Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Biosensory ratiometryczne, które mierzą mitochondrialny stan redoks i ATP w żywych komórkach drożdży

21.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50633

⸱

22 lipca 2013

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology and Cell Biology, Columbia University, 2Herbert Irving Comprehensive Cancer Center, Columbia University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy użycie dwóch ratiometrycznych, genetycznie kodowanych biosensorów, które są oparte na GFP, do monitorowania mitochondrialnego stanu redoks i poziomów ATP w rozdzielczości subkomórkowej w żywych komórkach drożdży.

Streszczenie

Mitochondria odgrywają rolę w wielu procesach komórkowych, począwszy od metabolizmu energetycznego i homeostazy wapnia, a skończywszy na kontroli długości życia komórek i zaprogramowanej śmierci komórki. Procesy te wpływają i są zależne od statusu redoks i produkcji ATP przez mitochondria. W tym miejscu opisujemy zastosowanie dwóch ratiometrycznych, genetycznie kodowanych bioczujników, które mogą wykrywać mitochondrialny stan redoks i poziomy ATP w rozdzielczości subkomórkowej w żywych komórkach drożdży. Mitochondrialny stan redoks mierzy się za pomocą wrażliwego na redoks białka zielonej fluorescencji (roGFP), które jest ukierunkowane na macierz mitochondrialną. Mito-roGFP zawiera cysteiny w pozycjach 147 i 204 GFP, które ulegają odwracalnemu i zależnemu od środowiska utlenianiu i redukcji, co z kolei zmienia widmo wzbudzenia białka. MitGO-ATeam to sonda rezonansowa Förstera do transferu energii (FRET), w której ε podjednostka syntazy Fo F 1-ATP jest umieszczona pomiędzy białkami fluorescencyjnymi donorowymi i akceptorowymi FRET. Wiązanie ATP z podjednostką ε powoduje zmiany konformacyjne w białku, które zbliżają donor i akceptor FRET i umożliwiają transfer energii rezonansu fluorescencyjnego od dawcy do akceptora.

Wprowadzenie

Mitochondria są niezbędnymi organellami do produkcji ATP, biosyntezy aminokwasów, kwasów tłuszczowych, hemu, klastrów siarki żelaza i pirymidyn. Mitochondria odgrywają również kluczową rolę w homeostazie wapnia i regulacji apoptozy. 1 Coraz więcej dowodów łączy mitochondria ze starzeniem się i chorobami związanymi z wiekiem, w tym chorobą Parkinsona, chorobą Alzheimera, stwardnieniem zanikowym bocznym i chorobą Huntingtona. 2 Podczas gdy ludzie żyją przez całe życie z mutacjami w białkach mitochondrialnych, które są związane z chorobami neurodegeneracyjnymi, objawy choroby pojawiają się dopiero w późniejszym życiu. Wskazuje to, że z wiekiem w mitochondriach zachodzą zmiany, które pozwalają na pojawienie się patologii chorobowej. Rzeczywiście, sprawność mitochondriów jest skorelowana z ogólnym zdrowiem i długością życia komórek drożdży i ssaków. 3,4 W tym miejscu opisujemy, jak wykorzystać genetycznie kodowane, ratiometryczne biosensory fluorescencyjne do oceny dwóch krytycznych cech mitochondriów w żywych komórkach drożdży: stanu redoks i poziomów ATP.

Funkcja mitochondriów w aerobowej mobilizacji energii jest dobrze ugruntowana. Mitochondrialny stan redoks jest produktem gatunków redukujących i utleniających w organellach, w tym NAD+/NADH, FAD/FADH2, NADP+/NADPH, glutationu/dwusiarczku glutationu (GSH/GSSG) i reaktywnych form tlenu (ROS). Rozprzęgnięcie mitochondriów lub niedotlenienie wpływa na aktywność oddechową mitochondriów i zmienia stosunek NAD+ do NADH w organellach. ROS, które są wytwarzane w wyniku nieefektywnego przenoszenia elektronów między kompleksami łańcucha transportu elektronów w wewnętrznej błonie mitochondrialnej, a także w wyniku deaminacji amin przez oksydazę monoaminową w zewnętrznej błonie mitochondrialnej 5, uszkadzają lipidy, białka i kwasy nukleinowe i są powiązane ze starzeniem się i chorobami neurodegeneracyjnymi związanymi z wiekiem 6,7,8. ROS odgrywają również rolę w transdukcji sygnału w mitochondriach poprzez utlenianie GSH. Na przykład dehydrogenaza NADH nie tylko przyczynia się do produkcji ROS, ale jest również regulowana poprzez interakcje z pulą glutationu 9,10. Dehydrogenaza α-ketoglutaranu i akonitaza, składniki cyklu TCA, wykazują zmniejszoną aktywność w środowiskach utleniających11,12.

Rzeczywiście, zależna od redoks regulacja aktywności tojady jest zachowana od bakterii do ssaków13,14. Dlatego monitorowanie stanu redoks i poziomów ATP mitochondriów ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia ich funkcji i roli w patologii choroby.

Metody biochemiczne zostały użyte do oceny stanu redoks lub poziomów ATP całych komórek lub izolowanych mitochondriów. Szeroko stosowane metody oceny stanu redoks całych komórek lub izolowanych mitochondriów opierają się na pomiarze poziomów pary redoks GSH/GSSG15. System lucyferyna-lucyferazy jest powszechnie stosowany do pomiaru mitochondrialnych poziomów ATP w przenikanych całych komórkach lub izolowanych mitochondriach. 16,17,18,19,20 W tym teście lucyferazy wiąże się z ATP i katalizuje utlenianie i chemiluminescencję lucyferyny. 21 Natężenie emitowanego światła jest proporcjonalne do ilości ATP w mieszaninie reakcyjnej. 22 Rozdział 22

Te metody ujawniły podstawowe informacje dotyczące funkcji mitochondriów, w tym odkrycie, że pacjenci z chorobami neurodegeneracyjnymi, takimi jak choroba Alzheimera, mają nienormalnie niski poziom ATP. 23 Nie można ich jednak używać do obrazowania żywych, nienaruszonych komórek. Co więcej, metody oparte na analizie całej komórki zapewniają średnią stanu redoks lub poziomów ATP we wszystkich przedziałach komórki. Pomiary w izolowanych organellach są potencjalnie problematyczne, ponieważ mitochondrialny stan redoks lub poziomy ATP mogą ulec zmianie podczas frakcjonowania subkomórkowego. Wreszcie, ostatnie badania z naszego laboratorium i innych wskazują, że mitochondria w poszczególnych komórkach są niejednorodne pod względem funkcji, co z kolei wpływa na długość życia komórek macierzystych i potomnych. 3 W związku z tym istnieje potrzeba pomiaru mitochondrialnych poziomów ATP i stanu redoks w żywych komórkach z rozdzielczością subkomórkową.

Opisane tutaj biosensory funkcji mitochondriów są oparte na GFP. Wrażliwy na redoks GFP (roGFP)24,25 to wariant GFP, w którym do cząsteczki dodaje się cysteiny naświetlone powierzchniowo. roGFP, podobnie jak GFP typu dzikiego, ma dwa piki wzbudzenia (przy ~400 nm i ~480 nm) i jeden pik emisji przy ~510 nm. Utlenianie reszt cysteinowych w roGFP powoduje wzrost wzbudzenia przy ~400 nm. Redukcja tych cystein sprzyja wzbudzeniu przy ~480 nm. Zatem stosunek emisji 510 nm po wzbudzeniu roGFP przy 480 nm i 400 nm ujawnia względną ilość zredukowanego i utlenionego roGFP, co odzwierciedla stan redoks środowiska fluoroforu.

Dwie wersje roGFP są powszechnie używane: roGFP1 i roGFP2. Oba zawierają te same insercje cysteiny. roGFP1 jest oparty na GFP typu dzikiego, a roGFP2 jest oparty na GFP S65T, który ma bardziej wydajne wzbudzenie przy 480 nm i mniej wydajne wzbudzenie przy 400 nm w porównaniu do wtGFP24. roGFP1 jest mniej wrażliwy na pH niż roGFP2, a jego zakres dynamiczny rozciąga się dalej w zakres ograniczony. W związku z tym roGFP1 może być bardziej przydatny do monitorowania bardziej redukujących przedziałów, takich jak mitochondria lub cytozol, oraz przedziałów o zmiennym pH, takich jak endosomy. roGFP2 oferuje jaśniejszy sygnał i, w niektórych badaniach, większy zakres dynamiki niż roGFP124,26. Badania nad Arabidopsis thaliana wskazują, że czas potrzebny na reakcję na zmiany stanu redoks jest podobny dla obu czujników (t1/2 dla utleniania, 65 i 95 sekund oraz t1/2 dla redukcji, 272 i 206 sekund, odpowiednio dla roGFP1 i roGFP2). 26

MitGO-ATeam2 to minimalnie inwazyjny, niezawodny czujnik, który mierzy mitochondrialne ATP w pączkujących drożdżach Saccharomyces cerevisiae. GO-ATeam to sonda rezonansowego transferu energii Förstera (FRET), która składa się z ε podjednostki syntazy FoF1-ATP umieszczonej pomiędzy białkami fluorescencyjnymi donorowymi i akceptorowymi FRET (odpowiednio GFP i pomarańczowe białko fluorescencyjne (OFP)). 27 Wiązanie ATP z podjednostką ε powoduje zmiany konformacyjne w białku, które zbliżają donor FRET do akceptora i umożliwiają transfer energii od dawcy do akceptora. Istnieją dwa warianty GO-ATeam, GO-ATeam1 i GO-ATeam2. GO-ATeam2 ma wyższe powinowactwo do MgATP niż GO-ATeam1, dzięki czemu jest bardziej odpowiedni do pomiaru zazwyczaj niższego [ATP] w mitochondriach w porównaniu z cytozolem. 27 Rozdział 27

Aby zbadać mitochondrialny stan redoks, skonstruowaliśmy białko fuzyjne (mito-roGFP1) składające się z roGFP1 połączonego z sekwencją lidera ATP9 i wyrażonego z plazmidu drożdży opartego na centromerze (niska liczba kopii) pod kontrolą silnego promotora dehydrogenazy gliceraldehydo-3-fosforanowej (GPD) (p416GPD, Addgene). Użyliśmy roGFP1 do zbadania statusu redoks mitochondriów w kontekście starzenia się modelowego grzyba Saccharomyces cerevisiae. Odkryliśmy, że roGFP1 może wykrywać zmiany w mitochondrialnym stanie redoks, które zachodzą podczas starzenia się i w odpowiedzi na dostępność składników odżywczych, ale nie ma widocznego szkodliwego wpływu na komórki drożdży. Obserwujemy również zmienność w stanie redoks mitochondriów w poszczególnych żywych komórkach drożdży, co podkreśla znaczenie biosensora o subkomórkowej rozdzielczości przestrzennej.

MitGO-ATeam2 to wariant GO-ATeam2, który ma mitochondrialną sekwencję sygnałową podjednostki VIIIA oksydazy cytochromu c wstawioną na końcu aminowym GO-ATeam2. 27 Zmodyfikowaliśmy sondę mitGO-ATeam2 (uprzejmie dostarczoną przez laboratorium H. Noji, Instytut Badań Naukowych i Przemysłowych, Uniwersytet w Osace, Japonia) do stosowania u drożdży poprzez subklonowanie jej, za pośrednictwem miejsc Xba1 i HindIII, do wektora ekspresji drożdży pAG415GPD-ccdB (Addgene, Cambridge, MA, USA), który jest plazmidem o niskiej kopii zawierającym silny konstytutywny promotor GPD. Wyraziliśmy mitGO-ATeam2 w pączkujących drożdżach i stwierdziliśmy, poprzez barwienie przeciwstawne barwnikiem wiążącym DNA DAPI, że lokalizuje się on wyłącznie w mitochondriach, gdzie służy jako skuteczna sonda do pomiaru fizjologicznych zmian w mitochondrialnych poziomach ATP.

roGFP i GO-ATeam są zakodowane genetycznie. W rezultacie, mogą być wprowadzane i stabilnie utrzymywane w nienaruszonych komórkach oraz dostarczają informacji o stanie redoks lub poziomach ATP w indywidualnych, żywych komórkach. Co więcej, oba biosensory monitorują zmiany stanu redoks lub poziomów ATP, które zachodzą w warunkach fizjologicznych. 28 Obie sondy są również ratiometryczne. W rezultacie, na pomiary wykonane za pomocą tych sond nie mają wpływu zmiany stężenia biosensora ani oświetlenia lub grubości próbki. Wreszcie, oba biosensory zapewniają subkomórkową rozdzielczość przestrzenną. Rzeczywiście, roGFP został ukierunkowany na mitochondria, ER, endosomy i peroksysomy24 i może wykrywać zmiany w stanie redoks każdej z tych organelli, w dużej mierze niezależnie od pH.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Transformacja komórek drożdży za pomocą biosensorów

  1. Przekształć pożądany szczep drożdży za pomocą plazmidu zawierającego mito-roGFP lub mitGO-ATeam2 przy użyciu metody octanu litu27.
  2. Aby potwierdzić transformację za pomocą biosensora przenoszonego przez plazmid i zapobiec utracie plazmidu, należy wybrać i utrzymywać transformanty na odpowiednim selektywnym syntetycznym kompletnym ośrodku (SC-Ura dla mito-roGFP lub SC-Leu dla mitGo-ATeam2). Jeśli sonda fluorescencyjna została subklonowana w innym plazmidzie niż opisane tutaj, należy użyć odpowiedniego podłoża selektywnego. Wizualizuj transformanty za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, aby potwierdzić, że wyrażają one bioczujnik fluorescencyjny i wykazują normalną morfologię mitochondriów.

2. Wzrost komórek i przygotowanie do obrazowania

Funkcja komórki i odpowiedź na leczenie farmakologiczne są w dużym stopniu zależne od gęstości komórek i aktywności metabolicznej. Najlepsze wyniki uzyskuje się, gdy komórki aktywnie się dzielą (faza mid-log, ~0,5 - 1 x 107 komórek/ml). Najbardziej niezawodnym sposobem generowania kultur w środkowej fazie logarytmicznej o stałej gęstości jest zaszczepienie z kultury wstępnej w fazie stacjonarnej.

  1. Przygotować hodowlę wstępną w fazie stacjonarnej: pobrać pojedynczą kolonię przekształconych komórek z płytki i zaszczepić selektywną pożywkę płynną (5 ml w probówce o stożkowym dnie o pojemności 50 ml). Rosnąć w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem przy 225 obr./min, aż gęstość optyczna kultury przy 600 nm (OD600) osiągnie plateau (24-48 godzin).
  2. Przygotować kulturę w środkowej fazie logarytmicznej do obserwacji: użyć odpowiedniej objętości kultury wstępnej, aby zaszczepić 5 ml selektywnej pożywki w probówce o stożkowym dnie o pojemności 50 ml. Pożywka YPD jest autofluorescencyjna i nie powinna być używana w tych badaniach. Stosować syntetyczne, kompletne, oparte na glukozie pożywki dropout (SC-Ura). Hoduj komórki w temperaturze 30 °C, wstrząsając z prędkością 225 obr./min, przez 4-16 godzin, aż osiągną fazę mid-log (~0,5 - 1 x 107 komórek/ml). Gęstość komórek można określić, mierząc OD600; skalibrować spektrofotometr, aby określić prawidłowy odczyt OD600. W naszym Beckman DU530 (Beckman Coulter, Indianapolis, IN) faza środkowa logarytmu odpowiada OD600 wynoszącemu 0,1-0,3.

Mito-roGFP1 wyczuwa fluktuacje w organellach w odpowiedzi na zmiany metaboliczne. Na przykład w tym teście mitochondrialny stan redoks zmienia się, gdy drożdże rosną na fermentowalnych źródłach węgla (np. glukozie, jak w pożywce SC) w porównaniu z niefermentującymi źródłami węgla (np. glicerolem, jak w pożywce SGlyc), a nawet w różnych partiach tego samego podłoża. Dlatego do wszystkich eksperymentów należy używać tej samej partii pożywki.

  1. Komórki są gotowe do koncentracji (patrz krok 2.4) i obrazowania, jeśli nie jest wykonywane żadne leczenie. Jeśli komórki są poddawane obróbce, należy je inkubować z odpowiednim leczeniem i przejść do następnego kroku.
  2. Zagęścić 1 ml kultury przez odwirowanie przy 6 000 x g przez 15 sekund i ponowne zawieszenie osadu komórkowego w 20 μl pożywki. Te warunki maksymalizują liczbę możliwych do rozróżnienia komórek w polu widzenia.
  3. Nanieść 2 μl zawieszonych komórek na szkiełko. Przykryj szkiełkiem nakrywkowym (nr 1,5, najlepiej o wysokiej wydajności o grubości 170±5 μm) i uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego przezroczystym lakierem do paznokci lub valapem (patrz Odczynniki). Aby uszczelnić za pomocą valap, rozpuść niewielką ilość na metalowej szpatułce, trzymając ją nad płomieniem palnika Bunsena, a następnie rozprowadź niewielką ilość wzdłuż krawędzi szkiełka nakrywkowego.
  4. Utrzymuj komórki w temperaturze 30 °C podczas obrazowania. Grzałka obiektywu na soczewce olejowej 100x używana do obrazowania dobrze sprawdza się w tym zastosowaniu. W tych warunkach morfologia mitochondriów, stan redoks i poziomy ATP pozostają niezmienione podczas obrazowania przez 10-15 minut.

3. Ustawienia obrazowania

  1. Zestaw do obrazowania mito-roGFP1 na szerokokątnym mikroskopie fluorescencyjnym
    Kroki tutaj są dostosowane do mikroskopu AxioObserver.Z1 wyposażonego w źródło wzbudzenia Colibri LED, szerokokątną kamerę Orca ER i oprogramowanie do akwizycji Axiovision. Fotowybielanie obu kanałów i fotokonwersja utlenionego mito-roGFP1 jest znacznie zmniejszone przy użyciu oświetlenia LED w porównaniu z oświetleniem rtęciowej lampy łukowej (patrz poniżej).
    Aby zmaksymalizować sygnał i rozdzielczość, należy użyć najwyższego możliwego otworu numerycznego w obiektywie i najniższego powiększenia, które zapewnia wystarczającą rozdzielczość przestrzenną. Ponadto w przypadku obrazowania mito-roGFP należy sprawdzić, czy obiektyw dobrze nadaje przy długości fali 365 nm. Obiektyw 100x/1.3NA EC PlanNeofluar (Zeiss) dobrze sprawdza się w tym zastosowaniu.
    Skonfiguruj oprogramowanie do akwizycji, aby wychwycić utlenione i zredukowane gatunki mito-roGFP1. Stosujemy następujące warunki.
    1. Skonfiguruj kanał dla utlenionego mito-roGFP, aby używał wzbudzenia przy 365 nm (100% mocy LED) i filtra emisyjnego odpowiedniego dla GFP, takiego jak zestaw filtrów 38 HE (Zeiss), z dołączonym filtrem wzbudzenia wyjętym z kostki. Usunięcie filtra wzbudzenia umożliwia wzbudzenie zarówno przy 365 nm, jak i 470 nm bez konieczności przełączania filtrów, zwiększając tym samym osiągalną rozdzielczość czasową.
    2. Skonfiguruj kanał dla zredukowanego mito-roGFP, aby używał wzbudzenia przy 470 nm (100% mocy LED) i, jak wspomniano powyżej, tej samej kostki filtra emisji, która jest używana dla utlenionego mito-roGFP. Ustaw kamerę na binning 1x1, aby zoptymalizować rozdzielczość przestrzenną.
    3. Ustaw oprogramowanie tak, aby uzyskać stos z składający się z 11 warstw w odstępach 0,5 μm, zbierając oba kanały w każdej pozycji z. Ten tryb akwizycji jest wolniejszy niż nabywanie każdego stosu z po kolei, ale zapobiega artefaktom powstającym w wyniku ruchu mitochondriów między akwizycją utlenionych i zredukowanych kanałów.
    4. Wyobraź sobie kilka komórek, aby określić odpowiedni czas ekspozycji, wytwarzając silny, ale nie nasycony sygnał. Ważne jest, aby zachować stosunek czasów ekspozycji dla utlenionego i zredukowanego mito-roGFP1 dla wszystkich eksperymentów. Na przykład, jeśli czasy ekspozycji dla utlenionego i zredukowanego mito-roGFP1 wynoszą odpowiednio 300 i 100 ms, to czas ekspozycji dla utlenionego mito-roGFP1 powinien być 3 razy większy niż dla zredukowanego mito-roGFP1 dla wszystkich eksperymentów.
  2. Zestaw do obrazowania mitGO-ATeam2 na spektralnym mikroskopie konfokalnym
    Aby określić ilościowo poziomy ATP za pomocą mitGO-ATeam2, należy odróżnić fluorescencję z GFP (maksimum emisji 510 nm) od fluorescencji z OFP (maksimum emisji 560 nm). Istnieją zestawy filtrów fluorescencyjnych, które rozpuszczają fluorescencję emitowaną przez te fluorofory. Okazuje się jednak, że detektor spektralny, dostępny w wielu laserowych skaningowych mikroskopach konfokalnych, najlepiej sprawdza się w tym zastosowaniu. Detektor spektralny rozdziela emisję fluorescencji na wiele składników (zwykle 32 lub więcej) w zależności od długości fali. Kilka sąsiadujących ze sobą pasm długości fal można połączyć w jeden kanał obrazu. Długości fal, które mają być połączone, są wybierane empirycznie tak, aby zmaksymalizować sygnał z GFP i OFP, unikając jednocześnie krzyżowania się sygnału, które zakłóciłoby pomiar FRET. Użyj obiektywu o największej dostępnej przysłonie numerycznej. Używamy obiektywu Apo-TIRF 100x/1.49 lub 60x/1.49. Używamy mikroskopu konfokalnego Nikon A1R z oprogramowaniem NIS Elements. Skonfiguruj oprogramowanie do akwizycji w celu wychwytywania gatunków mitGO-ATeam2 związanych z ATP i niezwiązanych z ATP. Stosujemy następujące warunki.
    1. Ustaw otworek na 1,0 jednostek Airy (AU), co w naszym systemie odpowiada rozdzielczości z około 0,42 μm.
    2. Ustaw powiększenie skanowania tak, aby zbliżało się do limitu próbkowania Nyquista, co zmaksymalizuje informacje przestrzenne na obrazie. W naszym systemie rozmiar piksela wynosi 0,12 μm.
    3. Ponieważ mitochondria mogą się poruszać podczas obrazowania, pomocne może być zwiększenie szybkości obrazowania poprzez przycięcie pola do 512 x 256 pikseli. Całkowity czas potrzebny do zobrazowania jednej klatki w naszym systemie wynosi 1,0 sekundy, wliczając w to 2-krotną średnią skanowania. W zależności od pożądanej rozdzielczości przestrzennej pole można dodatkowo przyciąć w celu zwiększenia rozdzielczości czasowej.
    4. Wzbudzić przy 488 nm i zebrać emisję od 500 - 520 nm dla GFP i od 550 - 580 nm dla OFP. Rzeczywiste wartości optymalne mogą się różnić w zależności od charakterystyki systemu obrazowania.
    5. Optymalna moc lasera dla naszego systemu wynosi od 6,0 do 6,4%. Optymalna moc lasera będzie się różnić dla każdego systemu mikroskopowego, ale najlepiej będzie, jeśli będzie jak najniższa, a jednocześnie będzie możliwa do zinterpretowania obraz. Użyj wewnętrznego lub zewnętrznego miernika mocy, aby monitorować zmiany mocy lasera, które zachodzą normalnie w czasie w dowolnym układzie optycznym.
    6. Dostosuj wzmocnienie detektora i intensywność światła oświetlenia, aby zmaksymalizować wykrywany zakres wartości pikseli, ale unikaj nasycenia sygnału dla jak największej liczby komórek. Nie analizuj żadnych komórek zawierających więcej niż 1% nasyconych pikseli. Obrazuj wszystkie próbki przy użyciu tego samego obiektywu, mocy lasera, powiększenia skanowania, rozmiaru piksela, wzmocnienia i przesunięcia.

4. Akwizycja obrazu

  1. Zlokalizuj płaszczyznę ogniskową komórek zainteresowania za pomocą światła przechodzącego, aby zminimalizować wybielanie sondy fluorescencyjnej.
  2. Po zlokalizowaniu jednej lub więcej interesujących komórek należy pobrać serię Z przez całą głębokość typowej komórki (ok. 7 μm), stosując krok o wielkości 0,5 μm.
  3. Zobrazuj inne interesujące komórki na slajdzie, ale nie twórz obrazu pojedynczego slajdu dłużej niż 15 minut. Po 15 minutach na szkiełku komórki tracą żywotność.

5. Analiza

Poziom ATP w mitochondriach jest określany przez pomiar stosunku emisji mitGO-ATeam2 przy 560 nm do emisji przy 510 nm. 27 Stan redoks organelli mierzy się jako stosunek zredukowany do utlenionego (R/O) mito-roGFP; tj. emisja przy 510 nm przy wzbudzeniu przy 470 nm podzielona przez emisję przy 510 nm przy wzbudzeniu przy 365 nm. Przed obliczeniem współczynnika odejmujemy tło i określamy wartość progową dla pikseli należących do mitochondriów fluorescencyjnych.

Domena publiczna (np. ImageJ30) lub komercyjnie dostępne oprogramowanie (np. Volocity, Perkin-Elmer) może być używane do analizy mito-roGFP1 lub mitGO-ATeam2. W zależności od oprogramowania używanego do pozyskiwania obrazów i analizy, obrazy mogą wymagać najpierw przekonwertowania na inny format, taki jak TIFF, przed otwarciem ich w oprogramowaniu do analizy. Jeśli obrazy są konwertowane, należy sprawdzić, czy wartości pikseli nie zostały zmienione podczas konwersji. Analiza danych mito-roGFP1 przy użyciu obu programów została opisana poniżej. Menu programów i opcje do wyboru w każdym menu są wyróżnione pogrubioną kursywą.

5.1 Analiza ImageJ

  1. Otwórz obrazy i zmień typ na 32-bitowy: Obraz→ Wpisz → 32-bitowy.
  2. Narysuj obszar zainteresowania (ROI) w obszarze, w którym nie ma komórek. Oblicz średnią intensywność w tym ROI: Analizuj → mierz.
  3. Odejmij obliczone średnie tło od stosu: Przetwarzaj → matematyki → Odejmij.
  4. Korzystając z odjętego stosu z, znajdź środkowy wycinek i próg w mitochondriach: Obraz → Dostosuj próg → i kliknij Zastosuj w oknie Próg. Zastosuj do wszystkich plasterków w stosie. Zaznacz opcję Ustaw piksele tła na NaN.
  5. Utwórz stos proporcji z: Kalkulator obrazu → procesu Podziel zredukowany stos przez utleniony stos z do analizy mito-roGFP1. Podziel obraz 560 nm (związany z ATP) przez obraz 510 nm (niezwiązany z ATP) w celu analizy mitGO-ATeam2.
  6. Narysuj ROI wokół obszaru zainteresowania. Wybierz opcję Analizuj narzędzia → → Menedżera zwrotu z inwestycji, a następnie kliknij przycisk Dodaj, aby zarejestrować zwrot z inwestycji. W menedżerze może być przechowywanych wiele regionów. W Menedżerze ROI zaznacz wszystkie ROI, a następnie wybierz opcję Więcej → wiele miar, aby zmierzyć wszystkie wycinki stosu. Eksportuj dane do arkusza kalkulacyjnego w celu analizy.

5.2 Analiza lotności

  1. Zaimportuj obrazy do biblioteki Volocity i utwórz sekwencję obrazów z 2 kanałami.
  2. Narysuj obszar zainteresowania (ROI) w obszarze, w którym nie ma komórek. Wybierz: Narzędzia → proporcje.
  3. Użyj Volocity, aby obliczyć tło: Get From ROI.
  4. Dostosuj próg, aby uwzględnić struktury mitochondrialne.
  5. Zaznacz opcję, aby zastosować tęczową tablicę LUT do kanału proporcji. Kanał modulowany intensywnością może wytwarzać mniej zaszumiony obraz do prezentacji, ale nie powinien być używany do ilościowego określania średniego stosunku.
  6. Wybierz zakładkę Pomiar, wybierz kanał proporcji i narysuj ROI wokół obszaru zainteresowania. Zmierz kanał stosunkowy, z wyłączeniem wartości zerowych. Wiele regionów może być wybranych i zmierzonych w tym samym czasie. Eksportuj dane do arkusza kalkulacyjnego w celu analizy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Pomiar stanu redoks mitochondriów z użyciem mito-roGFP

W niniejszej pracy wykazujemy, że mito-roGFP1 posiada zakres dynamiczny pozwalający na wykrywanie zmian stanu redox mitochondriów — od pełnego utlenienia do redukcji — w żywych komórkach drożdży, nie wpływając przy tym na wzrost komórek drożdżowych ani morfologię mitochondriów. Po pierwsze stwierdzono, że komórki wykazujące ekspresję GFP ukierunkowanego na mitochondria oraz roGFP1 rosną w normalnym tempie (Rycina 1A). Maksyma...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu opisujemy metody wykorzystania mito-roGFP1 i mitGO-ATeam2 jako bioczujników do oceny mitochondrialnego stanu redoks i poziomów ATP w żywych komórkach drożdży. Odkryliśmy, że ekspresja plazmidowego mito-roGFP1 lub mitGO-ATeam powoduje ilościowe ukierunkowanie na mitochondria, bez żadnego oczywistego wpływu na morfologię lub dystrybucję mitochondriów lub na tempo wzrostu komórek. 3 Mito-roGFP1 może wykrywać zmiany w mitochondrialnym stanie redoks ze stanów wysoce utlenionych do wysoce zredukowanych...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca została wsparta nagrodami od HHMI 56006760 dla JDV, National Institutes of Health (NIH) (2 TL1 RR 24158-6) dla DMAW, oraz od Ellison Medical Foundation (AG-SS-2465) i NIH (GM45735, GM45735S1 i GM096445) dla LP. GM45735S1 został wydany przez NIH na mocy amerykańskiej ustawy o odbudowie i reinwestycjach z 2009 roku. Mikroskopy użyte do tych badań były częściowo wspierane przez grant NIH ⁄ NCI (5 P30 CA13696).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
 Reodczynniki
AntimycinA Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)1397-94-0Rozpuszczony w etanolu do roztworu podstawowego o stężeniu 2 mg/ml.
Pożywka drożdżowa SGlyc (syntetyczna glicerolu) *pominąć dla SGlyc-Ura
**pominąć dla SGlyc-Leu		Rozpuścić w H2O. Dostosuj pH do 5,5 za pomocą NaHCO3. Autoklaw.

Składniki:
0,67% Drożdżowa zasada azotowa bez aminokwasów
3% Glicerol
0,05% Glukoza
2 mg/ml adenina
2 mg/ml uracyl*
1 mg/ml L-arginina
1 mg/ml L-histydyna
1 mg/ml L-leucyna**
3 mg/ml L-lizyna
2 mg/ml L-metionina
4 mg/ml L-fenyloalanina
2 mg/ml L-tryptofan
3 mg/ml L-tyrozyna
SC (syntetyczna kompletna, na bazie glukozy) pożywka dla drożdży *pomiń dla SGlyc-Ura
**pomiń dla SGlyc-Leu		Rozpuść w H2O. Dostosuj pH do 5,5 za pomocą NaHCO3. Autoklaw. Składniki:
0,67% Drożdżowa zasada azotowa bez aminokwasów
3% Glukoza
2 mg/ml adenina
2 mg/ml uracyl*
1 mg/ml L-arginina
1 mg/ml L-histydyna
1 mg/ml L-leucyna**
3 mg/ml L-lizyna
2 mg/ml L-metionina
4 mg/ml L-fenyloalaniny
2 mg/ml L-tryptofanu
3 mg/ml L-tyrozyny
ValapPołącz składniki w stosunku 1:1:1 (w:w:w). Stopić przez zanurzenie w 70 ° Kąpiel C H2O. Porcję przelać na szklane szalki Petriego. Przechowywać w temperaturze pokojowej. Składniki: < / em>
wazelina wazelinowa, twarda parafina, lanolina
 Sprzęt i oprogramowanie
Preclean Gold Seal Rite-on Micro SlidesThomas Scientific (Swedesboro, NJ)3050Rozmiar: 25 x 75 mm; Grubość: 0,93 do 1,05 mm
Wysokowydajne szkiełka nakrywkowe, nr 1.5, 18x18 mmZeiss (Thornwood, NY)474030-9000-000Mają mniej zmienną grubość (170± 5 μ m) niż standardowe szkiełka nakrywkowe, zmniejszając aberrację sferyczną i poprawiając jakość obrazowania 3D
Szkło nakrywkowe mikroskopu Fisherbrand, nr 1.5Fisher Scientific (Pittsburgh, PA)12-545ERozmiar: 22 x 22 mm, grubość nr 1.5 (170 μ m)
Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny A1 z detektorem spektralnym i obiektywem 100x/1.49 NA Apo-TIRFNikon (Melville, NY) 
Mikroskop AxioObserver.Z1 wyposażony w obiektyw Plan-Neofluar 100x/1,3NA EC (Zeiss) oraz kamerę CCD chłodzoną Orca ER (Hamamatsu) i sterowany przez oprogramowanie AxiovisionZeiss (Thornwood, NY); Hamamatsu (Hamamatsu City, Japonia) 
Oprogramowanie do analizy obrazu 3D VolocityPerkin Elmer (Waltham, MA)Moduł przywracania do dekonwolucji; Moduł ilościowy do obliczania i pomiaru współczynnika
Oprogramowanie ImageJNational Institutes of Health (Bethesda, MD)http://rsb.info.nih.gov/ij/

Bibliografia

  1. Rizzuto, R., De Stefani, D., Raffaello, A., Mammucari, C. Mitochondria as sensors and regulators of calcium signalling. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 13 (9), 566-578 (2012).
  2. Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: in sickness and in health. Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).
  3. McFaline-Figueroa, J. R., Vevea, J., et al. Mitochondrial quality control during inheritance is associated with lifespan and mother-daughter age asymmetry in budding yeast. Aging Cell. 10 (5), 885-895 (2011).
  4. Hamilton, M. L., Van Remmen, H., et al. Does oxidative damage to DNA increase with age. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 10469-10474 (2001).
  5. Cadenas, E., Davies, K. J. Mitochondrial free radical generation, oxidative stress, and aging. Free Radical Biology & Medicine. 29 (3-4), 222(2000).
  6. Mammucari, C., Rizzuto, R. Signaling pathways in mitochondrial dysfunction and aging. Mechanisms of Ageing and Development. 131 (7-8), 536-543 (2010).
  7. Lin, M. T., Beal, M. F. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases. Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).
  8. Schon, E. A., Przedborski, S. Mitochondria: the next (neurode)generation. Neuron. 70 (6), 1033-1053 (2011).
  9. Taylor, E. R., Hurrell, F., Shannon, R. J., Lin, T. -K., Hirst, J., Murphy, M. P. Reversible glutathionylation of complex I increases mitochondrial superoxide formation. The Journal of Biological Chemistry. 278 (22), 19603-19610 (2003).
  10. Beer, S. M., Taylor, E. R., et al. Glutaredoxin 2 catalyzes the reversible oxidation and glutathionylation of mitochondrial membrane thiol proteins: implications for mitochondrial redox regulation and antioxidant defense. The Journal of Biological Chemistry. 279 (46), 47939-47951 (2004).
  11. Tretter, L., Adam-Vizi, V. Inhibition of Krebs cycle enzymes by hydrogen peroxide: A key role of [alpha]-ketoglutarate dehydrogenase in limiting NADH production under oxidative stress. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 20 (24), 8972-899 (2000).
  12. Nulton-Persson, A. C., Szweda, L. I. Modulation of mitochondrial function by hydrogen peroxide. The Journal of Biological Chemistry. 276 (26), 23357-23361 (2001).
  13. Gardner, P. R., Fridovich, I. Effect of glutathione on aconitase in Escherichia coli. Archives of Biochemistry and Biophysics. 301 (1), 98-102 (1993).
  14. Gardner, P. R., Raineri, I., Epstein, L. B., White, C. W. Superoxide radical and iron modulate aconitase activity in mammalian cells. The Journal of Biological Chemistry. 270 (22), 13399-13405 (1995).
  15. Schafer, F., Buettner, G. Redox environment of the cell as viewed through the redox state of the glutathione disulfide/glutathione couple. Free Radical Biology and Medicine. 30 (11), 1191-1212 (2001).
  16. Maechler, P., Wang, H., Wolheim, C. B. Continuous monitoring of ATP levels in living insulin secreting cells expressing cytosolic firefly luciferase. FEBS Lett. 422, 328-332 (1998).
  17. Ouhabi, R., Boue-Grabot, M., Mazat, J. P. Mitochondrial ATP synthesis in permeabilized cells: Assessment of the ATP/O values in situ. Anal. Biochem. 263, 169-175 (1998).
  18. Strehler, B. L., Totter, J. R. Firefly luminescence in the study of energy transfer mechanism in substrates and enzymes determinations. Arch. Biochem. Biophys. 40, 28-41 (1952).
  19. Lemasters, J. J., Backenbrock, C. R. Adenosine triphosphate: Continuous measurement in mitochondrial suspension by firefly luciferase luminescence. Biochem. Biophys. Res. Commun. 55, 1262-1270 (1973).
  20. Wibom, R., Lundin, A., Hultman, E. A sensitive method for measuring ATP formation in rat muscle mitochondria. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 50, 143-152 (1990).
  21. Manfredi, G., Spinazzola, A., Checcarelli, N., Naini, A. Assay of Mitochondrial ATP Synthesis in Animal Cells. Methods in Cell Biology, Mitochondria. Pon, L. A., Schon, E. A. 65, Academic Press. New York. 133-145 (2001).
  22. DeLuca, M. Firefly luciferase. Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 44, 37-68 (1976).
  23. Atamna, H., Frey, W. H. Mechanisms of mitochondrial dysfunction and energy deficiency in Alzheimer's disease. Mitochondrion. 7, 297-310 (2007).
  24. Hanson, G. T., Aggeler, R., et al. Investigating mitochondrial redox potential with redox-sensitive green fluorescent protein indicators. J. Biol. Chem. 279 (13), 13044-13053 (2004).
  25. Dooley, C. T., Dore, T. M., Hanson, G. T., Jackson, W. C., Remington, S. J., Tsien, R. Y. Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators. J. Biol. Chem. 279 (21), 22284-22293 (2004).
  26. Schwarzländer, M., Fricker, M. D., et al. Confocal imaging of glutathione redox potential in living plant cells. Journal of Microscopy. 231 (2), 299-316 (2008).
  27. Nakano, M., Imamura, H., Nagai, T., Noji, H. Ca2+ regulation of mitochondrial ATP synthesis visualized at the single cell level. ACS Chem Biol. 6 (7), 709-715 (2011).
  28. Berg, J., Hung, Y. P., Yellen, G. A genetically encoded fluorescent reporter of ATP:ADP Ratio. Nature Methods. 6 (2), 161-166 (2009).
  29. Gietz, R. D., Woods, R. A. Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method. Methods in Enzymology. 350, 87-96 (2002).
  30. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9, 671-675 (2012).
  31. Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science (New York, N.Y.). 297 (5588), 1873-1877 (2002).
  32. Dairaku, N., Kato, K., et al. Oligomycin and antimycin A prevent nitric oxide-induced apoptosis by blocking cytochrome c leakage. J. Lab. Clin. Med. 143 (3), 141-153 (2004).
  33. Cannon, M. B., Remington, S. J. Re-engineering redox-sensitive green fluorescent protein for improved response rate. Protein Sci. , 45-57 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Biosensory ATProGFP mitochondriówsonda FRET do ATPmitochondria drożdżymikroskopia fluorescencyjnaanaliza obrazuprotokół progowaniarozdzielczość subkomórkowa
Biosensory ratiometryczne, które mierzą mitochondrialny stan redoks i ATP w żywych komórkach drożdży
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.