Elektroporacja jest powszechnie stosowaną metodą wprowadzania DNA do bakterii w procesie znanym jako transformacja. Tradycyjne protokoły przygotowania ogniw elektrokompetentnych są czasochłonne i pracochłonne. W artykule opisano alternatywną, szybką i wydajną metodę przygotowania ogniw elektrokompetentnych, obecnie stosowaną przez niektóre laboratoria.
Artykuł metodologiczny
Szybki protokół przygotowania elektrokompetentnych Escherichia coli i Vibrio cholerae
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Elektroporacja stała się powszechnie stosowaną metodą szybkiego i efektywnego wprowadzania obcego DNA do szerokiej gamy komórek. Elektrotransformacja stała się metodą z wyboru do wprowadzania DNA do prokariontów, które nie są naturalnie kompetentne. Elektroporacja to szybka, wydajna i usprawniona metoda transformacji, która oprócz oczyszczonego DNA i kompetentnych bakterii wymaga dostępnego na rynku kontrolera impulsów genowych i kuwet. W przeciwieństwie do etapu pulsacyjnego, przygotowanie elektrokompetentnych komórek jest czasochłonne i pracochłonne, obejmujące wielokrotne rundy wirowania i mycie w zmniejszających się ilościach sterylnych, zimnych lub niejonowych dużych ilości kultur wyhodowanych do środkowej logarytmicznej fazy wzrostu. Można zaoszczędzić czas i wysiłek, kupując elektrokompetentne ogniwa ze źródeł komercyjnych, ale wybór jest ograniczony do powszechnie stosowanych szczepów laboratoryjnych E. coli. Niniejszym rozpowszechniamy szybką i skuteczną metodę przygotowania elektrokompetentnej E. coli, która jest od pewnego czasu stosowana przez laboratoria bakteriologiczne, może być dostosowana do V. cholerae i innych prokariontów. Chociaż nie możemy ustalić, komu należy przypisać opracowanie oryginalnej techniki, niniejszym udostępniamy ją społeczności naukowej.
Wprowadzenie
Od momentu powstania na początku lat 80-tych1, elektroporacja stała się integralną techniką biologii molekularnej, prawdopodobnie najpowszechniejszą metodą stosowaną do transformacji/transfekcji żywych komórek za pomocą cyrkularnych lub liniowych kwasów nukleinowych. Pierwotnie opracowana do transfekcji komórek eukariotycznych1, elektroporacja została następnie przystosowana do transformacji E. coli2, 3. W bakteriologii elektroporacja stała się standardem laboratoryjnym i została zmodyfikowana w celu przekształcenia szerokiej gamy bakterii, w tym Gram-ujemnych Pseudomonas4, Salmonellae5, Vibrios6, Serratiae i Shigellae7; Gram-dodatnie Clostridia8, Pałeczki kwasu mlekowego 9, Pałeczki kwasu mlekowego10 i Enterokoki11. Nawet niektóre archebakterie okazały się podatne na transformację przez elektroporację, w tym gatunki Methanococci12 i Sulfolobus 13. Wyczerpujący przegląd można znaleźć w Aune i Aachmann14. Wydajność przemiany przez elektroporację jest podobno 10-20 razy wyższa niż w przypadku kompetencji chemicznej lub szoku cieplnego2. Jednak, podobnie jak przygotowanie bakterii do kompetencji chemicznych, jak to zoptymalizował Douglas Hanahan w latach 80. XX wieku, ogniwa muszą być również przygotowane do bycia elektrokompetentnymi.
Elektroporacja to szybki i skuteczny sposób transformacji bakterii, wymagający elektrokompetentnych bakterii, oczyszczonego DNA, modułu sterującego impulsami, który dostarcza impuls elektryczny, oraz komory, która mieści małe jednorazowe kuwety, które działają jako elektroda. Krótko mówiąc, zimne, kompetentne bakterie miesza się z plazmidowym DNA, poddaje impulsowi wysokiego napięcia w kuwecie, ponownie zawiesza w pożywce wzrostowej, inkubuje w temperaturze 30-37 °C przez 30-45 minut, a następnie posiewa na półstałym podłożu (pożywkowe płytki agarowe) z odpowiednim selektywnym antybiotykiem.
W przeciwieństwie do etapu pulsacji, przygotowanie elektrokompetentnych bakterii E. coli pozostaje wieloetapową procedurą, która tradycyjnie przeprowadzana jest w dużych ilościach. Krótko mówiąc, nocną hodowlę bakterii zaszczepia się w kolbie Erlenmeyera ze 100 ml do 1 l bulionu Luria (LB), hoduje do środkowej logarytmicznej fazy wzrostu (OD600 z <1,0) i poddaje się seryjnemu płukaniu sterylnym buforem niejonowym lub wodą podwójnie destylowaną (ddH2O) w zmniejszających się objętościach w temperaturze 4 °C. Należy zachować dużą ostrożność, aby komórki były zimne przez cały czas trwania zabiegu i nie dopuścić do zanieczyszczenia. Wymaga to użycia autoklawowanych wiader wirujących i niejonowych lub ddH2O, inkubatora z wytrząsarką orbitalną, wirówki z chłodzeniem o dużej objętości o dużej pojemności oraz zestawu wirników. Bakterie są ostatecznie zawieszane w małej objętości buforu uzupełnionego 10% glicerolem i podzielone na objętości ~40 μl, które są przechowywane w temperaturze -80 °C do momentu użycia. Przechowywanie w niskiej temperaturze często skutkuje zmniejszeniem wydajności transformacji z powodu utraty rentowności w miarę upływu czasu.
Elektrokompetentne komórki bakteryjne są również dostępne z różnych komercyjnych źródeł, ale tylko dla ograniczonej liczby (często z niedoborem rekombinacji) szczepów E. coli, powszechnie wykorzystywanych jako gospodarze do rozmnażania szerokiej gamy plazmidów. W rezultacie, naukowcy polegają na własnych metodach, aby przygotować własne szczepy/mutanty do transformacji.
Alternatywny, szybki i skuteczny protokół przygotowania elektrokompetentnych bakterii E. coli jest używany przez kilka laboratoriów bakteriologii molekularnej już od jakiegoś czasu i został rozszerzony na dodatkowe bakterie Gram-ujemne, w naszym przypadku V. cholerae. Nie można zidentyfikować twórcy protokołu, ponieważ z biegiem czasu został on zoptymalizowany przez innych badaczy. Przedstawiona tutaj metoda jest stosowana w naszych laboratoriach od prawie dwóch dekad, a naszym celem jest podzielenie się tym użytecznym protokołem z naszymi rówieśnikami.
Protokół
1. Przygotowanie kultur bakteryjnych, narzędzi i odczynników (DZIEŃ 1, popołudnie)
- Późnym popołudniem zaszczepić 1-5 ml autoklawowanego bulionu LB w sterylnych (na przykład 100 x 13 mm) probówkach ze szkła borokrzemianowego z niewielką ilością bakterii (E. coli lub V. cholerae).
- Umieść zaszczepione probówki w bębnie rolkowym o temperaturze 37 °C (ciepłe pomieszczenie lub inkubator), włącz bęben rolkowy z dużą prędkością i inkubuj O/N.
- Przygotuj rozsiewacz komórek w kształcie "kija hokejowego" ze szklanego pręta, podgrzewając środek pręta w płomieniu palnika Bunsena, aż szkło zmięknie, a następnie delikatnie skieruj zagięcie pęsetą lub szczypcami pod kątem 135°. Podgrzej pręt jeszcze raz w środkowym punkcie między końcem a pierwszym zgięciem i zegnij go pod kątem 45° do wewnątrz (w kierunku przeciwnym do pierwszego zagięcia).
- Przygotować LB-agar bez antybiotyków i wlać na szalki Petriego w celu przygotowania protokołu elektrokompetencji oraz płytki LB-agar zawierające odpowiedni antybiotyk (zgodnie ze znacznikiem oporności na wektorze, który ma być elektroporowany) i przechowywać w temperaturze 4 °C.
- Przygotować wysterylizowany przez filtr 2 mM roztwór CaCl2 dla V. cholerae lub autoklaw ddH2O dla E. coli i przechowywać w temperaturze 4 °C.
2. Wzrost bakterii elektrokompetentnych (DZIEŃ 2, rano)
- Dostarczyć 100 μl kultury bakteryjnej O/N na każdą płytkę agarową LB, można również wykorzystać zamrożone zapasy glicerolu i dostarczyć je bezpośrednio na płytkę.
- Zanurz rozsiewacz komórek w kształcie kija hokejowego w 100% EtOH, na krótko odcedź i spal pozostały EtOH, aby wysterylizować go przed użyciem i rozprowadzeniem. Rozprowadzić równomiernie 100 μl kultury bakteryjnej O/N za pomocą sterylnego rozsiewacza szklanych komórek, uważając, aby nie naruszyć (nie złamać) powierzchni agaru.
- Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 4-6 godzin lub do momentu, gdy na cienkim trawniku pojawi się rozrost bakterii. Komórki są najbardziej kompetentne, gdy aktywnie rosną.
3. Przygotowanie elektrokompetentnych komórek bakteryjnych (DZIEŃ 2, popołudnie)
- Zbierz bakterie za pomocą sterylnej pętli zaszczepiającej, uważając, aby nie przebić ani nie złamać powierzchni agaru. Jedna masa bakteryjna o średnicy 2 mm wystarcza na pojedynczą przemianę. Zazwyczaj wymaga to dwukrotnego lub trzykrotnego zeskrobania powierzchni cienkiego trawnika za pomocą pętli zaszczepiającej. Z tej samej płytki można pobrać kilka próbek (zwykle od 4 do 6).
- Zawiesić masę bakteryjną w 1 ml lodowatego 2 mM CaCl2 (dla V. cholerae) lub sterylnego ddH2O (dla E. coli) i dobrze wymieszać, aż nie będą widoczne grudki, trzymać na lodzie.
- Odwirować każdą zawiesinę bakteryjną przez 5 minut przy 5 000 x g w mikrowirówce z chłodzeniem ustawionej na 4 °C lub w mikrowirówce przechowywanej w chłodni ustawionej na 4 °C.
- Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić osad bakteryjny w tej samej objętości lodowato zimnego 2 mM CaCl2 lub sterylnego ddH2O i powtórzyć poprzednio poprzednio etap wirowania jeszcze dwa razy, w sumie trzy płukania.
- Usunąć supernatant, zawiesić, a następnie dokładnie poluzować osad bakteryjny w 40 μl lodowatego 2 mM CaCl2 lub sterylnym ddH2O i trzymać na lodzie.
4. Transformacja bakterii elektrokompetentnych (DZIEŃ 2, popołudnie)
- Dodać do 1 μg plazmidowego DNA (w maksymalnie 1 μl wody lub buforu Tris-EDTA) do 40 μl zawiesiny bakteryjnej i przenieść tę mieszaninę do wstępnie schłodzonej, sterylnej kuwety o szczelinie 0,2 cm. Stężenie soli w próbce DNA musi być niskiea, ponieważ w następnym kroku przyczyni się to do wyładowania łukowego impulsu.
- Włóż kuwetę do komory elektroporacyjnej modułu sterującego impulsami i elektroporuj przy napięciu 1.8 kV, 25 μF. Stała czasowa powinna wynosić ~5,0 ms i nie powinno wystąpić wyładowanie łukowe.
- Szybko odzyskaj zawiesinę komórkową poprzez ponowne podpisanie w 1 ml bulionu LB i przeniesienie do wcześniej autoklawizowanej probówki ze szkła borokrzemianowego.
- Pozostawić komórki do regeneracji poprzez inkubację w napowietrzonych warunkach wzrostu (w bębnie rolkowym) w temperaturze 37 °C przez 30 minut bez doboru antybiotyków.
- Umieścić bakterie na uprzednio przygotowanych płytkach agarowych LB w obecności odpowiedniego środka selektywnego (antybiotyku) i inkubować w temperaturze 37 °C O/N. Jeśli bakterie są przekształcane za pomocą wysokiego stężenia oczyszczonego wektora (0,1-1 μg superskręconego plazmidu), należy dostarczyć 10 μl kultury bakteryjnej na krawędź płytki agarowej LB i ze sterylną smugą pętli inokulacyjnej dla izolowanych kolonii przy użyciu metody smug kwadrantowych. Jeśli mieszanina ligacji została przekształcona, dostarczyć 100 μl kultury bakteryjnej na każdą płytkę agarową i równomiernie rozprowadzić ją za pomocą wysterylizowanego rozsiewacza szklanych komórek.
a Jeśli stała czasowa jest krótka (poniżej 3,5 ms), lub pulsowanie prowadzi do wyładowania łukowego, należy ponownie wyciąć próbkę DNA, przemyć dwukrotnie 70% EtOH w celu usunięcia soli przed wysuszeniem i ponownym zawieszeniem w buforze TE.
Wyniki
Przeprowadziliśmy serię transformacji z wykorzystaniem E. coli oraz V. cholerae, aby porównać wydajność transformacji naszej szybkiej metodologii z adaptacją (tradycyjnej) metody pierwotnie opisanej przez Dower et al.2 w celu przygotowania bakterii elektrokometentnych. W celu tradycyjnego przygotowania kompetentnych komórek, 500 ml LB w kolbie Erlenmeyera o pojemności 2 L zaszczepiono 500 μl nocnej kultury E. coli DH5α lub V. cholerae O395, inkubowano w wytrząsarku orbitalnym (215 rpm w 37 °C) i zebrano przy OD600 w zakresie 0,5-1,0. Kolbę schłodzono na lodzie, a kultury odwirowano w schłodzonym rotorze przy 4 000 x g przez 10 min w 4 °C. Osady komórkowe dokładnie resuspendowano w 500 ml lodowatego 2 mM CaCl2 dla V. cholerae oraz w ddH2O dla E. coli, a następnie ponownie odwirowano w tych samych warunkach. Kolejne etapy resuspensji i wirowania przeprowadzono w malejących objętościach 200 i 100 ml, dbając o to, aby kultura pozostawała schłodzona w 4 °C. Na koniec wykonano resuspensję i wirowanie w objętości 10 ml z zastosowaniem 10% glicerolu. Końcowy osad resuspendowano w 2 ml 10% glicerolu, a alikwoty po 40 μl zamrożono w -80 °C i przechowywano nie dłużej niż tydzień przed elektroporacją.
Warunki elektroporacji, w tym ustawienia impulsów i rozmiar kuwety, były identyczne dla obu gatunków bakterii we wszystkich procesach elektroporacji, niezależnie od metody przygotowania komórek kompetentnych. Jedyną różnicą było przeprowadzenie przemywań w zimnej ddH2O w przypadku E. coli oraz w zimnym 2 mM CaCl2 dla V. cholerae. Tabela 1 przedstawia wyniki transformacji bakterii, które poddano identycznej elektroporacji, ale których kompetencja została uzyskana za pomocą protokołu szybkiego lub metody tradycyjnej. Jako powszechnie stosowane, reprezentatywne szczepy wykorzystaliśmy odpowiednio O395 dla V. cholerae oraz DH5α dla E. coli; podobne wyniki można uzyskać z innymi szczepami tych samych gatunków (choć nie każdy pojedynczy szczep został przetestowany), a metoda ta jest prawdopodobnie możliwa do adaptacji dla innych bakterii Gram-ujemnych i prawdopodobnie poza tę grupę.
Aby zapewnić obecność równej liczby komórek w każdej serii poddanej impulsowi, bakterie elektrokompetentne otrzymane szybką metodą po zebraniu połączono, wymieszano, utrzymano w jednorodnej zawiesinie i podzielono na alikwoty o objętości 40 μl bezpośrednio przed elektroporacją. Bakterie elektrokompetentne otrzymane metodą tradycyjną potraktowano analogicznie przed zamrożeniem w alikwotach 40 μl. Po podaniu impulsu każdą partię 40 μl elektroporowanych bakterii zawieszono w 400 μl LB i poddano rozcieńczeniom seryjnym w stosunku 1:10. Sto mikrolitrów każdego rozcieńczenia naniesiono na agar LB z dodatkiem 100 μg/ml ampicyliny, rozprowadzono za pomocą sterylnego szklanego rozpylacza do komórek i inkubowano przez noc w temperaturze 37 °C. W celu określenia całkowitej liczby bakterii wykorzystanych w każdej transformacji, alikwoty 40 μl bakterii elektrokompetentnych z każdej przygotowanej serii poddano rozcieńczeniom seryjnym i w ten sam sposób wysiano równolegle na agar LB bez antybiotyków. Jedną alikwotę bakterii potraktowanych w ten sam sposób z każdej serii poddano elektroporacji z dodatkiem 1 μl buforu Tris-EDTA (TE) bez DNA (transformacja pozorowana), następnie poddano rozcieńczeniom seryjnym i wysiano na agar LB bez antybiotyków, aby oszacować liczbę komórek utraconych w wyniku podania impulsu elektrycznego. Na koniec przeprowadzono dodatkowy wariant doświadczenia, aby sprawdzić, czy 30-minutowa inkubacja w temperaturze 37 °C w 1 ml LB po elektroporacji, ale przed wysianiem na agar LB, wpłynie na odzysk transformowanych komórek. Liczbę jednostek tworzących kolonie (CFU) policzono następnego dnia.
W tym eksperymencie wykorzystaliśmy pUC18, powszechnie stosowany plazmid laboratoryjny, oraz partie bakterii kompetentnych zawierające około 108 CFUs w przypadku komórek przygotowanych metodą tradycyjną oraz 107 CFUs dla komórek przygotowanych zgodnie z protokołem szybkim. Sama elektroporacja (bez DNA) zredukowała liczbę żywych CFUs 10-100 krotnie, niezależnie od metody użytej do przygotowania komórek elektrokompetentnych. Jak pokazano w Tabeli 1, wydajność transformantów w trzech powtórzeniach eksperymentu (odchylenia standardowe w nawiasach) mieściła się w zakresie 106 -107 CFUs/μg DNA odpowiednio dla E. coli (DH5α) oraz V. cholerae (O395) przy zastosowaniu tradycyjnej, bardziej czasochłonnej metody przygotowania komórek elektrokompetentnych. Wydajność transformantów wydawała się być 10-krotnie niższa, osiągając 105 -106 CFUs/μg DNA w trzech powtórzeniach eksperymentu (odchylenie standardowe w nawiasach) odpowiednio dla E. coli i V. cholerae przy zastosowaniu metody szybkiej. Z tego powodu określiliśmy procent przekształconych bakterii, dzieląc liczbę transformowanych CFUs przez liczbę CFUs odzyskanych z „transformacji pozornych” (bez plazmidu) z identycznych partii komórek kompetentnych. Procent przekształconych bakterii mieścił się w granicach jednego rzędu wielkości (2,5-9,4%), niezależnie od metody przygotowania i transformowanego gatunku (liczby w nawiasach w Tabeli 1). Wyniki te sugerują, że wydajność metody szybkiej jest porównywalna z wydajnością tradycyjnej, bardziej czasochłonnej procedury przygotowania komórek kompetentnych oraz że reprezentatywne szczepy Vibrio cholerae i Escherichia coli są w równym stopniu podatne na procedurę szybką.
Stwierdzono, że wydajność transformacji w przypadku plazmidów takich jak pUC18 zawierających kasety β-laktamazy nie jest zależna od 30-minutowego czasu regeneracji w bulionie LB. Odzyskano taką samą liczbę transformantów niezależnie od tego, czy komórki zostały wysiane bezpośrednio po elektroporacji na agar LB z ampicyliną, czy też pozostawiono je na 30–45 min w celu regeneracji w bulionie LB w temperaturze 37 °C przed wysianiem. Nasze wyniki wskazujące na to, że oporność na ampicylinę nie wymaga wzrostu w warunkach nieselektywnych, sugerują, że ekspresja β-laktamazy następuje wystarczająco szybko po transformacji. Należy jednak zauważyć, że przeprowadzono seryjne rozcieńczenia bakterii poddanych impulsowi w bulionie LB, co mogło wspomóc regenerację po wstrząsie elektrycznym i zainicjować ekspresję genów.
Rycina 1. Graficzne przedstawienie metodologii szybkiego przygotowania bakterii elektrokompetentnych. Po 4-6 h (w zależności od gęstości szczepionki) można zebrać wystarczającą liczbę bakterii, aby przeprowadzić od czterech do sześciu transformacji z jednej płytki z agarem LB. Aby zapewnić taką samą liczbę kompetentnych komórek dla każdej końcowej objętości poddawanej elektroporacji, bakterie zebrane z płytki z agarem LB zostały początkowo połączone i wspólnie przemyte, a następnie podzielone na aliquoty o objętości 40 μl w zależności od wielkości osadu (większe osady rozcieńczano w większych objętościach podzielnych przez 40 μl).
| Liczba transformantów opornych na ampicylinę/μg DNA (odzyskane transformanty oporne na ampicylinę [%]) | ||
| Szczep | Metoda tradycyjna | Metoda szybka |
| E. coli (DH5α) | 2.3 x 106 (± 7.3 x 105) [9.4%] | 3 x 106 (± 7.1 x 105) [2.5%] |
| V. cholerae (O395) | 4 x 107 (± 1.7 x 107) [5%] | 6.7 x 105 (± 2.1 x 105) [3.3%] |
Tabela 1. Wydajność transformacji na mikrogram DNA (pUC18) bakterii elektrokompetentnych przygotowanych metodą tradycyjną w porównaniu z metodą szybką.
Wszystkie transformacje przeprowadzono z użyciem 500 ng DNA pUC18 (~80% DNA superzwiniętego, co potwierdzono w elektroforezie w 1% żelu agarozowym), a elektroporowane komórki poddano dziesięciokrotnym rozcieńczeniom seryjnym w bulionie LB przed wysianiem w celu oznaczenia CFU na agarze LB z antybiotykami. Dla każdego zestawu transformacji przeprowadzono kontrole z bakteriami niepoddanymi elektroporacji oraz bakteriami elektroporowanymi bez plazmidu, które poddano rozcieńczeniom seryjnym i wysiano na agar LB bez antybiotyków, aby określić całkowitą liczbę żywych bakterii przed i po impulsie elektrycznym. Kontrole po elektroporacji stanowiły punkt odniesienia dla obliczenia procentowego udziału żywych bakterii, które uległy pomyślnej transformacji.
Dyskusja
Wydajność przemian zależy od wielu czynników, niezależnie od metody zastosowanej do przygotowania kompetentnych komórek. Analogiczne zmienne mają zastosowanie do tej metody; Należy dołożyć wszelkich starań, aby po pobraniu komórek z płytki agarowej utrzymać je w stałej niskiej temperaturze (nie wyższej niż 4 °C). Trawnik bakteryjny musi aktywnie rosnąć w momencie zbioru; Komórki muszą znajdować się w środkowej logarytmicznej fazie wzrostu. Jakość DNA (tj. zanieczyszczenie soli) wpływa na efektywność przemiany. W szczególności, przy stosowaniu tej metody, agar nie powinien być rozbijany, ponieważ fragmenty agaru w kuwecie spowodują wygięcie łukowe impulsu.
Większość problemów napotkanych podczas tej techniki wiąże się z dwoma kwestiami; Zbieranie bakterii w odpowiednim oknie czasowym z płytki agarowej, gdy aktywnie rosną. Zebranie ich zbyt wcześnie spowoduje niewystarczającą liczbę komórek i sprawi, że zeskrobywanie płytki agarowej LB będzie frustrujące, ponieważ tworzona przez nie "błonka" jest trudna do podniesienia z powierzchni płytki. Zbyt późne zbieranie bakterii drastycznie obniży ich kompetencje. Okno czasowe będzie się naturalnie różnić w zależności od gęstości inokulum posianego na płytkach agarowych LB. Drugim krytycznym krokiem jest utrzymywanie bakterii w niskiej temperaturze (4 °C) od momentu ich zdjęcia z płytki agarowej i ponownego zawieszenia w CaCl2 lub ddH2O, aż do momentu ich posiewu na agarze LB po przemianie. Probówki do mikrofuge zawierające bakterie, kuwety i bufor powinny być wstępnie schłodzone i trzymane na lodzie przez cały czas, aż bakterie zostaną platerowane. Jednak dodatkowe problemy mogą się pojawić, gdy sterylne ddH2O lub CaCl2 zawierają osad lub są zanieczyszczone. Z tego powodu zalecamy przygotowanie tego odczynnika na świeżo.
Rozwiązywanie problemów z transformacją jest ułatwione dzięki włączeniu kontroli podczas przekształcania bakterii, które stają się kompetentne dowolną metodą. Kontrola ujemna składająca się z partii nieprzekształconych kompetentnych bakterii posianych na płytce agarowej LB zawierającej marker selektywny szybko pomoże określić, czy antybiotyk na płytce jest skuteczny. Transformacja kontroli pozytywnej ze znanym preparatem plazmidowym dobrej jakości i w ilości, zawierającym ten sam marker selektywny co próbka doświadczalna, będzie pomocna w ustaleniu, czy bakterie są kompetentne, ale także czy przekształcone eksperymentalne DNA było wystarczające pod względem ilości lub jakości.
Zalety tej techniki są wielorakie; Metoda może być przeprowadzona w tym samym dniu, w którym planowana jest transformacja. Odkryliśmy, że zamrożony bakteryjny materiał glicerolowy można posiewać bezpośrednio na agarze LB bez utraty kompetencji elektrycznych; Robiliśmy to w sytuacjach "awaryjnych" (po tym, jak zapomnieliśmy uruchomić nocny posiew dzień wcześniej). Chociaż nie udało nam się przetestować każdego znanego szczepu, każdy szczep E. coli lub V. cholerae , który można przekształcić za pomocą elektroporacji, był podatny na ten protokół w naszych rękach. Technika ta jest szybka, skuteczna i zapewnia wydajność transformacji porównywalną z uzyskaną przy wytwarzaniu bakterii elektrokompetentnych przy użyciu tradycyjnych metod. Metoda ta eliminuje konieczność stosowania wirówki o dużej prędkości i związanych z nią wirników, wytrząsarki inkubatora orbitalnego i sterylnych wiader (pojemników) wirówek oraz dużych objętości autoklawowanego buforu. Chociaż Tabela Specyficznych Odczynników i Sprzętu jest dość obszerna, większość laboratoriów przeprowadzających elektroporację będzie miała większość, jeśli nie wszystkie, tych materiałów już dostępnych. Być może najważniejsze jest to, że technika ta może być łatwo zastosowana do szybkiego generowania elektrokompetentnych szczepów specyficznych dla laboratorium ze zmutowanym tłem. Nie zdajemy sobie sprawy z żadnych ograniczeń tej techniki, ponieważ zastąpiła ona tradycyjną metodę otrzymywania bakterii elektrokompetentnych w naszych laboratoriach.
Przedstawione tutaj wyniki naszych eksperymentów zostały przeprowadzone na świeżych ogniwach elektrokompetentnych wyprodukowanych tradycyjną metodą, które były przechowywane w temperaturze -80 °C nie dłużej niż 1 tydzień. Jednak zamrożone zapasy ogniw elektrokompetentnych tracą kompetencje i/lub rentowność przez dłuższy okres przechowywania. Nasz skrócony protokół pozwala na przygotowanie świeżych ogniw elektrokompetentnych tego samego dnia, w którym planowana jest transformacja, bez obaw o wiek stada, co może skutkować zmniejszoną wydajnością transformatora. Nie podjęliśmy prób przechowywania elektrokompetentnych ogniw wyprodukowanych metodą szybką do wykorzystania w innym dniu, ponieważ nie było to konieczne.
Chociaż nie zostało to tutaj pokazane, wydajność elektrokompetentnych ogniw przygotowanych przy użyciu naszej szybkiej metody jest wystarczająca dla mieszanin ligacyjnych. Przemiany opisane dla V . cholerae nie-O1 w niedawnym artykule Unterweger i wsp.17 przeprowadzono przy użyciu bakterii elektrokompetentnych przygotowanych metodą opisaną tutaj (z wyjątkiem tych przeprowadzonych metodą koniugacji). Technika ta pozwala naukowcom na szybkie i skuteczne przekształcanie szczepów ze zmutowanym tłem bez konieczności przygotowywania dużych partii komórek. Ta metoda szybkiego przygotowania bakterii elektrokompetentnych może być dostosowana do innych prokariontów, które okazały się podatne na elektroporację, ponieważ zasada przygotowania i ustawienia elektroporacji będą takie same, jak w tradycyjnych protokołach.
Oświadczenia
Nie mają zastosowania żadne ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy są wdzięczni swoim kolegom i pracownikom obecnych i byłych laboratoriów, którzy wspierali rozwój tej techniki. Laboratorium S.P. jest wspierane przez Kanadyjski Instytut Badań nad Zdrowiem Grant Operacyjny MOP-84473 oraz Alberta Innovates-Health Solutions (finansowane przez Alberta Heritage Foundation for Medical Research Endowment Fund). D.P. był wspierany przez granty National Institutes of Health MD001091-01 i GM068855-02.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Moduł Gene Pulser | Bio-Rad | 165-2668 | |
| Komora kuwety Gene Pulser | Bio-Rad | 165-2669 | |
| Kuwety elektryczne (odstęp 0,2 cm) | Bio-Rad | 165-2082 | |
| 13 x 100 mm Rurki hodowlane Pyrex bez kołnierza | Corning | 70820-13 13 | |
| mm Zamknięcia probówek hodowlanych | Cole Parmer | EW-04500-00 | |
| 6 x Pręt szklany 250 mm | Lab Source | 11381D | |
| Jednorazowe szalki Petriego | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| Zespół bębna rolkowego | New Brunswick Scientific | M1053-4004 | |
| Bęben rolkowy do probówek hodowlanych 13 x 100 mm | New Brunswick Scientific | M1053-0306 | |
| Chlorek wapnia | Sigma Chemicals | C5670 | |
| Etanol, bezwodny/denaturowany | Sigma Chemicals | 227649 | |
| Pętla inokulacyjna | Decon Labs | MP182-5 | |
| Mikrowirówka z chłodzeniem 5451 R | Eppendorf | 22621425 | |
| Palnik Bunsena | Fisher Scientific | 03-917Q | |
| LB Rosół MILLER | EMD | 1.10285.0500 | |
| Bakteriologiczny agar | Fisher Naukowy | S25127 |
Bibliografia
- Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO J. 1 (7), 841-845 (1982).
- Dower, W. J., Miller, J. F., Ragsdale, C. W. High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation. Nucleic Acids Res. 16 (13), 6127-6145 (1988).
- Taketo, A. DNA transfection of Escherichia coli by electroporation. Biochim. Biophys. Acta. 949 (3), 318-324 (1988).
- Fiedler, S., Wirth, R. Transformation of bacteria with plasmid DNA by electroporation. Anal. Biochem. 170 (1), 38-44 (1988).
- O'Callaghan, D., Charbit, A. High efficiency transformation of Salmonella typhimurium and Salmonella typhi by electroporation. Mol. Gen. Genet. 223 (1), 156-158 (1990).
- Hamashima, H., Nakano, T., Tamura, S., Arai, T. Genetic transformation of Vibrio parahaemolyticus, Vibrio alginolyticus, and Vibrio cholerae non O-1 with plasmid DNA by electroporation. Microbiol. Immunol. 34 (8), 703-708 (1990).
- Grones, J., Turna, J. Transformation of microorganisms with the plasmid vector with the replicon from pAC1 from Acetobacter pasteurianus. Biochem. Biophys. Res. Commun. 206 (3), 942-947 (1995).
- Allen, S. P., Blaschek, H. P. Electroporation-induced transformation of intact cells of Clostridium perfringens. Appl. Environ. Microbiol. 54, 2322-2324 (1988).
- Belliveau, B. H., Trevors, J. T. Transformation of Bacillus cereus vegetative cells by electroporation. Appl. Environ. Microbiol. 55, 1649-1652 (1989).
- Chassy, B. M., Flickinger, J. L. Transformation of Lactobacillus casei by electroporation. FEMS Microbiol. Lett. 44, 173-177 (1987).
- Dunny, G. M., Lee, L. N., LeBlanc, D. J. Improved electroporation and cloning vector system for gram-positive bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 57 (4), 1194-1201 (1991).
- Micheletti, P. A., Sment, K. A., Konisky, J. Isolation of a coenzyme M-auxotrophic mutant and transformation by electroporation in Methanococcus voltae. J. Bacteriol. 173 (11), 3414-3418 (1991).
- Schleper, C., Kubo, K., Zillig, W. The particle SSV1 from the extremely thermophilic archaeon Sulfolobus is a virus: demonstration of infectivity and of transfection with viral DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (16), 7645-7649 (1992).
- Aune, T. E., Aachmann, F. L. Methodologies to increase the transformation efficiencies and the range of bacteria that can be transformed. Appl. Microbiol. Biotechnol. 85 (5), 1301-1313 (2010).
- Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166, 557(1983).
- Unterweger, D., Kitaoka, M., et al. Constitutive Type VI Secretion System Expression Gives Vibrio cholerae Intra- and Interspecific Competitive Advantages. PLoS One. 7 (10), e48320(2012).
Przedruki i uprawnienia
