Artykuł metodologiczny

Modele i metody oceny transportu systemów dostarczania leków przez bariery komórkowe

46.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50638

⸱

17 października 2013

 , 
1Fischell Department of Bioengineering, University of Maryland, 2Institute for Bioscience and Biotechnology Research, University of Maryland

W tym artykule

Podsumowanie

Wiele zastosowań terapeutycznych wymaga bezpiecznego i wydajnego transportu nośników leków i ich ładunków przez bariery komórkowe w ciele. W artykule opisano adaptację uznanych metod do oceny szybkości i mechanizmu transportu nanonośników leków (NC) przez bariery komórkowe, takie jak nabłonek przewodu pokarmowego (GI).

Streszczenie

Nośniki submikrometrowe (nanonośniki; NCs) zwiększają skuteczność leków poprzez poprawę rozpuszczalności, stabilności, czasu krążenia, celowania i uwalniania. Dodatkowo, pokonywanie barier komórkowych w organizmie ma kluczowe znaczenie zarówno dla doustnego dostarczania terapeutycznych NC do krążenia, jak i transportu z krwi do tkanek, gdzie potrzebna jest interwencja. Transport NC przez bariery komórkowe osiąga się poprzez: (i) drogę parakomórkową, poprzez przejściowe przerwanie połączeń, które blokują sąsiednie komórki, lub (ii) drogę transkomórkową, w której materiały są internalizowane przez endocytozę, transportowane przez ciało komórki i wydzielane na przeciwległej powierzchni komórki (transyctoza). Dostarczanie przez bariery komórkowe może być ułatwione poprzez sprzężenie środków terapeutycznych lub ich nośników ze środkami celującymi, które wiążą się specyficznie z markerami powierzchniowymi komórek biorącymi udział w transporcie. W tym miejscu przedstawiamy metody pomiaru zakresu i mechanizmu transportu NC przez modelową barierę komórkową, która składa się z monowarstwy komórek nabłonka przewodu pokarmowego (GI) wyhodowanych na porowatej membranie umieszczonej we wkładce transwell. Powstanie bariery przepuszczalności potwierdza się poprzez pomiar przeznabłonkowego oporu elektrycznego (TEER), transepiteliczny transport substancji kontrolnej oraz barwienie immunologiczne połączeń ścisłych. Jako przykład stosuje się polimerowe NC o długości ~200 nm, które przenoszą ładunek terapeutyczny i są pokryte przeciwciałem, które jest ukierunkowane na determinant powierzchni komórki. Przeciwciało lub ładunek terapeutyczny jest znakowany 125I w celu śledzenia radioizotopów, a znakowane NC są dodawane do górnej komory nad monowarstwą komórki przez różne okresy czasu. Można wykryć NC związane z komórkami i/lub transportowane do leżącej poniżej komory. Pomiar wolnego 125I pozwala na odjęcie frakcji zdegradowanej. Trasa parakomórkowa jest oceniana poprzez określenie potencjalnych zmian spowodowanych transportem NC do opisanych powyżej parametrów bariery. Transport transkomórkowy jest determinowany poprzez zajęcie się efektem modulacji endocytozy i szlaków transcytozy.

Wprowadzenie

Bariery komórkowe w ciele działają jak brama między środowiskiem zewnętrznym a wewnętrznymi kompartmentami. Tak jest w przypadku wyściółki nabłonka oddzielającej zewnętrznie odsłoniętą powierzchnię przewodu pokarmowego (GI) i krwiobiegu1-3. Bariery komórkowe stanowią również granicę między krwiobiegiem a miąższem oraz składnikami komórkowymi tkanek i narządów. Dzieje się tak w przypadku wewnętrznej wyściółki śródbłonka w naczyniach krwionośnych, takich jak bariera krew-płuca, bariera krew-mózg itp.1 Zdolność do przekraczania tych barier komórkowych w organizmie ma kluczowe znaczenie dla skutecznego dostarczania środków terapeutycznych i diagnostycznych do krążenia i tkanek/narządów, w których potrzebna jest interwencja.

Aby usprawnić dostarczanie środków terapeutycznych lub diagnostycznych, związki te mogą być ładowane do submikrometrowych nanonośników (NC). Te nośniki leków mogą być formułowane z różnymi substancjami chemicznymi i strukturami w celu optymalizacji rozpuszczalności leków, ochrony, farmakokinetyki, uwalniania i metabolizmu4,5. NC mogą być również funkcjonalizowane za pomocą ugrupowań o powinowactwie lub ugrupowaniach celujących (np. przeciwciała, peptydy, cukry, aptamery itp.), aby ułatwić adhezję do obszarów ciała, w których wymagane jest działanie terapeutyczne2,6. Ukierunkowanie NC na determinanty wyrażone na powierzchni barier komórkowych może dodatkowo ułatwić transport do i/lub przez te wyściółki2,6.

Rola selektywnego transportu substancji między dwoma środowiskami wymaga pewnych unikalnych cech wśród warstw komórkowych. Jedną z takich cech jest polaryzacja komórek, przy której błona wierzchołkowa skierowana w stronę światła jam różni się od błony podstawno-bocznej zorientowanej w kierunku śródmiąższu tkanki, w odniesieniu do morfologii błony i składu lipidów, transporterów i receptorów2. Kolejną cechą są połączenia międzykomórkowe łączące sąsiednie komórki. Regulacja białek, które tworzą ścisłe połączenia, w szczególności cząsteczek adhezyjnych złączy (JAM), okludyn i klaudyn, moduluje funkcję bariery, aby selektywnie zezwalać lub nie zezwalać na transport substancji między komórkami, znany jako transport parakomórkowy, umożliwiając przejście materiałów ze światła do przestrzeni podstawno-bocznej3. Wiązanie wielu naturalnych i syntetycznych elementów (leukocytów, molekuł, cząsteczek i systemów dostarczania leków) z barierami komórkowymi w organizmie może wywołać otwarcie połączenia komórkowego, które może być przejściowe i stosunkowo nieszkodliwe lub bardziej długotrwałe, a zatem niebezpieczne przy dostępie niepożądanych substancji przez barierę2,5,7-9. W związku z tym szlak ten można ocenić, mierząc przeznabłonkowy opór elektryczny (TEER) i bierną parakomórkową dyfuzję cząsteczek (zwaną tutaj przeciekiem parakomórkowym), przy czym zmniejszona rezystancja prądu elektrycznego lub zwiększony wyciek parakomórkowy obojętnego związku do przestrzeni podstawno-bocznej wskazują odpowiednio na otwarcie połączeń komórkowych5,10,11. Aby uzupełnić te metody, każde z wymienionych powyżej białek połączeń ścisłych można wybarwić w celu oceny ich integralności, przy czym barwienie powinno wydawać się skoncentrowane na granicach komórka-komórka na całym obwodzie komórki5,10,12.

Alternatywnie, systemy dostarczania leków, które celują w określone determinanty powierzchni komórek, takie jak te związane z dołami pokrytymi klatryną lub wgłębieniami błony w kształcie kolby zwanymi kaweolami, mogą wywoływać wychwyt pęcherzykowy do komórek przez endocytozę, zapewniając drogę do dostarczania leku do przedziałów wewnątrzkomórkowych5,13. Ponadto endocytoza może prowadzić do transportu pęcherzyków przez ciało komórki w celu uwolnienia po stronie podstawno-bocznej, zjawisko znane jako transyctoza lub transport międzykomórkowy14. W związku z tym wiedza na temat kinetyki i mechanizmu endocytozy może być wykorzystana do wykorzystania wewnątrzkomórkowego i transkomórkowego dostarczania leków, które oferuje stosunkowo bezpieczny i kontrolowany sposób dostarczania w porównaniu z drogą parakomórkową. Mechanizm endocytozy można ocenić za pomocą modulatorów klasycznych szlaków (endocytoza za pośrednictwem klatryny i kaweoliny oraz makropinocytoza) lub nieklasycznych (takich jak endocytoza za pośrednictwem cząsteczki adhezyjnej komórek (CAM))5,13,15.

Podczas gdy transport wewnątrzkomórkowy jest często badany w standardowych studzienkach lub szkiełkach nakrywkowych, brak podstawno-bocznego kompartmentu wyklucza polaryzację komórek i możliwość badania transportu między warstwami komórek. Aby pokonać tę przeszkodę, transport przez monowarstwy komórek jest od dawna badany przy użyciu wkładek transwell10,11,16,17, które składają się z górnej (wierzchołkowej) komory, porowatej przepuszczalnej membrany, do której komórki przyczepiają się i tworzą ciasną monowarstwę, oraz dolnej (podstawno-bocznej) komory (ryc. 1). W tej konfiguracji transport można mierzyć w kierunku wierzchołkowym do podstawno-bocznym poprzez podanie zabiegu do górnej komory, po transporcie przez monowarstwę komórkową i leżącą poniżej porowatą błonę, a na koniec zebranie pożywki w dolnej komorze w celu ilościowego określenia transportowanego materiału. Transport w kierunku podstawno-bocznym do wierzchołkowego można również zmierzyć przez początkowe podanie do dolnej komory, a następnie pobranie z górnej komory5,10,12,16. Istnieją różne techniki weryfikacji tworzenia bariery przepuszczalności na transwellach, w tym testy TEER i transportu parakomórkowego, jak opisano powyżej. Ponadto filtr przepuszczalny, na którym hodowane są komórki, może zostać usunięty w celu analizy obrazowej (np. za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, konfokalnej, elektronowej), w ramach dalszej walidacji modelu monowarstwowego komórki, a także mechanizmu transportu. Wybór typu membrany, która jest dostępna w różnych rozmiarach porów, materiałach i powierzchniach, zależy od różnych czynników, takich jak wielkość substancji lub przedmiotów do transportu, typ komórki i metoda obrazowania16,18-20. Wkładki Transwell ułatwiają również kontrolowaną i dokładną kwantyfikację transportu w porównaniu ze złożonymi systemami ssaków, ponieważ objętość komór i powierzchnia komórek są znanymi stałymi. Podczas gdy wiele czynników związanych z dostarczaniem in vivo jest eliminowanych, w tym obecność śluzu jelitowego, stres ścinający, enzymy trawienne, komórki odpornościowe itp., ten model in vitro na małą skalę dostarcza użytecznych wstępnych informacji dotyczących transportu.

Jako przykład ilustrujący adaptację tych metod do badania transportu NC przez bariery komórkowe10,11,16,17, opisujemy tutaj przypadek, w którym potencjał transportu NC przez nabłonek przewodu pokarmowego został zamodelowany poprzez ocenę przejścia modelowego systemu dostarczania leków przez monowarstwę komórek ludzkiego nabłonkowego gruczolakoraka jelita grubego (Caco-2). W tym celu komórki hodowano we wkładkach transwell, na filtrze z politereftalanu etylenu (PET) o porach 0,8 μm (średnica 6,4 mm), który jest przezroczysty i może być używany do obrazowania mikroskopowego. Stan bariery przepuszczalności jest weryfikowany poprzez pomiar TEER, transportu wierzchołkowego do podstawno-bocznego substancji kontrolnej, albuminy oraz wizualizację pod mikroskopem fluorescencyjnym elementu połączeń ścisłych, białka okludyny. Zastosowano model docelowego polimeru NC, składającego się z niebiodegradowalnych nanocząstek polistyrenu o długości 100 nm. NC są powlekane przez adsorpcję powierzchniową samym przeciwciałem celującym lub kombinacją przeciwciała docelowego i ładunku terapeutycznego, przy czym każdy składnik może być znakowany za pomocą 125I w celu śledzenia izotopów promieniotwórczych. W wybranym przykładzie przeciwciało rozpoznaje międzykomórkową cząsteczkę adhezyjną-1 (ICAM-1), białko ulegające ekspresji na powierzchni komórek nabłonka przewodu pokarmowego (i innych) komórek, które, jak wykazano, ułatwia wewnątrzkomórkowy i transkomórkowy transport nośników leków i ich ładunków21. Ładunek to alfa-galaktozydaza (α-Gal), enzym terapeutyczny stosowany w leczeniu choroby Fabry'ego, genetycznego lizosomalnego zaburzenia spichrzeniowego22.

Powlekane NC, o wielkości około 200 nm, są dodawane do komory wierzchołkowej nad monowarstwą komórki i inkubowane w temperaturze 37 °C przez różne okresy czasu, po czym można wykryć 125I na NC związanych z monowarstwą komórki i/lub przetransportowane do komory podstawno-bocznej poniżej komórek. Dodatkowe wyznaczenie wolnego 125I pozwala na odjęcie frakcji zdegradowanej i oszacowanie natoczonego transportu NC. Mechanizm transportu jest dalej oceniany poprzez badanie zmian bariery przepuszczalności odnoszącej się do drogi parakomórkowej, poprzez parametry opisane powyżej, podczas gdy transport transkomórkowy jest określany poprzez badanie zmian w transporcie podczas modulacji szlaków endocytozy i transcytozy.

Te metody dostarczają cennych informacji na temat modeli barier komórkowych, zakresu i szybkości transportu systemu dostarczania leków oraz mechanizmu tego transportu, co pozwala na ocenę możliwości dostarczania leków przez bariery komórkowe.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Hodowla monowarstwy komórkowej we wkładkach Transwell

  1. W sterylnym kapturze do hodowli komórkowych o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 umieść wkładki transwell PET o porach 0,8 mm na płytce 24-dołkowej (4 dołki na warunek, dla istotności statystycznej) za pomocą kleszczy. Wszystkie materiały wchodzące do okapu należy wysterylizować etanolem.

Uwaga: Wielkość porów filtra musi być wybrana zgodnie ze średnią wielkością użytego NC, aby umożliwić transport przez membranę. Ponadto, aby uzyskać statystycznie istotne wyniki, każdy warunek eksperymentalny wymaga co najmniej czterech powtórzeń (dołków) w ramach tego samego eksperymentu i co najmniej 3 niezależnych eksperymentów.

  1. Przygotować pożywkę do hodowli komórkowych zawierającą pożywkę DMEM uzupełnioną 4,5 g/l glukozy, 15% płodowej surowicy bydlęcej i 1% paciorkowca Pen i podgrzać do 37 °C w łaźni wodnej.
  2. Rozcieńczyć ludzkie nabłonkowe gruczolakoraka jelita grubego (Caco-2) w pożywce komórkowej i umieścić 200-400 μl roztworu komórkowego w górnej (wierzchołkowej) komorze wkładki transwell, o gęstości 1,5 x 105 komórek/cm2. Wypełnij dolną (podstawno-boczną) komorę 700 - 900 μl pożywki komórkowej.
  3. Hodowla komórek w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i wilgotności 95% przez 16-21 dni, wymiana pożywki w górnej i dolnej komorze co 3-4 dni, przy użyciu objętości wskazanych w kroku 1.3. Wymień pożywkę w następującej kolejności, aby utrzymać ciśnienie powyżej (a nie poniżej) monowarstwy ogniwa: zassać pożywkę z dolnej komory, zassać pożywkę z górnej komory, napełnić górną komorę świeżą pożywką i napełnić dolną komorę świeżą pożywką.

2. Walidacja bariery przepuszczalności nabłonka przewodu pokarmowego za pomocą transepitelialnego oporu elektrycznego (TEER) i barwienia immunologicznego połączeń ścisłych

  1. W przypadku krótkotrwałego przechowywania (mniej niż 2 tygodnie) należy zanurzyć elektrody STX100 w roztworze elektrolitu (0,1-0,15 M KCl lub NaCl). Podłącz elektrody do portu elektrody w woltomierzu EVOM, aby system był wewnętrznie zwarty i zachowana była symetria elektrody. W przypadku długotrwałego przechowywania spłukać dH2O i przechowywać w suchym, ciemnym miejscu.
  2. Aby wysterylizować elektrody, zanurz je w etanolu na 15 minut i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu na 15 sekund. Alternatywnie elektrody można przechowywać w okapie UV. Przepłukać elektrody w sterylnym roztworze elektrolitu (bufor fosforanowy, sól fizjologiczna, PBS) lub 0,1-0,15 M roztworu KCl lub NaCl, przed każdym pomiarem rezystancji.
  3. Gdy woltomierz jest ustawiony na rezystancję, umieść pionowo elektrody w studzience zawierającej wkładkę transwell, tak aby krótka elektroda w górnej komorze i długa elektroda w dolnej komorze dotykały dna studni. Gdy odczyt EVOM ustabilizuje się, zapisz wartość rezystancji (podaną w omach; Ω) dla każdej studzienki.
  4. Obliczyć rezystywność (rezystancję znormalizowaną do powierzchni; Ω×cm2) próbek, odejmując rezystancję tła (TEER wkładek transwell bez komórek) i mnożąc przez pole powierzchni membrany. Wartości rezystywności są najczęściej podawane w literaturze. (Zobacz dyskusję)
  5. Powtarzaj pomiary co 1-2 dni, aż wartości TEER wzrosną do maksimum i ustabilizują się, wskazując na tworzenie się bariery przepuszczalności, co zwykle trwa 2-3 tygodnie od momentu posiewu komórek. Wartości TEER plateau i czas niezbędny do osiągnięcia integralności bariery mogą się różnić w zależności od liczby pasaży komórkowych.
  6. Aby sprawdzić obecność ścisłych połączeń w monowarstwach komórkowych o wysokim TEER (równym lub wyższym od wartości progowej tworzenia bariery), utrwal komórki przez inkubację z zimnym 2% paraformaldehydem przez 15 minut. Następnie przemyć komórki PBS i inkubować je przez 30 minut w temperaturze pokojowej z 1 μg/ml antyokludyny. Ponownie umyć komórki PBS i inkubować je przez 30 minut w temperaturze pokojowej z 7,5 μg/ml znakowanych fluorescencyjnie przeciwciałami drugorzędowymi. Używaj studni o niskim TEER jako negatywnej kontroli tworzenia bariery.

Uwaga: Jako substytut anty-okludyny, można stosować przeciwciała przeciwko alternatywnym białkom połączeń ścisłych.

  1. Ostrożnie wyciąć membranę filtracyjną, na której przymocowana jest stała monowarstwa, i zamontować na szkiełkach w celu obrazowania za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej lub konfokalnej.

3. Ocena transportu transepitelialnego docelowych nosicieli

  1. Oznacz przeciwciało docelowe (mysie przeciwciało monoklonalne przeciwko ICAM-1, anty-ICAM, w tym przykładzie) za pomocą 125I, jak opisano wcześniej7. Użyj testu Bradforda, aby oszacować stężenie białka i licznika gamma, aby określić zawartość 125I na przeciwciałie, a następnie oblicz aktywność właściwą w liczbach na minutę (CPM)/mg znakowanego przeciwciała.

Uwaga: Aby kontrolować specyficzność, powtórz procedurę, oznaczając mysie IgG, które będą używane do przygotowania niedocelowych powlekanych NC. Aby zbadać transport ładunku terapeutycznego, powtórz procedurę oznaczania ładunku, np. alfa-galaktozydazy (α-Gal) w tym przykładzie. Alternatywy mogą być stosowane w przypadku czynnika celującego, nieswoistej kontroli lub ładunku terapeutycznego. Metody alternatywne mogą być również stosowane do znakowania związków i szacowania stężenia znakowanych odpowiedników.

  1. Sprzęgnij znakowane przeciwciało celujące (w naszym przykładzie anty-ICAM) z powierzchnią NC. W tym przykładzie inkubuj nanokulki polistyrenowe (o średnicy 100 nm) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z 125I-anty-ICAM, aby umożliwić adsorpcję powierzchniową, jak opisano7.

Uwaga: Do kontroli niespecyficznej użyj 125I-IgG. Aby prześledzić transport ładunku, użyj kombinacji przeciwciała celującego i ładunku 125znakowanego I (w naszym przykładzie α-Gal

).
  1. Odwirować przy 13 000 x g przez 3 minuty i usunąć niepowlekane odpowiedniki z supernatantu przez aspirację. Ponownie zawiesić osad zawierający powlekane NC przy użyciu 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w PBS przez pipetowanie i sonikować przy niskiej mocy, aby rozbić potencjalne agregaty cząstek (20-30 krótkich impulsów).
  2. W celu charakterystyki NC zmierz rozmiar, polidyspersyjność i potencjał ζ powlekanych cząstek za pomocą dynamicznego rozpraszania światła (zgodnie z instrukcjami dostawcy) i określ ilościowo liczbę 125cząsteczek przeciwciała celującego znakowanych I (np. anty-ICAM) na powierzchni cząstek za pomocą licznika gamma.

Uwaga: Te metody mogą być powtarzane dla niespecyficznych i terapeutycznych odpowiedników. Wielkość powlekanych cząstek waha się około 200 nm.

  1. Dodaj 125przeciwciał I-przeciwciał NC (np. 125I-anty-ICAM NC; 56 nCi/ml) do górnej komory powyżej zlewających się monowarstw Caco-2 z TEER ≥350 Ω×cm2 (patrz Dyskusja) na tle (16-21 dni po wysiewie). Inkubować w temperaturze 37 °C przez jeden lub więcej żądanych odstępów czasu. Zmierz TEER (sekcja 2.3) przed i po inkubacji, aby ocenić wpływ NC na barierę przepuszczalności.

Uwaga: Ta procedura może być powtórzona dla niespecyficznych i terapeutycznych odpowiedników.

  1. Zebrać pożywkę z górnej i dolnej komory i przemyć je raz 0,5 ml DMEM w temperaturze 37 °C (górna komora) lub 1 ml dH2O (dolna komora). Zebrać popłuczyny do pomiaru całkowitej zawartości izotopów promieniotwórczych za pomocą licznika promieniowania gamma.
  2. W celu pomiaru frakcji komórkowej należy wyciąć filtr przepuszczalny, np. za pomocą żyletki do nacięcia wokół krawędzi, a następnie inkubować w probówce przeciw promieniowaniu gamma z 1% Triton X-100 przez 10 minut (w celu uwolnienia zawartości komórek), przed pomiarem całkowitej radioaktywności związanej z komórką.
  3. Aby zmierzyć 125I uwolnione z NC podczas transportu lub z powodu potencjalnej degradacji, najpierw zmieszaj 300 μl próbki (z górnej, dolnej lub komórkowej frakcji) z 700 μl 3% BSA w PBS i 200 μl kwasu trichlorooctowego (TCA). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Tymczasem tym razem zmierz całkowitą radioaktywność tej próbki w liczniku gamma.
  4. Odwirować próbki TCA o masie 3 000 x g przez 5 minut w celu oddzielenia nienaruszonego białka (osadu) od zdegradowanego białka lub frakcji 125I (supernatantu). Określić ilościowo promieniotwórczość wolnej frakcji125I i odjąć tę wartość od całkowitej promieniotwórczości zmierzonej przed odwirowaniem. Zapewni to ilość znakowanego białka, które nie ulega degradacji.

4. Mechanizm transepitelalnego transportu docelowych nanonośników

  1. Oznaczyć albuminę za pomocą 125I, jak opisano w sekcji 3.1 i wcześniej zgłoszono7.

Uwaga: Albumina jest białkiem o masie 66,5 kDa, a więc stosunkowo dużą substancją. Chociaż jest to ważna kontrola dla pasywnego transportu większych obiektów (np. NC 200 nm stosowana tutaj), powinna zostać zastąpiona mniejszymi obojętnymi cząsteczkami znacznikowymi podczas badania transportu mniejszych nośników leków (patrz Dyskusja).

  1. Aby ocenić transport parakomórkowy za pomocą przecieku okołokomórkowego albuminy, należy wyhodować monowarstwy Caco-2 na wkładkach transwell, jak opisano powyżej.
  2. Do pożywki górnej komory powyżej monowarstwy komórkowej dodać 125samych I-albumin (kontrola ujemna pokazująca podstawowy poziom przecieku) lub 125I-albuminy i nieznakowanych radioaktywnie przeciwciał NC (jak opisano w sekcji 3.5). Inkubować w temperaturze 37 °C przez wybrany przedział czasowy (przedziały czasu), który powinien odpowiadać tym, które są badane podczas badania transportu NC. Zmierzyć TEER (sekcja 2.3) przed, w trakcie i po inkubacji, a następnie zebrać wszystkie frakcje dla całkowitych pomiarów 125I i wolnych 125I, jak wskazano w sekcji 3. Uwaga: Jednoczesne dodanie 125I-albuminy i nieznakowanych radioaktywnie kontrolnych IgG NC może być stosowane jako kontrola.
  3. Jako pozytywną kontrolę otwierania połączeń międzykomórkowych dodać pożywkę komórkową zawierającą 5 mMH 2O2 do górnej i dolnej komory wkładki transwell i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Następnie zmierz TEER (sekcja 2.3) i dodaj 125I-albuminy do górnej komory w wybranych odstępach czasu. Zmierz TEER w różnych punktach czasowych podczas inkubacji, aby zidentyfikować spadek wartości TEER spowodowany przez indukowane przezH2O2otwarcie połączeń komórkowych.
  4. W równoległych eksperymentach oceń transport transkomórkowy, zwany również transcytozą, 125NC ukierunkowanych na I, inkubując zlewające się monowarstwy Caco-2 z 50 μM monodansylkadaweryną (MDC; inhibitor endocytozy za pośrednictwem klatryny), 1 μg/ml filipiny (inhibitor endocytozy za pośrednictwem kaweoli), 0,5 μM wortmanniny (inhibitor kinazy fosfatydyloinozytolu 3 [PI3K], biorącego udział w makropinocytozie) lub 20 μM [5-(N-etylo-N-izopropylo)amiloryd] (EIPA, inhibitor makropinocytozy i endocytozy zależnej od CAM15).

Uwaga: 125I-IgG NCs i 125I-albumin mogą być używane jako negatywne kontrole działania tych inhibitorów, a inne metody (np. techniki siRNA) mogą zapewnić bardziej selektywne hamowanie.

  1. Pomiar TEER (sekcja 2.3) przed, w trakcie i po inkubacji komórek z inhibitorami i materiałami znakowanymi radioaktywnie, jako dodatkowa kontrola wpływu inhibitorów na przepuszczalność monowarstwy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W ramach walidacji naszego modelu komórkowego do badania transportu transepitelialnego celowanych NC, Rysunek 2 pokazuje, że monowarstwy komórek Caco-2 wysiane z gęstością 1,5 × 105 komórek/cm2 osiągnęły konfluencję około 12. dnia i zachowały integralność monowarstwy do 18. dnia, co wykazano za pomocą TEER (Rysunek 2A). Potwierdzono to poprzez obecność pozytywnych pod kątem oklydyny połączeń ścisłych (Rysunek 2B) w monowarstwach o wysokiej wartości ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Korzystając z metod omówionych powyżej, można ustalić model komórkowy do badania transportu docelowych NC przez bariery komórkowe, taki jak przykład podany dla komórek nabłonka Caco-2, który jest istotny dla oceny transportu ze światła przewodu pokarmowego do krwi w przypadku doustnych systemów dostarczania leków. Hodowla monowarstw komórek nabłonka przewodu pokarmowego we wkładkach transwell umożliwiła pomiar TEER i barwienia immunologicznego fluorescencji połączeń ścisłych w celu potwierdzenia powstania bariery przepus...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez stypendium Instytutu Medycznego Howarda Hughesa i Narodowej Fundacji Nauki dla R.G. oraz fundusze przyznane S.M. przez National Institutes of Health (Grant R01-HL98416) i American Heart Association (Grant 09BGIA2450014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Wkłady TranswellBD Falcon353095 
Zmodyfikowane podłoże orła Dulbecco (DMEM), 1xCellgro10-013-CM 
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Cellgro35-015-CV 
Pióro StrepGibco15140 
Ludzkie komórki gruczolakoraka nabłonkowego jelita grubego (Caco-2)ATCCHTB-37TM 
125IodinePerkin ElmerNEZ033H002MCRadioactive hazard
Phosphate Buffer Saline (PBS)Gibco14190-235 
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Equitech BioBAH-66 
Paraformaldehyd (16%)Fisher Scientific15710 
Mysia immunoglobulina G (IgG)Jackson ImmunoResearch015-000-003 
Mysie przeciwciała monoklonalne przeciwko ludzkiemu ICAM-1 (anty-ICAM)Marlin 1987 
&alfa;-Galaktozydaza, z zielonych ziaren kawySigmaG8507-25UN 
Koraliki lateksowe FITC, 100 nmPolysciences, Inc.Numer katalogowy: 17150 
Triton X-100Sigma234729-500ML 
Kwas trichlorooctowy (TCA)Fisher ScientificSA433-500 
Przeciwciało okludyny (Y-12), kozie poliklonalne przeciwciało antyludzkieSanta Cruz BiotechnologySc-27151 
Monodansylkadaweryna (MDC)SigmaD4008 
FilipińskaSigmaF9765 
5-(N-etylo-N-izopropylo)amiloryd (EIPA)SigmaA3085 
WortmanninSigmaW1628 
Licznik gammaPerkin ElmerWizard2 
Woltomierz Miernik omówWorld Precision InstrumentsEVOM2 
Elektrody TEERWorld Precision InstrumentsSTX100Elektrody dostępne dla różnych płytek studziennych
Dynamiczne rozpraszanie światła (DLS)MalvernNano-ZS90 

Bibliografia

  1. Deli, M. A. Potential use of tight junction modulators to reversibly open membranous barriers and improve drug delivery. Biochim. Biophys. Acta. 1788, 892-910 (2009).
  2. Mrsny, R. J. Lessons from nature: "Pathogen-Mimetic" systems for mucosal nano-medicines. Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 172-192 (2009).
  3. Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nat. Rev. Immunol. 9, 799-809 (2009).
  4. Torchilin, V. Multifunctional and stimuli-sensitive pharmaceutical nanocarriers. Eur. J. Pharm. Biopharm. 71, 431-444 (2009).
  5. Sadekar, S., Ghandehari, H. Transepithelial transport and toxicity of PAMAM dendrimers: implications for oral drug delivery. Adv. Drug Deliv. Rev. 64, 571-588 (2012).
  6. Muro, S. Challenges in design and characterization of ligand-targeted drug delivery systems. J. Control. Release. , 0168-3659 (2012).
  7. Volkheimer, G. Persorption of particles: physiology and pharmacology. Adv. Pharmacol. Chemother. 14, 163-187 (1977).
  8. Dejana, E. Endothelial cell-cell junctions: happy together. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 5, 261-270 (2004).
  9. Jung, T., et al. Biodegradable nanoparticles for oral delivery of peptides: is there a role for polymers to affect mucosal uptake. Eur. J. Pharm. Biopharm. 50, 147-160 (2000).
  10. Hubatsch, I., Ragnarsson, E. G., Artursson, P. Determination of drug permeability and prediction of drug absorption in Caco-2 monolayers. Nat. Protoc. 2, 2111-2119 (2007).
  11. Hidalgo, I. J., Raub, T. J., Borchardt, R. T. Characterization of the human colon carcinoma cell line (Caco-2) as a model system for intestinal epithelial permeability. Gastroenterology. 96, 736-749 (1989).
  12. Tavelin, S., Grasjo, J., Taipalensuu, J., Ocklind, G., Artursson, P. Applications of epithelial cell culture in studies of drug transport. Methods Mol. Biol. 188, 233-272 (2002).
  13. Bareford, L. M., Swaan, P. W. Endocytic mechanisms for targeted drug delivery. Adv. Drug Deliv. Rev. 59, 748-758 (2007).
  14. Tuma, P. L., Hubbard, A. L. Transcytosis: crossing cellular barriers. Physiol. Rev. 83, 871-932 (2003).
  15. Muro, S., et al. A novel endocytic pathway induced by clustering endothelial ICAM-1 or PECAM-1. J. Cell Sci. 116, 1599-1609 (2003).
  16. Shah, P., Jogani, V., Bagchi, T., Misra, A. Role of Caco-2 cell monolayers in prediction of intestinal drug absorption. Biotechnol. Prog. 22, 186-198 (2006).
  17. Delie, F., Rubas, W. A human colonic cell line sharing similarities with enterocytes as a model to examine oral absorption: advantages and limitations of the Caco-2 model. Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 14, 221-286 (1997).
  18. Kuhnline Sloan, C. D., et al. Analytical and biological methods for probing the blood-brain barrier. Annu. Rev. Anal. Chem. 5, 505-531 (2012).
  19. Hatherell, K., Couraud, P. O., Romero, I. A., Weksler, B., Pilkington, G. J. Development of a three-dimensional, all-human in vitro model of the blood-brain barrier using mono-, co-, and tri-cultivation Transwell models. J. Neurosci. Methods. 199, 223-229 (2011).
  20. Kasper, J., et al. Flotillin-involved uptake of silica nanoparticles and responses of an alveolar-capillary barrier in vitro. Eur. J. Pharm. Biopharm. , 0939-6411 (2012).
  21. Ghaffarian, R., Bhowmick, T., Muro, S. Transport of nanocarriers across gastrointestinal epithelial cells by a new transcellular route induced by targeting ICAM-1. J. Control. Release. 163, 25-33 (2012).
  22. Hsu, J., et al. Enhanced endothelial delivery and biochemical effects of alpha-galactosidase by ICAM-1-targeted nanocarriers for Fabry disease. J. Control. Release. 149, 323-331 (2011).
  23. Schmiedlin-Ren, P., et al. Mechanisms of enhanced oral availability of CYP3A4 substrates by grapefruit constituents. Decreased enterocyte CYP3A4 concentration and mechanism-based inactivation by furanocoumarins. Drug Metab. Dispos. 25, 1228-1233 (1997).
  24. Hughes, J., Crowe, A. Inhibition of P-glycoprotein-mediated efflux of digoxin and its metabolites by macrolide antibiotics. J. Pharmacol. Sci. 113, 315-324 (2010).
  25. Wielinga, P. R., de Waal, E., Westerhoff, H. V., Lankelma, J. In vitro transepithelial drug transport by on-line measurement: cellular control of paracellular and transcellular transport. J. Pharm. Sci. 88, 1340-1347 (1999).
  26. Morris, M. C., Deshayes, S., Heitz, F., Divita, G. Cell-penetrating peptides: from molecular mechanisms to therapeutics. Biol. Cell. 100, 201-217 (2008).
  27. Kapus, A., Szaszi, K. Coupling between apical and paracellular transport processes. Biochem. Cell Biol. 84, 870-880 (2006).
  28. Hood, E. D., et al. Antioxidant protection by PECAM-targeted delivery of a novel NADPH-oxidase inhibitor to the endothelium in vitro and in vivo. J. Control. Release. 163, 161-169 (2012).
  29. Simone, E., et al. Endothelial targeting of polymeric nanoparticles stably labeled with the PET imaging radioisotope iodine-124. Biomaterials. 33, 5406-5413 (2012).
  30. Vercauteren, D., et al. The use of inhibitors to study endocytic pathways of gene carriers: optimization and pitfalls. Mol. Ther. 18, 561-569 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Model Transwelltransepithelialna oporno elektrycznaledzenie izotopami promieniotw rczymiinhibicja endocytozytransport parakom rkowyszlaki transcytozykom rki Caco 2transport nanono nik w

Powiązane artykuły