Model odwarstwienia siatkówki u gryzoni przez podsiatkówkowe wstrzyknięcie hialuronianu sodu

Podsumowanie

Tworzenie eksperymentalnych odwarstwień siatkówki o powtarzalnej i trwałej wysokości odwarstwienia, bez krwotoku podsiatkówkowego, jest ważne dla badania patofizjologii utraty komórek fotoreceptorowych w chorobie siatkówki i oceny potencjalnych interwencji terapeutycznych. Tutaj szczegółowo opisujemy taką metodę.

Streszczenie

Podsiatkówkowe wstrzykiwanie hialuronianu sodu jest powszechnie akceptowaną metodą wywoływania odwarstwienia siatkówki (RD). Jednak wysokość i czas trwania RD lub wystąpienie krwotoku podsiatkówkowego może wpływać na śmierć komórki fotoreceptora w odwarstwionej siatkówce. W związku z tym korzystne jest tworzenie powtarzalnych RD bez krwotoku podsiatkówkowego w celu oceny śmierci komórki fotoreceptorowej. Zmodyfikowaliśmy wcześniej opisaną metodę tworzenia pęcherzowych i uporczywych RD w odtwarzalnej lokalizacji z rzadkim występowaniem krwotoku podsiatkówkowego. Krytycznym etapem tej zmodyfikowanej metody jest utworzenie samouszczelniającego się nacięcia twardówki, które może zapobiec wyciekowi hialuronianu sodu po wstrzyknięciu do przestrzeni podsiatkówkowej. Aby wykonać samouszczelniające się nacięcie twardówki, tworzy się tunel twardówkowy, a następnie penetrację twardówki do naczyniówki za pomocą igły 30 G. Chociaż na tym etapie może wystąpić krwotok naczyniówkowy, zwężenie włócznią chirurgiczną zmniejsza częstość krwotoku naczyniówkowego. Metoda ta pozwala na bardziej powtarzalny i wiarygodny model śmierci fotoreceptorów w chorobach związanych z RD, takich jak regmatogenne RD, retinopatia wcześniaków, retinopatia cukrzycowa, centralna surowicza chorioretinopatia i zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem (AMD).

Wprowadzenie

Śmierć komórki fotoreceptora i późniejsze pogorszenie wzroku następuje, gdy fotoreceptory są oddzielone od leżącego pod spodem nabłonka barwnikowego siatkówki. Fizyczne rozdzielenie fotoreceptorów obserwuje się w różnych zaburzeniach siatkówki, w tym w zwyrodnieniu plamki żółtej związanym z wiekiem (AMD), centralnej surowiczej chorioretinopatii, retinopatii cukrzycowej i retinopatii wcześniaków, a także regmatogennym (tj. spowodowanym pęknięciem siatkówki) odwarstwieniu siatkówki (RD). Podsiatkówkowe wstrzyknięcie hialuronianu sodu jest powszechnie akceptowanym modelem tworzenia RD, który prowadzi do śmierci komórki fotoreceptora, zapewniając wgląd w patofizjologię zwyrodnienia fotoreceptorów^1-15.

Zwyrodnienie fotoreceptorów wywołane wstrzyknięciem hialuronianu sodu do siatkówki, wprowadzone po raz pierwszy w 2001^{roku 7}, ma tę zaletę, że ma rozsądny przebieg czasowy (dni do tygodni). Jednak może mieć znaczną zmienność utraty komórek fotoreceptorowych ze zwierzęcia na zwierzę ze względu na dwa główne czynniki, które wpływają na śmierć komórki fotoreceptora po RD: 1) wysokość i czas trwania RD oraz 2) wystąpienie krwotoku podsiatkówkowego. Metoda ta wiąże się ze stromą krzywą uczenia się techniki, która przyczynia się do obu czynników. Zwyrodnienie komórek fotoreceptorowych zwiększa się wraz ze wzrostem RD, ponieważ odległość między warstwą nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) a fotoreceptorami zwiększa się^16-17. Zgodnie z tymi doniesieniami, nasze poprzednie eksperymenty wykazały większą śmierć fotoreceptorów w pęcherzowych RD niż płytkich RD. Doniesiono również, że krwotok podsiatkówkowy jest toksyczny dla komórek fotoreceptorowych i wpływa na śmierć komórek fotoreceptorów^18-21. Podobnie, zaobserwowaliśmy więcej zgonów fotoreceptorów w RD z krwotokiem podsiatkówkowym niż w RD bez krwotoku podsiatkówkowego. W związku z tym techniki minimalizujące zmienność muszą koncentrować się na osiąganiu stałych wysokości RD przy jednoczesnym unikaniu krwotoku podsiatkówkowego.

Nasza zmodyfikowana metoda wywoływania RD może sprawić, że w tym samym miejscu oka pojawi się powtarzalne pęcherzowe i uporczywe RD z rzadkim występowaniem krwotoku podsiatkówkowego. Przeprowadziliśmy operację z zastosowaniem podejścia czasowego, ponieważ łatwiej jest uzyskać szersze pole operacyjne w porównaniu z innymi miejscami. Po nacięciu spojówki wykonuje się samouszczelniające się nacięcie twardówki za pomocą igły 30 G. Powstaje tunel twardówkowy, po którym następuje penetracja twardówki do naczyniówki. Jeśli na tym etapie wystąpi krwawienie naczyniówkowe, krwotok wyjdzie z oka przez ranę twardówki, a krwawienie można zatrzymać przez zwężenie włócznią chirurgiczną. Następnie wykonuje się nakłucie przedniej komory z rogówki w celu obniżenia ciśnienia wewnątrzgałkowego. Jest to ważny krok, ponieważ samo wstrzyknięcie podsiatkówkowe doprowadzi do wzrostu ciśnienia wewnątrzgałkowego, a w rezultacie do niedrożności tętnicy siatkówki i niedokrwienia wewnętrznej siatkówki. Igła o wadze 33 G połączona ze strzykawką Hamiltona o pojemności 10 μl jest następnie wprowadzana do przestrzeni podsiatkówkowej, a 3,5 μl hialuronianu sodu jest delikatnie wstrzykiwana w celu odłączenia siatkówki neurosensorycznej od leżącego pod nią RPE. W przeciwieństwie do innych metod indukowania RD, które są wykonywane w ramach obserwacji dna oka, ta technika jest wykonywana pod bezpośrednią obserwacją. Ponieważ rana twardówki jest samouszczelniająca, hialuronian sodu nie wycieknie po wstrzyknięciu. Na koniec klej nakłada się na ranę twardówki, a spojówkę ponownie przymocowuje się do swojej pierwotnej pozycji. Te ostatnie kroki zmniejszają również ryzyko wycieku hialuronianu sodu. Wstrzyknięcie 3,5 μl hialuronianu sodu tworzy powtarzalne RD (50% siatkówki) w oczach 8-tygodniowych myszy. Stworzenie samouszczelniającej się rany jest najważniejszym krokiem w naszej zmodyfikowanej procedurze, ponieważ zapobiega wyciekaniu wstrzykniętego hialuronianu sodu z oka, umożliwiając w ten sposób powtarzalne pęcherzowe i trwałe RD.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z oświadczeniem Stowarzyszenia Badań nad Widzeniem i Okulistyką dotyczącą wykorzystania zwierząt w badaniach nad oczami i wzrokiem oraz wytycznymi i przepisami określonymi przez Komitet Opieki nad Zwierzętami w Massachusetts Eye and Ear Infirmary.

1. Obróbka wstępna

1. Znieczulij 8-tygodniową mysz wstrzyknięciem dootrzewnowym mieszaniny 60 mg/kg ketaminy i 6 mg/kg ksylazyny.
2. Obetnij wąsy. Dzieje się tak, ponieważ zakłócają one wizualizację i rozmieszczenie instrumentów.
3. Rozszerz źrenicę za pomocą 5% fenylefryny i 0,5% tropikamidu.
4. Wytnij rzęski. Dzieje się tak również dlatego, że zakłócają one wizualizację i rozmieszczenie instrumentów.
5. Zastosuj znieczulenie miejscowe (0,5% roztwór okulistyczny chlorowodorku proparakainy).

2. Operacja pod mikroskopem

1. Ustaw mysz w pozycji bocznej z nosem skierowanym w stronę chirurga. Wykonuje się szczypanie palca u nogi w celu potwierdzenia znieczulenia chirurgicznego, a przed rozpoczęciem operacji zakłada się sterylne rękawiczki.
2. Naciąć spojówkę skroniową na tylnym rąbku i oddzielić spojówkę od twardówki. Unikaj penetrowania twardówki. Po tym kroku chwyć spojówkę na rąbku kleszczami, aby kontrolować oko.
3. Wykonaj samouszczelniające się nacięcie twardówki za pomocą końcówki igły 30 G ze skosem skierowanym do góry. Wykonaj tunel twardówkowy przez twardówkę i wniknij w twardówkę do naczyniówki (ryc. 1). Unikać penetracji siatkówki. Jeśli wystąpi krwawienie naczyniówkowe i wyjdzie przez ranę twardówki, wykonaj zwężenie włócznią chirurgiczną, aż krwawienie ustanie. Ta rana twardówkowa zostanie samoczynnie uszczelniona ciśnieniem wewnątrzgałkowym.
4. Nakłuć rogówkę igłą 30 G, aby zmniejszyć ciśnienie wewnątrzgałkowe. Igły należy używać równolegle do tęczówki, aby uniknąć uszkodzenia tęczówki i soczewki podczas wprowadzania do komory przedniej. Ciśnienie wewnątrzgałkowe spowoduje samouszczelnienie się rany.
5. Włóż igłę 33 G podłączoną do strzykawki Hamiltona 10 μl do przestrzeni podsiatkówkowej ze skosem skierowanym w dół (w kierunku wewnętrznego oka) i delikatnie wstrzyknij 3,5 μl hialuronianu sodu, aby odłączyć siatkówkę neurosensoryczną od leżącego pod nią RPE. Należy unikać penetracji siatkówki igłą 33 G, ponieważ hialuronian sodu dostanie się do przestrzeni ciała szklistego, ale nie do przestrzeni podsiatkówkowej, jeśli siatkówka zostanie przeniknięta. Należy również unikać szybkiego wstrzykiwania, ponieważ spowoduje to rozdarcie jamy ustnej, a hialuronian sodu wycieknie do przedniej komory.
6. Pozwól, aby ciecz wodnista wypłynęła z nakłucia rogówki, popychając rogówkę wokół nakłucia rogówki za pomocą kleszczy, aby wyregulować ciśnienie wewnątrzgałkowe.
7. Potwierdź brak wycieku z rany twardówki za pomocą włóczni chirurgicznej.
8. Aby zmniejszyć ryzyko wycieku hialuronianu sodu, umieść klej chirurgiczny z cyjanoakrylanem na ranie twardówki.
9. Ponownie przymocuj spojówkę do jej pierwotnej pozycji za pomocą kleju chirurgicznego z cyjanoakrylanem. To jeszcze bardziej zmniejszy ryzyko wycieku hialuronianu sodu.
10. Sprawdź dno oka za pomocą szkła nakrywkowego i potwierdź utworzenie pęcherzowego RD bez krwotoku podsiatkówkowego.

3. Po zabiegu

1. Nałóż maść z antybiotykiem bacytracyny na oko, aby zmniejszyć ryzyko infekcji.
2. Trzymaj myszy na poduszce grzewczej, aby zapobiec znieczuleniu (mieszaninie ketaminy i ksylazyny) powodującemu niską temperaturę ciała po niskim ciśnieniu krwi.
3. Umieść myszy z powrotem w klatce dla zwierząt po przebudzeniu z narkozy. Codziennie monitoruj myszy pod kątem powikłań. Jeśli pojawią się jakiekolwiek komplikacje, poddaj myszy eutanazji zgodnie z poniższym opisem.

4. Poświęcenie

1. Poddać myszy eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy po dootrzewnowym wstrzyknięciu 100 mg / kg pentobarbitalu sodu i wyłuszczyć oczy w odpowiednich punktach czasowych dla każdego eksperymentu (nie pokazano). Unikaj wywierania nacisku na oko podczas enukleacji, ponieważ hialuronian sodu może wyciekać. Pęcherzowe RD powinny utrzymywać się przez co najmniej 14 dni.

Wyniki

Aby ocenić trwałość odwarstwienia siatkówki (RD) wywołanego zgodnie z tym protokołem, w 3., 7. i 14. dniu po indukcji RD wykonano krioprzecięcia. Dla każdego punktu czasowego wykorzystano sześć oczu. Do wizualizacji przekrojów zastosowano barwienie hematoksyliną i eozyną (HE). Wszystkie przekroje wykazały pęcherzowe RD sięgające soczewki (Rysunek 2). W jednym oku w 7. dniu zaobserwowano krwotok podsiatkówkowy. W żadnym z oczu nie wystąpiły oznaki infekcji ani uszkodzenia soczewki.

Rysunek 1. Wykonanie samouszczelniającego nacięcia twardówki. Ten schemat przedstawia obraz przekroju poprzecznego prawidłowego oka myszy. Czerwona linia wskazuje samouszczelniające nacięcie twardówki. Wykonanie tunelu w twardówce, a następnie penetracja twardówki do naczyniówki igłą 30 G tworzy samouszczelniające nacięcie twardówki. Rana ta zostanie samoczynnie uszczelniona pod wpływem ciśnienia wewnątrzgałkowego, co może zapobiec wyciekowi hialuronianu sodu po wstrzyknięciu do przestrzeni podsiatkówkowej i pozwolić na uzyskanie trwałych odwarstwień bąblowych siatkówki.

Rycina 2. Przebieg czasowy odwarstwienia siatkówki. To zdjęcie dna oka przedstawia pęcherzykowate odwarstwienie siatkówki bez krwotoku podsiatkówkowego bezpośrednio po zabiegu. Przekroje mrożone z barwieniem hematoksyliną i eozyną (HE) wykazują trwałe pęcherzykowate odwarstwienie siatkówki bez krwotoku podsiatkówkowego co najmniej do 14. dnia.

Dyskusja

Opisano kilka metod ustalania modelu RD w oczach gryzoni^{3-15, 22}. Większość z nich wykorzystuje podsiatkówkowe wstrzyknięcie hialuronianu sodu, ponieważ jest to lepki materiał powszechnie stosowany podczas operacji wewnątrzgałkowej u ludzi i nie wiąże się z żadną znaną toksycznością oczną^1-15. Hialuronian sodu, w przeciwieństwie do zwykłej soli fizjologicznej lub soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), wydłuża czas trwania RD.

Metody wstrzykiwania hialuronianu sodu do siatkówki wykorzystują jedno z dwóch podejść: dostęp przezszklistkowy^3-6 lub dostęp przeztwardówkowy^7-15. Obie metody wykonywane są z obserwacją dna oka. W podejściu transszklistkowym do jamy ciała szklistego wprowadza się wstrzykiwacz podsiatkówkowy, w siatkówce obwodowej tworzy się retinotomię, a hialuronian sodu jest wstrzykiwany do przestrzeni podsiatkówkowej. W tej metodzie wykonuje się dwa rozdarcia siatkówki, co zwiększa ryzyko krwotoku siatkówkowego, który może dostać się do przestrzeni podsiatkówkowej. Ponadto istnieje ryzyko uszkodzenia soczewki podczas tworzenia retinotomii. Istnieje kilka zmodyfikowanych metod podejścia przeztwardówkowego. W większości tych metod^7-12, po obniżeniu ciśnienia wewnątrzgałkowego za pomocą nakłucia przedniej komory, igła 30 G połączona ze strzykawką wypełnioną hialuronianem sodu jest bezpośrednio wprowadzana do przestrzeni podsiatkówkowej przez spojówkę, twardówkę, naczyniówkę i RPE. Hialuronian sodu jest następnie wstrzykiwany do przestrzeni podsiatkówkowej. Ryzyko rozdarcia siatkówki i uszkodzenia soczewki przy użyciu tej metody przeztwardówkowej jest mniejsze niż w przypadku dostępu przezszklistego. Jednak otwór wykonany w twardówce za pomocą igły 30 G jest duży, szczególnie w przypadku oczu myszy, a hialuronian sodu wstrzyknięty do przestrzeni podsiatkówkowej łatwo wycieka z oka przez ranę twardówki. Prowadzi to do niższej, mniej trwałej RD i bardziej zmiennej śmierci komórek fotoreceptorów. Ponadto, jeśli krwawienie naczyniówkowe wystąpi na etapie perforacji twardówki, krwotok rozprzestrzeni się do przestrzeni podsiatkówkowej, ponieważ ciśnienie wewnątrzgałkowe zostało zmniejszone przed wstrzyknięciem hialuronianu podsiatkówkowego.

Kilka czynników może wpływać na wpływ RD na odwarstwioną siatkówkę, w tym zarówno krwotok podsiatkówkowy, jak i wysokość i trwałość RD^16-21. Śmierć komórki fotoreceptora wzrasta wraz ze wzrostem wysokości RD^{16, 17}, a uszkodzenie komórek fotoreceptorów może być bardziej rozległe z powodu zmniejszonej dyfuzji tlenu i niezbędnych składników odżywczych z naczynia włosowatego przy wyższym RD w porównaniu z płytkim RD. Krwotok podsiatkówkowy jest również toksyczny dla komórek fotoreceptorów^18-21; Możliwe mechanizmy tej toksyczności w odwarstwionej siatkówce obejmują niedotlenienie i zakłócenie metabolizmu przez krwotok podsiatkówkowy jako barierę dyfuzyjną oraz bezpośrednią neurotoksyczność indukowaną przez składniki krwi (takie jak żelazo). Uszkodzenie soczewki, o którym doniesiono, że działa ochronnie na komórki zwojowe siatkówki²³, może również wpływać na śmierć komórki fotoreceptora po indukcji RD. Ponadto, jeśli miejsce rany wlotowej nie zostanie uszczelnione, hialuronian sodu może wyciekać w wyniku manipulacji oka podczas enukleacji. Może to prowadzić do błędnej klasyfikacji RD jako płytkiej, co z kolei może wpłynąć na interpretację wyników.

Zmodyfikowaliśmy metodę przeztwardówkową do wstrzykiwania podsiatkówkowego hialuronianu sodu, aby zwiększyć odtwarzalność RD i zmniejszyć częstość krwotoku podsiatkówkowego. Krytycznym etapem tego protokołu jest wykonanie samouszczelniającego się nacięcia twardówki za pomocą igły 30 G, co zapobiega wyciekowi hialuronianu sodu po wstrzyknięciu. W przeciwieństwie do poprzednich metod, ten protokół jest wykonywany bez obserwacji dna oka, dlatego większą uwagę zwraca się na ranę twardówki. Zastosowanie kleju zapobiega również wyciekaniu hialuronianu sodu z oka. Z naszego doświadczenia wynika, że częstość krwotoku podsiatkówkowego przy tym protokole była znacznie mniejsza niż w przypadku innych protokołów. Jeśli krwawienie naczyniówkowe wystąpi podczas etapu nacięcia twardówki, wyjdzie ono z oka przez ranę twardówkową, ponieważ ten etap jest wykonywany przed obniżeniem ciśnienia wewnątrzgałkowego. Jeśli krwawienie naczyniówkowe wystąpi po obniżeniu ciśnienia wewnątrzgałkowego i odwarstwieniu siatkówki neurosensorycznej, krew zostanie rozprowadzona do przestrzeni podsiatkówkowej. Odkryliśmy, że dzieje się tak w około 5% przypadków, w przeciwieństwie do około 10-20% w przypadku innych technik. Zwierzęta te powinny być wyłączone z analizy.

Technika ta może być również stosowana do wstrzykiwania podsiatkówkowego transferu genów za pośrednictwem wektora do docelowych komórek fotoreceptora lub RPE^{24, 25}. Ponieważ typowy nośnik (PBS, sól fizjologiczna) do tych zastrzyków jest znacznie mniej lepki niż hialuronian sodu, standardowe techniki są nękane większą liczbą wycieków. Opisana w niniejszym dokumencie technika, zmniejszając to ryzyko, sprawia, że eksperymenty z transferem wektorów są bardziej powtarzalne i wiarygodne.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Ketaject	Phoenix	2010025
AnaSed	LLOYD	4004821
5% Fenylefryna / 0,5% Tropicamid	Massachusetts Eye and Ear Pharmacy
0,5% Chlorowodorek proparakainy Roztwór okulistyczny	AKORN	17478-263-12
Provics	Alcon	8065183085
Webglue	Patterson Veterinary	07-8566128
Mikroskop	Leica	MG90
30G1/2 Igła PrecisionGlide	BD	305106
Weck-Cel Eye Spears	Beaver-Visitec	0008685
10 mikrolitrów Strzykawka	Hamilton	7635-01
33, igła 0,5 cala	Hamilton	7803-05
Szkło osłonowe 18x18mm	Fisher Scientific	18-548A