Matryce fibrynowe zawierające czynniki wzrostu zostały użyte do zatrzymania przeszczepionych nerwowych komórek macierzystych w miejscach całkowitego przecięcia rdzenia kręgowego. Przeszczepione komórki całkowicie wypełniły jamę chorobową i zróżnicowały się w wiele typów komórek nerwowych, w tym neurony, które rozciągały aksony do rdzenia kręgowego gospodarza na duże odległości.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Promowanie przeżycia i różnicowania nerwowych komórek macierzystych z koktajlami fibryny i czynnika wzrostu po ciężkim urazie rdzenia kręgowego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Neuronalne komórki macierzyste (NSC) mogą samoodnawiać się i różnicować w neurony i komórki glejowe. Przeszczepione NSC mogą zastąpić utracone neurony i komórki glejowe po urazie rdzenia kręgowego (SCI) i mogą tworzyć funkcjonalne przekaźniki w celu ponownego połączenia segmentów rdzenia kręgowego powyżej i poniżej zmiany. Wcześniejsze badania nad przeszczepianiem nerwowych komórek macierzystych były ograniczone przez niepełne przeżycie przeszczepu w obrębie uszkodzenia rdzenia kręgowego. Co więcej, śledzenie przeżywalności, różnicowania i wydłużania procesu komórek przeszczepu nie zostało zoptymalizowane. Wreszcie, w poprzednich badaniach, hodowane szczurze NSC zwykle różnicowały się w glej po przeszczepieniu do uszkodzonego rdzenia kręgowego, a nie neuronów, chyba że los był kierowany do określonego typu komórek. Aby rozwiązać te problemy, opracowaliśmy nowe metody poprawy przeżywalności, integracji i różnicowania NSC do miejsc nawet ciężkiego SCI. NSC zostały świeżo wyizolowane z rdzenia kręgowego w 14. dniu embrionalnym (E14) ze stabilnej transgenicznej linii szczurzej Fischer 344 z ekspresją białka zielonej fluorescencji (GFP) i zostały osadzone w matrycy fibrynowej zawierającej czynniki wzrostu; Preparat ten miał na celu zatrzymanie przeszczepionych komórek w jamie zmiany chorobowej i wsparcie przeżycia komórek. NSC w koktajlu fibryny/czynnika wzrostu wszczepiono dwa tygodnie po całkowitym przecięciu rdzenia kręgowego na poziomie 3 (T3) w klatce piersiowej, unikając w ten sposób szczytowych okresów zapalenia. Powstałe przeszczepy całkowicie wypełniły jamę chorobową i zróżnicowały się zarówno w neurony, które rozszerzyły aksony do rdzenia kręgowego gospodarza na niezwykle duże odległości, jak i glej. Przeszczepy hodowanych ludzkich NSC wykazujących ekspresję GFP dały podobne wyniki. W ten sposób zdefiniowano metody poprawy przeszczepu nerwowych komórek macierzystych, przeżywalności i analizy wyników in vivo.
Wprowadzenie
Uraz rdzenia kręgowego (SCI) często uszkadza nie tylko drogi istoty białej, które przenoszą sygnały do i z mózgu, ale także centralną istotę szarą, powodując segmentową utratę interneuronów i neuronów ruchowych. Konsekwencją SCI jest utrata zarówno funkcji motorycznych, jak i czuciowych poniżej zmiany. Niestety, dorosły ośrodkowy układ nerwowy (OUN) nie regeneruje się spontanicznie, co skutkuje trwałymi deficytami funkcjonalnymi1. Dlatego rekonstrukcja uszkodzonego dorosłego rdzenia kręgowego i poprawa funkcji motorycznych, czuciowych i autonomicznych jest ważnym celem badań nad SCI. Neuronalne komórki macierzyste (NSC), niezależnie od tego, czy są bezpośrednio izolowane z embrionalnego, czy dorosłego OUN, są niezbędnymi komórkami kandydującymi do zastąpienia utraconych neuronów i komórek glejowych. Co więcej, komórki te mają potencjał do tworzenia nowych przekaźników funkcjonalnych w celu przywrócenia przewodnictwa aksonalnego w miejscu zmiany chorobowej2,3.
Do tej pory nie było szczegółowego wyjaśnienia anatomicznych, elektrofizjologicznych i behawioralnych skutków tworzenia przekaźników neuronalnych przez przeszczepione NSC po ciężkim SCI. Dzieje się tak z kilku powodów: po pierwsze, przeszczepione NSC lub tkanki OUN płodu słabo przeżywają, gdy są przeszczepiane do dużych jam chorobowych. Wcześniejsze badania wykazały znaczną wczesną utratę komórek, pozostawiając duże puste jamy zmian torbielowatych4,5. W niektórych badaniach przeszczepione komórki następnie dzieliłyby się i wypełniały jamę zmiany4,5, ale może to nastąpić z opóźnieniem od kilku dni do tygodni, a późniejsze wypełnienie miejsca zmiany może nie być pełne lub spójne. Po drugie, brakowało wydajnego systemu śledzenia, który dostarczałby rzetelnych danych na temat przeżycia komórek, różnicowania/dojrzewania i wzrostu przeszczepionych NSC. Większość wczesnych badań wykorzystywała znakowanie wsteczne i wsteczne do śledzenia projekcji aksonalnych po przeszczepach2,3. Jednak techniki te tylko częściowo i często niewyraźnie oznaczały wypustki aksonalne powstające z przeszczepionych komórek, a metody znacznikowe są narażone na artefakty spowodowane wyciekiem barwnika poza wszczepione komórki. Inne grupy wykorzystały ludzkie specyficzne markery neuronalne do oznaczania projekcji aksonalnych po przeszczepieniu ludzkich płodowych NSC do uszkodzonego rdzenia kręgowego gryzoni5,6. Jednak w tych badaniach ksenoprzeszczepy nie zawsze przeżywały dobrze. Ostatnio wirusowe dostarczenie genu reporterowego GFP wykorzystano do znakowania hodowanych NSC7,8. Jednak ekspresja GFP była często niespójna i może być regulowana w dół7. Ostatnio wykorzystanie transgenicznych myszy lub szczurów dawców ze stabilną ekspresją genu reporterowego, GFP, czyli ludzkiej fosfatazy alkalicznej łożyska, znacznie poprawiło śledzenie przeszczepionych nerwowych komórek macierzystych / progenitorów in vivo9,11. Po trzecie, kilka badań wskazuje, że NSC szczurów hodowane in vitro pochodzące z embrionalnego lub dorosłego OUN różnicują się w linie glejowe wyłącznie po przeszczepieniu do środowiska nienaruszonego lub uszkodzonego dorosłego rdzenia kręgowego7,12,13, pomimo faktu, że te nerwowe komórki macierzyste są zdolne do różnicowania się zarówno w neurony, jak i glej in vitro, co wskazuje, że lokalne środowisko może decydować o losie komórek macierzystych. Alternatywnie, hodowane NSC, zwłaszcza te pochodzące z dorosłego OUN, mogą mieć wewnętrzną domyślną właściwość różnicowania się w linie glejowe in vivo13.
Z powodu ograniczeń omówionych powyżej, nasza grupa niedawno opracowała nowy protokół mający na celu poprawę śledzenia, przeżywalności i różnicowania/dojrzewania embrionalnej NSC w poważnie uszkodzonym dorosłym rdzeniu kręgowym. Krótko mówiąc, zaczęliśmy od stabilnej transgenicznej linii inbredu szczurów Fischer 344 z ekspresją genu reporterowego GFP, który podtrzymuje ekspresję GFP po przeszczepie in vivo 14. Następnie użyliśmy świeżo wyizolowanych NSC z embrionalnego dnia 14 rdzenia kręgowego Fischer 344, etapu rozwoju, który zachowuje potencjał do generowania zarówno neuronów, jak i gleju. Na koniec umieściliśmy świeżo zdysocjowane NSC w macierzy fibryny zawierającej czynniki wzrostu15-17, aby zatrzymać komórki i równomiernie rozprowadzić je w dużej jamie zmiany, mając na celu wsparcie przeżycia, różnicowania i integracji komórek przeszczepu. Przeszczepy umieszczono w miejscach całkowitego przecięcia T3, dwa tygodnie po urazie rdzenia kręgowego. Te przeszczepione komórki konsekwentnie wypełniały pełne miejsca transsekcji i różnicowały się w liczne neurony, które rozciągały dużą liczbę aksonów do rdzenia kręgowegogospodarza na duże odległości. Podobne wyniki uzyskano przy użyciu hodowanych przeszczepów ludzkich nerwowych komórek macierzystych u szczurów z niedoborem odporności18.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie protokoły dotyczące zwierząt są zatwierdzone przez VA-San Diego Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Wytyczne NIH dotyczące opieki i bezpieczeństwa zwierząt laboratoryjnych są ściśle przestrzegane. Zwierzęta mają swobodny dostęp do pożywienia i wody przez cały czas trwania badania i są odpowiednio leczone w celu zminimalizowania bólu i dyskomfortu.
1. Przygotowanie składników fibryny zawierających koktajle czynników wzrostu
- Rozpuścić 25 mg fibrynogenu szczura w 0,5 ml PBS, aby otrzymać 50 mg/ml 2x roztwór podstawowy (patrz tabela materiałów). Fibrynogen jest trudny do rozpuszczenia i należy go umieścić w inkubatorze lub łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i wstrząsać co 5-10 minut przez 1-2 godziny.
- Rozpuścić 100 UN trombiny szczura w 2 ml 10 mM sterylnego CaCl2 w celu uzyskania 50 U/ml 2x roztwór podstawowy.
- Rozpuścić czynniki wzrostu w PBS w następujących stężeniach, aby otrzymać 100 μl roztworu podstawowego: 1 mg/ml: BDNF; NT-3 (wysokie stężenie podstawowe w postaci infuzji dooponowej in vivo19); 200 μg/ml: GDNF; IGF; bFGF; Europejskiego Funduszu Ekonomicznego (EFG); PDGF; aFGF; HGF (około 1000 razy wyższy niż stosowany do hodowli komórkowych).
- Rozpuścić 25 mg MDL28170 (inhibitor kalpainy) w 1,3 ml DMSO, aby otrzymać 50 mM roztworu podstawowego DMSO, a następnie rozcieńczyć 50x w PBS, aby otrzymać 1 mM roztwór podstawowy.
- Zmieszać 100 μl każdego składnika czynnika wzrostu i 100 μl MDL28170 (1 mM roztwór podstawowy), aby uzyskać 1 000 μl roztworu koktajlu czynnika wzrostu (ryc. 1).
- Zmieszać 500 μl fibrynogenu 2x roztwór podstawowy z koktajlem 500 μl czynnika wzrostu, aby otrzymać 25 mg/ml roztworu roboczego fibrynogenu zawierającego czynniki wzrostu i podwielokrotność na 10 lub 20 μl do przechowywania w temperaturze -70 °C. Roztwór jest stabilny do 12 miesięcy w temperaturze -70 °C.
- Podobnie, zmieszać 500 μl trombiny 2x roztwór podstawowy z koktajlem czynnika wzrostu 500 μl, aby otrzymać 25 j./ml roztworu roboczego trombiny zawierającego czynniki wzrostu i podwielokrotność na podobne objętości 10 lub 20 μl do przechowywania w temperaturze -70 °C przez okres do 12 miesięcy.
- W dniu szczepienia umieść koktajle czynników wzrostu zawierających fibrynogeny i trombinę na lodzie, aż do zmieszania z komórkami.
2. Przecięcie rdzenia kręgowego T3
- Znieczulenie dorosłych samic szczurów Fischer 344 lub atymicznych nagich szczurów przy użyciu akceptowalnych metod. Badani są głęboko znieczuleni, gdy reakcja na szczypanie ogona i łapy jest całkowicie nieobecna. Uwaga: Zwykle używamy 150-200 g szczurów Fischera lub 180-220 g szczurów atymicznych oraz koktajlu znieczulającego (2 ml / kg) ketaminy (25 mg / ml), ksylazyny (1,3 mg / ml) i acepromazyny (0,25 mg / ml).
- Zastosuj maść do oczu, aby zapobiec suchości lub urazom oczu, gdy zwierzęta są pod narkozą.
- Ogol górną część klatki piersiowej i oczyść skórę za pomocą Betadine.
- Przetnij skórę i mięśnie za pomocą ostrza #15, odsłoń kręg T3 za pomocą retraktora chirurgicznego i wykonaj laminektomię na kręgu T3, aby odsłonić rdzeń kręgowy T3/4 za pomocą rongeur.
- Wykonaj podłużne nacięcie linii środkowej w oponie twardej o długości około 2 mm za pomocą ostrza #11.
- Umieść nożyczki do irydektomii pod oponą twardą, aby przeciąć prawą boczną część rdzenia kręgowego. Wykonaj kolejne cięcie po tej samej stronie o 1,5 mm bardziej szczegółowo.
- Odessać tkankę rdzenia kręgowego między dwoma przeciętymi segmentami za pomocą igły 23 G podłączonej do podciśnienia o umiarkowanej intensywności. Użyj weryfikacji wizualnej, aby zapewnić pełne przecięcie brzusznie i bocznie. To zakończy hemisekcję boczną.
- Aby rozszerzyć zmianę do przecięcia rdzenia kręgowego na całej szerokości, należy umieścić nacięcia lustrzane w lewym półrdzeniu. Spróbuj pozostawić oponę twardą nienaruszoną, z wyjątkiem pierwszego cięcia, aby zachować twardą matrycę przeszczepu/fibryny w miejscu zmiany po przeszczepieniu dwa tygodnie później.
- Zszyj mięsień, nałóż antybiotyk w proszku i zszyj skórę.
- Natychmiast po zabiegu należy wstrzyknąć mleczaną dawkę Ringera (3 ml), bannaminę (2,5-5 mg/kg) i ampicylinę (80-100 mg/kg) (patrz tabela materiałów) i utrzymywać szczury w ciepłym inkubatorze do czasu przywrócenia termoregulacji.
- Opróżnij pęcherz moczowy i wstrzykuj roztwór Ringera i ampicyliny dwa razy dziennie przez około dwa tygodnie, aż do wystąpienia odruchowego opróżniania pęcherza (ryc. 1B).
3. Przygotowanie świeżo zdysocjowanych komórek macierzystych rdzenia kręgowego z dnia 14
- Uzyskaj wsobne transgeniczne szczury GFP F344 (F344-Tg(UBC-EGFP)F455Rrrc) z Rat Resource and Research Center, University of Missouri.
- Wstrzyknąć 40 μg des-Gly10, [D-Ala6]-leuteinizującego hormon uwalniający hormon etylamidu (LHRH) rozcieńczony w PBS w stężeniu 200 μg/ml dootrzewnowo (IP) na dojrzałą samicę szczura (8 tygodni lub starszą) po 2-3 godzinach indukcji światła w celu synchronizacji pobierania zarodków.
- Kojarzyć się z dojrzałym homozygotycznym lub heterozygotycznym samcem szczura GFP przez noc 4 dni po wstrzyknięciu.
- Zbierz zarodki w dniach 13,5-14,5 po stosunku (p.c.) w zimnym buforze HBSS, zbadaj ekspresję GFP pod latarką "NightSea" i okularami filtrującymi (BLS1 - BlueStar Flashlight i filtr barierowy Model VG1) lub mikroskopem fluorescencyjnym.
- Wypreparuj rdzeń kręgowy aseptycznie z każdego płodu z dodatnim GFP i usuń leżące nad nim opony mózgowe i przyczepione zwoje rdzeniowe za pomocą nożyczek do irydektomii i cienkich kleszczy jubilerskich.
- Zebrać wypreparowany rdzeń kręgowy do 2 ml zimnego buforu HBSS w 15 ml probówki rogowej i trzymać na lodzie.
- Postępuj zgodnie z odniesieniem #20, aby oddzielić wypreparowane rdzenie kręgowe:
- Krótko dodać 2 ml 0,25% trypsyny-EDTA do probówki zawierającej wypreparowany rdzeń kręgowy (kilka rdzeni może być trawionych razem, 1 pępowina może wytworzyć wystarczającą ilość komórek do przeszczepu jednego pacjenta) i trawić w temperaturze 37 °C przez 10-12 minut.
- Zatrzymaj reakcję trypsyny, dodając do probówki 10 ml DMEM zawierającego 10% FBS i odwiruj tkankę z prędkością 2500 obr./min przez 2 min.
- Zawiesić tkankę w 2 ml pożywki NeuroBasal zawierającej 2% witaminy B27 i rozdzielić tkankę rdzenia kręgowego za pomocą coraz mniejszych, polerowanych ogniowo pipet Pasteura.
- Odwirować komórki z prędkością 2 500 obr./min przez 2 minuty, ponownie zawiesić w 2 ml pożywki NeuroBasal zawierającej witaminę B27 i przefiltrować komórki za pomocą sitka o wielkości 40 μm.
- Policz komórki za pomocą hemocytometru i podziel je równo na dwie probówki Eppendorfa.
- Odwirować komórki i całkowicie usunąć supernatant (potrzeba 1-2 minut, aby usunąć cały supernatant za pomocą końcówki o niskiej próżni), aby koktajle czynników wzrostu nie zostały rozcieńczone przez pozostały supernatant po ponownym zawieszeniu komórek.
- Ponownie zawiesić każdą połówkę komórek w roztworze roboczym fibrynogenu lub trombiny zawierającym odpowiednio czynniki wzrostu, w stężeniu 250 000 komórek/μl (liczba komórek w postaci około 1/3 końcowej objętości) i umieścić je na lodzie przed przeszczepem (ryc. 1A). Należy zauważyć, że fibrynogen może spontanicznie żelować po zmieszaniu z komórkami przed połączeniem z trombiną w miejscu zmiany/przeszczepu; Aby uniknąć przedwczesnej galelacji, wymieszaj komórki w fibrynogenie bezpośrednio przed przeszczepieniem komórek in vivo.
4. Transplantacja
- Ponownie odsłonić uszkodzony rdzeń kręgowy T3/4 dwa tygodnie po przecięciu rdzenia kręgowego.
- 5 μl komórek fibrynogenu i 5 μl komórek trombiny można bezpośrednio wstrzyknąć do dziewięciu punktów miejsca zmiany przez uszczelnioną tkankę bliznowatą i nienaruszoną oponę twardą bez ponownego otwierania miejsca uszkodzenia.
- Użyj igły 27 G, aby utworzyć 9 otworów na powierzchni tkanki bliznowatej i nienaruszonej opony twardej 1-2 tygodnie po zmianie: 3 w środku (jeden w punkcie środkowym i dwa w bocznych i w odstępach 0,5 mm od siebie) i 3 w obu miejscach rostralnych i 3 w interfejsie ogonowym (około 0,5 mm rostralnie lub ogonowo do środka zmiany).
- Następnie wstrzyknąć połowę objętości roztworu komórek fibrynogenu do trzech centralnych punktów miejsca zmiany chorobowej i jedną czwartą objętości do 3 punktów granicy faz rostralnych i jedną czwartą objętości do 3 punktów granicy ogonowej.
- Następnie natychmiast wstrzyknij komórki pulsujące w te same miejsca. Mieszanina komórek fibrynogenu i komórek trombiny wewnątrz miejsca zmiany utworzy żel fibrynowy, który utrzyma komórki w miejscu uszkodzenia, a koktajle czynników wzrostu będą wspierać przeżycie komórek. Komórki są wstrzykiwane za pomocą ciągniętych szklanych pipet podłączonych do PicoSpritzer (General Valve, Inc.).
- Przeszczep ludzkie NSC21 w tej samej procedurze opisanej powyżej i użyj koktajli fibryny i czynnika wzrostu wykonanych z ludzkich odczynników.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Immunohistochemiczne znakowanie GFP wykazuje, że przeszczepione szczurze NSCs resuspenderowane w soli fizjologicznej PBS (bez matrycy fibrynowej i czynników wzrostu) wykazywały niską przeżywalność w miejscu przecięcia T3, przyłączając się jedynie do brzegu zmiany/gospodarza i pozostawiając większość miejsca zmiany pustą, bez przeszczepionych komórek (Rycina 2A). Przeżywalność NSCs poprawiła się podczas wspólnego przeszczepiania z samymi matrycami fibrynowymi, jednak przeszczep nie wypełnił całkowicie duż...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Jedną z głównych przeszkód w przeszczepieniu NSC w uszkodzonym rdzeniu kręgowym jest słabe przeżycie w centrum uszkodzenia. Wszelkie luki lub ubytki w miejscu uszkodzenia mogą potencjalnie zmniejszyć lub osłabić tworzenie funkcjonalnych przekaźników neuronalnych między aksonami nadrdzeniowymi a oddzielonymi segmentami rdzenia kręgowego poniżej urazu. Ponadto słaba przeżywalność przeszczepionych NSC może wpływać na ich integrację z tkanką gospodarza, a tym samym zmniejszać łączność przeszczepionych neuronów z neuronami go...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie mamy nic do ujawnienia.
Podziękowania
Dziękujemy Centrum Zasobów i Badań nad Szczurami, University of Missouri, Columbia, Missouri, za dostarczenie szczurów GFP; Neuralstem Inc. za dostarczanie ludzkich nerwowych komórek macierzystych. Praca ta była wspierana przez Administrację Weteranów, NIH (NS09881), Kanadyjską Organizację Badań nad Kręgosłupem, Fundację Craiga H. Neilsena oraz Bernard and Anne Spitzer Charitable Trust.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Fibrynogen (szczur) | Sigma | F6755-25MG | 2 godziny w 37 & stopniach; C do dissovle Stężenie magazynowe: 50 mg / ml Stężenie końcowe: 25 mg / ml |
| Trombina (szczur) | Sigma | T5772-100UN | Dissovle w 10 mM CaCl2 Stężenie zapasowe: 50 U / ml Stężenie końcowe: 25 mg / ml |
| bFGF (człowiek) | Sigma | F0291 (25 μ g) | Stężenie zapasów: 200 ng / μ l Stężenie końcowe: 10 ng/μ l |
| EGF (myszy) | Sigma | E1257 (0,1 mg) | Stężenie magazynowe: 200 ng /μ l Stężenie końcowe: 10 ng/μ l |
| BDNF (człowiek) | Peprotech | 452-02 (1 mg) | Stężenie zapasowe: 1,000 ng /μ l Stężenie końcowe: 50 ng/μ l |
| NT-3 (człowiek) | Peprotech | 452-03 (1 mg) | Stężenie zapasów: 1,000 ng /μ l Stężenie końcowe: 50 ng/μ l |
| GDNF (szczur) | Sigma | G1401 (10 μ g) | Stężenie zapasów: 200 ng / μ l Stężenie końcowe: 10 ng/μ l |
| IGF-1 (mysz) | Sigma | I8779 (50 μ g) | Stężenie zapasów: 200 ng / μ l Stężenie końcowe: 10 ng/μ l |
| aFGF (człowiek) | Sigma | F5542 (25 μ g) | Stężenie zapasów: 200 ng / μ l Stężenie końcowe: 10 ng/μ l |
| PDGF-AA (człowiek) | Sigma | P3076 (10 μ g) | Stężenie zapasów: 200 ng / μ l Stężenie końcowe: 10 ng/μ l |
| HGF (człowiek) | Sigma | H9661 (5 μ g) | Stężenie zapasów: 200 ng / μ l Stężenie końcowe: 10 ng/μ l |
| MDL28170 | Sigma | M6690 (25 mg) | Zapas w DMSO Stężenie magazynowe: 1 mM Stężenie końcowe: 50 μ M |
| PBS | Millipore | BSS-1005-B | Stężenie magazynowe: 1x Stężenie końcowe: 1x |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Ketamina | Putney | 26637-411-01 | 40-80 mg / kg Stężenie magazynowe: 100 mg / ml Stężenie końcowe: 25 mg / ml |
| Ksylazyna | Lloyd | 0410, | 2,5-8 mg / ml Stężenie fabryczne: 100 mg / ml Stężenie końcowe: 5,8 mg / ml |
| Acepromazyna | Butler | 003845 | 0,5-4 mg / ml Stężenie zapasowe: 10 mg / ml Stężenie końcowe: 0,25 mg / ml |
| Betadine | Healthpets | BET16OZ | |
| Ringers | Abbott | 04860-04-10 | 2-3 ml/inj |
| Banamine | Schering-Plough | 0061-0851-03 | 2,5-5 mg / kg Stężenie podstawowe: 50 mg / ml Stężenie końcowe: 0,5 mg / ml |
| Ampicillin | Sandoz | 0781-3404-85 | 80-100 mg / kg Stężenie końcowe: 50 mg / ml |
| LH-RH | Sigma | L4513 | 200 μ g / kg Stężenie końcowe: 200 μ g / ml |
| HBSS | Gibco | 14175-096 | |
| Trypsyna | Gibco | 25200056 | Stężenie zapasów: 0,25 % Stężenie końcowe: 0,125 % |
| DMEM | Gibco | 11995073 | |
| FBS | Gibco | 16000044 | Stężenie zapasów: 100 % Stężenie końcowe: 10 |
| Podłoże neurobazowe | Gibco | 21103049 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | Stężenie magazynowe: 100x Stężenie końcowe: 1x |
| Uwaga, używaj ludzkich odczynników do przeszczepów ludzkich NSC |
Bibliografia
- Ramon y Cajal, S. In Degeneration and regeneration of the nerve system. , New York: Hafner. (1991).
- Jakeman, L. B., Reier, P. J. Axonal projections between fetal spinal cord transplants and the adult rat spinal cord: a neuroanatomical tracing study of local interactions. J Comp Neurol. 307, 311-334 (1991).
- Bamber, N. I., Li, H., Aebischer, P., Xu, X. M. Fetal spinal cord tissue in mini-guidance channels promotes longitudinal axonal growth after grafting into hemisected adult rat spinal cords. Neural Plast. 6, 103-121 (1999).
- Theele, D. P., Schrimsher, G. W., Reier, P. J. Comparison of the growth and fate of fetal spinal iso- and allografts in the adult rat injured spinal cord. Exp Neurol. 142, 128-143 (1996).
- Giovanini, M. A., Reier, P. J., Eskin, T. A., Wirth, E., Anderson, D. K. Characteristics of human fetal spinal cord grafts in the adult rat spinal cord: influences of lesion and grafting conditions. Exp Neurol. 148, 523-543 (1997).
- Wictorin, K., Björklund, A. Axon outgrowth from grafts of human embryonic spinal cord in the lesioned adult rat spinal cord. Neuroreport. 3, 1045-1048 (1992).
- Vroemen, M., Aigner, L., Winkler, J., Weidner, N. Adult neural progenitor cell grafts survive after acute spinal cord injury and integrate along axonal pathways. Eur J Neurosci. 18, 743-751 (2003).
- Blits, B., et al. Lentiviral vector-mediated transduction of neural progenitor cells before implantation into injured spinal cord and brain to detect their migration, deliver neurotrophic factors and repair tissue. Restor Neurol Neurosci. 23, 313-324 (2005).
- Lepore, A. C., Fischer, I. Lineage-restricted neural precursors survive, migrate, and differentiate following transplantation into the injured adult spinal cord. Exp Neurol. 194, 230-242 (2005).
- Gaillard, A., et al. Reestablishment of damaged adult motor pathways by grafted embryonic cortical neurons. Nat Neurosci. 10, 1294-1299 (2007).
- Remy, S., et al. New lines of GFP transgenic rats relevant for regenerative medicine and gene therapy. Transgenic Res. 19, 745-763 (2010).
- Cao, Q. L., et al. Pluripotent stem cells engrafted into the normal or lesioned adult rat spinal cord are restricted to a glial lineage. Exp Neurol. 167, 48-58 (2001).
- Mothe, A. J., Kulbatski, I., Parr, A., Mohareb, M., Tator, C. H. Adult spinal cord stem/progenitor cells transplanted as neurospheres preferentially differentiate into oligodendrocytes in the adult rat spinal cord. Cell Transplant. 17, 735-751 (2008).
- Bryda, E. C., Pearson, M., Agca, Y., Bauer, B. A. Method for detection and identification of multiple chromosomal integration sites in transgenic animals created with lentivirus. Biotechniques. 41, 715-719 (2006).
- Willerth, S. M., Faxel, T. E., Gottlieb, D. I., Sakiyama-Elbert, S. E. The effects of soluble growth factors on embryonic stem cell differentiation inside of fibrin scaffolds. Stem Cells. 25, 2235-2244 (2007).
- Grumbles, R. M., Sesodia, S., Wood, P. M., Thomas, C. K. Neurotrophic factors improve motoneuron survival and function of muscle reinnervated by embryonic neurons. J Neuropathol Exp Neurol. 68, 736-746 (2009).
- Kadoya, K., et al. Combined intrinsic and extrinsic neuronal mechanisms facilitate bridging axonal regeneration one year after spinal cord injury. Neuron. 64, 165-172 (2009).
- Lu, P., et al. Long-distance growth and connectivity of neural stem cells after severe spinal cord injury. Cell. 150, 1264-1273 (2012).
- Coumans, J. V., et al. Axonal regeneration and functional recovery after complete spinal cord transection in rats by delayed treatment with transplants and neurotrophins. J Neurosci. 21 (23), 9334-9344 (2001).
- Harris, J., Lee, H., Tu, C. T., Cribbs, D., Cotman, C., Jeon, N. L. Preparing e18 cortical rat neurons for compartmentalization in a microfluidic device. J Vis Exp. (305), (2007).
- Yan, J., et al. Extensive neuronal differentiation of human neural stem cell grafts in adult rat spinal cord. PLoS Med. 4 (2), e39(2007).
- Popovich, P. G. Building bridges for spinal cord repair. Cell. 150 (6), 1105-1106 (2012).
- Catelas, I. Fibrin. Comprehensive Biomaterials. 2, 303-328 (2011).
- Petter-Puchner, A. H., et al. The long-term neurocompatibility of human fibrin sealant and equine collagen as biomatrices in experimental spinal cord injury. Exp Toxicol Pathol. 58, 237-245 (2007).
- Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287, 1433-1438 (2000).
- Deister, C., Schmidt, C. E. Optimizing neurotrophic factor combinations for neurite outgrowth. Journal of Neural Engineering. 3, 172-179 (2006).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
