Artykuł metodologiczny

Śledzenie transsynaptyczne od celów obwodowych z wirusem wścieklizny rzekomej, a następnie podwójne znakowanie toksyną i biotynylowanymi aminami dekstranu

DOI:

10.3791/50672

⸱

14 września 2015

 ,  , 
1Department of Neurobiology, Duke University Medical Center, 2Howard Hughes Medical Institute

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Śledzenie transsynaptyczne stało się potężnym narzędziem do analizy centralnych eferentów regulujących cele obwodowe za pomocą obwodów wielosynaptycznych. Tutaj przedstawiamy protokół, który wykorzystuje transsynaptycznego wirusa wścieklizny rzekomej do identyfikacji i lokalizacji funkcjonalnego obwodu mózgu, a następnie klasyczne techniki śledzenia dróg w celu walidacji określonych połączeń w obwodzie między zidentyfikowanymi grupami neuronów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Śledzenie transsynaptyczne stało się potężnym narzędziem używanym do analizy centralnych eferentów, które regulują cele peryferyjne za pomocą obwodów wielosynaptycznych. Podejście to jest najszerzej stosowane w mózgu poprzez wykorzystanie wirusa wścieklizny rzekomej (PRV)1 u świń. PRV nie zakaża małp człekokształtnych, w tym ludzi, dlatego najczęściej stosuje się go w badaniach na małych ssakach, zwłaszcza gryzoniach. Szczep PRV152 przeciwko wściekliźnie rzekomej ulega ekspresji genu reporterowego wzmocnionego białka zielonej fluorescencji (eGFP) i przecina funkcjonalne synapsy tylko wstecz przez hierarchiczną sekwencję połączeń synaptycznych z dala od miejsca infekcji2,3. Inne szczepy PRV mają odrębne właściwości mikrobiologiczne i mogą być transportowane w obu kierunkach (PRV-Becker i PRV-Kaplan)4,5 . Niniejszy protokół będzie dotyczył wyłącznie PRV152. Dostarczając wirusa do miejsca obwodowego, takiego jak mięśnie, możliwe jest ograniczenie wnikania wirusa do mózgu przez określony zestaw neuronów. Powstały w ten sposób wzorzec sygnału eGFP w całym mózgu rozdziela następnie neurony, które są połączone z początkowo zainfekowanymi komórkami. Ponieważ rozproszony charakter śledzenia transsynaptycznego z wirusem rzekomej wścieklizny utrudnia interpretację określonych połączeń w obrębie zidentyfikowanej sieci, przedstawiamy czułą i wiarygodną metodę wykorzystującą biotynylowane aminy dekstranowe (BDA) i podjednostkę b toksyny (CTb) do potwierdzania połączeń między komórkami zidentyfikowanymi za pomocą PRV152. Wybór pada na immunochemiczne wykrywanie BDA i CTb za pomocą peroksydazy i DAB (3,3'-diaminobenzydyny), ponieważ są one skuteczne w ujawnianiu procesów komórkowych, w tym dendrytów dystalnych6-11.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Śledzenie transsynaptyczne stało się potężnym narzędziem używanym do analizy centralnych eferentów, które regulują cele peryferyjne za pomocą obwodów wielosynaptycznych. Podejście to było najszerzej stosowane w mózgu gryzoni poprzez wykorzystanie wirusa rzekomej wścieklizny (PRV) patogenu świń, zwłaszcza atenuowanego szczepu PRV-Bartha opisanego po raz pierwszy w 1961 roku. W tym miejscu przedstawiamy protokół identyfikacji reprezentacji kory ruchowej określonych mięśni lub grup mięśniowych za pomocą rekombinowanego szczepu wirusa rzekomej wścieklizny (PRV152) wykazującego ekspresję genureporterowego 2 wzmocnionego białka zielonej fluorescencji (eGFP). Opisana metoda wykorzystuje zachowanie wirusów neurotropowych, które wytwarzają zakaźne potomstwo, które krzyżuje synapsy, aby zainfekować inne neurony w obrębie obwodu funkcjonalnego3,4,13. PRV152, który jest izogeniczny z PRV-Bartha, przecina synapsy wstecznie przez hierarchiczną sekwencję połączeń synaptycznych z dala od miejsca infekcji3,5. Dzięki precyzyjnej kontroli obwodowego miejsca infekcji możliwe jest ograniczenie przedostawania się wirusa do mózgu przez określony podzbiór neuronów ruchowych. Ponieważ wirus sekwencyjnie infekuje łańcuchy połączonych neuronów, powstały wzorzec sygnału eGFP w całym mózgu rozwiąże sieć neuronów, które są połączone z początkowo zainfekowanymi komórkami.

Dodatkową zaletą używania wirusa do śledzenia neuronów jest amplifikacja białka reporterowego (w tym przypadku eGFP) w zainfekowanych komórkach. To wzmocnienie sygnału zapewnia poziom czułości, który umożliwia wykrywanie nawet rzadkich projekcji. Na przykład u szczurów przy użyciu białka zielonej fluorescencji14 stwierdzono rzadką projekcję z kory ruchowej wibrysy do neuronów ruchowych twarzy kontrolujących wąsy; Poprzednie badania nie zdołały znaleźć tej projekcji przy użyciu klasycznych znaczników bez reporterowej amplifikacji genu11,15. Niestety, wiele wektorów śledzenia wirusa, takich jak ten użyty w cytowanym badaniu, nie krzyżuje się z synapsami, ograniczając w ten sposób ich zastosowanie do śledzenia obwodów wielosynaptycznych.

Prezentując wyraźne korzyści dla identyfikacji sieci komórek uczestniczących w obwodzie motorycznym, rozproszony charakter śledzenia transsynaptycznego za pomocą PRV-152 utrudnia interpretację konkretnych połączeń w obwodzie. W związku z tym przedstawiamy prostą metodę walidacji określonych połączeń w obrębie obwodów zidentyfikowanych za pomocą PRV-152 poprzez podwójne znakowanie przy użyciu biotynylowanych amin dekstranowych (BDA) i podjednostki b toksyny (CTb). Łączne zastosowanie BDA i CTb jest dobrze ugruntowanym podejściem do śledzenia połączeń między określonymi zestawami neuronów6-8,11. Stosowane razem, te dwa znaczniki można zwizualizować w tej samej sekcji za pomocą dwukolorowej procedury DAB (3, 3'-diaminobenzydyna)16. BDA o wysokiej masie cząsteczkowej (BDA10kDa) został wybrany do tego protokołu, ponieważ zapewnia szczegółowe znakowanie procesów neuronalnych6,7,9. Do dodatkowych zalet BDA10kDa należą: jest on preferencyjnie transportowany w kierunku następczym6-8; może być dostarczany przez iniekcję jonoforetyczną lub ciśnieniową6-8; można go uwidocznić za pomocą prostej procedury HRP z biotynylacją awidyny (ABC)17; i można go obrazować za pomocą mikroskopii świetlnej lub elektronowej6,7,18. Immunochemiczne wykrywanie CTb za pomocą peroksydazy i DAB zostało wybrane do wstecznego znakowania neuronów ruchowych, ponieważ jest skuteczne w ujawnianiu procesów komórkowych, w tym dendrytów dystalnych10,19. Niedawno zastosowaliśmy to podejście do zidentyfikowania ścieżki motorycznej głosu u myszy i ujawnienia rzadkiego połączenia między pierwotną korą ruchową a neuronami ruchowymi krtani, które wcześniej zakładano, że jest nieobecne20.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Wszystkie procedury dla zwierząt zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Duke'a.

1. Przechowywanie wirusa pseudowścieklizny

  1. Otrzymujemy żywego wirusa (PRV152) z laboratorium dr Lynn Enquist na Uniwersytecie Princeton w mianie 1 x 109 pfu/m. Opublikowano protokół generowania wirusa2.
  2. Porcję wirusa należy podać w ilości 20 μl na probówkę w komorze bezpieczeństwa biologicznego BSL-2 i przechowywać w temperaturze -80 °C w odpowiednich warunkach bezpieczeństwa biologicznego.
  3. Rozmrozić podwielokrotność PRV bezpośrednio przed wstrzyknięciem.

2. Chirurgiczne przygotowanie do iniekcji w mięśnie

  1. Wywołać znieczulenie ogólne przez domięśniowe wstrzyknięcie ketaminy-ksylazyny (100 mg/kg ketaminy; 10 mg/kg ksylazyny) i utrzymać odpowiednią płaszczyznę znieczulenia za pomocą izofluoranu.
  2. Chroń rogówki maścią okulistyczną.
  3. Przygotować miejsce operacyjne zgodnie z techniką aseptyczną, przycinając włosy i dezynfekując miejsce operacyjne naprzemiennie peelingami Betadine i 70% alkoholu (minimum 3 cykle). Pamiętaj, aby użyć sterylnych obłożeń do zakrycia obszarów chirurgicznych. Upewnij się, że przestrzegasz sterylnych technik podczas wszystkich zabiegów.
  4. Wykonaj nacięcie skóry i odsłoń interesujący mięsień. Na przykład, aby uzyskać dostęp do mięśnia krtaniowego tarczycy, należy najpierw usunąć leżącą nad nim część mięśnia mostkowo-gnykowego.
  5. Uszczelnij wszystkie mięśnie, przez które doszło do przecięcia, za pomocą kleju tkankowego VetBond.

3. Wstrzyknięcie PRV do mięśnia

  1. Załaduj do mikrostrzykawki NanoFil o pojemności 10 μl świeżo rozmrożony roztwór PRV, przymocuj igłę ze stali nierdzewnej 34 G i ostrożnie zamontuj ją na urządzeniu stereotaktycznym.
  2. Powoli oczyść martwą przestrzeń i sprawdź, czy roztwór wydostaje się z końcówki mikrostrzykawki. Wyrzuć płyn jako odpad bioharzard.
  3. Za pomocą stereotaktycznego urządzenia do mikropozycjonowania ostrożnie umieść końcówkę mikrostrzykawki w interesującym nas mięśniu i powoli wypełniaj mięsień, aż pojawi się lekki obrzęk. Szybkość wstrzykiwania będzie się różnić w zależności od wielkości mięśnia i objętości, która ma być wstrzyknięta. Na przykład pięć wstrzyknięć po 200 nl (łącznie 1 μl) z szybkością 4 nl/s należy wykonać w odstępie 1 minuty w tym samym miejscu, aby wypełnić mięsień pierścienno-tarczowy. Przesunąć strzykawkę do następnego interesującego mięśnia (w tym przypadku bocznego pierwiastka) i powtórzyć procedurę wstrzykiwania. Nakłuj każdy mięsień tylko raz.
  4. Wycofać mikrostrzykawkę po pięciu minutach.
  5. Uszczelnij przerwę w powięzi za pomocą kleju tkankowego VetBond.
  6. Po wykonaniu wszystkich wstrzyknięć należy zamknąć ranę za pomocą kleju tkankowego VetBond. W zależności od lokalnych wytycznych dotyczących stosowania zwierząt, można stosować szwy lub klipsy do ran.
  7. Monitoruj zwierzę aż do opadnięcia mostka i zapewnij mu środek przeciwbólowy, jedzenie, wodę i opiekę, zgodnie z wytycznymi dotyczącymi stosowania zwierząt w instytucji.
  8. Po eksperymentalnie określonym czasie przeżycia (w tym przypadku 90 godzin na znakowanie neuronów korowych 2. rzędu), należy złożyć zwierzę w ofierze przez przedawkowanie pentobarbitalu i perfuzję przezsercową z 0,9% soli fizjologicznej, a następnie 4% formaldehydu w 0,1 M PBS.
  9. Usuń mózg i utrwal go w 4% formaldehydzie przez 24 godziny.
  10. Krioprotektoratuj mózg w buforze fosforanowym zawierającym 30% sacharozy przez co najmniej 48 godzin.

4. Immunochemiczne wykrywanie eGFP

  1. Wycinaj sekcje z prędkością 40 μm na przesuwnym mikrotomie i zapisuj sekcje pływające w 0,1 m PBS. Cieńsze sekcje, na przykład 30 μm, mogą być stosowane do barwienia zamontowanych sekcji.
  2. Sekcje hartowania przez 30 min w 0,3% H2O2 w PBS chronione przed światłem.
  3. Blokować nieswoiste antygeny w skrawkach przez 30 minut w PBS zawierającym 0,3% Tween 20 z normalną kozią surowicą z zestawu VECTASTAIN Elite Kit (zestaw VE).
  4. Inkubować zablokowane sekcje przez 3,5 godziny w króliczym anty-eGFP (1:1,000) w temperaturze pokojowej.
  5. Przemyć skrawki trzy razy w PBS przez 5 minut, a następnie inkubować je przez 1 godzinę w kozim przeciwciałie drugorzędowym przeciwko królikowi z zestawu VE w RT.
  6. Przygotuj roztwór ABC z zestawu VE zgodnie z instrukcjami producenta.
  7. Przemyć skrawki trzy razy w PBS przez 5 minut, a następnie reagować przez 1 godzinę w roztworze ABC z zestawu VE w RT.
  8. Przemyć skrawki trzykrotnie w buforze fosforanowym przez 10 minut i rozwijać przez 8 minut w buforze fosforanowym o pH 7,4, zawierającym 0,05% DAB (3,3'-diaminobenzydyny) i 0,015%H2O2.
  9. Zamontuj sekcje na prowadnicach SuperFrost Plus i odwadniaj je za pomocą serii stopniowanych alkoholi (70%, 95%, 100% i 100% przez 5 minut każda).
  10. Oczyść skrawki przez dwie płukanki ksylenowe (każde po 5 minut) i nakryj szkiełka za pomocą środka montażowego Permount.
  11. Zobrazuj zamontowane sekcje pod mikroskopem. Produkt reakcji DAB wewnątrz komórek powinien być brązowy. Zdigitalizowane obrazy można odwrócić kolorami, aby podkreślić drobne procesy.

5. Chirurgiczne przygotowanie do wstrzykiwania znaczników w obszary mózgu odkryte przez śledzenie PRV

  1. Wywołać znieczulenie ogólne przez domięśniowe wstrzyknięcie ketaminy-ksylazyny (100 mg/kg ketaminy; 10 mg/kg ksylazyny) i utrzymać odpowiednią płaszczyznę znieczulenia za pomocą izofluoranu.
  2. Chroń rogówki maścią okulistyczną.
  3. Zamocuj głowę w odpowiedniej ramie stereotaktycznej.
  4. Przygotować miejsce operacji zgodnie z techniką aseptyczną, przycinając włosy i dezynfekując miejsce naprzemiennie peelingami z betadyny i 70% alkoholu (minimum 3 cykle).
  5. Wykonaj nacięcie skóry głowy i cofnij skórę nad interesującym obszarem mózgu.
  6. Wykonaj małą kraniotomię przy odpowiednich współrzędnych stereotaktycznych. Na przykład współrzędne kory ruchowej połączonej krtaniowo zidentyfikowanej przez śledzenie PRV u dorosłej myszy to 1,2 mm boczny i 0,2 mm rostralny do Bregmy.

6. Wstrzykiwanie biotynylowanych amin dekstranowych do mózgu

  1. Przygotować 7,5% biotynylowanych amin dekstranowych (BDA), rozpuszczając 25 mg BDA (10 000 MW) w 333 μl sterylnej soli fizjologicznej.
  2. Napełnić system mikropipet Nanoject II roztworem BDA w ilości wystarczającej do planowanych wstrzyknięć.
  3. Powoli oczyść martwą przestrzeń i sprawdź, czy roztwór wydostaje się z końcówki mikropipety.
  4. Za pomocą stereotaktycznego urządzenia do mikropozycjonowania ostrożnie opuść końcówkę mikropipety do obszaru mózgu zainteresowania i powoli wstrzyknij BDA. Dostosuj szybkość wstrzykiwania w zależności od rozmiaru obszaru, który ma być oznaczony. Na przykład 12 wstrzyknięć 4,6 nl powinno być wykonanych w czterech różnych miejscach oddalonych od siebie o 0,2 mm (kierunek rostro-ogonowy), aby pokryć korę ruchową połączoną krtaniowo u dorosłych myszy. Ostateczna objętość wstrzyknięcia powinna być dostosowana do wielkości obszaru mózgu będącego przedmiotem zainteresowania, pamiętając, że etykieta może rozprzestrzeniać się z rdzenia iniekcji poprzez dyfuzję przez tkankę mózgową i wzdłuż procesów znakowanych neuronów.
  5. Uszczelnij kraniotomię za pomocą cementu dentystycznego i zamknij ranę skóry głowy za pomocą kleju tkankowego VetBond.
  6. Monitoruj zwierzę aż do opadnięcia mostka i zapewnij mu środek przeciwbólowy, jedzenie, wodę i opiekę, zgodnie z wytycznymi dotyczącymi stosowania zwierząt w instytucji.

7. Wstrzyknięcie podjednostki b toksyny do mięśni

  1. Przygotować 1% podjednostkę b (CTb) toksyny, rozpuszczając 1 mg CTb w 100 μl sterylnego roztworu soli fizjologicznej.
  2. Sześć dni po wstrzyknięciu BDA do mózgu należy wykonać przygotowanie chirurgiczne, jak opisano powyżej, do wstrzyknięć PRV do mięśni.
  3. Załaduj system mikrostrzykawkowy NanoFil o pojemności 10 μl roztworem CTb, zamocuj igłę ze stali nierdzewnej 34 G i ostrożnie zamontuj ją na urządzeniu stereotaktycznym.
  4. Wykonać mikroiniekcje w mięsień (mięśnie) będący przedmiotem zainteresowania, jak opisano wcześniej dla PRV.
  5. Monitoruj zwierzę aż do opadnięcia mostka i zapewnij mu środek przeciwbólowy, jedzenie, wodę i opiekę, zgodnie z wytycznymi dotyczącymi stosowania zwierząt w instytucji.
  6. Trzy dni po wstrzyknięciu CTb należy uśmiercić zwierzę przez przedawkowanie pentobarbitalu i perfuzję przezsercową z 0,9% soli fizjologicznej, a następnie 4% formaldehydu w 0,1 M PBS.
  7. Usuń mózg i utrwal go w 4% formaldehydzie przez 24 godziny.
  8. Krioprotektoratuj mózg w buforze fosforanowym zawierającym 30% sacharozy przez co najmniej 48 godzin.

8. Wykrywanie BDA i CTb w tych samych sekcjach

  1. Wytnij odcinki z prędkością 40 μm na mikrotomie i zapisz pływające odcinki w 0,1 m PBS.
  2. Sekcje hartowania przez 30 min w 0,3% H2O2 w PBS chronione przed światłem.
  3. Przygotuj roztwór ABC z zestawu VE zgodnie z instrukcjami producenta.
  4. Przemyć skrawki trzy razy w PBS przez 5 minut, a następnie reagować przez 1 godzinę w roztworze ABC w temperaturze pokojowej.
  5. Przemyć skrawki trzykrotnie w buforze fosforanowym przez 10 minut i rozwijać przez 8 minut w buforze fosforanowym o pH 7,4, zawierającym 0,05% DAB (3,3'-diaminobenzydyny), 0,015%H2O2i 0,05% chlorku niklu. Produkt reakcji DAB wewnątrz komórek powinien być.
  6. Blokuj skrawki przez 30 minut w PBS zawierającym 0,3% Tween 20 z normalną surowicą króliczą z zestawu VECTASTAIN Elite.
  7. Inkubować zablokowane sekcje przez 2 godziny w kozim anty-CTb (1:10 000) w temperaturze pokojowej.
  8. Przemyć skrawki trzy razy w PBS przez 5 minut, a następnie inkubować je przez 1 godzinę w drugorzędowym przeciwciałie przeciw kozom królika z zestawu VE w RT.
  9. Przygotuj roztwór ABC z zestawu VE zgodnie z instrukcjami producenta.
  10. Przemyć skrawki trzykrotnie w PBS przez 5 minut, a następnie reagować przez 30 minut w roztworze ABC w temperaturze pokojowej stężenia.
  11. Przemyć skrawki trzykrotnie w buforze fosforanowym przez 10 minut i rozwijać do 8 minut w buforze fosforanowym o pH 7,4, zawierającym 0,05% DAB (3,3'-diaminozydyny) i 0,015%H2O2. Produkt reakcji DAB wewnątrz komórek powinien być brązowy.
  12. Zamontuj sekcje na prowadnicach SuperFrost Plus i odwadniaj je za pomocą serii stopniowanych alkoholi (70%, 95%, 100% i 100% przez 5 minut każda).
  13. Oczyść skrawki przez dwie płukanki ksylenowe (każde po 5 minut) i nakryj szkiełka za pomocą środka montażowego Permount.
  14. Zobrazuj zamontowane sekcje pod mikroskopem.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Barwienie na eGFP powinno zacząć wykazywać słaby sygnał w pierwotnych neuronach ruchowych około 72 godziny po wstrzyknięciu PRV152 do mięśnia. Replikacja i transport transsynaptyczny wirusa są zależne od miana i czasu4. Około 90 godzin po wstrzyknięciu barwienie eGFP ujawni silny sygnał w zakażonych komórkach 2. rzędu. Dłuższy czas przeżycia ujawni komórki 3. i wyższego rzędu, ale czas przeżycia jest ograniczony przez śmiertelność PRV po około 5 dniach od inokulacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Istnieje szereg kwestii, które należy wziąć pod uwagę planując eksperyment z użyciem PRV1524,21. Co najważniejsze, wirus wścieklizny rzekomej jest śmiertelny. Jak wspomniano wcześniej, małpy człekokształtne, w tym ludzie, nie są podatne na infekcje, ale należy zachować odpowiednią ostrożność, aby chronić inne zwierzęta. Dorosłe myszy zazwyczaj przeżywają od pięciu do siedmiu dni po zaszczepieniu atenuowanym szczepem PRV152. Z tego powodu PRV152 nie jest odpowiedni do eksperymentów, które wymagają czasu przeżyc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy dr Toshio Terashima z Uniwersytetu Kobe w Japonii za nauczanie techniki chirurgii krtani oraz dr Lynn Enquist z Uniwersytetu Princeton za dostarczenie PRV-Bartha. Badania były wspierane przez nagrodę NIH Pioneer Award DP1 OD000448 dla Ericha D. Jarvisa oraz nagrodę NSF Graduate Research Fellowship dla Gustavo Arriaga. Ryciny z odpowiednio opatrzonych autorami wcześniejszych prac są wykorzystywane na licencji Creative Commons (CC-BY) w otwartym dostępie PLoS ONE zgodnie z polityką redakcyjną czasopisma.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
firmysię odczynnikiem/materiałemNumer katalogowyKomentarze
System mikroiniekcji NanoFilWorld PrecisionInstruments IO-Kit Opcja 34G
Rama stereotaktyczna DavidKopf InstrumentsModel 900
Nanoject II Auto-Nanolitr InjectorDrummond Scientific Company3-000-204
Przesuwny mikrotomLeicaSM2010 R
[nagłówek]
VetBond3M 1469SB
Izofluoran (Forane)Baxter 
Patyczek do wacików BetadineCardinal Health2130-01200 sztuk
Średni montaż PermountFisher ScientificSP15-500
SuperFrost Plus FisherScientific12-550-15
Biotynylowane aminy dekstranuInvitrogenD-195610 000 MW
Wirus wścieklizny rzekomejLaboratorium dr. Lynn Enquist (Uniwersytet Princeton)PRV152Miano >1 x 107
Podjednostka toksyny przeciwcholeryjskiej B (koza)Lista Laboratoria biologiczne703
podjednostek toksyny BLaboratoria biologiczne103B
Anti-eGFPOpen BiosystemsABS4528
3, 3'-diaminobenzydynaSigma-AldrichD5905Tabletki 10 mg
EtanolSigma-AldrichE7023200 proof
FormaldehydSigma-AldrichF8775Rozcieńczony do 4%
Nadtlenek wodoruSigma-AldrichH341030%
Ketamina HCl & Ksylazyna HClSigma-AldrichK413880 mg/ml & 6 mg/ml
Chlorek nikluSigma-Aldrich339350
Bufor fosforanowySigma-AldrichP36191,0 M; pH 7,4
Solanka fizjologiczna buforowana fosforanamiSigma-AldrichP549310x; pH 7,4
Pentobarbital soduSigma-AldrichP3761dawka
50 mg/mlSacharozaSigma-AldrichS9378
Tween 20Sigma-AldrichP1379
KsylenySigma-Aldrich534056Klasa histologiczna
VECTASTAIN Elite ABC KitVector LaboratoriesPK-6101 (królik); PK-6105 (koza)
Maść okulistyczna OptixcareVet Depot1017992
Nazwa zajmującej 1001936060 Prowadnice Lista

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Card, J. P., Enquist, L. W. Transneuronal circuit analysis with pseudorabies viruses.Multiple values selected. Unit 1.5, John Wiley & Sons Inc. Hoboken, NJ, USA. Multiple values selected 1.51-1.5.28 (2001).
  2. Smith, B. N., Banfield, B. W., et al. Pseudorabies virus expressing enhanced green fluorescent protein: a tool for in vitro electrophysiological analysis of transsynaptically labeled neurons in identified central nervous system circuits. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (16), 9264-9269 (2000).
  3. Aston Jones, G., Card, J. P. Use of pseudorabies virus to delineate multisynaptic circuits in brain opportunities and limitations. Journal of Neuroscience Methods. 103 (1), 51-61 (2000).
  4. Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. Molecular biology of pseudorabies virus impact on neurovirology and veterinary medicine. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 69 (3), 462-500 (2005).
  5. Brittle, E. E., Reynolds, A. E., Enquist, L. W. Two modes of pseudorabies virus neuroinvasion and lethality in mice. Journal of Virology. 78 (23), 12951-12963 (2004).
  6. Reiner, A., Veenman, C. L., Medina, L., Jiao, Y. Pathway tracing using biotinylated dextran amines. Journal of neuroscience. 103, 23-37 (2000).
  7. Reiner, A., Honig, M. G. Neuroanatomical tract-tracing 3 (Chapter 10). Dextran Amines Versatile Tools for Anterograde and Retrograde Studies of Nervous System Connectivity. 10, 304-335 (2006).
  8. Veenman, C. L., Reiner, A., Honig, M. G. Biotinylated dextran amine as an anterograde tracer for single and double labeling studies. Journal of Neuroscience Methods. 41 (3), 239-254 (1992).
  9. Rajakumar, N., Elisevich, K., Flumerfelt, B. A. Biotinylated dextran a versatile anterograde and retrograde neuronal tracer. Brain Research. 607 (1-2), 47-53 (1993).
  10. Dederen, P. J. W. C., Gribnau, A. A. M., Curfs, M. H. J. M. Retrograde neuronal tracing with cholera toxin B subunit: comparison of three different visualization methods. Histochemical Journal. 26 (11), 856-862 (1994).
  11. Hattox, A. M., Priest, C. A., Keller, A. Functional circuitry involved in the regulation of whisker movements. The Journal of Comparative Neurology. 442 (3), 266-276 (2002).
  12. Bartha, A. Experimental reduction of virulence of Aujeszkys disease virus. Magy Allatorv Lapja. 16, 42-45 (1961).
  13. Kuypers, H., Ugolini, G. Viruses as transneuronal tracers. Trends in Neurosciences. 13 (2), 71-75 (1990).
  14. Grinevich, V., Brecht, M., Osten, P. Monosynaptic pathway from rat vibrissa motor cortex to facial motor neurons revealed by lentivirus-based axonal tracing. The Journal of Neuroscience. 25 (36), 8250-8258 (2005).
  15. Miyashita, E., Keller, A., Asanuma, H. Input output organization of the rat vibrissal motor cortex. Experimental Brain Research. 99 (2), 223-232 (1994).
  16. Hsu, S. M., Soban, E. Color modification of diaminobenzidine (DAB) precipitation by metallic ions and its application for double immunohistochemistry. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 30 (10), 1079-1082 (1982).
  17. Hsu, S. M., Raine, L., Fanger, H. Use of avidin biotin-peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase techniques a comparison between ABC and unlabeled antibody (PAP) procedures. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 29 (4), 577-580 (1981).
  18. Wouterlood, F. G., Jorritsma Byham, B. The anterograde neuroanatomical tracer biotinylated dextran amine comparison with the tracer Phaseolus vulgaris leucoagglutinin in preparations for electron microscopy. Journal of Neuroscience Methods. 48 (1-2), 75-87 (1993).
  19. Altschuler, S. M., Bao, X. M., Miselis, R. R. Dendritic architecture of nucleus ambiguus motoneurons projecting to the upper alimentary tract in the rat. The Journal of Comparative Neurology. 309 (3), 402-414 (1991).
  20. Arriaga, G., Zhou, E. P., Jarvis, E. D. Of mice birds and men the mouse ultrasonic song system has some features similar to humans and songlearning birds. PLoS ONE. 7 (10), e46610(2012).
  21. Card, J. P. Practical considerations for the use of pseudorabies virus in transneuronal studies of neural circuitry. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 22 (6), 685-694 (1998).
  22. Zuckerman, F. A., Zsak, L., Mettenleiter, T. C., Ben Porat, T. Pseudorabies virus glycoprotein gIII is a major target antigen for murine and swine virus-specific cytotoxic T lymphocytes. Journal of Virology. 64 (2), 802-812 (1990).
  23. Card, J. P., Enquist, L. W., Moore, R. Y. Neuroinvasiveness of pseudorabies virus injected intracerebrally is dependent on viral concentration and terminal field density. The Journal of Comparative Neurology. 407 (3), 438-452 (1999).
  24. Pickard, G. E., Smeraski, C. A., et al. Intravitreal injection of the attenuated pseudorabies virus PRV Bartha results in infection of the hamster suprachiasmatic nucleus only by retrograde transsynaptic transport via autonomic circuits. The Journal of Neuroscience. 22 (7), 2701-2710 (2002).
  25. Smith, G. A., Gross, S. P., Enquist, L. W. Herpesviruses use bidirectional fast axonal transport to spread in sensory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6), 3466-3470 (2001).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Podjednostka B toksyny cholerycznejretrogradne ledzenie wirusoweznaczniki monosynaptycznemikroskopia fluorescencyjnaimmunohistochemia DABwsp rz dne stereotaksycznesekcjonowanie w kriotomacie

Powiązane artykuły