Opisano protokół, który wykorzystuje testy Infinium firmy Illumina do przeprowadzania genotypowania na dużą skalę. Testy te mogą niezawodnie genotypować miliony SNP w setkach pojedynczych próbek DNA w ciągu trzech dni. Po wygenerowaniu genotypy te można wykorzystać do sprawdzenia powiązań z wieloma różnymi chorobami lub fenotypami.
Artykuł metodologiczny
Test Infinium do zastosowań genotypowania SNP na dużą skalę
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Genotypowanie wariantów w ludzkim genomie okazało się skuteczną metodą identyfikacji powiązań genetycznych z fenotypami. Rozmieszczenie wariantów w obrębie rodzin lub populacji może ułatwić identyfikację genetycznych czynników choroby. Panel genotypowania BeadChips firmy Illumina umożliwia badaczom genotypowanie tysięcy lub milionów polimorfizmów pojedynczych nukleotydów (SNP) lub analizowanie innych wariantów genomu, takich jak liczba kopii, w dużej liczbie próbek DNA. Te SNP mogą być rozprzestrzeniane w całym genomie lub ukierunkowane na określone regiony, aby zmaksymalizować potencjalne odkrycie. Test Infinium został zoptymalizowany pod kątem szybkiego uzyskania wysokiej jakości, dokładnych wyników. Przy odpowiedniej konfiguracji jeden technik może przetworzyć od kilkuset do ponad tysiąca próbek DNA tygodniowo, w zależności od rodzaju macierzy. Ten test prowadzi użytkowników przez każdy krok, począwszy od genomowego DNA, a skończywszy na skanowaniu macierzy. Za pomocą odpowiednich odczynników próbki są amplifikowane, fragmentowane, wytrącane, ponownie zawieszane, hybrydyzowane z chipem, rozszerzane o pojedynczą zasadę, barwione i skanowane w systemie obrazowania optycznego o wysokiej rozdzielczości iScan lub Hi Scan. Do amplifikacji DNA wymagany jest jeden nocny krok. DNA jest denaturowane i amplifikowane izotermicznie przez amplifikację całego genomu; w związku z tym nie jest wymagany PCR. Próbki są hybrydyzowane z macierzami podczas drugiego etapu nocnego. Trzeciego dnia próbki są gotowe do skanowania i analizy. Amplifikowane DNA może być przechowywane w dużych ilościach, co pozwala na przetwarzanie matryc kulek każdego dnia tygodnia, maksymalizując w ten sposób przepustowość.
Wprowadzenie
Typowanie polimorfizmów pojedynczego nukleotydu (SNP) jest kluczową metodą identyfikacji wariantów ryzyka związanych z chorobą. Historycznie rzecz biorąc, zakres eksperymentów genotypowania był ograniczony przez dostępną technologię. Metody genotypowania oparte na elektroforezie żelowej są ograniczone pod względem przepustowości próbki i SNP[1]. Opracowanie tych testów może być często pracochłonne, opierając się na składzie i strukturze regionu otaczającego wariant w celu optymalizacji[1]. Testy genotypowania TaqMan, opracowane przez Life Technologies, mogą szybko i przy minimalnym zaangażowaniu techników badać dużą liczbę próbek[2], ale ograniczenia dotyczące multipleksowania SNP nadal ograniczają całkowitą liczbę genotypów do znacznie poniżej miliona dziennie[3,4]. Platforma iPlex firmy Sequenom może również uruchamiać wiele próbek jednocześnie, ale ponieważ można multipleksować mniej niż sto SNP, przepustowość jest ogólnie porównywalnie niska[5]. Technologia strumienia SNP Beckmana Coultera może teoretycznie wyprodukować ponad trzy miliony genotypów dziennie, ale technologia ta ogranicza zakres projektu do maksymalnie zaledwie czterdziestu ośmiu SNP na reakcję[4,6]. Podczas gdy test GoldenGate może przetwarzać prawie dwieście próbek DNA każdego dnia na setkach lub tysiącach SNP na próbkę, cena za genotyp nie jest konkurencyjna w stosunku do zaawansowanych, ultra-wysokoprzepustowych technik przy typowaniu ponad trzech tysięcy SNP jednocześnie[4,7]. W celu przetwarzania kilku milionów genotypów dziennie, co jest skalą wymaganą w przypadku dużych badań asocjacyjnych całego genomu, testy hybrydyzacji macierzy stały się najbardziej opłacalną opcją na rynku.
Linia tablic hybrydyzacyjnych Affymetrix i linia tablic opartych na Infinium firmy Illumina pozwalają potencjalnie na równoległe typowanie setek próbek na setkach tysięcy lub milionach SNP[4,8]. Te SNP mogą być rozproszone po całym genomie, zlokalizowane w regionach zainteresowań, takich jak egzomy, lub dostosowane do preferencji użytkownika. Zaletą tych macierzy jest nie tylko możliwość dokładnego genotypowania miliona SNP na próbkę jednocześnie, ale także pomiaru zmienności liczby kopii, potencjalnie ujawniając nieprawidłowości chromosomalne. Układy OMNI BeadChip dostosowane do Infinium mają obecnie możliwość genotypowania do prawie pięciu milionów markerów na próbkę, w tym pół miliona niestandardowych loci, na prawie stu próbkach każdego dnia.
Ponieważ większość chorób ma komponent genetyczny, te eksperymenty na dużą skalę mogą być kluczowe w poszukiwaniu genów związanych z chorobą. Genotypowanie o wysokiej przepustowości pozwala na wydajne generowanie genotypów w zestawach próbek wystarczająco dużych, aby przekonująco wykryć asocjację genetyczną przy niższych częstościach alleli mniejszych. Projekty genotypowania całego genomu mogą być wykorzystywane do lokalizowania regionów o statystycznie istotnej częstości występowania alleli kliniczno-kontrolnych lub różnicach w liczbie kopii [9,10,11]. Według National Human Genome Research Institute, badania asocjacyjne całego genomu doprowadziły do 1490 oddzielnych publikacji w okresie od 25 listopada 2008 r. do 25 stycznia 2013 r., wynikających z odkrycia 8283 SNP o wartości p mniejszej niż 1 x 10-5 (patrz http://www.genome.gov/gwastudies/). Badania te, w których badano schorzenia od wzrostu do raka jąder, skorzystały z szerokiego podejścia zapewnionego przez analizę całego genomu. W takich przypadkach całe obszary zainteresowania mogłyby umknąć uwadze, gdyby zakres wpisywania był zbyt restrykcyjny. W związku z tym w przypadku wielkoskalowych analiz asocjacyjnych preferowaną techniką jest technika genotypowania całego genomu.
Istnieją różne wersje testu Infinium, z których każda jest przeznaczona do użycia z określonymi typami tablic. Test InfiniumUltra, omówiony szczegółowo poniżej, jest odpowiedni dla wielu układów z 12 lub 24 próbkami. Często genotypują one ponad sto tysięcy SNP na próbkę DNA i koncentrują się na docelowych regionach, takich jak egzom lub niestandardowe panele. Inne wersje testów mogą być wymagane dla innych typów chipów, takich jak macierze genotypowania całego genomu. Ponieważ jednak wszystkie testy Infinium mają wspólną podstawę i różnią się głównie nazwami odczynników, objętościami odczynników lub dokładną procedurą barwienia odczynników, techniki udoskonalone w jednej wersji testu mogą być często powszechnie stosowane. Inne tablice, takie jak macierze metylacji, mogą również używać prawie identycznego protokołu. Należy zachować ostrożność, aby używać wyłącznie wersji testu wymaganej dla używanego typu chipa. Niektóre typy, takie jak te mierzące poziom ekspresji genów, mogą wymagać użycia protokołu innego niż Infinium.
Próbki muszą być przetwarzane partiami. Na przykład w teście InfiniumUltra probówki z odczynnikiem do prehybrydyzacji zawierają wystarczającą objętość, aby uruchomić 96 próbek, a probówek nie można ponownie zamrozić. W związku z tym próbki muszą być badane w partiach po 96 próbek jednocześnie. Próbki zostaną amplifikowane pierwszego dnia. Po około 1 godzinie pracy na stole próbki należy podgrzewać w piecu konwekcyjnym przez 20-24 godziny. Następnego dnia prawie 4 godziny zostaną poświęcone na fragmentację, wytrącanie i ponowne zawieszanie próbek, po czym próbki mogą zostać zamrożone do wykorzystania w przyszłości lub zhybrydyzowane z chipem. Ładowanie wiórów trwa prawie 2 godziny, po czym próbki będą hybrydyzowane przez noc przez 16-24 godziny. Trzeciego dnia etap barwienia i przedłużania trwa ~4 godziny. Kolejna godzina zostanie poświęcona na mycie, powlekanie i suszenie frytek. Na koniec skanowane są matryce, co może zająć od 15 do 60 minut/chip, w zależności od użytego typu.
Obowiązują standardowe środki ostrożności i czystości w laboratorium. Chociaż amplifikacja nie jest oparta na PCR, konieczne są oddzielne stacje robocze do procedur przed i po amplifikacji, aby zminimalizować prawdopodobieństwo zanieczyszczenia. Numer identyfikacyjny każdego używanego odczynnika dostarczonego w zestawie musi być zapisany na karcie śledzenia. Odczynniki należy rozmrozić bezpośrednio przed użyciem i kilkakrotnie odwrócić przed dozowaniem. DNA, które ma być typowane, musi być genomowym DNA wysokiej jakości (współczynnik absorbancji 260/280 wynosi 1,6-2,0, współczynnik absorbancji 260/230 poniżej 3,0), wyizolowanym metodami wzorcowymi i oznaczonym ilościowo za pomocą fluorometru. Degradacja DNA jest często czynnikiem przyczyniającym się do niskiej jakości wyników testów. Zazwyczaj wymagane jest 200 ng DNA, chociaż ilość ta może się różnić w przypadku niektórych typów chipów. Robot do obsługi cieczy Tecan może zautomatyzować wiele etapów protokołu i zminimalizować błąd ludzki jako czynnik.
Protokół
Dzień pierwszy
1. Przygotowanie
- Dozuj 200 ng DNA do głębokiej płytki z 96 próbkami. Należy posiać co najmniej 96 próbek (pełne płytki), aby upewnić się, że żaden odczynnik nie zostanie zmarnowany. Oznacz płytkę naklejką z kodem kreskowym dołączoną do zestawu i odwiruj ją.
- W celu znormalizowania objętości należy pozostawić próbki na noc w szufladzie lub okapie w celu odparowania cieczy. Przykryj talerz luźno pokrywką lub ręcznikiem papierowym, aby nie dopuścić do kurzu.
2. Wzmocnienie
UWAGA: próbki nie powinny być poddawane amplifikacji, chyba że następnego dnia będą dostępne 4 godziny na etapy fragmentacji, wytrącania i ponownego zawieszenia.
- Wyjmij dostarczone przez firmę pudełko lub paczkę probówek oznaczonych "Pre" z zamrażarki w temperaturze -20 °C (jedna probówka MA1, MA2 i MSM wystarcza na każdy zestaw 96 próbek). Ustaw probówki MA2 i MSM na ławce do rozmrożenia. Włącz prawidłowo skalibrowany piekarnik i ustaw na 37 °C.
- Używając miski na odczynnik i 8-kanałowej pipety o pojemności 10 μl, dozuj 4 μl buforu do rezawieszania DNA do każdej studzienki w celu ponownego uwodnienia próbek. Nie ma potrzeby wyrzucania końcówek pipet między każdą kolumną, jeśli uważa się, aby nie dotknąć cieczy.
- Za pomocą pipety 8-kanałowej dozuj 20 μl MA1 do każdego dołka płytki. Do każdego nowego odczynnika należy użyć zbiornika na świeży odczynnik. Przykryj płytkę uszczelką wielokrotnego użytku, wirówką pulsacyjną i wiruj przez 1 minutę przy 1 600 obr./min na wytrząsarce do mikropłytek.
- 2.4) Inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej 30 minut.
- Dozować 4 μl 0,1 N NaOH do każdego dołka płytki. Przykryj płytkę uszczelką wielokrotnego użytku, wirówką pulsacyjną i wirem na 1 minutę przy 1 600 obr./min.
- Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
- Dozować 34 μl MA2 do każdego dołka płytki.
- Dozować 38 μl MSM do każdego dołka płytki. Przykryj płytkę uszczelką wielokrotnego użytku, wirówką pulsacyjną i wirem na 1 minutę przy 1 600 obr./min.
- Wstawić do piekarnika na 20-24 godziny.
Dzień drugi
3. Fragmentacja
- Wyjąć probówki FMS z pudełka "Post-1" o temperaturze -20 °C (jedna probówka wystarcza na każdy zestaw 96 próbek). Rozmrozić na ławce lub w łaźni wodnej o temperaturze pokojowej. Po włożeniu wkładki płytki MIDI do stołowego systemu inkubacji mikropróbek, włączyć blok grzewczy i ustawić go na 37 °C.
- Po rozmrożeniu probówek wyjąć płytkę z próbką z pieca i odwirować pulsacyjnie. Dozować 25 μl FMS do każdego dołka płytki DNA. Załóż pokrywę, wirówkę pulsacyjną i wiruj z prędkością 1 600 obr./min przez 1 min.
- Inkubować płytkę w bloku grzewczym przez 1 godzinę.
4. Opady
- Wyjąć probówkę PM1 z pudełka lub opakowania "Post-3" o temperaturze 4 °C i ogrzać do temperatury pokojowej (jedna probówka wystarcza na każdy zestaw 96 próbek). Wyjąć płytkę z bloku grzewczego i wirować pulsacyjnie.
- Dozować 50 μl PM1 do każdego dołka płytki. Załóż pokrywę, wirówkę pulsacyjną i wiruj z prędkością 1 600 obr./min przez 1 min.
- Inkubować płytkę w bloku grzewczym przez 5 minut.
- Wyjmij płytkę z bloku grzewczego, wyłącz ją i wyrzuć pokrywkę płyty. Dozuj 155 μl 100% izopropanolu do każdego dołka płytki. Przykryj szczelnie nową pokrywką i ręcznie odwróć talerz kilka razy, aby wymieszać.
- Umieść płytkę w temperaturze 4 °C na co najmniej 30 minut. Włącz wirówkę z chłodzeniem i ustaw na 4 °C, aby ostygła.
- Zrównoważyć płytkę i odwirować w temperaturze 4 °C przez 20 minut przy 3 000 x g.
- Sprawdzić spód płytki bez odwracania jej i upewnić się, że próbki są wytrącone w niebieskim granulku. Jeśli nie widać żadnych granulek, odwirować ponownie. Zaopatrz się w ręczniki papierowe.
- Wyrzuć pokrywkę i szybko usuń płyn, odwracając talerz i mocno uderzając nim o blat pokryty ręcznikami papierowymi. Po odwróceniu płytki należy uważać, aby jej nie cofnąć, dopóki nie pozostanie płyn. Kilkakrotnie postukaj talerzem o blat, aż cały płyn zostanie usunięty.
- Umieść płytkę na stojaku na probówki, odwróconą, do wyschnięcia. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
5. Ponowne zawieszenie
- Usunąć RA1 z pudełka "Post-2" -20 °C i rozmrozić w łaźni wodnej o temperaturze pokojowej. Włącz piekarnik i ustaw go na 48 °C.
- Po rozmrożeniu dozować 23 μl RA1 do każdego dołka płytki z próbką. Nie wlewać całej butelki RA1 do miseczki; Zachowaj 30 ml na później. Jeśli próbki zostaną zhybrydyzowane z matrycami później tego samego dnia, umieść RA1 w chłodziarce o temperaturze 4 °C. Jeśli próbki zostaną pobrane w późniejszym terminie, oznacz butelkę etykietą i ponownie zamroź RA1.
- Zgrzej nową pokrywkę na talerzu. Odwiruj pulsacyjnie płytkę i wstaw ją do piekarnika na 1 godzinę.
- Wyjmij talerz z piekarnika i wiruj z prędkością 1 800 obr./min przez 1 min.
Próbki mogą być bezpiecznie przechowywane na tym etapie przez okres do jednego tygodnia. Płytki mogą być składowane, a próbki mogą być reorganizowane w celu przygotowania do nałożenia wiórów ściegowych, jeśli to konieczne. Jeśli kontynuujesz procedurę, pozostaw płytkę w temperaturze pokojowej i włącz blok grzewczy. W przeciwnym razie należy przechowywać płytkę w temperaturze -20 °C.
6. Hybrydyzacja
UWAGA: Próbki nie powinny być poddawane hybrydyzacji, chyba że następnego dnia będzie dostępnych 5,5 godziny na etapy barwienia i mycia.
- Włącz blok grzewczy i ustaw go na 95 °C. Włącz piekarnik i ustaw go na 48 °C.
- Gdy temperatura się ustabilizuje, inkubuj płytkę na bloku grzewczym przez 20 minut.
- Podczas denaturacji płytki wyjmij pudełko z wiórkami kulek z 4 °C i połóż je na stole. Weź butelkę XC4 (z zestawu o temperaturze pokojowej) i dodaj 330 ml 100% etanolu. Dobrze wstrząsnąć i inkubować w temperaturze pokojowej przez noc. Przygotować mieszaninę formamidu/EDTA (95% formamidu, 0,2% EDTA (0,5 M), 4,8%H2Oobjętościowo) i zamrozić w oddzielnych porcjach po 15 ml. Nadmiar formamidu może być składowany.
- Wyjmij płytkę próbki z bloku grzewczego. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
- Podczas gdy płyta stygnie, przygotuj komorę hyb. Jedna komora będzie potrzebna na każde cztery przetworzone wióry kulek.
Umieść gumową matę na górze podstawy komory hyb, wyrównując grubszy otwór z przodem podstawy. Symbol kodu kreskowego wytrawiony na podstawie powinien być nadal widoczny (patrz rysunek 2). - Za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl dozuj 400 μl PB2 do każdego z ośmiu zbiorników nawilżających wyrzeźbionych w podstawie. PB2 można znaleźć w pudełku lub opakowaniu "Post-3". Umieść pokrywę komory hyb na podstawie i zapnij oba końce, zamykając najpierw dwa zapięcia po przekątnej po przeciwnych stronach.
- Wyjmij pojedyncze srebrne paczki wiórów koralików z odpowiednich pudełek, ale aby zminimalizować narażenie wiórów na powietrze i światło, nie otwieraj ich jeszcze. Dokładnie zeskanuj kody kreskowe chipów i zapisz kolejność, w jakiej zostaną załadowane, na arkuszu śledzenia wraz z identyfikatorami pudełek, z których pochodzą. Konieczne jest dokładne zrozumienie, gdzie każda pojedyncza próbka DNA zostanie dozowana na chipach kulek.
- Wyjmij pojedyncze srebrne paczki wiórów koralików z odpowiednich pudełek, ale aby zminimalizować narażenie wiórów na powietrze i światło, nie otwieraj ich jeszcze. Dokładnie zeskanuj kody kreskowe chipów i zapisz kolejność, w jakiej zostaną załadowane, na arkuszu śledzenia wraz z identyfikatorami pudełek, z których pochodzą. Konieczne jest dokładne zrozumienie, gdzie każda pojedyncza próbka DNA zostanie dozowana na chipach kulek.
- Tuż przed zakończeniem 30-minutowego schładzania otwórz paczki z chipsami ze srebrnymi kulkami. Wyjmij wióry z przezroczystych plastikowych rękawów. Nie dotykając koralików, umieść każdy wiór koralika na wkładce komory hyb, orientując kod kreskowy chipa z symbolem kodu kreskowego wytrawionym na górnej powierzchni wkładki.
- Zdjąć i wyrzucić pokrywkę płytki do próbki. Pobrać 15 μl próbki z płytki do pobierania próbek i powoli dozować na wlocie do matrycy (zob. rysunek 3). Należy zachować szczególną ostrożność, aby umieścić właściwą próbkę na właściwym wiórze kulki we właściwej pozycji, zgodnie z zarejestrowaną wcześniej kolejnością wiórów koralików. Pipeta wielokanałowa może być używana do dozowania cieczy na wióry, ale należy zachować ostrożność, aby zassać tylko tyle próbek, ile można bezpiecznie umieścić na chipie kulkowym, ponieważ liczba rzędów na płytce nie zawsze odpowiada liczbie rzędów na chipie.
- Po umieszczeniu każdej próbki na odpowiedniej matrycy należy wizualnie sprawdzić chip pod kątem pęcherzyków lub obszarów, które nie są pokryte cieczą. Jeśli te problemy występują, delikatnie potrząśnij wkładką. W razie potrzeby do tablicy można dodać więcej płynu. Zadbaj o to, aby dodać odpowiednią próbkę DNA.
- Otwórz komorę hyb i umieść wkłady nad zbiornikami nawilżającymi. Kod kreskowy chipa należy umieścić nad kodem kreskowym wytrawionym w podstawie komory hyb. Załóż pokrywę komory hyb i zamknij wszystkie cztery zatrzaski, zamykając najpierw zapięcia po przeciwnych stronach.
- Inkubuj komorę hyb w piekarniku przez 16-24 godziny. Uważaj, aby nie przechylić komór podczas ich przenoszenia.
- Jeśli do przetworzenia ma zostać przetworzona więcej niż jedna płytka, wróć do kroku 6.2. Nie zaleca się przetwarzania więcej niż 24 wiórów kulek dziennie, zarówno w celu zminimalizowania prawdopodobieństwa błędu ludzkiego podczas pracy z dużą ilością materiałów eksploatacyjnych lub wiórów, jak i zminimalizowania czasu potrzebnego do przetworzenia wiórów w przyszłych etapach, ponieważ należy zachować ostrożność, aby w jak największym stopniu ograniczyć ich ekspozycję na powietrze. Jedna butelka XC4 wystarcza na 24 chipsy z kulek.
Dzień trzeci
7. Przygotowanie do barwienia
- Wyjmij komory hyb z piekarnika i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 25 minut. Jeśli przetwarzasz więcej niż dwie komory hyb, rozłoż je w czasie dwukrotne usuwanie co 10 minut. Aby wióry nie wyschły, nie otwieraj jeszcze komór hyb.
- Podczas gdy komory hyb stygną, wyjmij rurki XC1, XC2, TEM, STM i ATM ze skrzynki "Post-1" -20 °C i umieść na stole do rozmrożenia. Pobrać butelkę RA1 z pudełka "Post-2" w temperaturze -20 °C (lub 4 °C w przypadku ponownego użycia odczynnika z poprzedniego dnia) i rozmrozić w łaźni wodnej o temperaturze pokojowej. Rozmrozić również tubkę z 95% formamidem. W przypadku 8 przetworzonych wiórów perełkowych wymagane będą dwie probówki każdego odczynnika, 10 ml RA1, 15 ml formamidu i 150 ml XC3 (znajdującego się w pudełku o temperaturze pokojowej dostarczonym przez firmę).
- Do każdego przetworzonego wióra wymagany będzie jeden szkiełko podstawowe, jeden plastikowy wspornik przepływowy, dwa metalowe zapięcia i jedna plastikowa przekładka. W przypadku plastikowej przekładki używaj tylko przezroczystej; Oddziel i wyrzuć nieprzezroczystą przekładkę. Ponadto potrzebne będą dwa naczynia do mycia wiórów perełkowych i jedna taca na wióry, a także jedno stanowisko do montażu płynów i jeden plastikowy pręt montażowy.
- Wyczyść szkiełka, spryskując je etanolem i wycierając do sucha.
- Włącz gorącą łaźnię wodną, która jest dołączona do stojaka studzienki przepływowej i ustaw ją na 44 °C. Delikatnie potrząśnij stojakiem komory, aby usunąć wszelkie pęcherzyki.
- Gdy komora hyb ostygnie przez 25 minut, napełnij naczynie PB1 (około 200 ml). PB1 można znaleźć w pudełku do pomiaru temperatury pokojowej "Post-4".
- Otwórz jedną komorę hyb. Zdejmij uszczelkę pokrywy z wióra stopki, chwytając uszczelkę za jeden róg i delikatnie odklejając po przekątnej (patrz rysunek 4). Po usunięciu uszczelki natychmiast umieść wiór w tacy na wióry i zanurz w PB1 bez dotykania kulek. Powtarzaj, aż taca zostanie wypełniona wiórkami koralików, uważając, aby żaden wiór nie wyschł.
- Delikatnie porusz tacką, aby usunąć wszelkie pęcherzyki i pozostaw frytki zanurzone na 1 minutę. Napełnij drugie naczynie do mycia PB1. Ponownie zamieszaj tacę.
- Przenieś tacę z wiórkami koralików do drugiego naczynia do mycia. Delikatnie wymieszaj i pozostaw do namoczenia na 1 minutę, a następnie ponownie wymieszaj.
- W stacji montażowej przepływowej cieczy umieść w rowkach cztery czarne plastikowe wsporniki przepływowe. Napełnij stację PB1, aż płyn osiągnie prawie wysokość ośmiu wsporników montażowych (około 150 ml).
- Wyjmij wiór koralika z tacki i umieść go na stanowisku montażowym na plastikowym wsporniku przepływowym. Kod kreskowy chipa powinien być wyrównany nad symbolem kodu kreskowego wytrawionym na stanowisku montażowym. Powtórz te czynności dla pozostałych trzech chipów, które mogą zmieścić się na stanowisku montażowym.
- Umieść przezroczystą plastikową przekładkę na wiórze koralika. Zewnętrzne krawędzie przekładki powinny otaczać wsporniki w obrębie stanowiska montażowego. Powtórz te czynności dla pozostałych chipów zanurzonych w PB1.
- Umieść plastikową listwę montażową na stanowisku montażowym, montując ją nad rowkami. Delikatnie umieść szklaną prowadnicę na plastikowej przekładce, dociskając tylny koniec prowadnicy do pręta montażowego i powoli opuszczając przód do płynu. Rowek na górze szkiełka powinien być skierowany w dół, bezpośrednio nad kodem kreskowym chipa, pozostawiając szczelinę między chipem koralika a suwakiem na końcu kodu kreskowego. Powtórz te czynności dla pozostałych chipów zanurzonych w PB1. Aby uzyskać pełny schemat montażu przepływowego, patrz rysunek 5.
- Sprawdź, czy między chipem a szkiełkiem nie ma pęcherzyków. Jeśli pojawią się bąbelki, delikatnie podnieś szkiełko na końcu kodu kreskowego i spróbuj ponownie. Uporczywe bąbelki można zetrzeć ze szkła papierowym ręcznikiem laboratoryjnym (Kimwipe).
- Zatrzaśnij dwa metalowe zapięcia wokół szklanego szkiełka, jedno w kierunku końca kodu kreskowego, a drugie do tyłu. Krawędzie zatrzasków powinny chwytać plastikową klamrę przepływową pod chipem. Powtórz te czynności dla każdego chipa zanurzonego w PB1.
- Wyjmij gotowe zespoły przepływowe i umieść poziomo na stole. Uważaj, aby nie przechylić zestawu pionowo, pozwalając na ucieczkę płynu spod szklanego szkiełka. Jeśli na tacy do mycia czeka więcej wiórów, można je zmontować pod tym samym PB1. Jeśli inne chipy czekają w swoich oryginalnych komorach hyb, wylej cały płyn ze stanowiska montażowego i umyj naczynia, a następnie wróć do kroku 7.6.
- Gdy wszystkie wiórki perełkowe znajdą się w swoich zespołach przepływowych, weź nożyczki chirurgiczne i odetnij oba końce przekładki, jak najbliżej szkiełka podstawowego.
8. Barwienie i rozszerzanie
- Sprawdzić, czy stojak komory przepływowej osiągnął 44 °C w wielu pozycjach za pomocą sondy temperatury. Jeśli temperatura jest niższa o więcej niż pół stopnia, wyreguluj temperaturę łaźni wodnej.
- Umieść zespół przepływu wiórów koralików na stojaku komory, przesuwając zespół w dół i zaczepiając klamrę u góry. Tylna strona wióra koralika powinna dotykać stojaka komory. Szkiełko powinno być skierowane na zewnątrz, z rowkiem u góry, aby utworzyć zbiornik odczynnika. Powtórz tę czynność dla każdego zespołu wiórów ściegu.
- Za pomocą pipety o pojemności 200 μl dodaj 150 μl RA1 do zestawów przepływowych, dozując płyn do szklanego zbiornika. Inkubować przez 30 sek. Powtórzyć 5x.
- Za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl dodaj 450 μl XC1 do zestawów przepływowych, dozując płyn do szklanego zbiornika. Inkubować przez 10 minut.
- Dodaj 450 μl XC2 do zestawów przepływowych, dozując płyn do szklanego zbiornika. Inkubować przez 10 minut.
- Dodaj 200 μl TEM do zestawów przepływowych, dozując płyn do szklanego zbiornika. Inkubować przez 15 minut.
- Dodać 450 μl 95% mieszanki formamidu/EDTA do zestawów przepływowych, dozując płyn do szklanego zbiornika. Inkubować przez 1 min. Powtórzyć 1x.
- Inkubować zestawy przepływowe przez 5 minut.
- Ustaw gorącą łaźnię wodną na temperaturę podaną na rurkach STM (lub 37 °C, jeśli nie jest pokazana). Upewnij się, że każda rurka STM ma podaną tę samą temperaturę.
- Dodać 450 μl XC3 do zestawów przepływowych. Inkubować przez 1 min. Powtórzyć 1x.
- Gdy temperatura gorącej łaźni wodnej osiągnie żądaną temperaturę, dodać 250 μLSTM do zestawów przepływowych, dozując ciecz do szklanego zbiornika. Inkubować przez 10 minut.
- Dodać 450 μl XC3 do zestawów przepływowych, dozując płyn do szklanego zbiornika. Inkubować przez 1 min. Powtórzyć 1x.
- Inkubować zestawy przepływowe przez 5 minut.
- Dodaj 250 μl ATM do zestawów przepływowych, dozując płyn do szklanego zbiornika. Inkubować przez 10 minut.
- Dodać 450 μl XC3 do zestawów przepływowych, dozując płyn do szklanego zbiornika. Inkubować przez 1 min. Powtórzyć 1x.
- Inkubować zestawy przepływowe przez 5 minut.
- Dodać 250 μl STM do zestawów przepływowych, dozując płyn do szklanego zbiornika. Inkubować przez 10 minut.
- Dodać 4 50 μl XC3 do zespołów przepływowych, dozując ciecz do szklanego zbiornika. Inkubować przez 1 min. Powtórzyć 1x.
- Inkubować zestawy przepływowe przez 5 minut.
- Powtórz kroki od 8.14 do 8.19 1x.
- Wyjmij zespoły przepływowe ze stojaka studzienki i wyłącz łaźnię wodną.
9. Mycie i uszczelnianie
- Napełnij naczynie do mycia wiórów barwiących PB1 (około 315 ml). Potrzebne będą dwie pionowe naczynia do mycia i jedna pionowa taca na wióry z koralikami, a także co najmniej jeden kolektor próżniowy.
- Zdemontuj zespół przepływowy, wkładając cienki metalowy pręt między klamry a klamrę, a następnie obracając. Odłóż na bok szkiełko i usuń wiór koralika. Natychmiast umieść wiór koralika w pionowej tacce na wióry i zanurz w PB1. Powtórz tę czynność dla każdego zespołu przepływowego, uważając, aby każdy wiór ściegu był skierowany w tym samym kierunku i minimalizując ich narażenie na działanie powietrza.
- Delikatnie porusz tackę na wióry, aby usunąć bąbelki. Inkubować zanurzone wiórki kulek w PB1 przez 5 minut. Napełnij drugie pionowe naczynie do mycia maszyną XC4 przygotowaną poprzedniego dnia. Ponownie zamieszaj tackę na wióry koralików.
- Przenieś tackę na wióry z koralikami do naczynia do mycia wypełnionego XC4. Delikatnie porusz tackę, aby usunąć bąbelki. Inkubować przez 5 minut i ponownie zamieszać.
- Jednym płynnym ruchem wyciągnij tackę na wióry z naczynia do mycia i umieść na stojaku na probówki, tak aby koraliki na każdym wiórze kulki były skierowane do góry. Za pomocą pęsety samoblokującej wysuń wiórek koralika z tacki i umieść na stojaku na probówki. Powtórz tę czynność dla każdego wióra koralika.
- Ostrożnie przenieś stojak na probówki z wiórami do eksykatora próżniowego. Zamknij i włącz podciśnienie, upewniając się o odpowiednim uszczelnieniu. Inkubować przez 50-55 minut. W razie potrzeby rozgrzej skaner podczas inkubacji.
10. Skanowanie
- Wyłącz podciśnienie i powoli przywróć ciśnienie do atmosferycznego. Sprawdź, czy wiórki koralików są suche. W razie potrzeby wytrzyj krawędzie i spód chipa ręcznikiem papierowym, aby usunąć wszelkie płyny lub zanieczyszczenia.
- Aktywuj oprogramowanie skanujące i przenieś wióry koralików do tacy skanowania. Pobierz pliki dekodowania chipa (dmaps), aktywując oprogramowanie Decode File Client i wprowadzając żądane kody kreskowe chipów koralików wraz z odpowiadającymi im identyfikatorami pól. Niezeskanowane wióry koralików można bezpiecznie przechowywać w suchym, ciemnym miejscu do 72 godzin.
- Gdy chipy zostaną prawidłowo osadzone w tacy, a pliki dekodowane zostaną rozpoznane przez oprogramowanie, rozpocznij skanowanie.
Wyniki
Prawidłowo przetworzony chip z kuleczkami powinien podczas skanowania wykazywać jasną i wyraźną intensywność czerwonego i zielonego światła laserowego. Na Ryc. 6 oprogramowanie skanujące iScan wyświetla standardową próbkę genomowego DNA pomyślnie zhybrydyzowaną z niestandardowym panelem matrycy do genotypowania SNP. Nukleotydy znakowane, które zostały przyłączone podczas etapów elongacji i barwienia, fluorescują pod wpływem światła dwóch laserów. Ponieważ nukleotydy te selektywnie wydłużają łańcuch oligonukleotydowy kuleczki zhybrydyzowany z fragmentem nici DNA, a łańcuchy oligonukleotydowe są zaprojektowane tak, aby kończyć się w miejscu wariantu, kolor i intensywność otrzymanego sygnału mogą być wykorzystane do określenia alleli obecnych w miejscu SNP.
Aby zaimportować pliki wyjściowe ze skanera do oprogramowania analitycznego GenomeStudio, niezbędne są dwa elementy: przygotowany przez użytkownika arkusz próbek, który przypisuje identyfikatory próbek oraz informacje kliniczne do chipID i pozycji, a także specyficzny dla danej macierzy manifest SNP, uzyskany bezpośrednio od producenta. Przykładowe arkusze próbek można znaleźć na stronie internetowej firmy. Po utworzeniu projektu w GenomeStudio genotypy można uzyskać z wynikowych klastrów intensywności generowanych automatycznie przez oprogramowanie. Choć dostępnych jest wiele opcji wyświetlania, domyślny widok, Norm-R (znormalizowana wartość intensywności) względem Norm-Theta (stosunek intensywności alleli), jest często najłatwiejszym wykresem do rozróżnienia trzech odrębnych klastrów. Większość SNP powinna wykazywać jeden, dwa lub trzy klastry, w zależności od częstości występowania rzadkiego allela.
Trzy skupienia reprezentują próbki wykazujące allele AA, AB lub BB (patrz Rysunek 7). Genotypy tych skupień można przypisać poprzez import szablonu pozycji skupień bezpośrednio od producenta, wybranie opcji „Cluster All SNPs” z paska narzędzi analizy oprogramowania lub poprzez klikanie i przeciąganie kolorowych kół na wykresach intensywności w celu ręcznej edycji wyników. Kolor próbki na wykresie intensywności (czerwony, fioletowy lub niebieski) wskazuje przypisany genotyp (odpowiednio AA, AB lub BB); kolor czarny oznacza brak przypisania. Przeglądając listę SNP w panelu Full Data oprogramowania, można wyświetlić lub przywołać skupienia dla każdego SNP. Po przypisaniu satysfakcjonujących wyników dla skupień, panel Full Data oprogramowania wyświetla genotypy dla każdej poszczególnej próbki w każdym konkretnym SNP. Opcja Column Chooser nad tabelą pozwala na przełączanie formatów danych.
Dane można eksportować za pomocą paska narzędzi Analysis lub bezpośrednio z tabeli Full Data w celu przeprowadzenia szczegółowej analizy.
Rysunek 1. Przegląd – Protokół analizy Infinium. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.
Rysunek 2. Kompletna podstawa i mata komory Hyb wraz z pokrywą.[12] Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększony obraz.
Rysunek 3. Załadowanie Beadchipu – Nanieś próbkę na porty wlotowe.[12] Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.
Rycina 4. Usuwanie folii ochronnej Beadchip – Chwyć folię za róg i delikatnie odklej ją po przekątnej.[12] Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.
Rysunek 5. Kompletny zespół przepływowy Beadchip – BeadChip jest oddzielony od szkiełka przedmiotowego za pomocą dystansera i połączony za pomocą zacisków. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.
Rysunek 6. Prawidłowy skan BeadChip – A) BeadChip jest skanowany za pomocą lasera czerwonego i zielonego; oprogramowanie skanujące wyświetla oba obrazy jednocześnie. Sekcje przechodzące kontrolę jakości (QC) intensywności zostaną podświetlone na zielono na wyświetlaczu BeadChip po lewej stronie. Sekcje nieprzechodzące kontroli jakości intensywności zostaną podświetlone na czerwono. B) Po zakończeniu skanowania oprogramowanie nałoży na siebie obrazy czerwony i zielony. Przedstawiono powiększony obraz. Kolor i intensywność każdego pojedynczego koralika (bead) wskazują obecny allel. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.
Rycina 7. Profile skupień SNP NORM-R vs. NORM-THETA – A) Prawidłowy SNP z trzema wyraźnymi skupieniami reprezentującymi genotypy AA, AB i BB, oznaczone kolorami czerwonym, fioletowym i niebieskim. B) SNP wymagający edycji. Środkowe skupienie, które powinno być homozygotyczne AB, pozostało nieprzypisane. Skupienie BB zostało błędnie przypisane jako AB. C) SNP o słabej wydajności. Z tego wykresu intensywności nie można uzyskać żadnych genotypów, ponieważ nie istnieją wyraźne skupienia. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.
Dyskusja
Zastosowania genotypowania na dużą skalę wykorzystano do lepszego zrozumienia mechanizmu genetycznego leżącego u podstaw wielu chorób u ludzi. Odkrycie dowolnego znaczącego wariantu poprzez analizę asocjacyjną całego genomu może oznaczyć region kandydujący do dalszych badań. Ponadto dane genotypowe są dobrym narzędziem do kontroli jakości w projektach sekwencjonowania.
Aby zmaksymalizować przepustowość próbki, wiele płytek z próbkami może być amplifikowanych i przechowywanych w stanie rozdrobnionym, ponownie zawieszonym. Osiem płytek może zostać wzmocnionych w ciągu jednego dnia, łącząc pierwsze 24 godziny protokołu dla wielu partii i zapewniając wystarczającą ilość materiału na ~2-8 dni obróbki chipów. Jeśli amplifikowane płytki są wcześniej składowane, a nowe próbki są hybrydyzowane z wiórami natychmiast po rozpoczęciu skanowania w poprzednim przebiegu, przetwarzanie może przebiegać w sposób ciągły bez konieczności robienia przerw w celu dodatkowego przygotowania próbki. W związku z tym, chociaż próbki będą potrzebowały trzech dni, aby przejść pełne testy, dane mogą być generowane codziennie. Zakładając, że codziennie przetwarzane są 24 chipy, 5-dniowy tydzień pracy pozwala na przeprowadzenie ponad 1,000 próbek DNA na 12-próbkowym chipie kulkowym. Jeśli jednak którykolwiek z etapów lub odczynników nie powiedzie się, wiele partii może być zagrożonych niską wydajnością, zanim będzie można zastosować jakąkolwiek korektę. Błędy mogą umknąć uwadze, dopóki tablice nie zostaną przeskanowane lub przeanalizowane; W związku z tym, jeśli przepustowość zostanie zmaksymalizowana, setki próbek na różnych etapach protokołu mogą już zostać poddane tej samej wadliwej obróbce w momencie wykrycia. Ponieważ utraconych odczynników i danych nie można odzyskać, użytkownik musi rozważyć te zagrożenia w stosunku do potrzeby przyspieszenia przepływu pracy.
Oprogramowanie analityczne GenomeStudio jest pierwszą szansą, aby naprawdę ocenić sukces procesu genotypowania. Jeśli wykresy intensywności Norm-R i Norm-Theta są prawidłowo zgrupowane, średnia częstotliwość wywołań (procent wszystkich pomyślnie wpisanych SNP) próbek powinna zbliżyć się do 99%, chociaż wartość ta różni się nieznacznie w zależności od typu tablicy. Dane z dowolnej próby, w której współczynnik połączeń jest niższy niż 85-90%, nie są wiarygodne i należy je odrzucić. Do celów kontroli jakości, wyniki powinny być porównywane z dowolnymi wcześniej znanymi genotypami, gdy tylko jest to możliwe. Jeśli takie dane nie istnieją, celowe powielanie próbek jest użytecznym narzędziem do weryfikacji rozmieszczenia płyt lub tablic. Te zduplikowane pary należy umieścić na oddzielnych chipach, płytach, partiach lub projektach; Ich genotypy sprawdzane są przy porodzie. Podczas gdy specyficzne ograniczenia QC różnią się w zależności od preferencji badacza, powszechne ograniczenia SNP opierają się na powodzeniu połączenia próby, równowadze Hardy'ego-Weinberga lub brakach między przypadkami a kontrolami, podczas gdy wspólne ograniczenia próby opierają się na wskaźnikach połączeń, niespójnościach Mendla lub odniesieniach heterozygotyczności chromosomu X do klinicznych danych dotyczących płci [13].
Jeśli pojawi się jakikolwiek problem, Pulpit Kontrolny, znajdujący się w pakiecie analiz, może zostać przesłany do firmy w celu ustalenia przyczyny. Te kontrole mogą często zawęzić problem do najbardziej prawdopodobnego kroku lub awarii odczynnika. Jeśli w eksperymencie genotypowania Infinium zostaną znalezione jakiekolwiek interesujące SNP, ich wykresy intensywności powinny zostać dwukrotnie sprawdzone w GenomeStudio pod kątem błędów grupowania przed przeprowadzeniem dalszych badań.
Nieudany eksperyment z genotypowaniem Infinium jest prawdopodobnie spowodowany błędem przetwarzania przez człowieka lub niską jakością wejściowego DNA. Kwantyfikacja próbki musi być dokładna i precyzyjna. Aby uzyskać najlepsze wyniki, wszelkie odczynniki dodane do dowolnej próbki lub chipa muszą być dozowane w objętości ustalonej w protokole. Pipety muszą być odpowiednio skalibrowane. Odczynników nie należy uruchamiać po upływie terminu ważności i nie należy ich ponownie zamrażać po rozmrożeniu, z wyjątkiem odczynnika RA1. W celu zminimalizowania ewentualnych błędów barwienia i przedłużania, mieszaninę formamidu/EDTA należy przygotowywać świeżą co miesiąc. Wszystkie odczynniki o temperaturze -20 °C należy przechowywać wyłącznie w zamrażarkach z ręcznym rozmrażaniem. Wszystkie materiały laboratoryjne używane w częściach protokołu do barwienia, przedłużania i mycia należy dokładnie spłukać wodą i łagodnym detergentem natychmiast po nieużyciu. Zbiorniki nawilżające w komorze hyb należy wyszorować szczotką do probówki i łagodnym detergentem. Szkiełka należy myć 10% wybielaczem, zgodnie z instrukcją obsługi, raz w tygodniu.
Oświadczenia
Autorzy tego artykułu nie mają żadnych konkurencyjnych interesów finansowych do ujawnienia.
Podziękowania
Finansowanie tej pracy zostało zapewnione przez NIH P20 GM103456, NIH RC2 AR058959 i NIH R56 AI063274
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Materiały eksploatacyjne lub sprzęt | Producent | Numer części | Minimum wymagane dla 96 próbek |
| 0,8 ml Płytka głębinowa | Thermo Scientific | AB-0765 | 1 |
| Mata talerzowa | Thermo Scientific | AB-0674 | 2 |
| Basen odczynników | Fisher Scientific | 13-681-502 | 9 |
| Arkusze termozgrzewalne | Thermo Scientific | AB-0559 | 1 |
| Przekładka przepływowa | Fisher Scientific | NC9563984 | 6 |
| Końcówki do pipet - 200 μ l | Końcówki | Rainin GP-L200F | 192 |
| - 10 μ l | Rainin | GP-L10F | 16 |
| końcówek do pipet - 1 000 μ l | Rainin | GP-L1000F | 16 |
| Bufor zawiesinowy DNA | Teknova | T0220 | 0,5 ml |
| 0,1 N NaOH | Fisher Scientific | AC12419-0010 | 0,5 ml |
| Izopropanol (klasa HPLC) | Fisher Scientific | A451 | 15 ml |
| etanolu (200-proof) | Sigma-Aldrich | 459836 | 330 ml |
| formamidu (100%) | Thomas Scientific | C001K38 | 15 ml |
| EDTA (0,5 M) | Amresco | E177 | 0,2 ml |
| 10 μ l Pipeta 8-kanałowa | Rainin | L8-10XLS | 1 |
| 200 μ l Pipeta 8-kanałowa | Rainin | L8-200XLS | 2 |
| 1,000 μ l Pipeta jednokanałowa | Rainin | L-1000XLS | 1 |
| Wytrząsarka do mikropłytek | VWR | 13500-890 | 1 |
| Wirówka do mikropłytek z chłodzeniem | VWR | BK369434 | 1 |
| Piec do hybrydyzacji | Illumina | SE-901-1001 | 1 |
| Inkubator do mikropróbek Hybex | SciGene | 1057-30-0 | 1 |
| Wkładka | bloku ciepła Hybex MIDIIllumina | BD-60-601 | 1 |
| Zgrzewarka | Thermo Scientific | AB-0384 | 1 |
| Komora Hyb z wkładką i matą | Illumina | BD-60-402 | 2 |
| Nożyczki chirurgiczne | Fisher Scientific | 13-804-20 | 1 |
| Przepływowe części | montażowe Illumina | WG-10-202 | 8 |
| Kosz i naczynie do mycia | Illumina | BD-60-450 | 1 |
| Genepaint Stojak na komorę | Tecan | 760-800 | 1 |
| Sonda temperatury | Illumina | A1-99-109 | 1 |
| Stojak do barwienia i naczynie | Illumina | WG-10-207 | 1 |
| Pęseta samozamykająca | Ted Pella, Inc | 5374-NM | 1 |
| Kolektor próżniowy | Ted Pella, Inc | 2240 | 1 |
| iScan lub HiScan | Illumina | - | 1 |
Bibliografia
- Shi, M. M. Enabling large-scale pharmacogenetic studies by high-throughput mutation detection and genotyping technologies. Clin. Chem. 47 (2), 164-172 (2001).
- Livak, K. J. SNP genotyping by the 5'-nuclease reaction. Methods Mol. Biol. 212, 129-148 (2003).
- Seeb, J. E., Pascal, C. E., Ramakrishnan, R., Seeb, L. W. SNP genotyping by the 5'-nuclease reaction: advances in high throughput genotyping with non-model organisms. Methods in Mol. Biol. 578, 277-292 (2009).
- Bayés, M., Gut, I. G. Overview of Genotyping. Molecular Analysis and Genome Discovery. ed, , 2nd, John Wiley & Sons, Ltd. Chichester, UK. 1-23 (2011).
- Lee, Y., Seifert, S. N., Fornadel, C. M., Norris, D. E., Lanzaro, G. C. Single-Nucleotide Polymorphisms for High-Throughput Genotyping of Anopheles arabiensis in East and Southern Africa. J. Med. Entomol. 49 (2), 307-315 (2012).
- Liu, Z. SNP Genotyping Platforms. Next generation sequencing and whole genome selection in aquaculture. , Wiley-Blackwell. 123-132 (2011).
- Shen, R., Fan, J. B., et al. High-throughput SNP genotyping on universal bead arrays. Mutat. Res./Fundam and Mol. Mech. of Mutagenesis. 573 (1), 70-82 (2005).
- Ragoussis, J. Genotyping technologies for all. Drug Discov. Today: Technol. 3 (2), 115-122 (2006).
- Wu, C. C., Shete, S., Jo, E. J., et al. Whole-Genome Detection of Disease-Associated Deletions or Excess Homozygosity in a Case-Control Study of Rheumatoid Arthritis. Hum. Mol. Genet. , (2012).
- Green, E. K., Hamshere, M., Forty, L., et al. Replication of bipolar disorder susceptibility alleles and identification of two novel genome-wide significant associations in a new bipolar disorder case-control sample. Mol. Psychiatry. , (2012).
- Shete, S., Hosking, F. J., Robertson, L. B., et al. Genome-wide association study identifies five susceptibility loci for glioma. Nat. Genet. 41 (8), 899-904 (2009).
- Inc Illumina. Infinium HD Ultra User Guide 11328087 RevB-1. , 15-101 (2009).
- Turner, S., Armstrong, L. orenL., Yuki Bradford,, et al. Quality Control Procedures for Genome Wide Association Studies. Curr Protoc Hum Genet. , 1-19 (2011).
Przedruki i uprawnienia
