Barwienie przeciwciał u C. elegans za pomocą "krakingu zamrażalnego"

Podsumowanie

"Freeze-cracking", metoda wystawiania wewnętrznych tkanek nicienia C. elegans na działanie przeciwciał w celu lokalizacji białek.

Streszczenie

Do plamy C. elegans z przeciwciałami, stosunkowo nieprzepuszczalny naskórek należy ominąć metodami chemicznymi lub mechanicznymi. "Freeze-cracking" to jedna z metod stosowanych do fizycznego wyciągania naskórka z nicieni poprzez ściskanie nicieni między dwoma przylegającymi szkiełkami, zamrażanie ich i rozsuwanie szkiełek. Freeze-cracking zapewnia prosty i szybki sposób na uzyskanie dostępu do tkanek bez obróbki chemicznej i może być stosowany z różnymi utrwalaczami. Prowadzi to jednak do utraty wielu próbek, a wymagana kompresja mechanicznie zniekształca próbkę. Wymagana jest praktyka, aby zmaksymalizować odzysk próbek o dobrej morfologii. Kraking zamrażalniczy można zoptymalizować pod kątem określonych warunków utrwalania, odzysku próbek lub niskiego niespecyficznego barwienia, ale nie dla wszystkich parametrów jednocześnie. W przypadku przeciwciał, które wymagają bardzo twardych warunków wiązania i tolerują obróbkę chemiczną potrzebną do chemicznej przepuszczalności naskórka, preferowane może być leczenie nienaruszonych nicieni w roztworze. Jeśli przeciwciało wymaga lżejszego mocowania lub jeśli optymalne warunki wiązania są nieznane, kraking zamrażalny stanowi bardzo przydatny sposób szybkiego oznaczania przeciwciała i może dostarczyć określonych informacji o lokalizacji subkomórkowej i komórkowej dla interesującego antygenu.

Wprowadzenie

Aby określić komórkową i subkomórkową lokalizację białek, naukowcy tradycyjnie oznaczali tkanki przeciwciałami wybranymi do specyficznego rozpoznawania określonych białek¹. W niektórych organizmach modelowych, takich jak C. elegans, barwienie przeciwciałami zostało często zastąpione technikami genetyki molekularnej, które dają wyniki szybciej. Należą do nich transformujące się organizmy z konstruktami składającymi się z fuzji genów między regionami promotora i kodującymi genu będącego przedmiotem zainteresowania a zielonym białkiem fluorescencyjnym. Jednak techniki molekularne są narażone na szereg artefaktów, w tym problemy z poznaniem prawdziwego promotora i zmiany w ekspresji konstruktów przy dużej liczbie kopii (typowe techniki u C. elegans)^2,3. Dlatego barwienie przeciwciałami pozostaje celem wielu naukowców badających funkcję białek in vivo.

Barwienie tkanek przeciwciałami może być trudne, ponieważ przeciwciała mogą rozpoznać swój antygen tylko w określonej konformacji¹. Na przykład przeciwciała mogą rozpoznawać tylko zdenaturowany lub nienaruszony antygen utrwalony w określony sposób i mogą nie rozpoznawać antygenu in situ. Problem barwienia przeciwciałami u nicieni pogłębia fakt, że naskórek nicienia tworzy stosunkowo nieprzepuszczalną barierę, blokując dostęp przeciwciał do tkanek.

Istnieje kilka różnych metod barwienia przeciwciał u C. elegans (omówione w naszej poprzedniej pracy⁴). Aby zabarwić nienaruszone "robaki", opracowano metody zamrażania i rozmrażania w stosunkowo twardym utrwalaczu (formaldehyd lub aldehyd glutarowy); Cykle zamrażania i rozmrażania pomagają pęknąć naskórek, aby umożliwić szybką penetrację utrwalacza⁵. Po utrwaleniu naskórek został przeniknięty, aby umożliwić penetrację przeciwciała; Metody obejmowały leczenie środkami redukującymi, kolagenazą lub obiema^5-7. Terapie te zachowywały morfologię, ale często zmniejszały lub niszczyły rozpoznawanie przeciwciał. Alternatywne metody obejmują preparację⁸, aby umożliwić penetrację przeciwciał.

"Freeze-cracking" to jeden ze sposobów na uzyskanie dostępu do wnętrza częściowo nienaruszonego robaka, aby umożliwić barwienie przeciwciał^9-10. Freeze-cracking można przeprowadzić w różnych warunkach utrwalenia, unikając kolagenazy i zabiegów redukcyjnych. Nicienie umieszcza się między dwoma szkiełkami samoprzylepnymi, zamraża, a następnie szkiełka rozdziela się, pozostawiając większość nicieni na dolnym szkiełku i większość naskórka na górnym szkiełku. Dolne szkiełko można umieścić w utrwalaczu, a całe szkiełko z przylegającymi nicieniami jest przenoszone przez procedurę barwienia przeciwciałami. Metoda ta wiąże się z dwiema poważnymi trudnościami. Po pierwsze, trudno jest zastosować odpowiednią siłę nacisku niezbędną do rozszczepienia nicieni bez ich poważnego zdeformowania. Po drugie, wiele robaków nie przyklei się do żadnego szkiełka i zostanie utraconych w utrwalaczu lub płukankach. Jednak przy odpowiednich preparatach i praktyce metoda szybko da nicienie o rozsądnej morfologii, które można stosować z szeroką gamą utrwalaczy i przeciwciał.

Metoda może być nieco zróżnicowana, w zależności od celu eksperymentatora. Jeśli pożądane jest barwienie pojedynczych nicieni (np. w celu określenia, czy pojedynczy transformant ma zmienione barwienie przeciwciałami), można zastosować szkiełka o maksymalnej przyczepności (ale wyższym barwieniu tła), takie jak przygotowane laboratoryjnie szkiełka z dodatkową polilizyną (patrz poniżej). Do utrwalania formaldehydu lub aldehydu glutarowego należy stosować szkiełka o wyższej przyczepności (przygotowane laboratoryjnie szkiełka polilizynowe), ponieważ nicienie gorzej przylegają do polilizyny po tych utrwaleniach. Jeżeli nicienie typu dzikiego są utrwalane metanolem i/lub acetonem, należy stosować szkiełka o mniejszej przyczepności i niższym barwieniu tła (szkiełka komercyjne lub przygotowane laboratoryjnie). Jeśli w laboratorium stosuje się różne przeciwciała i utrwalacze, wybór preparatów może być przygotowany z wyprzedzeniem i przechowywany do czasu, gdy będą potrzebne.

Po uzyskaniu dostępu do tkanki nicienia, procedury barwienia przeciwciał są zgodne ze standardowymi metodami (z dłuższymi inkubacjami charakterystycznymi dla tkanek, a nie komórek^1,11).

Protokół

UWAGA: Przedstawiono wiele etapów protokołu z opcjami konfiguracji i przygotowania, w zależności od konkretnych warunków eksperymentu. W takich przypadkach alternatywne kroki są przedstawione jako A, B, C itd. Protokół z alternatywnymi krokami przedstawiono na rysunku 1.

1. Przygotowanie preparatów pokrytych polilizyną

Można stosować trzy różne rodzaje preparatów, w zależności od pożądanego kompromisu między łatwością przygotowania, względną adhezją i niespecyficznym wiązaniem przeciwciała. Szczegółowe informacje na temat alternatywnych metod przygotowania preparatów podano poniżej w krokach 1A-1C w kolejności zwiększania przyczepności i złożoności. Preparaty przygotowane tymi różnymi metodami mogą być używane razem w jednym eksperymencie.

1A. Brak przygotowania do slajdów

Dostępne na rynku prowadnice pokryte polilizyną zapewniają niską przyczepność i niskie tło.

1B. Przygotowanie szkiełek optymalne do utrwalania metanolu i acetonu

Średnia przyczepność i niskie tło.

1. Przygotuj roztwór polilizyny do zanurzania szkiełek: Dodaj 400 mg poli-L-lizyny o bardzo wysokiej masie cząsteczkowej (150 000 - 300 000 D) do 200 ml podwójnie destylowanej wody. Dodać 2 ml 10% wywaru z azydku sodu (stężenie końcowe 0,1%) jako środek konserwujący. UWAGA: suchy azydek sodu jest reaktywny i wszystkie formy są toksyczne. Noś maskę i rękawiczki podczas ważenia proszku, aby przygotować 10% bulionu w wodzie podwójnie destylowanej.
2. Przetrzyj szkiełka z matowego szkła z pojedynczym końcem niestrzępiącymi się chusteczkami, usuwając smugi i cząstki. Należy to zrobić nawet w przypadku szkiełek zakupionych z oznaczeniem "wstępnie oczyszczone".
3. Umieść szkiełka tyłem do siebie w uchwycie na szkiełka, słoiku z kopiną lub innym pojemniku do barwienia szkiełek, utrzymując matowe krawędzie do góry i nie do końca idealnie wyrównane (aby ułatwić późniejsze oddzielenie). Umieść uchwyt na plasterki w zlewce z 70% etanolem (alkohol klasy odczynnik nie jest potrzebny) z 1% HCl w wodzie destylowanej lub napełnij słoik do barwienia do poziomu lukru. Skała ślizga się w roztworze przez minimum 5 minut. UWAGA: Ten roztwór jest, należy nosić rękawice. UWAGA: To rozwiązanie może być wielokrotnie używane (do kilku miesięcy).
4. Szkiełka płucz pod bieżącą wodą destylowaną przez 1 min.
5. Całkowicie suche szkiełka w środowisku wolnym od kurzu, umieszczając w piekarniku o temperaturze 40-60 °C na 30-60 minut lub przechowując przez noc w temperaturze pokojowej.
6. Inkubować szkiełka w roztworze polilizyny (pokrywając nieoszronione części) na wahaczu przez 15 minut.
7. Powtórz suszenie szkiełek.
8. Powtórzyć etapy inkubacji i suszenia roztworu polilizyny.
9. Oddziel szkiełka za pomocą cienkiego metalowego przedmiotu, takiego jak cienka szpatułka do ważenia. Jeśli są odpowiednio przylegające, trudno je rozdzielić. Nosić odpowiedni sprzęt ochronny (okulary ochronne) i pracować na papierze stołowym (do wyrzucenia po użyciu), ponieważ małe kawałki szkła mogą odlecieć luźno po rozdzieleniu szkiełek.
10. Przechowuj szkiełka w czystym (bezpyłowym) pudełku na szkiełka w temperaturze 4 °C do czasu, gdy będą potrzebne.

1C. Przygotowanie szkiełek optymalne do utrwalania formaldehydu

Najwyższa przyczepność, ale wysokie tło.

1. Szkiełka podstawowe przygotowane metodą 1B należy umieścić płasko w naczyniu bezpyłowym (do suszenia w piekarniku) lub na płaskiej, wolnej od kurzu powierzchni (do suszenia na powietrzu).
2. Umieść 20-60 μl kropli roztworu polilizyny na środku każdego szkiełka.
3. Całkowicie wysuszyć szkiełka w piekarniku lub w temperaturze pokojowej. Polilizyna pozostawi blade owale podczas parowania. Te owale są bardzo przyczepne. Niestety, wiążą się one również z przeciwciałami pierwszorzędowymi i drugorzędowymi, nawet po zablokowaniu.
4. Przechowuj szkiełka w czystym (bezpyłowym) pudełku na szkiełka w temperaturze 4 °C do czasu, gdy będą potrzebne.

2. Przygotowanie mrożonych szkiełek z nicieni

Przygotuj nicienie do barwienia, całkowicie oczyszczając je z bakterii, używając metody 2A (dla płytek nicieni) lub 2B (dla pojedynczych nicieni).

2A. Przygotowanie preparatów z płytek nicieni

1. Umieść płaski kawałek metalu na suchym lodzie, aby wstępnie schłodzić.
2. Użyj wody destylowanej i szklanej pipety (zmniejsza utratę robaków) lub mikropipety, aby wypłukać robaki z płytki NGM z bakteriami do probówki o pojemności 1,5 ml. Talerze mogą być zsynchronizowane lub mieszane wieki; Nie używaj płytek z wieloma dauerami (trudnymi do złamania) lub głodnymi robakami (zwiększona autofluorescencja), chyba że jest to konieczne.
3. Opłucz robaki 3-4x wodą destylowaną, aż będą wolne od bakterii. (Aby zmniejszyć utratę robaków, użyj tej samej szklanej pipety.) Aby granulować robaki, pozwól im usiąść na ławce przez 3-5 minut (aby zebrać głównie dorosłe osobniki na dnie probówki) lub wiruj przez 30 sekund z prędkością ~1,000 obr./min (~ 500 g) w wirówce stołowej (w celu zebrania dorosłych, larw i zarodków).
4. Usuń większość wody z rurki z robakami, pozostawiając około dwa razy więcej wody niż robaki (ale co najmniej 25 μl całkowitej objętości).
5. Oznacz matową stronę "spodu" (obrobionego w kroku 1) szkiełka polilizynowe niezmywalnym atramentem i umieść szkiełka na blacie obok pojemnika z suchym lodem, etykietą do góry.
6. Miej pod ręką równą liczbę zwykłych (wytartych, czystych, ale nie poddanych działaniu polilizyny) "górnych" szkiełek.
7. Umieść ~25 μl robaków w wodzie na "dolnym" szkiełku przylegającym i rozprowadź płyn zawierający robaki na środkowej części szkiełka za pomocą boku końcówki pipety.
8. Pozwól robakom osiąść na 30 sekund do 2 minut. Jeśli szkiełko jest odpowiednio lepkie, końce robaków będą się przyklejać, gdy zetkną się ze szkiełkiem.
9. Przytrzymaj dolną prowadnicę jedną ręką i umieść górną prowadnicę na dolnej prowadnicy, tak aby wszystkie oprócz matowych części zachodziły na siebie. Płyn powinien lekko rozsuwać szkiełka, aby robaki nadal lekko się poruszały. Nie pozwól, aby zjeżdżalnie ślizgały się po sobie - to skręca robaki.
10. Ostrożnie lekko dociśnij lekko prosto w dół górny suwak, używając kciuków i palców wskazujących każdej ręki. Przy idealnym nacisku kilka największych hermafrodytów na krawędzi szkiełek pęknie, podczas gdy większość dorosłych i larw zetknie się z każdym szkiełkiem, ale pozostanie nienaruszona.
11. Natychmiast i ostrożnie (bez poślizgnięcia) połóż szkiełka na kawałku metalu na suchym lodzie. Slajdy powinny wyglądać na zamrożone w ciągu jednej minuty. Trzymaj na suchym lodzie przez 5 minut, aż dokładnie zamarznie.
12. W tym momencie szkiełka mogą być przechowywane w oznakowanym pudełku w temperaturze -80 °C przez kilka dni. (Jeśli są przechowywane tygodniami w temperaturze -80 °C, woda zacznie sublimować, a robaki również nie będą się plamić). Jeśli szkiełka są przechowywane w temperaturze -80 °C, pozwól im "rozgrzać się" na suchym lodzie przez 10 minut przed pęknięciem.
13. Przejdź do kroku 3 (mocowanie).

2B. Przygotowanie preparatów poszczególnych nicieni

1. Umieść płaski kawałek metalu na suchym lodzie, aby wstępnie schłodzić.
2. Użyj kilofa, aby przenieść pojedyncze nicienie do kropli wody na płytce NGM, aby uwolnić je od bakterii. Nicienie powinny być dobrze odżywione, aby zmniejszyć autofluorescencję, jeśli to możliwe. W razie potrzeby powtórz przenoszenie do nowych miejsc w wodzie, aż robak(i) będą wolne od bakterii.
3. Oznacz matową stronę "dolnych" szkiełek polilizynowych niezmywalnym tuszem i umieść szkiełka na blacie obok pojemnika z suchym lodem, etykietą do góry. Mieć do dyspozycji równą liczbę mniej przylegających "górnych" (nieobrobionych) szkiełek.
4. Umieść kroplę wody o wielkości 5-10 μl w obszarze dolnego szkiełka podwójnie potraktowanego polilizyną. Użyj większej objętości w przypadku przenoszenia większej liczby robaków, aby zapobiec parowaniu wody przed zakończeniem.
5. Przenieś robak(i) do kropli wody za pomocą wykałaczki do robaków, używając mikroskopu, aby obserwować, jak robaki opadają, aby dotknąć lepkiej powierzchni szkiełka. Przenieś tylko jednego robaka na aż 20+ robaków na kroplę.
6. Przytrzymaj dolną prowadnicę jedną ręką i umieść górną prowadnicę na dolnej prowadnicy, tak aby wszystkie oprócz matowych części zachodziły na siebie.
7. Natychmiast i ostrożnie (bez poślizgu i ściskania) połóż szkiełka na kawałku metalu na suchym lodzie. Przechowywać na suchym lodzie przez 5-30 minut (nie przechowywać tych szkiełek przez długi czas, ponieważ łatwo wysychają).
8. Przejdź do kroku 3 (mocowanie).

3. Fiksacja

Utrwalacze są niezbędne do 'utrwalenia' antygenu w komórce, poprzez wytrącanie ("fiksacja światła") lub sieciowanie ("twarda fiksacja") antygenu. Utrwalenie może zakłócić antygenowość; Większość znanych przeciwciał działa najlepiej w przypadku określonego warunku fiksacji. W przypadku nowych przeciwciał należy zbadać szereg warunków wiązania.

Dla każdej fiksacji, pierwszym krokiem jest przygotowanie roztworu soli fizjologicznej buforowanego fosforanem. Następnie utrwalaj szkiełka z nicieniami do barwienia przeciwciałami metodą A (lekkie utrwalanie przy użyciu metanolu i acetonu) lub B (twardsze utrwalanie przy użyciu formaldehydu lub aldehydu glutarowego).

1. Przygotować sterylny 10 x PBS (roztwór podstawowy z buforem soli fizjologicznej), dodając 80 g NaCl, 2,0 g KCl, 27,2 g Na₂HPO₄•H₂0, 2,4 g KH₂PO₄, 20 ml 10% bulionu azydku sodu. Aby przygotować ten roztwór podstawowy, odważ proszek azydku sodu, aby uzyskać 10% roztwór w wodzie podwójnie destylowanej. Mieszaj sól fizjologiczną z delikatnym ogniem, aż się rozpuści. UWAGA: suchy azydek sodu jest reaktywny i wszystkie formy są toksyczne. Nosić maskę i rękawiczki podczas pracy z suchym azydkiem sodu lub roztworami.
2. Pozostaw sól fizjologiczną do ostygnięcia (Tris pH jest wrażliwe na temperaturę), a następnie pH do 7,2 z 1-10 M NaOH. Uzupełnij do 1 l wodą podwójnie destylowaną i autoklawem do sterylizacji. Przechowywać w temperaturze pokojowej i w razie potrzeby rozcieńczyć do 1x sterylną wodą podwójnie destylowaną. UWAGA: NaOH jest - podczas użytkowania należy nosić rękawice.

3A. Lekka poprawka za pomocą metanolu-acetonu

1. Umieść 100% metanolu, 100% acetonu i 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w słoikach do barwienia na lodzie, aby wstępnie schłodzić przez co najmniej 10 minut. UWAGA: Metanol i aceton są toksyczne, nosić rękawice.
2. Wyjmij parę dolnych i górnych szkiełek z suchego lodu, szybko je rozsuń i natychmiast zanurz "dolną" szkiełko w lodowatym metanolu na 2 minuty. "Górny" suwak można wyrzucić.
3. Przenieś szkiełka z metanolu na lodowaty aceton na 4 minuty. Jeśli slajdy miały wiele robaków, większość (90%) odpadnie w naprawie, nawet przy najlepiej przygotowanych slajdach. Jeśli szkiełka pojedyncze ślimakowe zostały odpowiednio przygotowane, robaki powinny pozostać przyklejone.
4. Umieść lub zanurz szkiełka w słoiku z PBS (aby spłukać utrwalacz) i przejdź do kroku 4 (barwienie).

3B. Twarde rozwiązanie za pomocą formaldehydu lub aldehydu glutarowego

1. Rozcieńczyć formaldehyd lub roztwór aldehydu glutarowego klasy odczynnikowej w 1x PBS do 0,5-4% stężenia końcowego. Podwielokrotności (1,5 ml) mogą być przechowywane w szczelnie zamkniętym korku w temperaturze od -20 do -30 °C; Rozmrozić porcje na lodzie tuż przed użyciem. UWAGA: roztwory formaldehydu ulegają degradacji z czasem i pod wpływem powietrza. UWAGA: formaldehyd i aldehyd glutarowy są toksyczne, nosić rękawice i pracować w kapturze.
2. Wyjmij parę dolnych i górnych szkiełek z suchego lodu, szybko je rozkręć i natychmiast umieść "dolną" szkiełko z robakami w płaskim naczyniu z pokrywką. (Górny slajd można wyrzucić).
3. Natychmiast odpipetować 200 μl toksycznego utrwalacza na środku obszaru szkiełka za pomocą robaków. Utrwalacz częściowo zamarznie na miejscu, a następnie stopi się, aby pokryć większy obszar szkiełka.
4. Jeśli robaki nie są całkowicie pokryte utrwalaczem, natychmiast i ostrożnie dodaj więcej utrwalacza za pomocą mikropipety. Nie pozwól, aby utrwalacz przepłynął przez krawędź szkiełka.
5. Przykryj naczynie pokrywką i odstaw na 10 minut do nocy w temperaturze pokojowej. Upewnij się, że naczynie jest nawilżone, jeśli stosuje się dłuższe inkubacje - można to zrobić, dodając do naczynia złożone, mokre, niestrzępiące się chusteczki. Nie pozwól, aby chusteczki dotykały szkiełek.
6. Po zakończeniu utrwalania ostrożnie odpipetować utrwalacz luźnymi robakami do probówki o pojemności 1,5 ml i zanurzyć szkiełko w słoiku do barwienia z PBS.
7. Kręć rurką ze robakami, które poluzowały się z dużą prędkością, przez 30 sekund, aby opluć. Opłucz robaki dwukrotnie za pomocą PBS, a następnie przetwarzaj równolegle z robakami na szkiełkach (wykonując kroki w probówkach do mikrofugów, a nie na szkiełkach).
8. Przejdź do kroku 4 (barwienie).

4. Barwienie przeciwciał

Protokół barwienia przeciwciał jest podobny do standardowych protokołów dla każdej tkanki na szkiełkach. Protokół ten jest taki sam dla wszystkich preparatów, niezależnie od przygotowania w krokach 1-3.

1. Przygotować bufor przeciwciał, mieszając 700 ml podwójnie destylowanej wody, 100 ml 10x PBS, 5 ml Triton X-100 (0,5% końcowy), 2 ml 0,5 M EDTA pH 8 (1 mM końcowy), 1 g BSA (0,1% końcowy), 5 ml 10% roztworu azydku sodu (0,05% końcowy). pH do 7,2 z HCl, następnie dodać podwójnie destylowaną wodę do 1 l; przechowywać w temperaturze 4 °C.
2. Przygotować blok, rozpuszczając surowicę osła w wodzie podwójnie destylowanej, a następnie dodając 5 ml surowicy do 45 ml buforu przeciwciał (końcowa 10% surowica).
3. Przygotować pierwszorzędowe i drugorzędowe roztwory przeciwciał, rozcieńczając przeciwciało w buforze przeciwciał plus 1% BSA. Zalecane rozcieńczenia to 1:50-1:2,000 dla przeciwciał pierwszorzędowych i 1:1,000-1:5,000 dla przeciwciał drugorzędowych (Cy3 lub OG488 sprzężone przeciwciała osła przeciwko gatunkom używanym do wytwarzania przeciwciał pierwszorzędowych).
4. Przygotować wywar DAPI, mieszając 2,5 mg/ml z wodą podwójnie destylowaną; przechowywać w 8 μl porcji zamrożonych w temperaturze -30 °C. UWAGA: DAPI jest toksycznym barwnikiem wiążącym DNA, należy nosić rękawiczki podczas ważenia i dozowania do porcji.
5. Przygotować 10 ml pożywki montażowej, mieszając 200 mg galusanu n-propylu, 0,3 ml 1 M Tris pH 9, 2,7 ml podwójnie destylowanej wody w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Podgrzewać w temperaturze 65 °C przez około 10 minut, aż do rozpuszczenia. Dodać 7 ml glicerolu i 8 μl porcji DAPI i dobrze odwirować. Podwielokrotność pożywki rozlać do probówek o pojemności 1,5 ml, zawinąć w folię i przechowywać w ciemnym miejscu w temperaturze 4 °C (zarówno powietrze, jak i światło rozkładają podłoże - jeśli stanie się bardziej żółte, należy je wyrzucić wraz z odpadami stanowiącymi zagrożenie biologiczne). UWAGA: galusan n-propylu jest reaktywnym przeciwutleniaczem, podczas ważenia należy nosić rękawice.
6. Przenieś szkiełka do słoika do barwienia z Block na 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub na noc w temperaturze 4 °C (preferowane przez noc w przypadku twardego utrwalenia). Unikaj potrząsania, aby uniknąć utraty robaków.
7. Przenieś szkiełka do słoika do barwienia z przeciwciałem pierwszorzędowym lub umieść szkiełka płasko w nawilżonym naczyniu i przykryj każde 100-500 μl przeciwciała pierwszorzędowego. Szkiełka inkubować przez noc w temperaturze 4 °C bez wstrząsania.
8. Po inkubacji przeciwciał pierwotnych przenieść szkiełka do słoika do barwienia PBS.
9. Filtruj blok przez lejek wyłożony bibułą filtracyjną i przechowuj w temperaturze 4 °C; jeśli jest sterylnie filtrowany co 1-2 tygodnie, blok może być ponownie używany przez 1 lub więcej miesięcy. Podobnie, przefiltrować i zachować przeciwciało pierwszorzędowe w temperaturze 4 °C do ponownego użycia (do 10 lub więcej rund barwienia).
10. Przepłukać szkiełka trzykrotnie (~20 min każde) w buforze przeciwciał.
11. Umieścić szkiełka w przeciwciałie wtórnym w światłoszczelnym pojemniku do barwienia i inkubować przez 4 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C.
12. Przenieś szkiełka do słoika do barwienia PBS. Przefiltrować i zachować przeciwciało drugorzędowe w temperaturze 4 °C do ponownego użycia (do 10 lub więcej rund barwienia).
13. Przepłukać szkiełka trzykrotnie (~20 min każde) w buforze przeciwciał.
14. Przenieść szkiełka do PBS i pozostawić w PBS (od kilku minut do nocy w temperaturze 4 °C) do momentu, gdy będą gotowe do montażu.
15. Pracuj szybko na poszczególnych szkiełkach, tak aby robaki z przodu zjeżdżalni pozostały mokre. Wyjmij jedno szkiełko z PBS, osusz tylną część szkiełka niestrzępiącą się chusteczką i połóż na ręczniku papierowym.
16. Umieść ~20 μl podłoża montażowego na robakach tak, aby na szkiełku znajdowały się w przybliżeniu równe części podłoża i PBS, aby delikatnie wymieszać oba roztwory. UWAGA: Podłoże montażowe jest toksyczne.
17. Przechyl suwak tak, aby matowa krawędź była niższa, a roztwór zebrał się w pobliżu oszronu, a następnie umieść jedną krawędź szkiełka nakrywkowego o wymiarach 24 x 60 mm na roztworze.
18. Delikatnie opuść szkiełko nakrywkowe, aby zminimalizować pęcherzyki powietrza (które zwiększają wybielanie i zakłócają oglądanie). Jeśli tworzą się bąbelki, powoli podnieś krawędź szkiełka nakrywkowego, a następnie opuść go ponownie, nie przesuwając szkiełka nakrywkowego po robakach.
19. Ostrożnie osusz krawędź szkiełka, nie przesuwając szkiełka nakrywkowego, ściskając krawędzie niestrzępiącą się ściereczką. Stosunkowo sucha krawędź szkiełka musi być widoczna dookoła krawędzi szkiełka nakrywkowego
20. Uszczelnij szkiełko nakrywkowe 2-3 warstwami lakieru do paznokci. Szkiełka można umieścić w płaskim uchwycie na szkiełka podczas przygotowania i przechowywania w celu ochrony przed światłem. Gdy szkiełko jest dobrze uszczelnione i suche, wyczyść szkiełko nakrywkowe i tylną część szkiełka.
21. Dobrze uszczelnione szkiełka można przechowywać w ciemności przez dni w temperaturze 4 °C lub tygodnie w temperaturze -20 °C. Z biegiem czasu barwienie DAPI DNA i większość zielonych barwników (np. wzbudzenie 488 nm) zanikają. W razie potrzeby ponownie uszczelnij szkiełko nakrywkowe większą ilością lakieru do paznokci, np. po użyciu dowolnej soczewki zanurzeniowej w olejku.

Wyniki

Gdy robaki są odpowiednio ściśnięte, popękane i lekko naprawione, praktycznie cały robak może być dostępny dla barwienia przeciwciałami (patrz Rysunek 2). Lokalizacja jąder wskazywana przez barwienie DAPI wskazuje, które części robaka są nienaruszone Gdy robaki są poddawane twardszemu utrwalaczowi, takiemu jak formaldehyd, morfologia robaka może zostać zniekształcona (co widać po nienaturalnie falistym wyglądzie mięśni na rycinach 3A-D). Innym częstym problemem jest nierównomierne utrwal...

Dyskusja

Protokół krakingu przez zamrażanie jest jedną z kilku metod barwienia przeciwciał u C. elegans. Zapewnia stosunkowo prosty sposób barwienia robaków, ale wymaga określonych odczynników i praktyki w celu uzyskania optymalnych wyników. Etapy krytyczne (przedstawione na rysunku 1) obejmują: 1) przygotowanie szkiełek (patrz kroki 1 i 2) ręczne wyciskanie nicieni (patrz kroki 2 i 3) szybkie utrwalanie (patrz krok 3). Po pierwsze, aby zmaksymalizować przyczepność nicieni do szkiełek, najlepiej jest prz...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
suwak poli-L-lizynowy (marka ESCO)Fisher		12-545-78	Prowadnice marki Sigma pasują również do
bromowodorku poli-L-lizyny	Sigma	P1524	WAŻNE: Marka i wysoka masa cząsteczkowa krytycznych dla polilizyny
szkiełek z pojedynczą matową krawędzią	Fisher	48312-002	Inne marki są odpowiednie
azydek sodu	Sigma	S2002-25G	TOXIC, nosić rękawiczki i maskę podczas ważenia proszku, aby uzyskać 10% zapasu. Nosić rękawice podczas pipetowania roztworu podstawowego
słoik do barwienia coplin	VWR	47751-792	Inne marki są odpowiednie
5-szkiełkowa koperta	Mikroskopia elektronowa Nauka	71549-01	Jedna z wielu różnych marek małych uchwytów do szkiełek, odpowiednich do barwienia
paraformaldehydu	VWR	MK262159	WAŻNE: Zwykłe roztwory formaliny (37% formaldehydu) NIE są odpowiednie. 1) Rozpuść paraformaldehyd krystalinowy w buforze fosforanowym i przechowuj w małych porcjach zamrożonych. Lub 2) kup paraformaldehyd klasy mikroskopii elektronowej w podwielokrotnościach. TOXIC - nosić rękawice; Nadmiar zlewu wylać wodą.
Roztwór aldehydu glutarowego, 25% w wodzie	Sigma	G 5882	WAŻNE: kup aldehyd glutarowy klasy do mikroskopii elektronowej w ampułkach; TOXIC - nosić rękawice; Nadmiar zlewu wylać wodą.
Triton X-100	VWR	EM-9410	Inne marki są odpowiednie
Albumina surowicy bydlęcej	Fisher	ICN820451	Inne marki są odpowiednie
Serum osła, liofilizowane	Jackson Immunoresearch	017-000-121	Inne marki są odpowiednie
Cy3 Donkey anty-mysie IgG wieloznakowe	Jackson Immunoresearch	715-165-150	Firma ta jest zalecana do produkcji wysokiej jakości przeciwciał wieloznakowych (zubożonych w powinowactwo). Wybierz odpowiedni barwnik i antygen (zwierzę używane do wytworzenia przeciwciała pierwotnego).
galusan n-propylu	Fisher	ICN10274750	Inne marki są odpowiednie
DAPI, dichlorowodorek 4',6'-diamidino-2-fenyloindolu	Sigma	D 9542	TOXIC. Nosić rękawice i dozować do małych porcji i feeze, aby zminimalizować narażenie
Whatman #1 Filtry o średnicy 15 cm	Fisher	09805G
Szkiełko nakrywkowe #1 1/2 prostokąt 24 x 60 mm	VWR	48393-252	#1 grubość 1/2 jest optycznie najlepsza
Teczka na szkiełka mikroskopowe	VWR	48429-092	Inne marki są odpowiednie