Artykuł metodologiczny

Zaawansowane podejścia genetyczne w Chlamydia trachomatis

DOI:

10.3791/50636

⸱

23 października 2013

 , 
1Department of Molecular Genetics and Microbiology, Center for Microbial Pathogenesis, Duke University Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy metodologię przeprowadzania analizy genetycznej u Chlamydii w oparciu o mutagenezę chemiczną i sekwencjonowanie całego genomu. Ponadto opisano system wymiany DNA w zakażonych komórkach, który można wykorzystać do mapowania genetycznego. Metoda ta może mieć szerokie zastosowanie w systemach mikrobiologicznych pozbawionych systemów transformacji i narzędzi genetyki molekularnej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chlamydia trachomatis, czynnik etiologiczny chorób przenoszonych drogą płciową i infekcji oczu, pozostaje słabo scharakteryzowany ze względu na jego nieuleczalność dla eksperymentalnej transformacji z rekombinowanym DNA. Opracowaliśmy podejście do przeprowadzania analizy genetycznej C. trachomatis pomimo braku narzędzi genetyki molekularnej. Nasza metoda obejmuje: i.) mutageneza chemiczna w celu szybkiego wygenerowania obszernych bibliotek genetycznie zdefiniowanych mutantów o odrębnych fenotypach; ii.) sekwencjonowanie całego genomu (WGS) w celu zmapowania podstawowych zmian genetycznych i znalezienia powiązań między zmutowanym genem (genami) a wspólnym fenotypem; iii.) Wytwarzanie rekombinowanych szczepów poprzez koinfekcję komórek ssaków bakteriami zmutowanymi i dzikimi. W związku z tym udało nam się ustalić związki przyczynowo-skutkowe między genotypami a fenotypami. Sprzężenie chemicznie indukowanej zmienności genów i WGS w celu ustalenia korelacyjnych powiązań genotyp – fenotyp powinno mieć szerokie zastosowanie do szerokiej listy ważnych z medycznego i środowiskowego punktu widzenia mikroorganizmów, które obecnie nie są poddawane analizie genetycznej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nieodzowna wewnątrzkomórkowa bakteria Chlamydia trachomatis odpowiada za około 2,8 miliona infekcji dróg rodnych rocznie w Stanach Zjednoczonych (Center for Disease Control) z towarzyszącymi następstwami, takimi jak zapalenie miednicy, ciąże pozamaciczne i niepłodność (1). Chlamydia spp mają unikalną fizjologię z dwufazowym cyklem rozwojowym składającym się z dwóch form: zakaźnego, ale niereplikującego ciała elementarnego (EB) i niezakaźnego, ale replikacyjnego ciała siatkowego (RB). Zakażenie rozpoczyna się od przyłączenia EB do komórek nabłonka, po którym następuje endooctiotozy (2). W wakuoli związanej z błoną, zwanej inkluzją, EB różnicują się w formę RB, która następnie replikuje się przez rozszczepienie binarne. W połowie cyklu RB przechodzą z powrotem w EB, które są następnie wydalane do przestrzeni zewnątrzkomórkowej, aby zainicjować nowe rundy infekcji, gdy komórka gospodarza ulega lizie (3).

C. trachomatis jest oporny na rutynowe manipulacje za pomocą standardowych molekularnych narzędzi genetycznych, takich jak ukierunkowana wymiana genów, transpozony i transdukcja fagów, które były kluczowe dla większości badań nad genetyką bakteryjną, Nie jest jasne, w jakim stopniu poszczególne geny Chlamydii przyczyniają się do unikania odporności wrodzonej, pozyskiwania składników odżywczych, przemian rozwojowych lub innych procesów ważnych dla przetrwania patogenu w Gospodarz eukariotyczny (4). W związku z tym patogen ten pozostaje słabo scharakteryzowany pomimo swojego znaczenia klinicznego.

Genomy Chlamydia spp. są stosunkowo małe (~1 Mb) (5) z wieloma gatunkami i biowarami zsekwencjonowanymi przy użyciu technologii sekwencjonowania Next Generation. Porównawcza analiza genomu przeprowadzona przez WGS dostarczyła unikalnych spostrzeżeń na temat ewolucji gatunków chlamydiów i ich adaptacji do ludzi (6-8) oraz do pewnego stopnia dostarczyła pewnych informacji na temat potencjalnej funkcji czynników wirulencji (9, 10). Różnorodność genetyczna wykazywana przez izolaty kliniczne nie zapewnia rozdzielczości wymaganej do systematycznego mapowania funkcji większości czynników wirulencji, prawdopodobnie dlatego, że mutacje w takich genach byłyby łatwo selekcjonowane. Bez zakłócających skutków doboru naturalnego, indukowana mutagenem zmienność genów, w połączeniu ze zdefiniowanymi testami, które mierzą defekty zjadliwości, może rozszerzyć spektrum mutacji, które można badać. W szczególności mutageny chemiczne są przydatne, ponieważ mogą generować allele zerowe, warunkowe, hipomorficzne (zmniejszona funkcja) i hipermorficzne (wzmocnienie funkcji). Wraz z pojawieniem się solidnych technologii sekwencjonowania genomu nowej generacji, takie mutacje można łatwo zidentyfikować i zmapować. W ten sposób można stworzyć silne powiązania między mutacjami w genie lub szlaku genetycznym a wspólnym fenotypem, co umożliwia zastosowanie zaawansowanych podejść genetycznych.

Sekwencje genomu szczepów klinicznych ujawniły mozaicyzm między serowarami a loci częstej rekombinacji (11). Empiryczne dowody rekombinacji wykazano poprzez jednoczesne zakażenie dwóch różnych szczepów opornych na antybiotyki i selekcję podwójnie opornego rekombinowanego potomstwa, które, jak się okazało, ma wkład genetyczny z obu szczepów (12, 13). Tak więc wymiana genetyczna między szczepami typu dzikiego i zmutowanymi w warunkach koinfekcji umożliwia segregację mutacji indukowanych chemicznie w celu wskazania dotkniętego genu, który prowadzi do obserwowanego fenotypu.

Tutaj opisujemy metodologię przeprowadzania analizy genetycznej w Chlamydii w oparciu o mutagenezę chemiczną, WGS i system wymiany DNA w zakażonych komórkach (14) (Rysunek 1).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Mutageneza chemiczna

Uwaga: Odkryliśmy, że replikacyjna forma RB jest bardziej podatna na mutagenezę chemiczną niż forma EB. W połowie cyklu (od 18 do 20 hpi) RB są największe przed przejściem RB-EB. Ponieważ Chlamydia trachomatis jest obowiązkowym patogenem wewnątrzkomórkowym, wpływ mutagenu na zdrowie gospodarza może ograniczać regenerację bakterii. Stwierdzono, że komórki Vero są bardziej odporne na niekorzystne skutki wysokiego poziomu EMS niż inne badane linie komórkowe.

Segregacja mutacji przez rekombinację wymaga selekcji dla rekombinowanego potomstwa opornego na antybiotyki. Zalecamy stosowanie szczepów lekoopornych (np. ryfampicyny, spektynomycyny lub trimetoprimu) do generowania mutantów w celu umożliwienia przeprowadzenia analizy rekombinowanej i wyizolowania szczepów izogenicznych. Szczepy oporne na antybiotyki zostały wygenerowane w procesie stopniowej selekcji (15, 16).

Uwaga: Chlamydia trachomatis (szczep L2/434/Bu / ATCC VR902B) jest patogenem BSL2. Zapoznaj się z instytucjonalnymi standardowymi procedurami operacyjnymi (SOP) dotyczącymi postępowania z takimi patogenami.

  1. Przygotowanie hodowanych komórek i zakażenie:
    1. Wysiewać około 1 x 106 komórek Vero (ATCC CCL-81) na kolbę o długości25 cm2 (T25) w 3 ml pożywki Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS). Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Komórki powinny w ciągu 24 godzin utworzyć zlewającą się monowarstwę.
    2. Odsysać pożywkę. Zakażone zlewające się kolby T25 komórek Vero Chlamydią przy wielokrotności infekcji (moi) 5 (~14 x 106) w całkowitej objętości 3 ml pożywki (DMEM, 200 ng / ml cykloheksamidu, 10% FBS).
  2. Rozpocznij mutagenezę po 18 godzinach od zakażenia (hpi):
    1. Przygotować 20 mg/ml EMS (metanosulfonian etylu) w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanem (PBS) z 0,9 mM chlorku wapnia i 0,49 mM chlorku magnezu w kapturze bezpieczeństwa chemicznego, ponieważ EMS jest cieczą lotną.
      Uwaga: EMS jest silnym mutagenem i czynnikiem rakotwórczym. Neutralizacja odpadów EMS i odkażanie rozlanych płynów, plastiku, papieru i szkła za pomocą 1 M wodorotlenku sodu.
    2. Odessać pożywkę i przemyć komórki raz 3 ml PBS/MgCl2/CaCl2. Inkubować komórki z 3 ml 20 mg/ml EMS w PBS/MgCl2/CaCl2 przez jedną godzinę w dygestorium w temperaturze pokojowej. Komórki Vero są w stanie przetrwać takie stężenie EMS i warunki poza inkubatorem przez krótki czas. Należy pamiętać o dołączeniu próbki kontrolnej, która nie została zmutagizowana.
    3. Usunąć pożywkę zawierającą EMS i umieścić ją w pojemniku zawierającym 1 M NaOH w celu dezaktywacji mutagenu. Umyj zakażone komórki 3 razy w 3 ml PBS + MgCl2/CaCl2 w celu usunięcia pozostałości mutagenu. Dodać 6 ml DMEM/10% FBS z 200 ng/ml cykloheksamidu i 25 μg/ml gentamycyny i inkubować w temperaturze 5% CO2, 37 °C przez 48-72 godzin. Inkluzje wydają się pozbawione bakterii po około 36 godzinach od mutagenezy. Po 72 godzinach około 10% inkluzji jest wypełnionych bakteriami, podczas gdy reszta pozostaje pusta.
    4. Ekstrakt EB przez hipotoniczną lizę: Całkowicie aspirujące podłoże. Dodać 1,0 mlH2Oi rozdrobnić komórki przez 10 minut. Lizować komórki, pipetując w górę i w dół co najmniej 10 razy. Zebrać lizat w mikrofudze i dodać 0,250 ml 5x buforu glutaminianu fosforanu sacharozy (SPG), aby doprowadzić go do 1x końcowego stężenia. Przechowywać w temperaturze -80 °C.
      Uwaga: Poziom mutagenezy można ocenić poprzez indukcję oporności na ryfampicynę. Aby oznaczyć częstość oporności na ryfampicynę, płytka nazębna 1 x 108 i 7 x 10-krotne seryjne rozcieńczenia bakterii w obecności 200 ng/ml ryfampicyny. Częstość występowania oporności na ryfampicynę definiuje się jako liczbę blaszek opornych na ryfampicynę podzieloną przez całkowitą liczbę platerowanych bakterii. Zapoznaj się z poniższą sekcją, aby uzyskać instrukcje dotyczące płytki nazębnej.

2. Klonalna izolacja zmutowanych szczepów Chlamydia trachomatis poprzez oczyszczanie płytki nazębnej

  1. Ustaw zlewające się monowarstwy komórek Vero w 6-dołkowych płytkach: Seed ~ 0,4 x 106 komórek w 3 ml DMEM / 10% FBS na studzienkę. Pozwól komórkom utworzyć jednorodną monowarstwę w ciągu następnych 24 godzin.
  2. Rozmrozić roztwór podstawowy mutagenizowanej chlamydii na lodzie. Wykonać 6 x 10-krotne seryjne rozcieńczenia w całkowitej objętości 200 μl na rozcieńczenie w DMEM/10% FBS i umieścić je na lodzie.
    Uwaga: Miano bakterii w jednostkach tworzących inkluzje (IFU) jest dobrym oszacowaniem jednostek tworzących płytkę nazębną (pfu). Staraj się zdobyć tabliczkę 10, 100 i 1000 pfu.
  3. Umyj komórki Vero dwukrotnie 3 ml PBS na studzienkę.
  4. Dodać 3 ml DMEM do każdej studzienki dla płytek 6-dołkowych i 100 μl rozcieńczeń bakteryjnych w dwóch kroplach. Zakręć płytką, aby zapewnić równomierną mieszanie.
  5. Wirować zainfekowane płytki w temperaturze 2 700 x g przez 30 minut w temperaturze 15 °C, a następnie inkubować w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze o stężeniu 5% CO2 przez 1-2 godziny.
  6. Przygotuj 0,54% agarozy w DMEM (na 6 dołków):
    1. Dodaj następujące składniki: 18,9 ml zimnego 2x DMEM, 4,2 ml FBS, 0,42 ml 100x NEAA, 0,042 ml 200 μg/ml cykloheksamidu, 0,021 ml 50 mg / ml gentamycyny. Dobrze wymieszaj.
    2. Wymieszać z 18,9 ml gorącej, sterylnej 1,2% agarozy/H2O, mieszając, aby zapobiec tworzeniu się grudek. Mieszanina powinna być ciepła w dotyku. Przechowywać w ciepłej łaźni wodnej o temperaturze 55 °C przed dodaniem do zakażonych komórek.
  7. Odessać zawiesinę bakteryjną z szalek i nałożyć 6 ml 0,54% agarozy/DMEM na dołek. Pozostaw agarozę do całkowitego zestalenia się w temperaturze pokojowej na zewnątrz okapu przez 15 minut. Wysuszyć płytki ze zdjętymi pokrywkami w kapturze bezpieczeństwa biologicznego przez 15 min.
    Uwaga: Wibracje z biologicznego kaptura zabezpieczającego mogą zniekształcić krzepnącą agarozę.
  8. Inkubować w temperaturze 37°C w inkubatorze CO2 przez 7-10 dni. Blaszki miażdżycowe powinny być widoczne za pomocą mikroskopu preparacyjnego. (Patrz rysunek 3, aby zapoznać się z typowym obrazem tabliczek).
  9. Dzień przed wyizolowaniem mutantów wysiewaj 1 x 104 komórki Vero w 100 μl na studzienkę na 96-dołkowej płytce. Komórki będą się zlewać w ciągu 24 godzin.
  10. Za pomocą mikroskopu preparacyjnego zaznacz płytki do pobrania. Zebrać zatyczki płytki za pomocą sterylnej końcówki do pipet barierowych o pojemności 1,0 ml.
  11. Zawiesić blaszki w 100 μl DMEM uzupełnionym 10% FBS, 400 ng / ml cykloheksamidu, 50 μg / ml gentamycyny.
  12. Aby rozbudować zmutowane szczepy, nałóż zawiesinę na zbiegające się monowarstwy komórek Vero. Wirować płytki przy 2 700 x g, 15°C przez 30 min.
  13. Inkubować w temperaturze 37°C/5% CO2 w nawilżanym inkubatorze. Zbierz EB, gdy >50% komórek jest zainfekowanych, co może wystąpić już po 48 hpi i dopiero po 14 dniach. Taka ilość zainfekowanych komórek pozwala na przechowywanie wystarczającej ilości żywotnych bakterii. Zmutowane szczepy różnią się tempem wzrostu i zakaźnością. Pozwól wolno rosnącym szczepom naturalnie ponownie zainfekować sąsiednie komórki, aż wystarczająca liczba komórek zostanie zainfekowana.
  14. Ekstrakcja EB przez hipotoniczną lizę zakażonych komórek:
    1. Całkowicie zasysać pożywkę.
    2. Dodać 160 μl sterylnej wody. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
    3. Rozbijaj komórki, kilkakrotnie pipetując w górę iw dół, aby zapewnić całkowitą lizę, użyj końcówek barierowych, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego.
    4. Przenieś 160 μl lizatów do probówek do mikrofuge.
    5. Wymieszać z 40 μl 5x SPG. Przechowywać w temperaturze -80 °C.
  15. Oznaczanie i badanie przesiewowe mutantów pod kątem fenotypu (fenotypów) będącego przedmiotem zainteresowania.

3. Sekwencjonowanie całego genomu wybranych mutantów Chlamydii

  1. Ekstrakcja genomowego DNA z oczyszczonych gradientowo EB, które są w dużej mierze wolne od zanieczyszczającego DNA gospodarza. Protokoły hodowli Chlamydii na dużą skalę i oczyszczania EB można znaleźć w odnośniku (17). Użyj komercyjnych zestawów do oczyszczania genomowego DNA (np. Qiagen kat. 69504), aby wyekstrahować DNA z 2 x 109 bakterii zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. Użyj fluorometru (Qubit, Invitrogen cat. Q32866), aby dokładnie zmierzyć ilość DNA. Do platformy sekwencjonowania Illumina wymagane jest 1-5 μg oczyszczonego DNA.
    Uwaga: Do sekwencjonowania genomów bakteryjnych można użyć kilku platform, w tym systemów opartych na Illumina/Solexa i SoliD. Zdecydowaliśmy się na użycie HiSeq (Illumina), ponieważ zapewnia on dużą gęstość krótkich, ale wysokiej jakości odczytów sekwencjonowania. Sekwencatory genomu na mniejszą skalę, takie jak IonTorrent (Life Technologies) i MySeq (Illumina) są również odpowiednie i więcej niż wystarczające do multipleksowania tych wygaszania do 4 genomów Chlamydii na raz, co przekracza minimalne pokrycie 25-krotne dla odpowiedniego złożenia genomu. Przygotowanie bibliotek sekwencjonowania DNA dla platformy Illumina opisano poniżej.
  3. Fragmentuj DNA do odpowiedniej wielkości (300-400 par zasad do sekwencjonowania Illumina) za pomocą instrumentu Adaptive Focused Acoustics S220 (Covaris) zgodnie z sugerowanymi przez producenta ustawieniami. Uwaga: Fragmentacja DNA przez nebulizację powoduje większą utratę próbki z powodu aerozolizacji próbki.
  4. Przygotuj biblioteki sekwencjonowania genomu przy użyciu komercyjnych zestawów konstrukcyjnych (Illumina FC-102-1001), postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Biblioteki mogą być indeksowane za pomocą starterów z kodami kreskowymi (Illumina FC-121-1003), dzięki czemu wiele próbek może być łączonych i sekwencjonowanych jednocześnie.
  5. Uruchom sekwencjonowanie próbek. Ten etap jest zwykle wykonywany przez usługi komercyjne lub główne obiekty obsługiwane przez dedykowany personel techniczny. Postępuj zgodnie z ich procedurami i zaleceniami.
  6. Odczyty Illumina (format FASTQ) mogą być zestawiane z genomem referencyjnym za pomocą przyjaznego dla użytkownika oprogramowania graficznego interfejsu użytkownika, takiego jak Geneious (Biomatters), które może być również wykorzystywane do identyfikacji SNP/mutacji. Aby zmapować mutacje, ustaw parametry na 90% dla minimalnej częstości wariantu i 50X dla minimalnego pokrycia. Można również stosować asemblery genomu typu open source, takie jak MAQ (18) i BWA (19).
  7. Potwierdź mutacje za pomocą sekwencjonowania Sangera: użyj genomowego DNA jako matrycy do amplifikacji PCR regionów 300-500 pz otaczających zidentyfikowane mutacje i sekwencjonuj oczyszczone lub rozcieńczone (1:20) produkty PCR za pomocą sekwencjonowania Sangera.

4. Generacja rekombinantów Chlamydii

Uwaga: Chlamydia może wymieniać DNA podczas infekcji, co pozwala na generowanie rekombinowanych szczepów (12, 13, 20). Po jednoczesnej infekcji komórek dwoma unikalnymi szczepami opornymi na antybiotyki, rekombinowane "potomstwo" może zostać wybrane pod kątem podwójnej oporności na antybiotyki (12, 13). Wykorzystaliśmy to zjawisko do segregacji mutacji i wygenerowania szczepów koizogenicznych. W związku z tym zmutowane szczepy wytworzono na tle oporności na antybiotyki (np. oporność na ryfampicynę (rifR) H471Y w CTL0567 (rpoB)) w taki sposób, że można je krzyżować ze szczepem typu dzikiego zawierającym inny allel oporny na antybiotyki (np. oporność na spektynomycynę (spcR), G1197A w r01/r02 (16SRNA kopie 1 i 2)). Szczegółowe informacje na temat wymiany i rekombinacji DNA w Chlamydii można znaleźć w piśmiennictwie (12, 13).

  1. Współinfekuj zmutowane szczepy typu dzikiego i klonalnego poprzez odwirowanie6 x 105 bakterii z każdego szczepu na zlewające się monowarstwy komórek Vero wyhodowanych na 24-dołkowej płytce. Równolegle infekuj monowarstwy każdym szczepem z osobna.
  2. Przy 44 hpi zbierz EB przez hipotoniczną lizę zakażonych komórek:
    1. Całkowicie zasysać pożywkę.
    2. Dodać 0,4 ml sterylnej wody i odstawić na 10 minut.
    3. Lizuj komórki poprzez energiczne pipetowanie w górę i w dół przez co najmniej 10 razy. Przenieś lizaty do probówki do mikrofuge.
    4. Wymieszaj 0,1 ml 5x SPG, aby uzyskać końcowe stężenie 1x SPG.
    5. Surowe lizaty mogą być użyte natychmiast lub przechowywane w temperaturze -80 °C.
  3. Płytka nazębna: 50 μl surowego preparatu EB i 5 seryjnych rozcieńczeń 1:10 w agarozie/DMEM, uzupełnione odpowiednimi antybiotykami w celu wyboru rekombinantów. (Patrz tabela stężeń typowych antybiotyków w celu wyboru rekombinantów.)
  4. Płytka nazębna oczyszcza i wzbogaca rekombinowane szczepy jak wyżej. Oceniaj rekombinanty pod kątem obecności lub braku pożądanego fenotypu. Ekstrahować DNA ze szczepów rekombinowanych przez poddawanie działaniu DNAzolu (następna sekcja) w celu genotypowania na obecność lub brak mutacji.
  5. Krzyżówki można powtarzać ze szczepami noszącymi inne markery oporności na antybiotyki w celu dalszej segregacji mutacji i wytworzenia szczepów izogenicznych. Jednoczesne zakażenie wybranych rekombinantów do innego szczepu typu dzikiego noszącego inny marker antybiotykowy.

Tabela 1: Stężenia antybiotyków do wyboru rekombinantów:

Stężenie końcowe Wskazówki dotyczące przygotowania 200 ng/ml ryfampicyny Przygotować zapas 25 mg/ml w dimetylosulfotlenku (DMSO). Uzupełnić 200 μg/ml roztworu roboczego, rozcieńczając zapasH2O. Przechowywać w temperaturze -20 °C w ciemności. 200 μg/ml trimetoprimu Zrób zapas 100 mg / ml w DMSO. Przechowywać w temperaturze -20 °C 200 μg/ml spektynomycyny Przygotować zapas 100 mg/ml w wodzie w 100 μl podwielokrotności. Przechowywać w temperaturze -20 °C. Unikać wielokrotnego zamrażania i rozmrażania.

5. Ekstrakcja genomowego DNA z rekombinowanych szczepów w celu genotypowania

Uwaga: Można również używać zestawów do oczyszczania opartych na kolumnach. Zaletą ekstrakcji DNA za pomocą leczenia DNAzolem jest koszt.

  1. Zakażone 1,2 x 105 chlamydii na monowarstwy komórek Vero wyhodowanych na 12-dołkowych płytkach.
  2. Przy 36-48 hpi odessać pożywkę i dodać 0,375 ml DNAzolu (Invitrogen 10503-027). Delikatnie wymieszaj komórki i odpipetuj lizaty do probówki o pojemności 1,5 ml.
  3. Wytrącić DNA przez dodanie 0,188 ml 100% etanolu. Wymieszaj przez odwrócenie.
  4. Ekstrahuj DNA przez nawinięcie na szpulę za pomocą końcówki pipety i umieść je w czystej probówce. Alternatywnie, osadzać DNA przez odwirowywanie z maksymalną prędkością przez 2 minuty w temperaturze pokojowej lub 4 °C i zdekantować supernatant.
  5. Przemyć osad DNA dwukrotnie 1,0 ml 75% etanolu.
  6. Suszenie DNA na powietrzu po usunięciu etanolu przez 15 sekund.
  7. Rozpuścić DNA za pomocą 0,2 ml 8 mM NaOH, a następnie zneutralizować do pH 8,0 za pomocą 20,2 μl 0,1 M HEPES. Do końcowej objętości 0,5 ml uzupełnić wodą lub TE. Alternatywnie, ponownie zawiesić DNA w buforze TE (osad DNA nie zostanie całkowicie rozpuszczony).
  8. Użyj DNA wyekstrahowanego DNAzolem jako matrycy do amplifikacji PCR regionów 300-500 pz flankujących zidentyfikowane mutacje. Sekwencjonowanie oczyszczonych lub rozcieńczonych (1:20) produktów PCR metodą sekwencjonowania Sangera.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Narażenie na mutagen prowadzi do inkluzji, które wydają się pozbawione bakterii, przypuszczalnie z powodu śmierci komórek bakteryjnych. Zazwyczaj serowar LGV-L2 powoduje całkowitą lizę zakażonych komórek w ciągu 48 godzin po zakażeniu, ale leczenie mutagenami może wydłużyć ten cykl do >90 godzin. Oczekuje się, że około 10% inkluzji odbuduje się. W naszych eksperymentach zakażone komórki Vero traktowane EMS w dawce 20 mg/ml doprowadziły do 99% spadku powrotu do zdrowia zakaźnego potomstwa w porównaniu z nieleczonymi kontr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metodologia ta spełnia podstawowe wymagania analizy genetycznej, ponieważ ustanawia powiązanie między genotypami a fenotypami. Co istotne, zostaje to osiągnięte bez pomocy konwencjonalnych narzędzi molekularnych do transformacji rekombinowanym DNA i inaktywacji insercyjnej genów w bakteriach, co często stanowi etap ograniczający tempo analizy funkcji genów u drobnoustrojów niebędących organizmami modelowymi.

Krytycznym krokiem jest zapewnienie klonalności mutantów oczyszczonych z plam (plaque-...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie ma nic do ujawnienia.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Dulbecco' s Zmodyfikowane podłoże Eagle (DMEM)Life Technologies11995-073
Surowica bydlęca płodu (FBS)Cellgro35-010-CV
Metanosulfonian etylu (EMS) SigmaM0880
CykloheksamidSigmaC4859-1ML
Gentamycyna Life Technologies15750-060
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Life Technologies14190-144
Roztwór soli fizjologicznej buforowany fosforanem (PBS) z 0,493 mM MgCl2 i 0,901 mM CaCl2 (PBS+MgCl2/CaCl2)Life Technologies14040-133
1 M bufor NaOH
5x SPG (1,25 M sacharozy, 50 mM fosforan sodu, 25 mM kwas glutaminowy)
Bufor SPG (0,25 M sacharozy, 10 mM fosforan sodu, 5 mM kwas glutaminowy)
Woda (sterylna, klasa hodowli tkankowej)
2x DMEM (przygotowany z proszku, buforowany 7,4 g/L Wodorowęglan soduSigmaD7777
Aminokwasy endogenne (NEAA) Technologieżycia11140-050
1,2% GTG Agaroza, autoklawizowanaLonzo50070
Zestawy do oczyszczania genomowego DNAQiagen69504
DNAzolLife Technologies10503-027
Etanol (klasa biologii molekularnej)
8 mM NaOH
0,1 M HEPES (4-(2-hydroksyetylo)-1- kwas piperazynoetanosulfonowy) bufor
25 cm2 kolby do hodowli tkankowych (kolby T25)
6-dołkowe płytki do hodowli tkankowych
kultur
tkankowych 96-dołkowe płytki do hodowli tkankowych
Kaptur
Biologiczny kaptur
bezpieczeństwa>Wirówka i adaptery do wirowania płytek
>Mikroskop
Fluorometr (kubit)InvitrogenQ32866
Adaptacyjna akustyka skoncentrowana S220 instrumentCovaris
12-dołkowe płytki dobezpieczeństwa chemicznego tkankowychpreparacyjny

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Haggerty, C. L., et al. Risk of sequelae after Chlamydia trachomatis genital infection in women. J Infect Dis. 201, Suppl 2. S134-S155 (2010).
  2. Dautry-Varsat, A., Subtil, A., Hackstadt, T. Recent insights into the mechanisms of Chlamydia entry. Cell Microbiol. 7 (12), 1714-1722 (2005).
  3. Hybiske, K., Stephens, R. S. Mechanisms of Chlamydia trachomatis entry into nonphagocytic cells. Infect Immun. 75 (8), 3925-3934 (2007).
  4. Heuer, D., Kneip, C., Maurer, A. P., Meyer, T. F. Tackling the intractable - approaching the genetics of Chlamydiales. Int J Med Microbiol. 297 (7-8), 569-576 (2007).
  5. Stephens, R. S., et al. Genome sequence of an obligate intracellular pathogen of humans, Chlamydia trachomatis. Science. 282 (5389), 754-759 (1998).
  6. Thomson, N. R., et al. Chlamydia trachomatis, genome sequence analysis of lymphogranuloma venereum isolates. Genome Res. 18 (1), 161-171 (2008).
  7. Harris, S. R., et al. Whole-genome analysis of diverse Chlamydia trachomatis strains identifies phylogenetic relationships masked by current clinical typing. Nat Genet. 44 (4), 413-419 (2012).
  8. Somboonna, N., et al. Hypervirulent Chlamydia trachomatis clinical strain is a recombinant between lymphogranuloma venereum (L(2)) and D lineages. MBio. 2 (3), e00045-00011(2011).
  9. Voigt, A., Schofl, G., Saluz, H. P. The Chlamydia psittaci genome, a comparative analysis of intracellular pathogens. PLoS One. 7 (4), e35097(2012).
  10. Jeffrey, B. M., et al. Genome sequencing of recent clinical Chlamydia trachomatis strains identifies loci associated with tissue tropism and regions of apparent recombination. Infect Immun. 78 (6), 2544-2553 (2010).
  11. Gomes, J. P., et al. Evolution of Chlamydia trachomatis diversity occurs by widespread interstrain recombination involving hotspots. Genome Res. 17 (1), 50-60 (2007).
  12. DeMars, R., Weinfurter, J. Interstrain gene transfer in Chlamydia trachomatis in vitro, mechanism and significance. J Bacteriol. 190 (5), 1605-1614 (2008).
  13. Demars, R., Weinfurter, J., Guex, E., Lin, J., Potucek, Y. Lateral gene transfer in vitro in the intracellular pathogen Chlamydia trachomatis. J Bacteriol. 189 (3), 991-1003 (2007).
  14. Nguyen, B. D., Valdivia, R. H. Virulence determinants in the obligate intracellular pathogen Chlamydia trachomatis revealed by forward genetic approaches. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (4), 1263-1268 (2012).
  15. Tipples, G., McClarty, G. Isolation and initial characterization of a series of Chlamydia trachomatis isolates selected for hydroxyurea resistance by a stepwise procedure. J Bacteriol. 173 (16), 4932-4940 (1991).
  16. Wang, L. L., Henson, E., McClarty, G. Characterization of trimethoprim- and sulphisoxazole-resistant Chlamydia trachomatis. Mol Microbiol. 14 (2), 271-281 (1994).
  17. Scidmore, M. A. Cultivation and Laboratory Maintenance of Chlamydia trachomatis. Curr Protoc Microbiol. Chapter 11, Unit 11A 11(2005).
  18. Li, H., Ruan, J., Durbin, R. Mapping short DNA sequencing reads and calling variants using mapping quality scores. Genome Res. 18 (11), 1851-1858 (2008).
  19. Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).
  20. Suchland, R. J., Sandoz, K. M., Jeffrey, B. M., Stamm, W. E., Rockey, D. D. Horizontal transfer of tetracycline resistance among Chlamydia spp. in vitro. Antimicrob Agents Chemother. 53 (11), 4604-4611 (2009).
  21. Sladek, F. M., Melian, A., Howard-Flanders, P. Incision by UvrABC excinuclease is a step in the path to mutagenesis by psoralen crosslinks in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (11), 3982-3986 (1989).
  22. Wang, Y., et al. Development of a transformation system for Chlamydia trachomatis, restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector. PLoS Pathog. 7 (9), e1002258(2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mutageneza chemicznasekwencjonowanie ca ego genomuasocjacja genotyp fenotypszczepy rekombinowanetest plackowymutageneza EMSkom rki Veroliza hipotonicznaforwardowy screening genetyczny

Powiązane artykuły