T, Rz). Co więcej, neurony mogą zostać pobrane od zwierzęcia i hodowane w odpowiednim podłożu, w którym komórki zachowują swoje właściwości elektryczne nawet przez 45 dni1,2.
Niewątpliwą zaletą ganglionu pijawki dla nauki wykonywania zapisów elektrofizjologicznych jest to, że komórki są charakterystycznie i niezawodnie ułożone w ganglion w sposób, który pozwala na identyfikację różnych typów komórek od ganglionu do ganglionu i od zwierzęcia do zwierzęcia. Unikalna lokalizacja i morfologia neuronów w zwojach pijawek zostały zauważone przez Retziusa już w 1891roku3. Wiedza o tożsamości i funkcji neuronu jest korzystna dla badania obwodów neuronalnych i przeprowadzania eksperymentów na danym typie komórki. Ze względu na stosunkowo duże somaty neuronów w zwoju, są one widoczne pod mikroskopem preparacyjnym, a somaty mogą być selektywnie nabijane mikroelektrodami w celu rejestrowania ich właściwości elektrycznych.
Barwniki i duże cząsteczki mogą być wstrzykiwane do pojedynczych komórek, a właściwości kanałów badane za pomocą zacisku krosowego. Prądy jonowe, które powodują powstawanie różnych kształtów charakterystycznych potencjałów czynnościowych w różnych neuronach, zostały zidentyfikowane4-7. Na podstawie badań nad wzorcem unerwienia i rozgałęziania się poszczególnych neuronów w obrębie OUN, połączenia synaptyczne zostały odtworzone w kulturze ze zidentyfikowanymi neuronami2,8. Badania w zwojach pijawek dostarczyły informacji na temat rozwoju obwodów funkcjonalnych, które można mierzyć za pomocą elektrofizjologii, a także badań nad zachowaniem całych zwierząt. Ośrodkowy układ nerwowy pijawki służył również jako cenny preparat do badania mechanizmów związanych z naprawą i regeneracją neuronów u całego zwierzęcia i w hodowli4-6,9-12.
W mózgach ssaków jest trudnym zadaniem wyjaśnienie zachowania pod kątem właściwości i połączeń poszczególnych zidentyfikowanych neuronów. W zasadzie można mieć nadzieję, że badania nad mniej złożonymi układami, takimi jak pijawka, mogą pomóc w zdefiniowaniu podstawowych mechanizmów stosowanych u zwierząt wyższych. Używane połączenia, które leżą u podstaw wzorca pływania13,14 i rytmiczności serca15, zostały dobrze scharakteryzowane u pijawki. Zdolność niektórych neuronów pijawek do tworzenia zarówno elektrycznej, jak i chemicznej komunikacji jest intrygująca. Niektóre połączenia są dwukierunkowe, podczas gdy inne są jednokierunkowe chemicznie, ale dwukierunkowe elektrycznie7. Zrozumienie połączeń synaptycznych w organizmie zwierzęcia, a także odtworzenie tego samego typu połączeń w naczyniu hodowlanym to potężne narzędzia do badania synaptogenezy16-18, a także profilowania farmakologicznego synaps19. Opisane tutaj techniki zapisu i stymulacji wewnątrzkomórkowej stanowią podstawę dla testów farmakologicznych i badań w zakresie neuroetologii i rozwoju.
Ponadto, segmentalny brzuszny rdzeń nerwowy może być wycięty za pomocą fragmentu unerwionej skóry. Dzięki zdolności do utrzymywania przy życiu fragmentu skóry i neuronów, sensoryczne pola recepcyjne mogą być badane poprzez rejestrowanie sygnałów elektrycznych z ciała komórki (tj. somy) neuronów czuciowych w odpowiednim zwoju brzusznym w OUN. W ten sposób można ocenić wrażliwość zakończeń czuciowych, przykładając różny stopień siły do skóry i mapując pola recepcyjne: lekki dotyk, nacisk i szkodliwe (bolesne) bodźce20,21.
Zaletą tego preparatu na skórę ganglionu pijawki jest to, że można narysować anatomicznie mapę pola recepcyjnego i prześledzić procesy neuronalne do zidentyfikowanego neuronu, gdy reakcje elektryczne są rejestrowane. Trzy opisane poniżej eksperymenty z pijawkami mogą być wykonywane wielokrotnie za pomocą jednej próbki, co sprawia, że jest to opłacalny moduł dydaktyczny dla laboratoriów akademickich.
Protokół
1. Przygotowanie elektrod i roztworu soli fizjologicznej
- Przygotuj sól fizjologiczną i elektrody przed sekcją zwierzęcia. Roztwór Leech Ringer składa się z następujących składników: 115,3 mM NaCl, 1,8 mM CaCl2, 4,0 mM KCl, 10 mM Tris/kwas maleinowy lub HEPES. Dostosować pH do 7,4.
- Przygotuj drut Ag-Cl, zanurzając oczyszczony srebrny drut w niewielkiej ilości wybielacza na 20 minut lub do momentu, gdy drut będzie miał gładkie ciemnoszare wykończenie. Przed użyciem umyj drut wodą destylowaną. Następnie umieść przewód w uchwycie na mikropipety, który podłącza się do amplifier.
- Przygotuj ostrą szklaną elektrodę ze szkła borokrzemianowego za pomocą ściągacza do pipet. Rezystancja elektrody powinna być rzędu 20 MΩ.
- Napełnij pipetę 3 M roztworem octanu potasu i włóż do uchwytu na mikropipety.
- W przypadku elektrody zewnątrzkomórkowej przygotuj ostrą szklaną pipetę, jak opisano powyżej, odłam końcówkę, pocierając kolejną ostrą pipetę w pobliżu ostrej krawędzi. Następnie wypoleruj końcówkę, aby nie rozerwała łączników. Plastikowe elektrody zewnątrzkomórkowe będą również działać, o ile będzie dobry kontakt między elektrodą a nerwem.
- Włożyć zewnątrzkomórkową elektrodę rejestrującą do uchwytu na mikropipety (z drutem Ag-Cl), który jest wyposażony w gumową rurkę i strzykawkę do odsysania. Za pomocą strzykawki wciągnij sól fizjologiczną do elektrody co najmniej do poziomu srebrnego drutu.
- Skonfiguruj parametry nagrywania sprzętowego (wzmacniacz i izolator bodźców) oraz programowego, postępując zgodnie z instrukcją obsługi konkretnego urządzenia rejestrującego sygnał. Patrz Leksrisawat et al.22, aby wyświetlić szczegółowe informacje na temat sprzętu używanego w eksperymentach opisanych poniżej.
2. Rozwarstwienie zwoju brzusznego
- Rozetnij pijawkę w dużym naczyniu wyłożonym elastomerem silikonowym roztworem Ringera pijawki. Jeśli zwierzę jest rozciągnięte wzdłużnie, łatwiej będzie usunąć brzuszny rdzeń nerwowy (patrz rysunek 1A).
- Za pomocą skalpela w rozmiarze #10 lub #11 wykonaj podłużne nacięcie z bardzo płytkimi nacięciami w brzusznej linii środkowej. Mniej więcej środkowa 2/3 cięcia brzusznego jest pokazana na rysunku 1B. Staraj się nie przecinać czarnej pończochy (brzusznej zatoki krwi), dopóki zwierzę nie zostanie całkowicie otwarte, a zatoka krwi nie zostanie rozciągnięta bez załamań. Ta zatoka krwi biegnie wzdłuż zwierzęcia wzdłuż brzusznej linii środkowej. VNC jest zawarty w tym naczyniu krwionośnym.
- Po przecięciu skóry na całej długości zwierzęcia użyj cienkich nożyczek do tęczówki, aby naciąć zatokę krwi (ryc. 2). Wsuń jedno ostrze cienkich nożyczek tęczówkowych pod zatokę i lekko podnieś ostrze, aby oddzielić je od tkanki nerwowej. Przetnij zatokę na całej długości VNC, unikając korzeni nerwowych, nerwów segmentowych lub łączników między zwojami.
- Następnie usuń część brzusznego rdzenia nerwowego, przecinając korzenie dystalnie do miejsca, w którym naczynie krwionośne łączy się z korzeniami. Powtórz ten proces dla każdego zwoju wzdłuż długości brzusznego rdzenia nerwowego.
- Przenieś segment jednego lub dwóch zwojów nerwowych na mniejszą szalkę Petriego. Zwoje lub pojedynczy zwój musi być napięty z pewnym luzem.
- Przypnij łączniki i korzenie tak, aby osłonka glejowa zwoju była lekko rozciągnięta, aby zapobiec przemieszczaniu się ciał komórek neuronalnych podczas przebijania przez osłonkę glejową do neuronu będącego przedmiotem zainteresowania. Szpilki należy umieścić w czarnej zatoce dla korzeni i pośrodku dwóch łączników, aby zminimalizować uszkodzenie aksonów (ryc. 3).
- Umieść szalkę Petriego z preparatem pod mikroskopem i zabezpiecz ją woskiem na dnie naczynia, aby zapobiec przemieszczaniu się.
- Ostrożnie skoncentruj wiązkę światła za pomocą lustra i kondensatora światła, aby zobaczyć neurony, jak na rysunku 4A (schematycznie pokazanym na rysunku 4B). Zwróć uwagę na dwie duże komórki Retziusa w środku zwoju.
- Aby dokonać wewnątrzkomórkowego zapisu neuronów Rz, T, P i N, ostrożnie umieść końcówkę elektrody nad interesującą komórką i delikatnie opuść końcówkę, aż pojawi się wgłębienie w osłonce glejowej.
- Postukaj w uchwyt elektrody lub manipulator (bardzo ostrożnie), aby końcówka elektrody "wyskoczyła" w interesujące Cię ogniwo.
- Wstrzyknij krótkie impulsy (30-40 ms) prądu dodatniego (1-10 nA) do ogniwa, aby wywołać potencjały czynnościowe.
3. Hodowla neuronów z preparatu zwoju brzusznego
- Przypnij zwoje brzuszne stroną do góry w czystym naczyniu zawierającym L-15 z płodową surowicą cielęcą (FCS) (ryc. 3). Przypnij korzenie tak, aby zwoje były lekko rozciągnięte, jak to zrobiono powyżej w przypadku nagrań wewnątrzkomórkowych. Cienkimi nożyczkami naciąć kapsułkę glejową na jednym końcu, wsunąć jedno ostrze nożyczek pod kapsułkę, a następnie przeciąć kapsułkę glejową, jak pokazano na rysunku 5A.
- Dodać 100 μl porcji kolagenazy/dypazy do naczynia i umieścić na shakerze na 15 minut. Zbadaj komórki, przesuwając pożywkę hodowlaną wokół odsłoniętych ciał komórkowych. Włóż komórki z powrotem do wytrząsarki na kolejne 15 minut lub dłużej, aż komórki wyjdą z minimalnym odsysaniem.
- Użyj pipety dołączonej do strzykawki, aby delikatnie pobrać komórki ze zwoju. Wypoleruj końcówkę pipety tak, aby była nieco większa niż średnica korpusu kuwety. W przypadku komórek Rz w dorosłej pijawce średnica powinna wynosić około 50 μm.
- Przygotuj różne pipety o różnych średnicach bez filamentu, ponieważ zmniejsza to ryzyko utknięcia komórek w pipecie. Pipety należy przechowywać w butelce zawierającej 80% etanolu (EtOH) za pomocą wacika umieszczonego na dnie, aby chronić końcówki przed odpryskami. Należy pamiętać, aby przed aspiracją komórek wypłukać EtOH z pipety pożywką.
- Po poddaniu działaniu enzymu należy przepłukać pożywkę zawierającą enzym preparatem L-15 (z FCS) 2x. Zidentyfikuj interesujące nas komórki i delikatnie wciągnij je do pipety, pociągając za strzykawkę (ryc. 6A). Odessane komórki należy rozładować do innego naczynia zawierającego L-15 (z FCS).
- Do tej pory wszystkie zabiegi były niesterylne. Wykonaj następujące czynności w sterylnym kapturze. Umieść 3-4 duże krople sterylnego L-15 (z FCS) w różnych miejscach wewnątrz sterylnej szalki Petriego.
- Odpipetuj komórki do jednej z wyżej wymienionych kropli, wdmuchując je w kroplę, aby je umyć. Powtórz to szeregowo w 3 lub 4 kroplach podłoża.
- Umieść komórki na czystej szalce Petriego wypełnionej L-15 (z FCS).
- Inkubuj komórki przez 1-24 godziny w temperaturze pokojowej. Następnie czyste komórki można platerować. Pozostawiając komórki na kilka godzin lub na noc, macierz zewnątrzkomórkowa łatwo odpada. Natychmiast plateruj komórki, aby generować dłuższe procesy.
- Użyj sterylnego podłoża do pokrycia naczynia z mikrostudzienką i pozostaw do całkowitego wyschnięcia (na noc) przed eksperymentami hodowlanymi.
- Po pokryciu naczynia należy je delikatnie umyć sterylną wodą, a następnie niewielką ilością pożywki L-15. Pamiętaj, aby użyć roztworu L-15 bez dodatku FCS, aby komórki mogły przylgnąć do naczynia. Pożywkę można delikatnie zmienić na L-15 z FCS po przyklejeniu się komórek do podłoża. Jeśli ogniwa mają być użyte kilka godzin po posiewie, zmiana pożywki na L-15 z FCS nie jest konieczna.
- Umieść komórki obok siebie w czasie posiewu, aby wywołać szybką synaptogenezę (ryc. 6B). Po 24 godzinach zmierz aktywność fizjologiczną w parach neuronów.
- Użyj wewnątrzkomórkowych technik elektrofizjologicznych, aby zarejestrować RP lub odpowiedzi synaptyczne w hodowanych parach komórek (stymuluj 1 neuron przez elektrodę wewnątrzkomórkową i rejestruj odpowiedzi ze sparowanej komórki za pomocą 2. elektrody wewnątrzkomórkowej).
4. Przygotowanie ściany ciała ganglionu
- Przypnij pijawkę grzbietową do dołu w naczyniu wyłożonym elastomerem, jak opisano powyżej.
- Przypnij skórę z jednej strony z korzeniami po drugiej stronie odciętego zwoju (ryc. 7A, powiększone na ryc. 7B) lub zrób okno na brzusznym aspekcie pijawki nad ganglionem (ryc. 7C) z nienaruszonymi wszystkimi korzeniami do ściany ciała.
- Po uzyskaniu stabilnego zapisu wewnątrzkomórkowego w jednej z komórek czuciowych (T, P, N) użyj małego szklanego pręta, który został wypolerowany ogniowo, aby delikatnie dotknąć skóry w tym samym segmencie. Jeśli neuron, z którego nagrywany, jest komórką N, konieczne będzie zastosowanie większego nacisku na skórę. W większości przypadków komórka N zareaguje tylko wtedy, gdy skóra zostanie uszczypnięta pęsetą. Z tego powodu komórki te powinny być testowane na końcu, ponieważ można uszkodzić skórę lub przemieścić kodowanie wewnątrzkomórkowe poprzez zakłócenie preparatu w taki sposób.
- Powinno być w stanie szybko naszkicować skórę i ganglion z detalami na tyle szczegółowymi, że mapa miejsca, w którym się dotyka, może być wykorzystana do określenia pola recepcyjnego dla konkretnego neuronu. Po nagraniu z jak największej liczby komórek T i P po obu stronach zwoju, wypróbuj komórki N.
- W celu zbadania, czy neurony czuciowe mają procesy, które przemieszczają się przez łączniki w sposób rostralny lub ogonowy, a następnie wychodzą korzenie w sąsiednim segmencie do skóry, można przeciąć łączniki między zwojami i ponownie zbadać pola recepcyjne pod kątem rozprzestrzeniania się detekcji. Zasadniczo bada się, czy nie nastąpiła jakakolwiek strata w polu recepcyjnym.
5. Wstrzykiwanie barwników fluorescencyjnych
- Przygotuj ganglion pijawki, jak opisano powyżej.
- Napełnij mikroelektrodę roztworem Lucifer yellow-CH (3,0%) i chlorku litu (300 mM).
- Wbij jedną z komórek czuciowych lub komórek Rz po brzusznej stronie zwoju, jak opisano powyżej.
- Wstrzyknij barwnik do ogniwa, przepuszczając prąd ujemny (3nA) przez elektrodę przez 15 minut. Ustaw czas trwania impulsu na 100 ms, a częstotliwość na 2 Hz.
- Wizualizuj neurony wypełnione barwnikiem, pobudzając barwnik za pomocą lampy rtęciowej i zestawu filtrów FITC/GFP.
Wyniki
Rejestracje wewnątrzkomórkowe z neuronów sensorycznych w zwoju pijawki charakteryzują się wyraźnymi przebiegami napięcie-czas, przedstawionymi na Rysunku 4C. Potencjał spoczynkowy błony komórkowej w zdrowych komórkach zwoju pijawki wynosi od -45 do -60 mV. Jeśli potencjały są niższe (mniej ujemne), należy wymienić elektrodę szklaną, a jeśli potencjał nadal pozostaje niski, przejść do innego segmentu sznura nerwowego. Spontaniczne potencjały czynnościowe o małej amplitudzie mogą wskazywać na to, że elektroda znajduje się w neuronie ruchowym. Jeśli dzieje się to w obrębie zwoju i ściany ciała, można zastosować iniekcję prądu, aby ustalić, czy neuron unerwia którykolwiek z mięśni wciąż przytwierdzonych do skóry. Neuron ruchowy mięśnia prostownika pierścienia (AE) znajduje się po brzusznej stronie zwoju (Rysunek 4B) i powoduje unoszenie się pierścieni (grzbietów lub segmentów) poprzez aktywację mięśnia prostownika pierścienia.
Wstrzykiwanie prądu do komórek sensorycznych powinno wywołać potencjały czynnościowe o charakterystycznych kształtach przebiegu pokazanych na Rysunku 4C. Jeśli przebiegi wyglądają inaczej, może to wynikać z niezbalansowanego mostka lub błędnej kompensacji pojemności offsetowej. W celu uzyskania szczegółowych informacji na temat sposobu balansowania mostka wewnątrz komórki należy zapoznać się z instrukcją obsługi jednostki akwizycji sygnałów. Zwróć uwagę na artefakty stymulacyjne na początku i na końcu impulsów prądowych na Rysunku 4C. Tak właśnie wyglądają artefakty, gdy mostek jest zbalansowany.
Pierwotne hodowle neuronów z zwoju pijawki tworzą w naczyniu synapsy elektryczne i chemiczne. Początkowo właściwości elektryczne hodowanych komórek nie są identyczne z tymi obserwowanymi in vivo. Jednak po kilku dniach impulsy są niemal nieodróżnialne od tych rejestrowanych w zwoju. Zostało to zademonstrowane na Rysunku 6C na przykładzie pary komórek Rz. Po 7 h hodowli amplituda potencjałów synaptycznych wynosiła 1-2 mV. Po 56 h hodowli potencjały synaptyczne były większe niż 10 mV (górne ślady na Rysunku 6C). Kształt potencjału czynnościowego ulega również zmianie po 56 h hodowli. W opisanych warunkach komórki te pozostają żywotne przez kilka dni.
Komunikację międzykomórkową można zademonstrować poprzez stymulację korzeni nerwowych lub połączeń i rejestrację sygnałów z neuronów w zwoju. Stymulacja tych nerwów generuje silne potencjały synaptyczne i potencjały czynnościowe w różnych komórkach zwoju. Przebiegi na Rysunku 8B zostały zarejestrowane z komórki Retziusa w zwoju, który został usunięty z organizmu i unieruchomiony szpilkami w naczyniu. Czarny przebieg został wywołany bodźcem podprogowym przyłożonym przez elektrodę zewnątrzkomórkową do połączenia. Zwiększenie napięcia bodźca spowodowało wygenerowanie przez komórkę potencjału czynnościowego (przebieg czerwony). W celu zbadania morfologii tych komórek można wstrzyknąć do nich barwniki fluorescencyjne lub peroksydazę chrzanową. Żółć lucyferowa została wstrzyknięta do neuronu Rz poprzez przepływ prądu ujemnego przez elektrodę. Alternatywną metodą jest wstrzykiwanie barwnika za pomocą krótkich impulsów ciśnienia powietrza. Rysunek 9A przedstawia barwnik krótko po rozpoczęciu iniekcji. Trzydzieści minut później barwnik zdążył już zdyfundować do korzeni nerwowych (Rysunek 9B). Wybór rodzaju barwnika zależy od zastosowania, np. barwniki o niskiej masie cząsteczkowej, które mogą przenikać przez połączenia szczelinowe, są wykorzystywane do identyfikacji synaps elektrycznych.
Rycina 1. Disekcja brzuszna pijawki. (A) Zwierzę jest dokładnie przypięte stroną brzuszną do góry w wyłożonej elastomerem szalce wypełnionej solą fizjologiczną dla pijawek. (B) Płytkie nacięcie wzdłuż osi przednio-tylnej wykonuje się tuż bocznie od linii środkowej, aby uniknąć uszkodzenia sznura nerwowego. Wyraźnie widoczny jest czarny zatokowy układ krwionośny (zawierający brzuszny sznur nerwowy). Należy zwrócić uwagę na jeden odsłonięty zwoj, który jest biały w porównaniu z pochewką. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.
Rysunek 2. Sekcja zatoki czarnej. Naczynie krwionośne (strzałka) należy ostrożnie rozciąć z jednej strony, aby odsłonić brzuszny sznur nerwowy (podwójna strzałka). Należy pozostawić nienaruszone fragmenty naczynia krwionośnego wokół korzeni segmentowych, aby służyły jako uchwyt do manipulowania brzusznym sznurem nerwowym podczas przenoszenia między naczyniem do sekcji a naczyniem do rejestracji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.
Rysunek 3. Wyizolowany odcinek brzusznego sznura nerwowego. Przytwierdzenie brzusznego sznura nerwowego za pomocą fragmentów naczyń krwionośnych pozostałych na korzeniach segmentowych oraz na końcach łączników segmentowych odsłania zwoje do rejestracji elektrofizjologicznej. Mocne naciągnięcie zwojów pozwala na zidentyfikowanie ciał komórkowych i ułatwia penetrację osłonki glejowej za pomocą ostrej elektrody szklanej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.
Rycina 4. Anatomia komórkowa zwoju pijawki. (A) W przypadku prawidłowego ustawienia mikroskopu i kondensora światła, komórki Retziusa (R) oraz inne duże ciała komórkowe (P – nacisk, T – dotyk, N – nocyceptywne, AE – annulus erector) powinny być wyraźnie widoczne. (B) Schematyczny widok komórek w zwoju. Ze względu na sposób rozciągania i przypinania zwoju, w każdym z nich wystąpią niewielkie różnice w lokalizacji som.** (C) Potencjały czynnościowe rejestrowane z som tych neuronów mają charakterystyczne kształty falowe. Impulsy te zostały wywołane poprzez wstrzyknięcie dodatniego prądu do komórki (prostokątny impuls nałożony na przebiegi napięcia w czasie). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.
Rycina 5. Usuwanie osłonki z zwoju w celu wyizolowania pojedynczych ciał komórkowych. (A) Osłonkę glejową należy ostrożnie przeciąć w poprzek zwoju, aby uniknąć uszkodzenia badanych komórek. Czerwona linia wskazuje miejsce cięcia, które pozwala uniknąć uszkodzenia somy neuronów Rz. Otwarcie osłonki umożliwia enzymom trawiennym dostęp do macierzy tkanki łącznej. (B) Zdrowe ciała komórkowe wypchnięte poza zwój po otwarciu osłonki glejowej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.
Rycina 6. Hodowla neuronów z zwoju pijawki. (A) Komórki są aspirowane ze zwoju za pomocą mikropipety i przenoszone do naczynia zawierającego pożywkę hodowlaną. (B) Umieszczenie wielu komórek blisko siebie zwiększa tempo synaptogenezy między identyfikowalnymi neuronami. Tutaj zakończenia dwóch neuronów utworzyły synapsę. (C) Neurony w hodowli wykazują nieco inne właściwości elektryczne. Górne zapisy przedstawiają potencjały synaptyczne wywołane stymulacją sąsiedniej komórki 7 hr i 56 hr po wysianiu komórek. Dolne zapisy zostały wywołane poprzez bezpośrednie wstrzyknięcie prądu do jednej z komórek Rz. Zwróć uwagę na wzrost amplitudy potencjału synaptycznego oraz zmianę kształtu potencjału czynnościowego po 56 hr hodowli. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.
Rycina 7. Preparat zrazu z zwojem i ścianą ciała pijawki do mapowania pól recepcyjnych. (A) Jednym z podejść jest usunięcie całego fragmentu ściany ciała wraz z 1-3 zwojami. Tutaj korzenie po jednej stronie zostały przecięte, a zwoj został przypięty z boku. (B) Przypięty zwoj w większym powiększeniu. (C) Inne podejście polega na wykonaniu niewielkiego okna w ścianie ciała i rejestrowaniu sygnałów z nienaruszonych zwojów podczas mapowania pola recepcyjnego. (D-G) Każdy z neuronów sensorycznych wykazuje charakterystyczną odpowiedź na bodziec mechaniczny. (D) Lekki dotyk wywołuje aktywność w komórkach T, ale nie w komórkach P lub N. (E) Odpowiedź komórki T ustaje w reakcji na silniejsze bodźce, ustępując miejsca aktywacji komórki P. Wraz ze wzrostem siły bodźca aktywowane są komórki N (F-G). Kliknij tutaj, aby wyświetlić obraz w większym rozmiarze.
Rycina 8. Wywołana aktywność w zwoju pijawki. Zewnątrzkomórkowa stymulacja łączników może być wykorzystana do pobudzenia przekazywania synaptycznego w sznurze nerwowym. (A) Odbywa się to poprzez przymocowanie elektrody ssącej do jednego z łączników i przyłożenie niewielkiego napięcia. Widoczna jest ostra elektroda szklana (strzałka) przebijająca komórkę Retziusa w zwoju. (B) Zapisy napięcia w czasie pokazujące artefakt stymulacji, po którym następuje potencjał synaptyczny (czarny) i potencjał czynnościowy (czerwony). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.
Rysunek 9. Wstrzykiwanie barwnika do neuronów pijawki. (A) Lucifer yellow można wstrzyknąć do somy poprzez przepuszczenie prądu przez mikroelektrodę rejestrującą. Następnie można użyć lampy rtęciowej i zestawu filtrów FITC w celu wizualizacji fluorescencji. (B) Barwnik dyfundował do aksonów Rz około 30 min po wstrzyknięciu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.
Dyskusja
Celem tego zestawu eksperymentów było: 1) nauczenie i pokazanie podstawowych zasad wewnątrzkomórkowych zapisów z identyfikowalnych neuronów oraz 2) rozpoznanie charakterystycznych kształtów sygnałów elektrycznych, które mogą powstać z tych konkretnych typów neuronów za pomocą dorosłych pijawek. Istnieje bogata historia badań z wykorzystaniem pijawki do badań neurofizjologicznych, a badania trwają nad kwestiami obwodów neuronalnych i regulacji genów podczas rozwoju, a także podczas naprawy i regeneracji synaps10. Neuromodulacja, szczególnie poprzez szlaki amin biogennych, była również udanym kierunkiem badań nad pijawkami. Poprzez dodanie dopaminy i innych środków farmakologicznych do układu nerwowego poprzez roztwór soli fizjologicznej, wykazano, że dopamina moduluje sieci neuronowe zaangażowane w podejmowanie decyzji23 i wzorce motoryczne dla zachowań raczkowania24,25. To eksperymentalne podejście jest prostym (i niedrogim) sposobem na włączenie modulacji do laboratorium dydaktycznego, a dostosowanie składu jonowego roztworu soli jest skutecznym sposobem nauczania równań Nernsta i Goldmana-Hodgkina-Katza.
Aby odnieść sukces w przygotowaniach ganglionu, ważne jest, aby ganglion był napięty przed próbą nakłucia somy elektrodą wewnątrzkomórkową. W przeciwnym razie soma poruszy się podczas naciskania na pakiet glejowy. Ponadto, podczas usuwania ganglionu w celu usunięcia neuronów do hodowli, unikaj obszaru zainteresowania podczas przecinania zwoju, aby soma nie została uszkodzona podczas usuwania. Ponadto nadmierna inkubacja enzymów może spowodować, że neurony będą zbyt delikatne, aby można je było usunąć. Wymaga to trochę prób i błędów, aby osiągnąć idealny czas inkubacji, ponieważ każda partia enzymów jest nieco inna w swoim działaniu.
Dalsze badania mające na celu optymalizację pożywek hodowlanych mogą udoskonalić tę technikę. Różne czynniki, takie jak obecność insuliny, cukrów lub czynników wzrostu, mogą być badane w celu dłuższego utrzymania kultur. Aby ustalić, czy komórki zachowują zdolność do syntezy przekaźników, takich jak synteza serotoniny w komórkach Rz, można zastosować neutralne czerwone barwienie do oznaczania procesów serotoninergicznych. Również inwazję mikrogleju na uszkodzoną i regenerującą się tkankę można określić ilościowo za pomocą plam jądrowych kilka dni po urazie.
Chociaż preparat ten ma wiele zalet do zaoferowania w badaniu regeneracji i naprawy, a także obwodów neuronalnych, farmakologiczna i molekularna identyfikacja różnych podtypów receptorów w synapsach nie została w pełni scharakteryzowana. Dostępna jest biblioteka znaczników sekwencjiwyrażonej 26, a genom pijawki lekarskiej jest obecnie składany27, ale głównym ograniczeniem pijawki w porównaniu z niektórymi preparatami modelowymi jest możliwość modyfikacji genomu pod kątem selektywnych genów w określonych typach komórek. W zarodkach ograniczenie to zostało rozwiązane poprzez wstrzyknięcie DNA lub dsRNA w celu regulacji ekspresji genów28. Technika pistoletu genowego została ostatnio wykorzystana do ekspresji białek koneksyny bezkręgowców (inneksyny) w neuronach pijawek. Ekspresja inneksyny z Hirudo verbana (have-inx6) jest wystarczająca do powstania ektopowych połączeń szczelinowych w pijawce lekarskiej29. Pijawka lekarska – lub H. verbena – z pewnością pogłębi naszą wiedzę na temat fizjologii i ewolucji synaps elektrycznych w ciągu najbliższych kilku lat.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Sylgard | Dow Corning | zestaw silikonowy 182 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| CaCl₂2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| Kwas tris/maleinowy | Sigma-Aldrich | ||
| Wybielacz | Sigma-Aldrich | Drucik srebrowo-chlorkowy | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 221465 | W celu dostosowania pH |
| HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | W celu dostosowania pH |
| Kolagenaza/Dyspaza | Boehringer Mannheim | 269-638 | |
| Pożywka Leibovitz L-15 z L-glutaminą | Gibco | 041-01415H | |
| płytka surowica cielęca | Ready Systems Ag | ||
| 04-001 | |||
| D-glukoza monohydrat | Merck | 8342 | |
| Siarczan gentamycyny | dowolny dostawca | 10 mg/ml | |
| Glutamina | Gibco | 043-0503H | |
| HEPES | Sigma | 3375 | Kwas wolny, krystaliczny |
| Konkanawalina A typu IV | Sigma | C 2010 | |
| Hydrobromek poli-L-lizyny | Sigma | P 7890 | masa cząsteczkowa 15–30 000 |
| Płytka mikrodobeczkowa, 60 x 10 μl | Falcon | 3034 | Płaskie dno, 10 szt. w opakowaniu |
| Narzędzia do sekcji | World Precision Instruments | asortyment | |
| Sonda z elektrodą wewnątrzkomórkową | |||
| Klatka Faradaya | |||
| Szpile do owadów | Fine Science Tools, Inc | 26001-60 | |
| Mikroskop stereoskopowy (100X) | |||
| Lampa światłowodowa | |||
| Małe regulowane lustro | Aby skierować wiązkę światła na preparat. | ||
| Elektrody szklane | Sigma-Aldrich | CLS7095B5X | Opakowanie 200 szt., Elektrody przyssawkowe |
| Mikromanipulator | World Precision Instruments | MD4-M3-R | Można zamocować do podstawy lub na pręcie metalowym |
| Podwyższony stojak preparacyjny | |||
| Drut srebrny (10/1000 cala) | A-M Systems | 782500 | |
| Komputer | dowolna firma | ||
| Wzmacniacz różnicowy AC/DC | A-M Systems | Model 3000 | |
| PowerLab 26T |  AD Instruments | 27T | |
| Głowica pomiarowa | AD Instruments | W zestawie znajduje się wzmacniacz AC/DC | |
| LabChart7 | AD Instruments | ||
| Przewody elektryczne | dowolna firma | ||
| Narzędzia szklane | stwórz siebie | Do manipulacji nerwami | |
| Kable i złącza | jakakolwiek firma | ||
| Pipety z gruszkami | Fisher Scientific | 13-711-7 | Opakowanie 500 sztuk |
| Zlewki | dowolna firma | ||
| Wosk lub glina modelarska | jakakolwiek firma lub lokalne sklepy | ||
| Stymulator | Grass Instruments | SD9 lub S88 | |
| Plastikowa końcówka do elektrody ssącej | lokalny sklep z artykułami hydraulicznymi i elektrycznymi (Watt’marki) | ¼ cal średnicy zewnętrznej x 0,170 cala średnicy wewnętrznej | Pokroić na małe kawałki. Wyciągnąć nad płomieniem i odciąć końcówkę do odpowiedniej wielkości. |
Bibliografia
- Fuchs, P. A., Nicholls, J. G., Ready, D. F. Membrane properties and selective connexions of identified leech neurones in culture. J Physiol. 316, 203-223 (1981).
- Ready, D. F., Nicholls, J. Identified neurones isolated from leech CNS make selective connections in culture. Nature. 281, 67-69 (1979).
- Blackshaw, S. E. Neurobiology of the Leech. Muller, K. J., Nicholls, J. G., Stent, G. S. , Cold Spring Harbor Laboratory. 51-78 (1981).
- Drapeau, P., Sanchez-Armass, S. Parallel processing and selection of the responses to serotonin during reinnervation of an identified leech neuron. J Neurobiol. 20, 312-325 (1989).
- Garcia, U., Grumbacher-Reinert, S., Bookman, R., Reuter, H. Distribution of Na+ and K+ currents in soma, axons, and growth cones of leech Retzius neurones in culture. J. Exp. Biol. , 1-17 (1990).
- Cooper, R. L., Miguel Fernandez, de, Adams, F., B, W., Nicholls, J. G. Synapse formation inhibits expression of calcium currents in purely postsynaptic cells. Proc. R. Soc. B-Biol. Sci. , 217-222 (1992).
- Liu, Y., Nicholls, J. Steps in the development of chemical and electrical synapses by pairs of identified leech neurons in culture. Proc. R. Soc. B-Biol. Sci. , 236-253 (1989).
- Fernandez de Miguel, F., Cooper, R. L., Adams, W. B. Synaptogenesis and calcium current distribution in cultured leech neurons. Proc. R. Soc. B-Biol. Sci. 247, 215-221 (1992).
- Briggman, K. L., Kristan, W. B. Multifunctional pattern-generating circuits. Annu. Rev. Neurosci. 31, 271-294 (2008).
- Macagno, E. R., Muller, K. J., Deriemer, S. A. Regeneration of axons and synaptic connections by touch sensory neurons in the leech central nercoys system. J. Neurosci. 5, 2510-2521 (1985).
- Becker, T., Macagno, E. R. CNS control of a critical period for peripheral induction of central neurons in the leech. Development. 116, 427-434 (1992).
- Marin-Burgin, A., Kristan, W. B., French, K. A. From Synapses to behavior: Development of a sensory-motor circuit in the leech. Dev. Neurobiol. 68, 779-787 (2008).
- Kristan, W. B. The Neurobiology of Swimming in the leech. Trends Neurosci. 6, 84-88 (1983).
- Brodfuehrer, P. D., Friesen, W. O. From stimulation to undulation: a neuronal pathway for the control of swimming in the leech. Science. 234, 1002-1004 (1986).
- Arbas, E. A., Calabrese, R. L. Slow oscillations of membrane potential in interneurons that control heartbeat in the medicinal leech. J. Neurosci. 7, 3953-3960 (1987).
- Ching, S. Synaptogenesis between identified neurons. , McGill University. (1995).
- Kristan, W. B., Eisenhart, F. J., Johnson, L. A., French, K. A. Development of neuronal circuits and behaviors in the medicinal leech. Brain Res. Bull. 53, 561-570 (2000).
- French, K. A. Gap junction expression is required for normal chemical synapse formation. J. Neurosci. 30, 15277-15285 (2010).
- Li, Q., Burrell, B. D. Two forms of long-term depression in a polysynaptic pathway in the leech CNS: one NMDA receptor-dependent and the other cannabinoid-dependent. J. Comp. Physiol. A Neuroethol. Sens. Neural Behav. Physiol. 195, 831-841 (2009).
- Nicholls, J. G., Baylor, D. A. Specific modalities and receptive fields of sensory neurons in CNS of the leech. J. Neurophysiol. 31, 740-756 (1968).
- Yau, K. W. Receptive fields, geometry and conduction block of sensory neurones in the central nervous system of the leech. J. Physiol. 263, 513-538 (1976).
- Leksrisawat, B., Cooper, A. S., Gilberts, A. B., Cooper, R. L. Muscle receptor organs in the crayfish abdomen: a student laboratory exercise in proprioception. J. Vis. Exp. (45), e2323(2010).
- Crisp, K. M., Mesce, K. A. Beyond the central pattern generator: amine modulation of decision-making neural pathways descending from the brain of the medicinal leech. J. Exp. Biol. 209, (2006).
- Puhl, J. G., Mesce, K. A. Dopamine activates the motor pattern for crawling in the medicinal leech. J. Neurosci. 28, 4192-4200 (2008).
- Crisp, K. M., Gallagher, B. R., Mesce, K. A. Mechanisms contributing to the dopamine induction of crawl-like bursting in leech motoneurons. J. Exp. Biol. 215, 3028-3036 (2012).
- Macagno, E. R., et al. Construction of a medicinal leech transcriptome database and its application to the identification of leech homologs of neural and innate immune genes. BMC Genomics. 11, 407(2010).
- Kandarian, B., et al. The medicinal leech genome encodes 21 innexin genes: different combinations are expressed by identified central neurons. Dev. Genes Evol. 222, 29-44 (2012).
- Shefi, O., Simonnet, C., Groisman, A., Macagno, E. R. Localized RNAi and ectopic gene expression in the medicinal leech. J. Vis. Exp. (14), e697(2008).
- Firme, C. P., Natan, R. G. 3rd, Yazdani, N., Macagno, E. R., Baker, M. W. Ectopic expression of select innexins in individual central neurons couples them to pre-existing neuronal or glial networks that express the same innexin. J. Neurosci. 32, 14265-14270 (2012).
- Siddall, M. E., Trontelj, P., Utevsky, S. Y., Nkamany, M., Macdonald, K. S. Diverse molecular data demonstrate that commercially available medicinal leeches are not Hirudo medicinalis. Proc. Biol. Sci. 274, 1481-1487 (2007).
Przedruki i uprawnienia
