Szybki protokół przygotowania elektrokompetentnych Escherichia coli i Vibrio cholerae

Podsumowanie

Elektroporacja jest powszechnie stosowaną metodą wprowadzania DNA do bakterii w procesie znanym jako transformacja. Tradycyjne protokoły przygotowania ogniw elektrokompetentnych są czasochłonne i pracochłonne. W artykule opisano alternatywną, szybką i wydajną metodę przygotowania ogniw elektrokompetentnych, obecnie stosowaną przez niektóre laboratoria.

Streszczenie

Elektroporacja stała się powszechnie stosowaną metodą szybkiego i efektywnego wprowadzania obcego DNA do szerokiej gamy komórek. Elektrotransformacja stała się metodą z wyboru do wprowadzania DNA do prokariontów, które nie są naturalnie kompetentne. Elektroporacja to szybka, wydajna i usprawniona metoda transformacji, która oprócz oczyszczonego DNA i kompetentnych bakterii wymaga dostępnego na rynku kontrolera impulsów genowych i kuwet. W przeciwieństwie do etapu pulsacyjnego, przygotowanie elektrokompetentnych komórek jest czasochłonne i pracochłonne, obejmujące wielokrotne rundy wirowania i mycie w zmniejszających się ilościach sterylnych, zimnych lub niejonowych dużych ilości kultur wyhodowanych do środkowej logarytmicznej fazy wzrostu. Można zaoszczędzić czas i wysiłek, kupując elektrokompetentne ogniwa ze źródeł komercyjnych, ale wybór jest ograniczony do powszechnie stosowanych szczepów laboratoryjnych E. coli. Niniejszym rozpowszechniamy szybką i skuteczną metodę przygotowania elektrokompetentnej E. coli, która jest od pewnego czasu stosowana przez laboratoria bakteriologiczne, może być dostosowana do V. cholerae i innych prokariontów. Chociaż nie możemy ustalić, komu należy przypisać opracowanie oryginalnej techniki, niniejszym udostępniamy ją społeczności naukowej.

Wprowadzenie

Od momentu powstania na początku lat 80-tych¹, elektroporacja stała się integralną techniką biologii molekularnej, prawdopodobnie najpowszechniejszą metodą stosowaną do transformacji/transfekcji żywych komórek za pomocą cyrkularnych lub liniowych kwasów nukleinowych. Pierwotnie opracowana do transfekcji komórek eukariotycznych¹, elektroporacja została następnie przystosowana do transformacji E. coli^{2, 3}. W bakteriologii elektroporacja stała się standardem laboratoryjnym i została zmodyfikowana w celu przekształcenia szerokiej gamy bakterii, w tym Gram-ujemnych Pseudomonas⁴, Salmonellae⁵, Vibrios⁶, Serratiae i Shigellae⁷; Gram-dodatnie Clostridia⁸, Pałeczki kwasu mlekowego 9, Pałeczki kwasu mlekowego¹⁰ i Enterokoki¹¹. Nawet niektóre archebakterie okazały się podatne na transformację przez elektroporację, w tym gatunki Methanococci¹² i Sulfolobus ¹³. Wyczerpujący przegląd można znaleźć w Aune i Aachmann¹⁴. Wydajność przemiany przez elektroporację jest podobno 10-20 razy wyższa niż w przypadku kompetencji chemicznej lub szoku cieplnego². Jednak, podobnie jak przygotowanie bakterii do kompetencji chemicznych, jak to zoptymalizował Douglas Hanahan w latach 80. XX wieku^, ogniwa muszą być również przygotowane do bycia elektrokompetentnymi.

Elektroporacja to szybki i skuteczny sposób transformacji bakterii, wymagający elektrokompetentnych bakterii, oczyszczonego DNA, modułu sterującego impulsami, który dostarcza impuls elektryczny, oraz komory, która mieści małe jednorazowe kuwety, które działają jako elektroda. Krótko mówiąc, zimne, kompetentne bakterie miesza się z plazmidowym DNA, poddaje impulsowi wysokiego napięcia w kuwecie, ponownie zawiesza w pożywce wzrostowej, inkubuje w temperaturze 30-37 °C przez 30-45 minut, a następnie posiewa na półstałym podłożu (pożywkowe płytki agarowe) z odpowiednim selektywnym antybiotykiem.

W przeciwieństwie do etapu pulsacji, przygotowanie elektrokompetentnych bakterii E. coli pozostaje wieloetapową procedurą, która tradycyjnie przeprowadzana jest w dużych ilościach. Krótko mówiąc, nocną hodowlę bakterii zaszczepia się w kolbie Erlenmeyera ze 100 ml do 1 l bulionu Luria (LB), hoduje do środkowej logarytmicznej fazy wzrostu (OD₆₀₀ z <1,0) i poddaje się seryjnemu płukaniu sterylnym buforem niejonowym lub wodą podwójnie destylowaną (ddH₂O) w zmniejszających się objętościach w temperaturze 4 °C. Należy zachować dużą ostrożność, aby komórki były zimne przez cały czas trwania zabiegu i nie dopuścić do zanieczyszczenia. Wymaga to użycia autoklawowanych wiader wirujących i niejonowych lub ddH₂O, inkubatora z wytrząsarką orbitalną, wirówki z chłodzeniem o dużej objętości o dużej pojemności oraz zestawu wirników. Bakterie są ostatecznie zawieszane w małej objętości buforu uzupełnionego 10% glicerolem i podzielone na objętości ~40 μl, które są przechowywane w temperaturze -80 °C do momentu użycia. Przechowywanie w niskiej temperaturze często skutkuje zmniejszeniem wydajności transformacji z powodu utraty rentowności w miarę upływu czasu.

Elektrokompetentne komórki bakteryjne są również dostępne z różnych komercyjnych źródeł, ale tylko dla ograniczonej liczby (często z niedoborem rekombinacji) szczepów E. coli, powszechnie wykorzystywanych jako gospodarze do rozmnażania szerokiej gamy plazmidów. W rezultacie, naukowcy polegają na własnych metodach, aby przygotować własne szczepy/mutanty do transformacji.

Alternatywny, szybki i skuteczny protokół przygotowania elektrokompetentnych bakterii E. coli jest używany przez kilka laboratoriów bakteriologii molekularnej już od jakiegoś czasu i został rozszerzony na dodatkowe bakterie Gram-ujemne, w naszym przypadku V. cholerae. Nie można zidentyfikować twórcy protokołu, ponieważ z biegiem czasu został on zoptymalizowany przez innych badaczy. Przedstawiona tutaj metoda jest stosowana w naszych laboratoriach od prawie dwóch dekad, a naszym celem jest podzielenie się tym użytecznym protokołem z naszymi rówieśnikami.

Protokół

1. Przygotowanie kultur bakteryjnych, narzędzi i odczynników (DZIEŃ 1, popołudnie)

1. Późnym popołudniem zaszczepić 1-5 ml autoklawowanego bulionu LB w sterylnych (na przykład 100 x 13 mm) probówkach ze szkła borokrzemianowego z niewielką ilością bakterii (E. coli lub V. cholerae).
2. Umieść zaszczepione probówki w bębnie rolkowym o temperaturze 37 °C (ciepłe pomieszczenie lub inkubator), włącz bęben rolkowy z dużą prędkością i inkubuj O/N.
3. Przygotuj rozsiewacz komórek w kształcie "kija hokejowego" ze szklanego pręta, podgrzewając środek pręta w płomieniu palnika Bunsena, aż szkło zmięknie, a następnie delikatnie skieruj zagięcie pęsetą lub szczypcami pod kątem 135°. Podgrzej pręt jeszcze raz w środkowym punkcie między końcem a pierwszym zgięciem i zegnij go pod kątem 45° do wewnątrz (w kierunku przeciwnym do pierwszego zagięcia).
4. Przygotować LB-agar bez antybiotyków i wlać na szalki Petriego w celu przygotowania protokołu elektrokompetencji oraz płytki LB-agar zawierające odpowiedni antybiotyk (zgodnie ze znacznikiem oporności na wektorze, który ma być elektroporowany) i przechowywać w temperaturze 4 °C.
5. Przygotować wysterylizowany przez filtr 2 mM roztwór CaCl₂ dla V. cholerae lub autoklaw ddH₂O dla E. coli i przechowywać w temperaturze 4 °C.

2. Wzrost bakterii elektrokompetentnych (DZIEŃ 2, rano)

1. Dostarczyć 100 μl kultury bakteryjnej O/N na każdą płytkę agarową LB, można również wykorzystać zamrożone zapasy glicerolu i dostarczyć je bezpośrednio na płytkę.
2. Zanurz rozsiewacz komórek w kształcie kija hokejowego w 100% EtOH, na krótko odcedź i spal pozostały EtOH, aby wysterylizować go przed użyciem i rozprowadzeniem. Rozprowadzić równomiernie 100 μl kultury bakteryjnej O/N za pomocą sterylnego rozsiewacza szklanych komórek, uważając, aby nie naruszyć (nie złamać) powierzchni agaru.
3. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 4-6 godzin lub do momentu, gdy na cienkim trawniku pojawi się rozrost bakterii. Komórki są najbardziej kompetentne, gdy aktywnie rosną.

3. Przygotowanie elektrokompetentnych komórek bakteryjnych (DZIEŃ 2, popołudnie)

1. Zbierz bakterie za pomocą sterylnej pętli zaszczepiającej, uważając, aby nie przebić ani nie złamać powierzchni agaru. Jedna masa bakteryjna o średnicy 2 mm wystarcza na pojedynczą przemianę. Zazwyczaj wymaga to dwukrotnego lub trzykrotnego zeskrobania powierzchni cienkiego trawnika za pomocą pętli zaszczepiającej. Z tej samej płytki można pobrać kilka próbek (zwykle od 4 do 6).
2. Zawiesić masę bakteryjną w 1 ml lodowatego 2 mM CaCl₂ (dla V. cholerae) lub sterylnego ddH₂O (dla E. coli) i dobrze wymieszać, aż nie będą widoczne grudki, trzymać na lodzie.
3. Odwirować każdą zawiesinę bakteryjną przez 5 minut przy 5 000 x g w mikrowirówce z chłodzeniem ustawionej na 4 °C lub w mikrowirówce przechowywanej w chłodni ustawionej na 4 °C.
4. Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić osad bakteryjny w tej samej objętości lodowato zimnego 2 mM CaCl₂ lub sterylnego ddH₂O i powtórzyć poprzednio poprzednio etap wirowania jeszcze dwa razy, w sumie trzy płukania.
5. Usunąć supernatant, zawiesić, a następnie dokładnie poluzować osad bakteryjny w 40 μl lodowatego 2 mM CaCl₂ lub sterylnym ddH₂O i trzymać na lodzie.

4. Transformacja bakterii elektrokompetentnych (DZIEŃ 2, popołudnie)

1. Dodać do 1 μg plazmidowego DNA (w maksymalnie 1 μl wody lub buforu Tris-EDTA) do 40 μl zawiesiny bakteryjnej i przenieść tę mieszaninę do wstępnie schłodzonej, sterylnej kuwety o szczelinie 0,2 cm. Stężenie soli w próbce DNA musi być niskie^a, ponieważ w następnym kroku przyczyni się to do wyładowania łukowego impulsu.
2. Włóż kuwetę do komory elektroporacyjnej modułu sterującego impulsami i elektroporuj przy napięciu 1.8 kV, 25 μF. Stała czasowa powinna wynosić ~5,0 ms i nie powinno wystąpić wyładowanie łukowe.
3. Szybko odzyskaj zawiesinę komórkową poprzez ponowne podpisanie w 1 ml bulionu LB i przeniesienie do wcześniej autoklawizowanej probówki ze szkła borokrzemianowego.
4. Pozostawić komórki do regeneracji poprzez inkubację w napowietrzonych warunkach wzrostu (w bębnie rolkowym) w temperaturze 37 °C przez 30 minut bez doboru antybiotyków.
5. Umieścić bakterie na uprzednio przygotowanych płytkach agarowych LB w obecności odpowiedniego środka selektywnego (antybiotyku) i inkubować w temperaturze 37 °C O/N. Jeśli bakterie są przekształcane za pomocą wysokiego stężenia oczyszczonego wektora (0,1-1 μg superskręconego plazmidu), należy dostarczyć 10 μl kultury bakteryjnej na krawędź płytki agarowej LB i ze sterylną smugą pętli inokulacyjnej dla izolowanych kolonii przy użyciu metody smug kwadrantowych. Jeśli mieszanina ligacji została przekształcona, dostarczyć 100 μl kultury bakteryjnej na każdą płytkę agarową i równomiernie rozprowadzić ją za pomocą wysterylizowanego rozsiewacza szklanych komórek.

^a Jeśli stała czasowa jest krótka (poniżej 3,5 ms), lub pulsowanie prowadzi do wyładowania łukowego, należy ponownie wyciąć próbkę DNA, przemyć dwukrotnie 70% EtOH w celu usunięcia soli przed wysuszeniem i ponownym zawieszeniem w buforze TE.

Wyniki

Przeprowadziliśmy zestaw transformacji z E. coli i V. cholerae, aby porównać efektywność transformacji naszej szybkiej metodologii z adaptacją (tradycyjnej) metody pierwotnie opisanej przez Dower et al.² do przygotowania bakterii elektrokompetentnych. Aby przeprowadzić tradycyjne przygotowanie kompetentnych komórek, 500 ml LB w kolbie 2 L-Erlenmeyera zaszczepiono 500 μl nocnej kultury E. coli DH5α lub V. cholerae O395, inkubowano w wytrząsarce orbitalnej (215 obr./min w 37 °C) i zebrano w temperaturze OD₆₀₀ między 0,5-1,0. Kolbę schładzano na lodzie, a kultury odwirowywano we wstępnie schłodzonym wirniku o sile 4 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Granulki komórkowe zostały dokładnie zawieszone w 500 ml lodowatego 2 mM CaCl₂ dla V. cholerae i ddH₂O dla E. coli i ponownie odwirowane w tych samych warunkach. Kolejne rundy ponownego zawieszania i wirowania przeprowadzano w zmniejszających się objętościach 200 i 100 ml, upewniając się, że kultura pozostaje schłodzona w temperaturze 4 °C. Na koniec przeprowadzono ponowne zawieszenie i odwirowanie w objętości 10 ml z 10% glicerolem. Końcowe osady zawieszono ponownie w 2 ml 10% glicerolu, a 40 μl podwielokrotności zamrożono w temperaturze -80 °C i przechowywano nie dłużej niż tydzień przed elektroporacją.

Warunki elektroporacji, w tym ustawienia impulsów i rozmiar kuwety, były identyczne dla obu gatunków bakterii we wszystkich elektroporacjach, niezależnie od metody przygotowania kompetentnych komórek. Jedyna różnica polegała na tym, że mycie przeprowadziliśmy w zimnym ddH₂O dla E. coli i zimnym 2 mM CaCl₂ dla V. cholerae. Tabela 1 przedstawia wyniki bakterii przekształconych przez elektroporację w identyczny sposób, ale uznanych za kompetentne w protokole szybkim lub w metodzie tradycyjnej. Użyliśmy szczepów O395 i DH5α jako powszechnie stosowanych, reprezentatywnych szczepów odpowiednio V. cholerae i E. coli; podobne wyniki można uzyskać z innymi szczepami tego samego gatunku (choć nie każdy pojedynczy szczep został przetestowany) i prawdopodobnie przystosowanymi do innych bakterii Gram-ujemnych i prawdopodobnie poza nimi.

Aby upewnić się, że w każdej partii pulsacyjnej występuje taka sama liczba komórek, elektrokompetentne bakterie wygenerowane metodą szybką zostały zebrane podczas zbierania, wymieszane, utrzymywane w stanie jednorodnego zawieszenia i podzielone na porcje w objętościach 40 μl na krótko przed elektroporacją. Bakterie elektrokompetentne wytworzone metodą tradycyjną potraktowano podobnie przed zamrożeniem w podwielokrotnościach o pojemności 40 μl. Po dostarczeniu impulsu, każda partia 40 μl elektroporowanych bakterii została zawieszona w 400 μl LB i seryjnie rozcieńczona w stosunku 1:10. Sto mikrolitrów każdego rozcieńczenia rozsiano na agarze LB w obecności 100 μg/ml ampicyliny i rozprowadzono za pomocą sterylnego rozsiewacza szklanych komórek i inkubowano w temperaturze 37 °C przez noc. Aby określić ilościowo całkowitą liczbę bakterii użytych w każdej transformacji, 40 μl objętości bakterii elektrokompetentnych z każdej przygotowanej partii zostało seryjnie rozcieńczonych i posianych na agarze LB bez antybiotyków identycznie równolegle. Jedna podwielokrotność jednakowo traktowanych bakterii z każdej partii została poddana elektroporacji 1 μl buforu Tris-EDTA (TE), ale bez DNA (pozorowana transformacja), seryjnie rozcieńczana i posiewana na agarze LB bez antybiotyków w celu oszacowania liczby komórek utraconych w wyniku dostarczenia impulsu elektrycznego. Na koniec przeprowadzono jedną dodatkową zmianę eksperymentu w celu określenia, czy 30-minutowa inkubacja w temperaturze 37 °C w 1 ml LB po elektroporacji, ale przed posiewem na LB-agarze wpłynie na regenerację przekształconych komórek. jednostki tworzące kolonie (CFU) zostały policzone następnego dnia.

Do tego eksperymentu użyliśmy pUC18, powszechnego plazmidu laboratoryjnego, oraz partii kompetentnych bakterii składających się z około 10⁸ CFU dla komórek przygotowanych metodą tradycyjną i 10⁷ CFU dla komórek przygotowanych przy użyciu protokołu szybkiego. Sama elektroporacja (bez DNA) zmniejszyła żywotne CFU od 10 do 100 razy, niezależnie od metody użytej do przygotowania elektrokompetentnych komórek. Jak pokazano w tabeli 1, wydajność transformantu mieściła się w zakresie 10⁶ -10⁷ CFU/μg DNA w trzech powtórzonych eksperymentach (odchylenia standardowe w nawiasach) odpowiednio dla E. coli (DH5α) i V. cholerae (O395) przy użyciu tradycyjnej, dłuższej metody przygotowania komórek elektrokompetentnych. Wydajność transformantu zmniejszyła się 10-krotnie do 10⁵ -10⁶ CFU/μg DNA w trzech powtórzonych eksperymentach (odchylenie standardowe w nawiasach) odpowiednio dla E. coli i V. cholerae przy użyciu metody szybkiej. Z tego powodu określiliśmy procent transformowanych bakterii, dzieląc przekształcone CFU przez liczbę CFU odzyskanych z "pozorowanych transformacji" (bez plazmidu) z identycznych partii kompetentnych komórek. Odsetek przekształconych bakterii mieścił się w obrębie jednego logarytmu (2,5-9,4%), niezależnie od metody przygotowania i przekształconych gatunków (tabela 1 w nawiasach kwadratowych). Wyniki te sugerują, że skuteczność szybkiej metody jest porównywalna z tradycyjną, dłuższą procedurą przygotowania kompetentnych komórek i że reprezentatywne szczepy Vibrio cholerae i Escherichia coli są równie podatne na szybką procedurę.

Stwierdziliśmy, że na efektywność transformacji, dla plazmidów takich jak pUC18 zawierających kasety β-laktamazy, nie ma wpływu 30-minutowy czas regeneracji w bulionie LB. Odzyskano taką samą liczbę transformantów, niezależnie od tego, czy komórki zostały posiane do agaru LB w obecności ampicyliny bezpośrednio, po elektroporacji, czy też pozostawiono im 30-45 minutowy czas odzyskiwania w bulionie LB w temperaturze 37 °C przed posiewem. Nasze odkrycia, że oporność na ampicylinę nie wymaga wzrostu w warunkach nieselektywnych, sugerują, że ekspresja β-laktamazy zachodzi wystarczająco szybko po transformacji. Należy jednak zauważyć, że przeprowadziliśmy seryjne rozcieńczenia bakterii pulsacyjnych w bulionie LB, co mogło przyczynić się do powrotu do zdrowia po porażeniu prądem elektrycznym i zainicjować ekspresję genów.

Rysunek 1. Graficzne przedstawienie metodyki szybkiego przygotowania bakterii elektrokompetentnych. Po 4-6 godzinach (w zależności od gęstości inokulu) można zebrać wystarczającą liczbę bakterii, aby przeprowadzić od czterech do sześciu przemian z jednej płytki agarowej LB. Aby zapewnić równą liczbę kompetentnych komórek dla każdej końcowej objętości do elektroporacji, bakterie zebrane z płytki agarowej LB zostały początkowo zebrane i przemyte razem, a następnie podzielone na objętości 40 μl w zależności od wielkości osadu (większe granulki rozcieńczano w większych objętościach podzielnych przez 40 μl).

Liczba odzyskanych transformantów odpornych na ampicylinę/μg DNA (odzyskane transformanty odporne na ampicylinę [%]) naprężać Metoda tradycyjna Szybka metoda E. coli (DH5α) 2.3 x 10⁶ (± 7.3 x 10⁵) [9.4%] 3 x 10⁶ (± 7,1 x 10⁵) [2,5%] V. cholerae (O395) 4 x 10⁷ (± 1,7 x 10⁷) [5%] 6.7 x 10⁵ (± 2.1 x 10⁵) [3.3%]

Tabela 1. Wydajność przemiany na mikrogram DNA (pUC18) bakterii elektrokompetentnych przygotowanych metodą tradycyjną w porównaniu z metodą szybką.

Wszystkie transformacje zostały przeprowadzone za pomocą 500 ng DNA pUC18 (~80% superskręconego DNA, co uwidoczniono za pomocą 1% elektroforezy w żelu agarozowym), a elektroporowane komórki zostały seryjnie rozcieńczone 10-krotnie w bulionie LB przed posiewem dla CFU na LB-agar z antybiotykami. Kontrole bakterii nienaelektryzowanych elektroporacją oraz bakterii elektroporowanych bez plazmidu, seryjnie rozcieńczanych i posiewanych na agarze LB bez antybiotyków przeprowadzono dla każdego zestawu przemian w celu określenia całkowitej liczby żywotnych bakterii przed i po pulsowaniu. Elektroporowane kontrole stanowiły linię bazową dla procentu żywych bakterii, które pomyślnie się przekształciły.

Dyskusja

Wydajność przemian zależy od wielu czynników, niezależnie od metody zastosowanej do przygotowania kompetentnych komórek. Analogiczne zmienne mają zastosowanie do tej metody; Należy dołożyć wszelkich starań, aby po pobraniu komórek z płytki agarowej utrzymać je w stałej niskiej temperaturze (nie wyższej niż 4 °C). Trawnik bakteryjny musi aktywnie rosnąć w momencie zbioru; Komórki muszą znajdować się w środkowej logarytmicznej fazie wzrostu. Jakość DNA (tj. zanieczyszczenie soli) wpływa na efektywność przemiany. W szczególności, przy stosowaniu tej metody, agar nie powinien być rozbijany, ponieważ fragmenty agaru w kuwecie spowodują wygięcie łukowe impulsu.

Większość problemów napotkanych podczas tej techniki wiąże się z dwoma kwestiami; Zbieranie bakterii w odpowiednim oknie czasowym z płytki agarowej, gdy aktywnie rosną. Zebranie ich zbyt wcześnie spowoduje niewystarczającą liczbę komórek i sprawi, że zeskrobywanie płytki agarowej LB będzie frustrujące, ponieważ tworzona przez nie "błonka" jest trudna do podniesienia z powierzchni płytki. Zbyt późne zbieranie bakterii drastycznie obniży ich kompetencje. Okno czasowe będzie się naturalnie różnić w zależności od gęstości inokulum posianego na płytkach agarowych LB. Drugim krytycznym krokiem jest utrzymywanie bakterii w niskiej temperaturze (4 °C) od momentu ich zdjęcia z płytki agarowej i ponownego zawieszenia w CaCl₂ lub ddH₂O, aż do momentu ich posiewu na agarze LB po przemianie. Probówki do mikrofuge zawierające bakterie, kuwety i bufor powinny być wstępnie schłodzone i trzymane na lodzie przez cały czas, aż bakterie zostaną platerowane. Jednak dodatkowe problemy mogą się pojawić, gdy sterylne ddH₂O lub CaCl₂ zawierają osad lub są zanieczyszczone. Z tego powodu zalecamy przygotowanie tego odczynnika na świeżo.

Rozwiązywanie problemów z transformacją jest ułatwione dzięki włączeniu kontroli podczas przekształcania bakterii, które stają się kompetentne dowolną metodą. Kontrola ujemna składająca się z partii nieprzekształconych kompetentnych bakterii posianych na płytce agarowej LB zawierającej marker selektywny szybko pomoże określić, czy antybiotyk na płytce jest skuteczny. Transformacja kontroli pozytywnej ze znanym preparatem plazmidowym dobrej jakości i w ilości, zawierającym ten sam marker selektywny co próbka doświadczalna, będzie pomocna w ustaleniu, czy bakterie są kompetentne, ale także czy przekształcone eksperymentalne DNA było wystarczające pod względem ilości lub jakości.

Zalety tej techniki są wielorakie; Metoda może być przeprowadzona w tym samym dniu, w którym planowana jest transformacja. Odkryliśmy, że zamrożony bakteryjny materiał glicerolowy można posiewać bezpośrednio na agarze LB bez utraty kompetencji elektrycznych; Robiliśmy to w sytuacjach "awaryjnych" (po tym, jak zapomnieliśmy uruchomić nocny posiew dzień wcześniej). Chociaż nie udało nam się przetestować każdego znanego szczepu, każdy szczep E. coli lub V. cholerae , który można przekształcić za pomocą elektroporacji, był podatny na ten protokół w naszych rękach. Technika ta jest szybka, skuteczna i zapewnia wydajność transformacji porównywalną z uzyskaną przy wytwarzaniu bakterii elektrokompetentnych przy użyciu tradycyjnych metod. Metoda ta eliminuje konieczność stosowania wirówki o dużej prędkości i związanych z nią wirników, wytrząsarki inkubatora orbitalnego i sterylnych wiader (pojemników) wirówek oraz dużych objętości autoklawowanego buforu. Chociaż Tabela Specyficznych Odczynników i Sprzętu jest dość obszerna, większość laboratoriów przeprowadzających elektroporację będzie miała większość, jeśli nie wszystkie, tych materiałów już dostępnych. Być może najważniejsze jest to, że technika ta może być łatwo zastosowana do szybkiego generowania elektrokompetentnych szczepów specyficznych dla laboratorium ze zmutowanym tłem. Nie zdajemy sobie sprawy z żadnych ograniczeń tej techniki, ponieważ zastąpiła ona tradycyjną metodę otrzymywania bakterii elektrokompetentnych w naszych laboratoriach.

Przedstawione tutaj wyniki naszych eksperymentów zostały przeprowadzone na świeżych ogniwach elektrokompetentnych wyprodukowanych tradycyjną metodą, które były przechowywane w temperaturze -80 °C nie dłużej niż 1 tydzień. Jednak zamrożone zapasy ogniw elektrokompetentnych tracą kompetencje i/lub rentowność przez dłuższy okres przechowywania. Nasz skrócony protokół pozwala na przygotowanie świeżych ogniw elektrokompetentnych tego samego dnia, w którym planowana jest transformacja, bez obaw o wiek stada, co może skutkować zmniejszoną wydajnością transformatora. Nie podjęliśmy prób przechowywania elektrokompetentnych ogniw wyprodukowanych metodą szybką do wykorzystania w innym dniu, ponieważ nie było to konieczne.

Chociaż nie zostało to tutaj pokazane, wydajność elektrokompetentnych ogniw przygotowanych przy użyciu naszej szybkiej metody jest wystarczająca dla mieszanin ligacyjnych. Przemiany opisane dla V . cholerae nie-O1 w niedawnym artykule Unterweger i wsp.¹⁷ przeprowadzono przy użyciu bakterii elektrokompetentnych przygotowanych metodą opisaną tutaj (z wyjątkiem tych przeprowadzonych metodą koniugacji). Technika ta pozwala naukowcom na szybkie i skuteczne przekształcanie szczepów ze zmutowanym tłem bez konieczności przygotowywania dużych partii komórek. Ta metoda szybkiego przygotowania bakterii elektrokompetentnych może być dostosowana do innych prokariontów, które okazały się podatne na elektroporację, ponieważ zasada przygotowania i ustawienia elektroporacji będą takie same, jak w tradycyjnych protokołach.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Moduł Gene Pulser	Bio-Rad	165-2668
Komora kuwety Gene Pulser	Bio-Rad	165-2669
Kuwety elektryczne (odstęp 0,2 cm)	Bio-Rad	165-2082
13 x 100 mm Rurki hodowlane Pyrex bez kołnierza	Corning	70820-13 13
mm Zamknięcia probówek hodowlanych	Cole Parmer	EW-04500-00
6 x Pręt szklany 250 mm	Lab Source	11381D
Jednorazowe szalki Petriego	Fisher Scientific	08-757-12
Zespół bębna rolkowego	New Brunswick Scientific	M1053-4004
Bęben rolkowy do probówek hodowlanych 13 x 100 mm	New Brunswick Scientific	M1053-0306
Chlorek wapnia	Sigma Chemicals	C5670
Etanol, bezwodny/denaturowany	Sigma Chemicals	227649
Pętla inokulacyjna	Decon Labs	MP182-5
Mikrowirówka z chłodzeniem 5451 R	Eppendorf	22621425
Palnik Bunsena	Fisher Scientific	03-917Q
LB Rosół MILLER	EMD	1.10285.0500
Bakteriologiczny agar	Fisher Naukowy	S25127