Artykuł metodologiczny

Barwienie przeciwciał u C. elegans za pomocą "krakingu zamrażalnego"

DOI:

10.3791/50664

⸱

14 października 2013

1Department of Biological Sciences, Ohio University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

"Freeze-cracking", metoda wystawiania wewnętrznych tkanek nicienia C. elegans na działanie przeciwciał w celu lokalizacji białek.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Do plamy C. elegans z przeciwciałami, stosunkowo nieprzepuszczalny naskórek należy ominąć metodami chemicznymi lub mechanicznymi. "Freeze-cracking" to jedna z metod stosowanych do fizycznego wyciągania naskórka z nicieni poprzez ściskanie nicieni między dwoma przylegającymi szkiełkami, zamrażanie ich i rozsuwanie szkiełek. Freeze-cracking zapewnia prosty i szybki sposób na uzyskanie dostępu do tkanek bez obróbki chemicznej i może być stosowany z różnymi utrwalaczami. Prowadzi to jednak do utraty wielu próbek, a wymagana kompresja mechanicznie zniekształca próbkę. Wymagana jest praktyka, aby zmaksymalizować odzysk próbek o dobrej morfologii. Kraking zamrażalniczy można zoptymalizować pod kątem określonych warunków utrwalania, odzysku próbek lub niskiego niespecyficznego barwienia, ale nie dla wszystkich parametrów jednocześnie. W przypadku przeciwciał, które wymagają bardzo twardych warunków wiązania i tolerują obróbkę chemiczną potrzebną do chemicznej przepuszczalności naskórka, preferowane może być leczenie nienaruszonych nicieni w roztworze. Jeśli przeciwciało wymaga lżejszego mocowania lub jeśli optymalne warunki wiązania są nieznane, kraking zamrażalny stanowi bardzo przydatny sposób szybkiego oznaczania przeciwciała i może dostarczyć określonych informacji o lokalizacji subkomórkowej i komórkowej dla interesującego antygenu.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby określić komórkową i subkomórkową lokalizację białek, naukowcy tradycyjnie oznaczali tkanki przeciwciałami wybranymi do specyficznego rozpoznawania określonych białek1. W niektórych organizmach modelowych, takich jak C. elegans, barwienie przeciwciałami zostało często zastąpione technikami genetyki molekularnej, które dają wyniki szybciej. Należą do nich transformujące się organizmy z konstruktami składającymi się z fuzji genów między regionami promotora i kodującymi genu będącego przedmiotem zainteresowania a zielonym białkiem fluorescencyjnym. Jednak techniki molekularne są narażone na szereg artefaktów, w tym problemy z poznaniem prawdziwego....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Przedstawiono wiele etapów protokołu z opcjami konfiguracji i przygotowania, w zależności od konkretnych warunków eksperymentu. W takich przypadkach alternatywne kroki są przedstawione jako A, B, C itd. Protokół z alternatywnymi krokami przedstawiono na rysunku 1.

1. Przygotowanie preparatów pokrytych polilizyną

Można stosować trzy różne rodzaje preparatów, w zależności od pożądanego kompromisu między łatwością przygotowania, względną adhezją i niespecyficznym wiązaniem przeciwciała. Szczegółowe informacje na temat alternatywnych metod przygotowania preparatów podano poniżej w kroka....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gdy robaki są odpowiednio ściśnięte, popękane i lekko naprawione, praktycznie cały robak może być dostępny dla barwienia przeciwciałami (patrz Rysunek 2). Lokalizacja jąder wskazywana przez barwienie DAPI wskazuje, które części robaka są nienaruszone Gdy robaki są poddawane twardszemu utrwalaczowi, takiemu jak formaldehyd, morfologia robaka może zostać zniekształcona (co widać po nienaturalnie falistym wyglądzie mięśni na rycinach 3A-D). Innym częstym problemem jest nierównomierne utrwal.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół krakingu przez zamrażanie jest jedną z kilku metod barwienia przeciwciał u C. elegans. Zapewnia stosunkowo prosty sposób barwienia robaków, ale wymaga określonych odczynników i praktyki w celu uzyskania optymalnych wyników. Etapy krytyczne (przedstawione na rysunku 1) obejmują: 1) przygotowanie szkiełek (patrz kroki 1 i 2) ręczne wyciskanie nicieni (patrz kroki 2 i 3) szybkie utrwalanie (patrz krok 3). Po pierwsze, aby zmaksymalizować przyczepność nicieni do szkiełek, najlepiej jest prz.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorka oświadcza, że nie ma konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Finansowanie zostało zapewnione przez NSF CCLI#0633618 i Uniwersytet Ohio. Niektóre szczepy zostały dostarczone przez Caenorhabditis Genetics Center. W filmie pojawia się doktorantka Reetobrata Basu.

....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
suwak poli-L-lizynowy (marka ESCO)Fisher12-545-78Prowadnice marki Sigma pasują również do
bromowodorku poli-L-lizynySigmaP1524WAŻNE: Marka i wysoka masa cząsteczkowa krytycznych dla polilizyny
szkiełek z pojedynczą matową krawędziąFisher48312-002Inne marki są odpowiednie
azydek soduSigmaS2002-25GTOXIC, nosić rękawiczki i maskę podczas ważenia proszku, aby uzyskać 10% zapasu. Nosić rękawice podczas pipetowania roztworu podstawowego
słoik do barwienia coplinVWR47751-792Inne marki są odpowiednie
5-szkiełkowa kopertaMikroskopia elektronowa Nauka71549-01Jedna z wielu różnych marek małych uchwytów do szkiełek, odpowiednich do barwienia
paraformaldehyduVWRMK262159WAŻNE: Zwykłe roztwory formaliny (37% formaldehydu) NIE są odpowiednie. 1) Rozpuść paraformaldehyd krystalinowy w buforze fosforanowym i przechowuj w małych porcjach zamrożonych. Lub 2) kup paraformaldehyd klasy mikroskopii elektronowej w podwielokrotnościach. TOXIC - nosić rękawice; Nadmiar zlewu wylać wodą.
Roztwór aldehydu glutarowego, 25% w wodzieSigmaG 5882WAŻNE: kup aldehyd glutarowy klasy do mikroskopii elektronowej w ampułkach; TOXIC - nosić rękawice; Nadmiar zlewu wylać wodą.
Triton X-100VWREM-9410Inne marki są odpowiednie
Albumina surowicy bydlęcejFisherICN820451Inne marki są odpowiednie
Serum osła, liofilizowaneJackson Immunoresearch017-000-121Inne marki są odpowiednie
Cy3 Donkey anty-mysie IgG wieloznakoweJackson Immunoresearch715-165-150Firma ta jest zalecana do produkcji wysokiej jakości przeciwciał wieloznakowych (zubożonych w powinowactwo). Wybierz odpowiedni barwnik i antygen (zwierzę używane do wytworzenia przeciwciała pierwotnego).
galusan n-propyluFisherICN10274750Inne marki są odpowiednie
DAPI, dichlorowodorek 4',6'-diamidino-2-fenyloindoluSigmaD 9542TOXIC. Nosić rękawice i dozować do małych porcji i feeze, aby zminimalizować narażenie
Whatman #1 Filtry o średnicy 15 cmFisher09805G
Szkiełko nakrywkowe #1 1/2 prostokąt 24 x 60 mmVWR48393-252#1 grubość 1/2 jest optycznie najlepsza
Teczka na szkiełka mikroskopoweVWR48429-092Inne marki są odpowiednie

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Harlow, E., Lane, D. Antibodies: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York City, New York. (1988).
  2. Mello, C., Fire, A. DNA Transformation. Methods Cell Biol. 48, 451-482 (1995).
  3. Boulin, T., Etchberger, J. F., Hobert, O. Reporter gene fusions.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Kompresja preparatu na szkie kufiksacja suchym lodemmetanol acetonmikroskopia fluorescencyjnaprzygotowanie nicienipermeabilizacja tkanekodzyskiwanie preparat w

Powiązane artykuły