Artykuł metodologiczny

Nanobiopolimery na bazie kwasu polimalowego do celowania w wiele markerów nowotworowych: szansa dla medycyny spersonalizowanej?

18K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50668

⸱

13 czerwca 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Nanomedicine Research Center, Department of Neurosurgery, Cedars-Sinai Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiono przykład nanoleku opartego na kwasie polimalowym w kierunku racjonalnego projektowania medycyny spersonalizowanej, która ma zastosowanie w leczeniu raka. Opisuje syntezę nanoleku do leczenia Her2-dodatniego ludzkiego raka piersi u nagiej myszy.

Streszczenie

Guzy o podobnym stopniu i morfologii często różnie reagują na to samo leczenie z powodu różnic w profilowaniu molekularnym. Aby uwzględnić tę różnorodność, opracowano medycynę spersonalizowaną w celu wyciszania genów związanych z nowotworami złośliwymi. Nanoleki odpowiadają na te potrzeby, celując w nowotwór i dostarczając oligonukleotydy antysensowne do wyciszania genów. Ponieważ leki stosowane w leczeniu są często podawane wielokrotnie, pożądany jest brak toksyczności i znikoma odpowiedź immunologiczna. W przedstawionym przykładzie nanolek jest syntetyzowany z biodegradowalnej, nietoksycznej i nieimmunogennej platformy kwasu polimalowego poprzez kontrolowaną ligację chemiczną oligonukleotydów antysensownych i cząsteczek ukierunkowanych na nowotwór. Synteza i leczenie są przykładem ludzkiego Her2-dodatniego raka piersi przy użyciu eksperymentalnego modelu mysiego. Przypadek można przełożyć na syntezę i leczenie innych nowotworów.

Wprowadzenie

W erze postgenomicznej, kiedy genomy raka zostały rozwikłane (National Center for Biotechnology i The Cancer Genome Atlas), przyszłe leczenie raka będzie uwzględniać różnorodność genetyczną guzów często w obrębie tego samego guza1-4. Bioinformatyka i szybkie, niedrogie sekwencjonowanie DNA pozwala na pozyskiwanie złośliwych genów/mutacji na poziomie osobistym2,4,5. Po zidentyfikowaniu genów pacjenci będą leczeni medycyną spersonalizowaną w celu zmodyfikowania lub wyciszenia ekspresji złośliwych genów6. Potrzeba celowania w komórki nowotworowe i dostarczania leków do tych komórek wymaga wielofunkcyjnych systemów dostarczania. Oczywiście, nanoleki mogą spełnić ten wymóg7.

W fali odkryć nanocząsteczki okazały się odpowiednie do dostarczania ładunków leków chemoterapeutycznych, białek i/lub materiału genetycznie aktywnego do komórek rakowych. Nadal jednak należy zająć się niekorzystnymi skutkami. Jedna z nich, związana z brakiem biodegradowalności, może powodować odkładanie się materiału w zdrowych tkankach i narządach z prawdopodobieństwem wywołania chorób. Aby zminimalizować osadzanie się, wprowadziliśmy nietoksyczny i nieimmunogenny kwas polimalowy, który jest pochodzenia mikrobiologicznego i ulega biodegradacji doH2OiCO28. Używamy polimeru do syntezy kowalencyjnego typu nanoleku typu "wszystko w jednym". Zawiera chemicznie przyłączone chemioterapeutyki, takie jak temozolomid, doksorubicyna lub oligonukleotydy antysensowne i grupy funkcyjne służące do wynaczynienia, celowania w tkanki, dostarczania endosomolitycznego. Leki są wewnętrznie odcinane od nanoplatformy, gdy docierają do docelowej komórki nowotworowej, regenerując w ten sposób ich pełną aktywność farmaceutyczną.

Opisujemy metodę mikrobiologicznej produkcji nano platformy polimerowej, jej oczyszczanie i syntezę chemiczną nano leku, który zawiera trastuzumab (Herceptin) do zwalczania raka i oligonukleotyd antysensowny do hamowania nadprodukcji HER2. Stosując nanolek do ksenogenicznego ludzkiego Her2-dodatniego raka piersi na nagich myszach, wykazujemy wysoką skuteczność leczenia raka. Wprowadzone tutaj zasady celowania w nowotwór i wyciszania genów dla nanoleków kwasu polimalowego mogą być stosowane w leczeniu innych przypadków raka.

Protokół

Wszystkie eksperymenty są zgodne z oficjalnymi przepisami dotyczącymi zwierząt, w tym zabiegi chirurgiczne i niechirurgiczne wykonywane in vivo i są w pełni zgodne z protokołami IACUC.

1. Bioprodukcja kwasu polimalowego

  1. Wyhodować kulturę nasienną z sferuli na agarze i przenieść plazmodię do 100 ml pożywki hodowlanej, używając inkubatora o temperaturze 25 °C i podstawowego podłożahodowlanego 8,9.
  2. Wyprodukuj ilość 500 ml mikroplazmodii wypełnionych grawitacyjnie bez dostępu światła, aby uniknąć zarodnikowania.
  3. Przygotować 80 g CaCO3 zawieszonego w 8 l pożywki podstawowej w 10-litrowym naczyniu bioreaktora. Przenieść wypełnione 500 ml mikroplazmodia do zamontowanego naczynia reakcyjnego i pozostawić bioproces przez 75 godzin w temperaturze 25 °C, przepływie przefiltrowanego powietrza 10 l/min i mieszaniu 150 obr./min, mieszając za pomocą mieszadła segmentowego.
  4. Zakończyć, gdy bulion hodowlany ma pH 4,8 wskazujące na koniec produkcji PMLA i zmierzyć zawartość PMLA za pomocą testu hydroksymatu/Fe(III).
  5. Schłodzić bulion do temperatury 17 °C i pozostawić komórki do grawitacyjnego osiadania.
  6. Schłodzić do 4 °C i dostosować do pH 7,5, użyć 2 M NaOH. Przepompować supernatant przez kolumnę wypełnioną 1,5 l DEAE-celulozy w kierunku od dołu do góry (gruboziarnisty DEAE, zrównoważony z 20 mM Tris-HCl pH 7,5 w 5 °C).
  7. Przemyć 3 kolumnami buforu zawierającego 0,3 M NaCl po zmianie kierunku od góry do dołu i wymyć PMLA w obecności 0,7 M NaCl.
  8. Dostosuj do 0,1 M CaCl2 i wytrącić PMLA-Wapń 80% lodowatym etanolem. Frakcjonować nad Sephadex G25 do PMLA-wapń o stężeniu 80 – 300 kDa, 50 – 80 kDa i 10 – 50 kDa, używać wody pod nieobecność buforu i soli.
  9. Przepuść każdą frakcję przez kolumnę Amberlite IR 120H+ i natychmiast zamroź przepływający kwas polimalowy w ciekłym azocie w celu liofilizacji.
  10. Rozpuścić w suchym acetonie. Po filtracji usunąć rozpuszczalnik ze strumienia suchego powietrza, liofilizować i przechowywać w temperaturze minus 20 °C.

2. Synteza nanoleku na bazie kwasu polimalowego

  1. Aktywuj grupy karboksylowe PMLA (P) przez zmieszanie 116 mg (1 mmol jednostek malylowych) PMLA-H w 1 ml bezwodnego acetonu i 1 mmol N-hydroksysukcynimidu i 1 mmol dicykloheksylu karbodymidu w 2 ml dimetyloformamidu (DMF). Mieszać w temperaturze 20 °C przez 3 godziny. Dodać 0,05 mmol mPEG5000-NH 2 (0,05 mol% jednostek malylowych) do 1 ml DMF, a następnie 0,05 mmol trietyloaminy (TEA).
  2. Dodać kroplami rozpuszczoną w DMF 0,4 mmol estru etylowego leucyny (LOEt) (40 mol% jednostek malylowych), 0,1 mmol 2-tiol-1-etyloaminy (2-MEA) (10 mol% jednostek malylowych) i 0,5 mmol TEA, wszystkie rozpuszczone w DMF. Po każdym dodaniu odczekaj 1 godzinę i sprawdź zakończenie reakcji przez ujemną odpowiedź ninhydryny (chromatografia cienkowarstwowa, TLC).
  3. Usuń resztki estru NHS przez spontaniczną hydrolizę soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (30 min, pH 6,8). Odsolić na kolumnie PD-10, otrzymać "prekoniugat" w postaci białego proszku przez liofilizację. Przechowywać w suchym miejscu w temperaturze minus 20 °C.
  4. Rozpuścić 30 mg przeciwciała (mAb, IgG2a-κ) w 4,5 ml 100 mM fosforanu sodu, 150 mM NaCl, pH 5,5.
  5. Zredukować wiązania dwusiarczkowe za pomocą 5 mM chlorowodorku tris(2-karboksyetylo)fosfiny przez 30 minut w temperaturze 20 °C i oczyścić kolumnę PD-10.
  6. Rozpuścić Mal-PEG3400-Mal w 2 ml tego samego buforu i dodać zredukowany mAb w końcowej objętości 10 ml i mieszać przez noc w temperaturze 4 °C. Skoncentrować do 2,5 ml nad Vivaspin 20, wykluczenie 30 kD, i oczyścić nad Sephadex G75. Sprawdzić produkt w sec-HPLC i zmierzyć ilość fotometrycznie przy długości fali 280 nm.
  7. Przyłącz Mal-PEG-Mal-mAb do "presprzężonych" tioli, uzyskując P / PEG5000 (5%) / LOEt (40%) / mAb (0,2%) / 2-MEA (10%). W tym celu należy zmieszać 5 ml 200 nmol mAb-PEG3400-Mal z 50 mg (P/mPEG5000/LOEt/2-MEA) w powyższym buforze o pH 5,5, dostosować stężenie sulfhydrylu do 2 mM i inkubować w temperaturze 20 °C przez 3 godziny (wydajność 98%).
  8. Rozpuścić 3'-H2N-AON w DMF / PBS (pH 7,2) i reagować z N-sukcynimidylo-3-(2-pirydylotio)propionianem (SPDP) w (1:1 v / v) DMF / metanolu (test ninhydryny) i oczyszczać AON-PDP nad Sephadex-LH20 w metanolu, a następnie w wodzie i liofilizować.
  9. Inkubować aktywowane 800 nmol AON w buforze o pH 5,5 z wyżej przygotowanym prekoniugatem Mal-PEG3400-Mal-mAb przez noc, aż do zakończenia reakcji wymiany dwusiarczkowej.
  10. Zawiera fluorescencyjny tioeter tworzący fluorescencyjny Alexa Fluor 680-maleimid z polimerem-2-MEA-SH. Zablokuj nadmiar sulfhydrylów za pomocą 3-pirydylotitiopropionianu (PDP) i oczyść nad Sephadex G75. Przechowywać w temperaturze 4 °C lub zatrzaskowo zamrożone w temperaturze -80 °C do dalszego użycia.

3. Testy i właściwości

  1. Przeprowadzić badania czystości i stabilności PBS i surowicy w temperaturze 4 °C i 37 °C za pomocą analizy sec-HPLC. Stosować sulfonian polistyrenu jako wzorce masy cząsteczkowej. Zmierz rozkład rozmiarów nano i potencjały zeta. Korzystaj z systemów komercyjnych.
  2. Do próbki 320 μl dodać 160 μl 10% (m/v) chlorku hydroksyloamonu i 160 μl 10% (m/v) NaOH. Po 10-15 minutach wymieszać ze 160 μl 5% (w/v) Fe(III)Cl3 w 12% (v/v) HCl i odczytać A540 hydroksymatu/Fe(III). Obliczyć PMLA przy założeniu, że 1 mg/ml PMLA odpowiada 2,5 A540.
  3. Hydrolizować nanolek przez noc w 2 M HCl w temperaturze 110 °C i oznaczyć kwas jabłkowy na chromatografii z odwróconymi fazami w odniesieniu do próbek wzbogaconych wzorcami kwasu jabłkowego. Rozszczepić nanolek za pomocą 100 mM ditiotreitolu i zmierzyć Morpholino-AON za pomocą ilościowej HPLC z odwróconymi fazami w stosunku do wzorców Morpholino AON.
  4. Weź nanolek bez rozszczepienia i zmierz przeciwciała za pomocą zestawu do oznaczania białek. Określić ilościowo mPEG, pozwalając na jego reakcję z ferrotioniocyjanianem amonu, a następnie wyekstrahować chloroformem i odczytać absorbancję przy długości fali 510 nm10.
  5. Wykonaj test ELISA z 5 μl nanoleku (1-10 μg mAb) na studzienkę, testując aktywność przeciwciał i koligację. Użyj odpowiednio receptora transferyny 0,5 μg/basenik i HER2 jako antygenów powlekanych płytką i przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z peroksydazą.
  6. Obliczyć osiągnięty % dla AON, mPEG i mAb w odniesieniu do kwasu jabłkowego (100%) i porównać z % zamierzonym w projekcie (zob. przykłady w Tabeli 1 i Tabeli 2).

4. Badania in vitro

  1. Inkubuj nanolek z hodowanymi komórkami rakowymi i zmierz komórki, które przeżyły w czasie, na podstawie ich aktywności w celu redukcji żółtego odczynnika [3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-5-(3-karboksymetoksyfenylo)-2-(4-sulfofenylo)-2H-tetrazolium] (MTS) do niebieskiego barwnika i odczytać względną absorbancję za pomocą fotometru. Postępuj zgodnie z instrukcjami dostawcy zestawu.
  2. Przygotuj ekstrakty komórkowe in vitro lub ex vivo do Western blot. Użyj lodowatego buforu ekstrakcyjnego, który zawiera SDS i koktajl inhibitorów proteazy. Oddzielanie białek poprzez redukcję elektroforezy w żelu poliakrylamidowym SDS.
  3. Wykonaj western blotting dla białek będących przedmiotem zainteresowania w ekstraktach próbki. Użyj przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z fosfatazą alkaliczną.
  4. Użyj mikroskopii konfokalnej, aby zademonstrować wychwyt komórek i kolokalizację platformy polimerowej nanoleku, AON i endosomów za pomocą znakowania fluorescencyjnego. Podłącz Alexa Fluor 680 do platformy nano sprzężonej i Lissamine do AON-ów jako etykiety fluorescencyjne. Użyj mikroskopowego skanera spektralnego 5X i żywych komórek rakowych, aby zobrazować rozmieszczenie znakowanych cząsteczek
  5. Zabarwić błony endosomów barwnikiem fluorescencyjnym czerwieni styrylowej i wykazać kolokalizację lub uwalnianie endosomu.

5. Testy in vivo

  1. Przygotuj ludzki HER2-dodatni model myszy z rakiem piersi (naga mysz Tac:Cr:(MCr)-Foxnnm). Umieść 0,72 mg 17β-estradiolu uwalniającego osad (uwalnianie 90-dniowe) podskórnie w szyję każdej myszy.
  2. Następnie wstrzyknij 1 x 107 komórek nowotworowych BT-474 podskórnie w prawą flankę i pozwól guzowi rosnąć.
  3. Leczenie należy rozpocząć, gdy guzy mają wielkość 120mm3, wstrzykując do żyły ogonowej 150 μl nanokoniugatu zawierającego 2,5 mg/kg AON i/lub 4,5 mg/kg każdego przeciwciała. W leczeniu wstrzykiwać dwa razy w tygodniu, łącznie sześć razy.
  4. Zmierz rozmiar guza za pomocą suwmiarki dwa razy słabszej i oblicz objętość za pomocą wzoru (długość x głębokość x szerokość) x (π/6). Eutanazja zwierząt 2 tygodnie po ostatnim wstrzyknięciu i po uspokojeniu roztworem ketaminy i deksmedetomidyny, a następnie zwichnięcie szyjki macicy.
  5. Izoluj guzy i skrawki barwników za pomocą H&E w celu oceny morfologicznej.
  6. Do oceny dystrybucji leków w skali zwierzęcej należy użyć systemu obrazowania fluorescencyjnego. Wstrzyknij nanolek i obraz oznaczony Alexa Fluor 680 po 24 i 48 godzinach.
  7. Poddaj zwierzę eutanazji i wykryj fluorescencję w izolowanych i perfundowanych guzach i narządach.

Wyniki

Hamowanie ludzkiego raka piersi HER2-dodatniego poprzez wyciszanie ekspresji receptora HER2 i blokowanie sygnałowania HER212

Strategia

Wśród różnych postaci raka piersi u ludzi, guzy HER2-dodatnie mają najgorsze rokowania kliniczne. Przedstawiamy skuteczne leczenie nadekspresyjnego raka piersi HER2 u ludzi w modelu myszy nago. Strategia ta wykorzystuje nanolek aktywny zarówno w natychmiastowym wyciszeniu szlaku sygnalizacyjnego HER2 z zastosowaniem Herceptinu, jak i specyficznego dla HER2 AON w celu zablokowania zależnej od mRNA HER2 syntezy receptora (Rycina 1). Główny nanokoniugat, zawierający Herceptin i anty-HER2 AON, przedstawiono na Rycini 3 wraz z dwiema kontrolami pozbawionymi odpowiednio Herceptinu lub AON. Główny związek zawierał anty-MsTfRmAb w celu uzyskania aktywnej ekstrawazacji poprzez transcytozę dzięki wiązaniu się z endotelialnym TfR naczyń guza. Znacznie mniejszy pobór do guza odnotowano w przypadku braku przeciwciała, co przypisano zależnemu od guza efektowi EPR13. Do badań obrazowych zsyntetyzowano fluorescencyjne wersje nanokoniugatów zawierające Alexa Fluor 680.

Schemat celowania w HER2; endocytoza koniugatu przeciwciało-lek, inhibicja sygnalizacji komórek rakowych.
Rysunek 1. Mechanizm dostarczania AON do komórek raka piersi HER2-dodatnich i inhibicja wzrostu guza.Górny lewy róg: Nanokoniugat zaadaptowany z Rysunku 3. Dolny lewy róg: Naczynia krwionośne guza mysiego z ekspresją TfR na powierzchni. Nanolek wiąże się z receptorem i wnika do guza poprzez transcytozę. Dodatkowo, pewien stopień dostępu do guza jest możliwy poprzez rozprzężone warstwy śródbłonka, które uczestniczą w zależnym od guza zwiększonym wychwycie i retencji (EPR)13. Następnie nanolek wiąże się z HER2 ekspresowanym na ludzkich komórkach rakowych i internalizuje do wczesnych endosomów. Wiązanie blokuje również szlak sygnalizacyjny HER2. Po dojrzewaniu endosomów i ich zakwaszeniu aktywowany jest mechanizm ucieczki nanoleku z endosomu. Nanolek wnikający do cytoplazmy zostaje uwolniony z nanoplatformy poprzez redukcyjne rozszczepienie łącznika disiarczkowego i wiąże się z HER2-mRNA, blokując syntezę HER2. Blokada syntezy przedłuża blokowanie sygnalizacji HER2 i indukuje inhibicję wzrostu guza.

Mikrobiologiczna produkcja platformy kwasu polimalonowego

Platforma nanokonjugatu, kwas polimalonowy (PMLA), została otrzymana z hodowli mikroplazmodiów Physarum polycephalum i oczyszczona z pożywki zgodnie z opisem w protokole oraz przedstawiono ją na Rysunku 2. Proces produkcji i oczyszczania przebiegał sprawnie i był powtarzalny. Kluczowe było kontrolowanie czasu, pH i temperatury, aby uniknąć spontanicznego rozszczepienia polimeru. Zaleca się dokładne płukanie i elucję z kolumny DEAE w celu usunięcia DNA, węglowodanów, toksyn i substancji barwiących. Bardzo wysoką czystość uzyskano po rozpuszczeniu w bezwodnym acetonie i usunięciu materiału nierozpuszczalnego. Całkowita ilość otrzymanego PMLA wynosiła 5 ± 1 g na kampanię. Ilości 1,5 ± 0,5 g wysokiej czystości PMPLA o Mw 80 000-100 000 uzyskiwano powtarzalnie przy użyciu bioreaktora o pojemności 10 L. Profile elucji Sec-HPLC były symetryczne. Analiza dynamicznego rozpraszania światła zgodnie z rozkładem liczbowym wykazała pojedynczy pik odpowiadający średnicy hydrodynamicznej 8 ± 1 nm oraz indeks polidyspersyjności PDI = 0,10 ± 0,02, obliczony przez oprogramowanie urządzenia dla założonych cząstek sferycznych. Potencjał zeta wynosił -22 ± 2 mV (pH 7,5).

Schemat syntezy fermentacyjnej β-polikwasu L-malonowego; przedstawia oczyszczanie: wymianę anionową, zakwaszanie.
Rycina 2. Produkcja i oczyszczanie polikwasu malonowego z hodowanych mikroplazmodiów Physarum polycephalum (adaptowano z Lee et al.9). Polikwas malonowy (PMLA) jest produkowany z plazmodiów Physarum polycephalum w bioreaktorze i odzyskiwany z nadsączu hodowlanego poprzez wiązanie na wymieniaczu anionowym (DEAE). Eluent jest wytrącany etanolem w postaci soli wapnia. Roztwory soli wapnia poddawane są frakcjonowaniu wg masy cząsteczkowej na Sephadex-G25. Frakcje zawierające PMLA są przekształcane z soli Ca w kwas na żywicy Amberlite IR-120H+. Wolny PMLA jest ostatecznie liofilizowany w celu uzyskania suchego, białego proszku.

Synteza chemiczna nanokoniugatu ołowiu

P/mPEG5000(5%)/LOEt(40%)/AON(2,5%)/Herceptin(0,2%)/anti-MsTfRmAb(0,2%)

Schematy struktur wiodącego nanoleku oraz dwóch prekursorowych nanokoniugatów przedstawiono na Rysunku 3. Związek wiodący zawiera wszystkie składniki, natomiast prekursory zostały zaprojektowane tak, aby brakowało w nich AONHER2 lub przeciwciała Herceptin. Oprócz AON i przeciwciał monoklonalnych (mAbs), związki zawierały glikol polietylenowy, mPEG5000, aby zminimalizować wiązanie z białkami osocza, eliminację przez układ siateczkowo-śródbłonkowy (RES) oraz degradację poprzez rozszczepienie enzymatyczne. Sekwencja antysensowna 5’-CAT-GGT-GCT-CAC-TGC-GGC-TCC-GGC-3’ była komplementarna do mRNA Her2 i została starannie przetestowana in vitro na kilku liniach komórkowych wykazujących ekspresję HER2, aby uzyskać wysoką specyficzność w blokowaniu syntezy HER2 bez wywoływania efektów poza celem.

Schemat nanoleku z Herceptinem, AON i Alexa Fluor, przedstawiający różne warianty komponentów.
Rycina 3. Nanokoniugaty do leczenia ludzkiego raka piersi HER2-dodatniego. Główny nanolek (struktura na górze) zawiera dwa leki (Herceptin, AONHER2). Wersje 2 i 3 zawierają tylko jeden z leków. Pobieranie 1 i 2 do ludzkich komórek nowotworowych z nadekspresją HER2 jest regulowane przez wiązanie Herceptinu. Nanokoniugat 3, który nie zawiera Herceptinu, został wyposażony w anti-HuTfRmAb w celu pobrania do endosomów przez ludzkie komórki. Koniugacja z Alexa Fluor 680 była opcjonalna na potrzeby obrazowania. Czerwony pasek reprezentuje platformę nanokoniugatu PMLA/LOEt(40%). % oznacza frakcję reszt kwasu jabłkowego zużytych podczas wiązania wskazanego ligandu (całkowita ilość reszt kwasu jabłkowego w nanoleku = 100%).

Schemat syntezy nanokoniugatu polimerowego; reakcje chemiczne: aktywacja PMLA, etapy koniugacji.
Rysunek 4. Synteza chemiczna nanokoniugatów P/LOEt/AONHER2/anti-MsTfR/Herceptin. Od góry do dołu: Synteza estru N-hydroksysukcynimidy PMLA (PMLA-NHS) z grupami bocznych karboksylowymi (aktywacja chemiczna). Zastąpienie NHS poprzez tworzenie wiązań amidowych z 2-merkapto-1-aminoetanem (2-MEA), aminą methyl-PEG5000 (mPEG5000-NH2), trileucyną (LLL) lub estrem etylowym leucyny (LOEt). Ten „prekoniugat” łączy mAb-Mal-PEG-Mal poprzez tworzenie tioeteru oraz AON poprzez tworzenie rozszczepialnych wiązań dwusiarczkowych. Pozostałe 2-MEA są blokowane, tworząc kwas amidoetyloditiopropionowy. Przedstawiono przyłączenie tylko jednego mAb. Przyłączenie wielu mAb realizowane jest poprzez zastosowanie mieszanin mAb. Procent % oznacza frakcje grup karboksylowych związanych z różnymi ligandami (100% dla wolnego PMLA).

Nanokoniugaty zsyntezowano zgodnie z opisem przedstawionym na Rysunku 4. Obliczona masa cząsteczkowa głównego koniugatu wynosiła 719 000. Całkowita wydajność syntezy wyniosła 45 ± 5% w odniesieniu do zawartości kwasu jabłkowego. Średnio, z 862 jednostek malylowych (=100%) platformy PMLA o masie 100 kDa, 40% przenosiło LOEt, 5% mPEG, 2% AON, 0,2% Herceptin i 0,2% przeciwciała anty-MsTfR mAb. Ilość każdego przeciwciała odpowiadała średnio 1,7 cząsteczce na cząsteczkę platformy PMLA. Procent zaplanowany oraz procent zweryfikowany w analizie grupowej były zgodne w granicach ±5%. Przykład przedstawiono w Tabeli 1 dla obliczeń eksperymentalnej zawartości kwasu jabłkowego, AON, mAb i mPEG5000, a w Tabeli 2 pokazano porównanie z zawartością zaplanowaną. Wysoką czystość, zgodnie z kryteriami opisanymi w sekcji 3, osiągnięto dzięki wysokim wydajnościom reakcji i skutecznej separacji metodą wykluczania sterycznego (np. wolne mAb i nanokoniugat mAb są rozdzielone w czasie 1 min w metodzie sec-HPLC) oraz selektywnej rozpuszczalności w rozpuszczalnikach. Wykazano, że aktywność przeciwciał monoklonalnych została zachowana podczas syntezy nanoleku i potwierdzono, że dwa rodzaje przeciwciał zostały osadzone na tej samej platformie polimerowej. Wynik nietypowego eksperymentu ELISA przedstawiono na Rysunku 5. Ogólnie rzecz biorąc, testy do ilościowej analizy grupowej dla kwasu jabłkowego, AON, białka, PEG oraz testy ELISA były stabilne, dając powtarzalne wyniki przy przeprowadzeniu przez różnych operatorów i z użyciem różnej aparatury, nie tylko w przypadku opisanej syntezy, ale także podczas analizy innych zsyntezowanych nanokoniugatów.

Tabela wyników analizy chemicznej z obliczeniami µmol i procentowej zawartości różnych grup z zastosowaniem protokołów.
Tabela 1. Obliczanie składu nanoleku w odniesieniu do zawartości kwasu jabłkowego.

Porównanie składu nanocząsteczek polimerowych; tabela przedstawiająca wartości eksperymentalne dla AON, mAb i mPEG.
Tabela 2. Porównanie eksperymentalnego składu nanoleku ze składem zaprojektowanym.

Wykres absorbancji ELISA; wykrywanie leku nano kontra absorpcja wolnego przeciwciała mAb; powlekanie antygenem HER2.
Rycina 5. Test ELISA do pomiaru powinowactwa przeciwciał po syntezie chemicznej oraz do wykazania wielokrotnego wiązania różnych przeciwciał. Lek nano zawiera przeciwciało mAb(A) oraz przeciwciało mAb(B) przeciwko antygenom A i B, odpowiednio. Płytki ELISA są powlekane antygenem(A). Na płytki ELISA naniesiono wolne mAb(A), wolne mAb(B) oraz lek nano. Po przemyciu przeciwciała przetestowano za pomocą wtórnych przeciwciał sprzężonych z peroksydazą, swoistych dla mAb(A) lub mAb(B), podczas gdy tylko mAb(A) wiąże się z antygenem(A). Widać, że na płytce zatrzymują się wolne mAb(A), lek nano sprzężony z mAb(A) oraz pośrednio sprzężone mAb(B) z tej samej cząsteczki leku nano, ale nie wolne mAb(B). Zależność od stężenia wykazuje porównywalne powinowactwa wiązania dla wolnego i sprzężonego mAb(A), co wskazuje, że sprzęganie chemiczne nie wpłynęło na aktywność wiązania przeciwciał. Ponadto, współligacja mAb(B) z mAb(A) na tym samym obiekcie fizycznym (platformie nano) skutkuje wykryciem przeciwciała mAb(B). Przedstawione tutaj wyniki eksperymentalne odnoszą się do anty-ludzkiego TfRmAb (A) oraz anty-mysiego TfRmAb (B). Podobne wyniki uzyskano dla innych testowanych par przeciwciał, takich jak anty-MsTfR mAb i anty-HER2 mAb (Herceptin).

Badania fizykochemiczne wykazały, że średnica hydrodynamiczna wynosiła 22,1 ± 2,3 nm dla P/mPEG(5%)/LOEt(40%)/AON(2%)/Herceptin(0,2%)/anti-MsTfRmAb(0,2%) (wariant wiodący, wersja z dwoma lekami), 20,1 ± 2,4 nm dla P/mPEG(5%)/LOEt(40%)/AON(2%)/anti-MsTfRmAb(0,2%)/anti-HuTfRmAb (0,2%) (wersja z lekiem AON) oraz 15,1 ± 1,2 nm dla P/mPEG(5%)/LOEt(40%)/Herceptin(0,2%) (wersja z lekiem Herceptin). Potencjały zeta przy pH 7,5 wynosiły odpowiednio -5,2 ± 0,4 mV, -5,7 ± 0,6 mV oraz -4,1 ± 0,4 mV. Należy zaznaczyć, że zmierzona średnica hydrodynamiczna nanokoniugatów nie wykazywała addytywności średnic zmierzonych dla wolnych komponentów.

Dostarczanie nanoleku przez błonę komórkową guza i uwalnianie do cytoplazmy po 0 h i 3 hr

Dostarczanie nanoleku przez błonę komórkową poprzez wychwyt endosomalny przedstawiono na Rysunku 6 po 0 h i 3 h. Markery fluorescencyjne przyłączono do platformy nanoleku (Alexa Fluor 680, zielony) oraz do AON (Lissamine, czerwony). Ich superpozycja jest pokazana na panelach D&L, a wraz z fluorescencją znakowanych endosomów (niebieski) na panelach G&O. Współczynniki korelacji Pearsona (R(r) obliczono na podstawie obrazów w odniesieniu do kolokalizacji platformy/endosomów, AON/endosomów oraz platformy/AON dla 0 h i 3 h. Obraz z 3 h wskazał na uwalnianie z endosomów do cytoplazmy oraz dysocjację AON z nanoleku w wyniku zależnego od glutationu rozszczepienia mostków disiarczkowych w cytoplazmie.

Fluorescence microscopy with endosome visualization, 0h/3h comparison, statistical graph results.
Rycina 6. Mikroskopia konfokalna obrazująca pobieranie nanokoniugatów przez komórki docelowe (adaptowano z Ding) i wsp.11)Komórki inkubowano przez 30 min w temperaturze 37 °C z nanolekiem, który został podwójnie znakowany: Alexa Fluor 680 (zielony) na platformie polimerowej oraz Lissamine (czerwony) przyłączony do AON. Dodatkowo endosomy zabarwiono barwnikiem FM1-43 (niebieski). Lokalizację przedstawiono po 0 h (A) i 3 h (B) inkubacja. Panele A,a-b, & B,i-j wykazują barwienie samych fluoroforów nanokoniugatu oraz ich ko-lokalizację w A,c-d & B,k-lDodatkowo, barwienie endosomów przedstawiono na panelach A,e & B,m oraz kolokalizacja nanokoniugatu i endosomów w panelach A,f-g & B,n-oPanele A,h & B,p należy przedstawić obrazy w kontraście fazowym dla odpowiednich paneli. (C) Współczynniki korelacji Pearsona R(r) dla kolokalizacji platformy z endosomami, AON z endosomami oraz platformy z AON, obliczone dla 0 h i 3 h. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Hamowanie raka piersi u ludzi in vitro oraz in vivo

In vitro zahamowanie wzrostu linii komórkowej BT-474 z nadekspresją HER2 w porównaniu z linią komórkową MDA-MB-231 o niskiej ekspresji przedstawiono na Rysunku 7. Stopień zahamowania wynosi odpowiednio 50% i 30% dla wiodącego nanokoniugatu P/mPEG/LOEt/AONHER2/Herceptin/anti-MsTfRmAb. Zahamowanie przez pozostałe związki jest mniejsze, lecz wyższe dla komórek BT-474 niż dla komórek MDA-MB-231. Linia komórkowa BT-474 została wybrana do leczenia myszy z ksenoprzeszczepem raka piersi.

Wykres hamowania wzrostu komórek HER2+ z użyciem wariantów Herceptinu, analiza linii komórkowych BT-474 i MDA-MB-231.
Rycina 7. Hamowanie wzrostu in vitro komórek raka piersi BT-474 z nadekspresją HER2 oraz komórek MDA-MB-231 z niską ekspresją (zaadaptowano z Inoue et al.12). Porównanie hamowania wzrostu dla linii komórkowej raka piersi BT-474 z nadekspresją HER2 (po lewej) oraz linii komórkowej raka piersi MDA-MB-231 z niską ekspresją HER2 (po prawej). TfR(s) oznacza anti-MsTfRmAb, a TfR(Hu/Ms) oznacza anti-HuTfRmAb & anti-MsTfRmAb. Główny nanolek, P/mPEG/LOEt/AONHER2/Herceptin/TfR(Ms), oraz nanoleki pozbawione Herceptinu lub AONHER2 zostały porównane z PBS, Herceptinem i AONHER2. W przypadku braku Herceptinu, sprzężono anti-MsTfRmAb w celu zapewnienia wychwytu endosomalnego przez komórki nowotworowe. Stężenia wynosiły 40 μg/ml w odniesieniu do przeciwciał, 4 μM w odniesieniu do AONHER2 oraz 4 μM endoportera (aplikacja AON). Istotność oznaczono jako *, P<0.05: **, P<0.02: ***, P< 0.003 w porównaniu z PBS.

Wyniki leczenia in vivo przedstawione na Rysunku 8 dotyczą myszy z nadekspresją Her2 w ludzkim raku piersi BT-474. Wzrost został zahamowany w >95% przez wiodący nanolek zawierający Herceptin oraz specyficzne dla HER2 AON w porównaniu z grupami kontrolnymi traktowanymi wyłącznie PBS (Rysunek 8). Hamowanie wyniosło 60% lub mniej w przypadku zastosowania samego Herceptinu, P/mPEG/LOEt/Herceptin lub P/mPEG/LOEt/AON/anti-MsTfRmAb/anti-HuTfRmAb. Analiza Western blot ekstraktów z guzów wykazała zahamowanie zarówno syntezy HER2, jak i fosforylacji Akt, przy braku zmian w poziomie całkowitego Akt oraz enzymu kontrolnego GAPDH. PARP uległ rozszczepieniu, co odpowiadało zwiększonemu poziomowi apoptozy. Zdjęcia guzów po leczeniu oraz przekroje tkanek barwione H&E ilustrujące regresję guza przedstawiono na Rysunku 9.

Wykres wzrostu guza, analiza Western blot; efekty nanoleku, HER2, Akt, PARP w badaniach nad rakiem.
Rysunek 8. Wielkość guza i białka podczas leczenia głównym nanolekiem i jego prekursorem (adaptacja z Inoue et al.12). A. Wielkość guza dla poszczególnych terapii (od 21. do 42. dnia, łącznie 8 iniekcji). Słupki wskazują odchylenia standardowe od średniej. Główny nanolek sprzężony z anty- Her2 AON i Herceptyną był skuteczniejszy niż sama Herceptyna lub pojedyncze nanokonjugaty zawierające lek. B. Wpływ poszczególnych terapii na ekspresję HER2, fosforylowanego Akt, całkowitego Akt, PARB, rozszczepionego PARB oraz GAPDH przedstawiono za pomocą Western blotting. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Eksperyment leczenia guza u myszy nago; histologia pelletu estrogenowego i wpływ na guz.
Rysunek 9. Leczenie HER2-dodatniego raka piersi człowieka BT-474 u myszy nago. Regresja guza oraz nekroza/apoptoza w sekcjach tkankowych (adaptacja z Ionue et al.12). Góra: Zmniejszenie rozmiaru guza (czerwone strzałki). Wskazanie pelletu estrogenowego wspomagającego wzrost guza (niebieska strzałka). Dół: Barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E) sekcji guza. Proliferujący guz widoczny jest jako gęste upakowanie komórek nowotworowych. Tkanka nekrotyczna widoczna jest w miejscach, gdzie komórki guza zostały wyeliminowane. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Przedstawiono eksperymentalną drogę otrzymywania nanoleków z biodegradowalnego polimeru naturalnego, które mogą być wykorzystane w syntezie medycyny spersonalizowanej. Opis rozpoczyna się od kontrolowanej produkcji i oczyszczania kwasu polimalowego, który jest wszechstronną platformą do syntezy nanoleków. Stosując powtarzalne techniki, polimer jest otrzymywany o wysokiej masie cząsteczkowej i ekstremalnej czystości odpowiedniej do syntez farmaceutycznych. Synteza została opisana dla nanoleku, który, jak wykazano, skutecznie leczy HER2-dodatniego raka piersi. Opis ten można przełożyć na syntezy większości innych nanoleków stosowanych w leczeniu raka. Celowanie obejmuje przeciwciała, takie jak Herceptin, które wiążą antygen specyficzny dla nowotworu, taki jak białko HER2 lub dowolny inny marker nowotworowy, który jest skutecznie internalizowany. Nanolek dostarcza szereg oligonukleotydów antysensownych i chemioterapeutyków, które skutecznie hamują wzrost leczonego nowotworu. W tym przykładzie wiązanie Herceptyny z HER2 i swoiste wyżarzanie oligonukleotydów antysensownych z mRNA kodującym HER2 spowodowało trwałe zablokowanie sygnalizacji HER2 i poważne zmniejszenie HER2-dodatniego raka piersi. Opierając się na podstawowej zasadzie celowania w nowotwór i hamowania ekspresji genów przez oligonukleotydy antysensowne, do tej pory zsyntetyzowaliśmy kilka innych nanoleków i skutecznie zahamowaliśmy przedklinicznego glejaka ludzkiego i potrójnie ujemnego raka piersi11,14-18.

Prace syntetyczne rozpoczynają się od przygotowania wysoko oczyszczonej platformy nanolekowej, którą jest kwas polimalowy z supernatantu kultury Physarum polycephalum (gatunek z rodziny "śluzowców"). Preparat kładzie nacisk na wysoką masę cząsteczkową polimeru, w zasadzie umożliwiając przyłączanie licznych przeciwciał, peptydów, oligonukleotydów i innych cząsteczek pełniących rolę w aktywnym dostarczaniu leków i hamowaniu wzrostu guza. Po kontrolowanym wyhodowaniu i oczyszczeniu uzyskano powtarzalną jakość polimeru w przewidywalnych plonach. Polimer jest przechowywany w dogodnych warunkach przez dowolny czas.

Synteza nanokoniugatów PMLA rozpoczynająca się od chemicznej aktywacji karboksylanów polimerowo-wiszących odbywa się w kilku syntetycznych etapach. Pomiędzy etapami synteza może być opcjonalnie wstrzymana, co pozwala na przygotowanie dowolnych ilości produktów pośrednich, a tym samym może być wykorzystana w skalowaniu w górę. Postęp syntezy jest śledzony przez TLC i sec-HPLC, a zarówno skład, jak i aktywność nanoleku są kontrolowane za pomocą ilościowych testów chemicznych specyficznych dla grupy, ELISA i różnych pomiarów fizycznych. Z naszego doświadczenia wynika, że syntezy te przebiegały płynnie i powtarzalnie, z doskonałymi plonami i czystością. Wybierając specyficzność oligonukleotydów przeciwciał i antysensownych, każdy wariant nanoleku jest korzystnie syntetyzowany w zależności od potrzeb w medycynie spersonalizowanej.

Metody skutecznego leczenia ludzkiego HER2-dodatniego raka piersi są ważnymi przedstawicielami w przygotowywaniu mysich modeli raka, stosowaniu nanoleków, obrazowaniu i analizie wzrostu guza. Wyniki badań żywotności in vitro są przydatne w wyborze linii komórkowej i wiodącego leku, który ma być użyty w doświadczeniu na zwierzętach. In vivo (in vivo) Obrazowanie ksenogenowe potwierdza, że nanolek jest rzeczywiście dostarczany do guza. Wyniki western blottingu ujawniają, czy poziom niektórych białek zareagował w przewidywany sposób podczas leczenia raka. Pomiar wielkości guza informuje o powodzeniu leczenia, czyli o zahamowaniu, recesji lub regresji. Opisany przykład odzwierciedla nasze doświadczenia z innymi nanolekami na bazie kwasu polimalowego, wskazując na wysoki stopień przewidywalności, odtwarzalności i braku zauważalnej toksyczności. Ostatnie wyniki dotyczące toksyczności i skuteczności wielu celowanych koniugatów kwasu polimalowego w leczeniu potrójnie ujemnego raka piersi silnie wspierają ten pogląd18. Kluczową cechą jest to, że nasz nanolek jest w stanie przenikać przez bariery biologiczne: barierę śródbłonkową przez wynaczynienie do śródmiąższu guza, błonę komórek nowotworowych przez wychwyt endosomów oraz rozerwanie błony endosomów przez działanie grup etyloestru leucyny lub trileucyny. Wynaczynienie i wychwyt endosomów są niezawodnie realizowane przez specyficzne przeciwciała przyłączone do nanoleku. Przeciwciało przeciwko mysiemu receptorowi transferyny pośredniczy w skutecznym napływie do guza przez transcytozę, prawdopodobnie dlatego, że receptor ulega nadekspresji na większości naczyń krwionośnych guza. Inne przeciwciało przyłączone do tej samej cząsteczki sprzężonej nano działa w specyficznym kierowaniu nanoleku do komórki nowotworowej biorcy. Obecność obu przeciwciał, jednego odpowiedzialnego za transcytozę, a drugiego za wychwyt endosomów, jest niezbędna do optymalnego funkcjonowania. Analiza ilościowa kwasu jabłkowego i przeciwciał jest wysoce zalecana w celu kontrolowania optymalnego składu nanoleku. Na koniec należy zauważyć, że kowalencyjny nanolek typu "wszystko w jednym" dostarcza lek w postaci przyłączonej chemicznie w drodze przez układ krwionośny gospodarza do komórki nowotworowej biorcy. Przyłączenie chemiczne sprawia, że większość leków jest nieaktywna (proleków), dopóki nie zostaną one odtworzone jako wolne leki przez rozszczepienie z platformy nano sprzężonej w miejscu docelowym. Jest to ważne, ponieważ metoda reaktywacji zapewnia wysoki stopień bezpieczeństwa podczas porodu i minimalną szansę na wywołanie szkodliwych skutków ubocznych. Wszechstronność, skuteczność i bezpieczeństwo to nieodzowne atrybuty dobrej medycyny spersonalizowanej.

Oświadczenia

Autorzy: Julia Y. Ljubimova, Keith L. Black i Eggehard Holler są udziałowcami Arrogene Technology Inc.

Podziękowania

Bardzo dziękujemy za wsparcie finansowe od NIH R01 CA123495, U01 CA151815, R01 CA136841, grantów z Wydziału Neurochirurgii w Cedars-Cedars Medical Center oraz Arrogene Technology Inc.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2-merkapto-1-etyloamina (cysteamina; 2MEA)Sigma-Aldrich30078-25G
4',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI)Vector Laboratories, Burlingame, CA
90-dniowe uwalnianie 17β-estradiol w granulkach Innowacyjne badania Ameryki
Alexa Fluor 680 C2 maleimidInvitrogenA20344
Amberlite IR 120HSigma-Aldrich6428
Przeciwpieniąca emulsja Y-30Sigam-AldrichA5758
Łańcuch anty-lamininy-411 SantaCruzSC-59980
Anti-pAktmAb Sygnalizacja komórkowa9271S
Przeciwciało anty-PARB mAbBD Biosciences556494
Przeciwciało przeciwko czynnikowi von Willebranda AbcamAB6994
Ekstrakt z drożdży BactoBacto, Dickinson / Sparks, MD212720
Sygnalizacja komórkowabeta-aktyny3700
BT-474 ATCCHTB-20
Węglan wapniaAlfa Aesar36337
Zestaw do oznaczania proliferacji komórekPromega, Madison, WI, USAPR-G3580
Centriplus 100 Millipore4414
DicykloheksylokarbodimidFluka36650
DMEMSigma-AldrichD5796
EozynaCardinal HealthS7439-4
Galardyna (inhibitory MMP) Santa CruzSC-994
Sygnalizacja komórkowa GAPDH 2118
HematoxilinCardinal HealthS7439-3
Hemin ze świniSigma-Aldrich51280
HerceptinGenentech15534
Herceptin (Western blotting)Sygnalizacja komórkowa2165S
IgG2a-kappa mysia malignomaSigmaM77695X5m
Immun-Star AP Pakiet substratówBiorad170-5012
Pakiet substratów Immun-StarTM AP Odczynnik do wody Biorad170-5012
LAL Lonza, MDW50-1000
Laminin-411 mAbsAbcam
Ester etylowy leucyny (LOEt)Sigma-Aldrich61850-10G-F
Limulus Amebocyte Lysate (LAL) PYROGENT-5000 TestyCambrex BioScienceN384
Lissamin-Morpholino AONGene ToolsWykonany
kwas L-jabłkowy Sigma-AldrichM6413
 Sigma-AldrichM2634
Mal-PEG-MalLaysanmal-PEG-mal-3400
MatrigelBD Biosciences354248
Mleko beztłuszczowe w proszku ProteomikaM203-10G
Morfoliinooligonukleotydy GeneToolsna
mPEG5000LysanmPEG-NH2-5000
N-hydroksysukcynimd (NHS) ACROS Organics15727100
NinhydrinMerck1.06762.0100
Bibuła filtracyjna z membraną nitrocelulozową SandwichInvitrogenLC2001
Kanapka z bibułą filtracyjną z membraną nitrocelulozową, 0,45 i mikro; m InvitrogenLC2001
Novex ® Bufor transferowy Tris-Glycine (25x)InvitrogenLC3675
Nagie myszy [Tac:Cr:(MCr)-Foxnnm] Taconic
PBS pH 7,2 10xGibco10010-49
PBS pH 7,2 1xGibco70013
PD-10GE Healthcare17-0851
Physarum polycephalum M3CVIIATCC204388
Test białka Pierce BCA Thermo Scientific23225
Koktajl inhibitorów proteazyRoche1.18362E+11
Detektor białek Zestaw ELISA KPL54-62-18
Sephadex G-25 superfineGE Healthcare17-0031
Sephadex G-75 GE Healthcare17-0050
Sephadex-LH20 GE Opieka zdrowotna17-0090
SKBR-3 Proteochem ATCCHTB-30
SPDP C1116
Streamline-DEAEGE Healthcare17-0994
Czerwień styrylowa FM 1-43 Technologie życiowe T-3163
TBS 10xBio-Rad170-6435
TCEPSigma-AldrichC4706-2G
TLC, arkusze tlenku glinu pokrytego krzemionkąMerck, Darmstadt, DE60F254
Trileucyna (LLL)BachemH-3915
Triton X-114 Sigma-AldrichX114
Tween® 20 Sigma-AldrichP1379
Vivaspin 20 VWR14005-302
DAPIVector Laboratories, Burlingame, Kalifornia
DeksmedetomidynaPfizer
Atipamezol, Pfizer
CarprofenPfizer
Betadine, Foster and Smith, Wisconsin
na zamówienieDehydrogenaza jabłczanowa zamówienie Kolumny odsalające , , , , ,

Bibliografia

  1. Koboldt, D. C., Fulton, R. S., McLellan, M. D. Comprehensive molecular portraits of human breast tumors. Cancer Genome Atlas Network. Nature. 490, 61-70 (2012).
  2. Kwong, L. N., Costello, J. C., et al. Oncogenic NRAS signaling differentially regulates survival and proliferation in melanoma. Nat. Med. 18, 1503-1510 (2012).
  3. Gerlinger, M., Rowan, A. J., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N. Engl. J. Med. Gerlinger, M., Rowan, A. J. 366, 883-892 (2012).
  4. Yap, T. A., Workman, P. Exploiting the cancer genome: strategies for the discovery and clinical development of targeted molecular therapies. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 52, 549-573 (2012).
  5. Chatterjee, S. Cancer Biomarkers: Knowing the Present and Predicting the Future. Future Oncol. 1, 37-50 (2005).
  6. Suh, K. S., Sarojini, S., Youssif, M., et al. Tissue Banking, Bioinformatics, and Electronic Medical Records: The Front-End Requirements for Personalized Medicine. J. Oncology. , (2013).
  7. Ljubimova, J. Y., Holler, E. Biocompatible nanopolymers: the next generation of breast cancer treatment. Future Medicine, Nanomedicine. 7, 1-4 (2012).
  8. Lee, B. -S., Vert, M., Holler, E. Water-soluble aiphatic polyesters: poly(malic acid)s. Biopolymers 3a. Steinbüchel, A. , Wiley VCH. Weinheim (Bergstrasse). 75-103 (2002).
  9. Lee, B. -S., Fujita, M., et al. Polycefin, a new prototype of multifunctional nanoconjugate based on poly(beta-L-malic acid) for drug delivery. Bioconjugate Chem. 17, 317-326 (2006).
  10. Nag, A., Mitra, G., et al. A colorimetric assay for estimation of polyethylene glycol and polyethylene glycolated protein using ammonium ferrothiocyanate. Analytical Biochem. 237, 224-231 (1996).
  11. Ding, H., Inoue, S., et al. Inhibition of brain tumor growth by intravenous poly(beta-L-malic) acid nanobioconjugate with pH-dependent drug release. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 18143-18148 (2010).
  12. Inoue, S., Ding, H., et al. Nanobioconjugate inhibition of HER2/neu signaling and synthesis provides efficient mouse breast cancer treatment. Cancer Research. 71, 1454-1464 (2011).
  13. Maeda, H., Sawa, T., Konno, T. Mechanism of tumor-targeted delivery of macromolecular drugs, including the EPR effect in solid tumor and clinical overview of the prototype polymeric drug SMANS. J. Control. Release. 74, 47-61 (2001).
  14. Ljubimova, J. Y., Fujita, M., Ljubimov, Y. J., et al. Poly(malic acid) nanoconjugates containing various antibodies and oligonucleotides for multitargeting drug delivery. Nanomed. 3, 247-265 (2008).
  15. Inoue, S., Patil, R., Portilla-Arias, J., et al. Novel nanobioconjugate inhibiting EGFR expression in triple negative breast cancer. PLoS One. 7, 1-9 (2012).
  16. Patil, R., Portilla-Arias, J., Ding, H., et al. Cellular Delivery of Doxorubicin via pH-Controlled Hydrazone Linkage Using Multifunctional Nano Vehicle Based on Poly(β-L-malic Acid). Int. J. Mol. Sci. 13, 11681-11693 (2012).
  17. Patil, R., Portilla-Arias, J., Ding, H., et al. Temozolomide delivery to tumor cells by a multifunctional nano vehicle based on poly(β-L-malic acid). Pharm. Res. 27, 2317-2329 (2010).
  18. Ljubimova, J. Y., Portilla-Arias, J., Patil, R., et al. Toxicity and efficacy evaluation of multiple targeted polymalic acid conjugates for triple-negative breast cancer treatment. J. Drug Target. 21, 956-967 (2013).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Nanobiopolimery kwasu polimalonowegomedycyna personalizowana w onkologiiHER2 dodatni rak piersidostarczanie oligosacharyd w antysensownychsynteza nanolek woczyszczanie kwasu polimalonowegometoda koniugacji przeciwciafluorescencyjna mikroskopia konfokalnahamowanie wzrostu guzabiokompatybilne dostarczanie lek w

Powiązane artykuły