Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Preparat in vitro izolowanych neuronów jelitowych i gleju ze splotu mięśniowo-jelitowego dorosłej myszy

28.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50688

⸱

7 sierpnia 2013

 ,  ,  ,  , 
1Pharmacology and Toxicology, Virginia Commonwealth University, 2Physiology and Biophyics, Virginia Commonwealth University

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentujemy protokół hodowli komórkowej do bezpośredniego badania neuronalnych i glejowych składników jelitowego układu nerwowego. Mieszana hodowla neuronów i glejów na szkiełkach nakrywkowych jest przygotowywana ze splotu mięśniowo-jelitowego dorosłej myszy, co daje możliwość zbadania funkcji poszczególnych neuronów i gleju za pomocą elektrofizjologii, immunohistochemii itp.

Streszczenie

Jelitowy układ nerwowy to rozległa sieć neuronów i gleju biegnąca wzdłuż przewodu pokarmowego, która funkcjonalnie kontroluje motorykę przewodu pokarmowego. Opisano procedurę izolacji i hodowli mieszanej populacji neuronów i komórek glejowych ze splotu mięśniowo-jelitowego. Pierwotne kultury mogą być utrzymywane przez ponad 7 dni, z rozwijającymi się połączeniami między neuronami a glejem. Podłużny pasek mięśniowy z przyczepionym splotem mięśniowo-jelitowym jest usuwany z leżącego poniżej mięśnia okrężnego jelita krętego myszy lub okrężnicy i poddawany trawieniu enzymatycznym. W sterylnych warunkach izolowana populacja neuronów i komórek glejowych jest zachowywana w osadzie po odwirowaniu i posiewana na szkiełkach nakrywkowych. W ciągu 24-48 godzin następuje rozrost neurytów, a neurony można zidentyfikować za pomocą markerów panneuronalnych. Po dwóch dniach w hodowli izolowane neurony uwalniają potencjały czynnościowe, jak zaobserwowano w badaniach z klamrą łatową. Ponadto glej jelitowy można również zidentyfikować za pomocą barwienia GFAP. Sieć neuronów i gleju w bliskim sąsiedztwie tworzy się w ciągu 5 - 7 dni. Neurony jelitowe można badać indywidualnie i bezpośrednio za pomocą metod takich jak immunohistochemia, elektrofizjologia, obrazowanie wapnia i PCR jednokomórkowy. Co więcej, procedura ta może być wykonywana u zwierząt modyfikowanych genetycznie. Ta metodologia jest prosta do wykonania i niedroga. Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten ujawnia składniki jelitowego układu nerwowego w łatwy do manipulowania sposób, dzięki czemu możemy lepiej odkryć funkcjonalność ENS w stanach normalnych i chorobowych.

Wprowadzenie

Jelitowy układ nerwowy (ENS) to rozległa sieć nerwów i glejów, która biegnie przez całą długość przewodu pokarmowego (GI). ENS funkcjonalnie kontroluje wszystkie aspekty trawienia, w tym perystaltykę jelit, wchłanianie/wydzielanie płynów, odczuwanie bodźców itp. Zawiera ponad 500 milionów neuronów, więcej niż znajduje się w rdzeniu kręgowym, i zawiera każdą klasę neuroprzekaźników znajdujących się w mózgu. Co więcej, ENS jest wyjątkowy, ponieważ może funkcjonować odruchowo bez udziału ośrodkowego układu nerwowego 2. Zrozumienie ENS jest kluczowe, nie tylko dla zrozumienia jego normalnej roli fizjologicznej, ale także dla zrozumienia jego udziału w różnych neuropatiach, które mogą być wrodzone (choroba Hirschsprunga), nabyte (Chagas), wtórne do stanów chorobowych (gastropareza cukrzycowa), wywołane lekami (zespół opioidowego jelita) lub spowodowane urazem (pooperacyjna niedrożność jelit) 1. Ponadto neurony jelitowe mogą być rezerwuarem infekcji wirusowych (ospy wietrznej i półpaśca)3. Ze względu na podobieństwa do mózgu i wysoki poziom serotoniny w jelitach, leki mające na celu leczenie wad ośrodkowego układu nerwowego często mają niepożądane skutki uboczne dla ENS 2. Warto również zauważyć, że wiele neuropatii, takich jak choroba Alzheimera i choroba Parkinsona, wykazuje podobne zmiany komórkowe w neuronach jelitowych na długo przed ich pojawieniem się w neuronach centralnych, co sprawia, że ENS jest dostępnym modelem do badania patogenezy tych chorób 4. Dlatego dokładne zrozumienie ENS jest niezbędne do zrozumienia stanów chorobowych i zapobiegania/przewidywania farmakologicznych skutków ubocznych.

Neurony ENS były tradycyjnie badane u świnki morskiej przy użyciu preparatów wholemount 5-7 lub hodowanych neuronów 8. Pomimo łatwości, z jaką można badać neurony u tego dużego zwierzęcia, model ten ma wiele ograniczeń, w tym brak genetycznie modyfikowanych szczepów, brak odczynników specyficznych dla tego gatunku oraz wysokie koszty związane z porządkowaniem i trzymaniem tych osób. Opracowanie modelu mysiego jelitowego układu nerwowego ma unikalną zaletę w postaci różnych systemów nokautujących, szerokiego wachlarza innych uznanych metodologii, które można stosować w połączeniu z techniką hodowli komórkowych, oraz możliwości zapewnienia walidacji dla modelu świnki morskiej.

ENS składa się z trzech splotów, które biegną wzdłuż przewodu pokarmowego: zewnętrznego splotu mięśniowo-jelitowego (między mięśniem podłużnym a okrężnym), który jest głównie odpowiedzialny za perystaltyczne działania jelit, a także splotu podśluzówkowego i śluzówkowego (znajdujących się odpowiednio pod i wewnątrz błony śluzowej), które w dużej mierze kontrolują wchłanianie/wydzielanie płynów i wykrywanie bodźców1 . Metoda ta rozpoczyna się od wyizolowania preparatu mięśnia podłużnego/splotu mięśniowo-jelitowego (LMMP) poprzez złuszczenie zewnętrznej warstwy mięśniowej przewodu pokarmowego. To radykalnie zmniejsza problemy z zanieczyszczeniem, które pojawiają się, gdy warstwa śluzówkowa jest zaangażowana w izolację. W rezultacie, proces ten jest idealny do badania neuronalnej kontroli ruchliwości, a nie działań wydzielniczych ENS.

Przedstawiona tutaj metoda prowadzi do powstania mieszanej kultury neuronów jelitowych i gleju. Na podstawie wcześniejszych obserwacji elektrofizjologicznych i immunocytochemicznych występują co najmniej dwa różne typy neuronów 9. Obecność gleju jest bardzo korzystna, ponieważ są one nie tylko ważnym typem komórek do samodzielnego badania, ale także przyczyniają się do przetrwania neuronów jelitowych 10 i utrzymują natywną ekspresję receptorów na powierzchni komórki neuronalnej 11. Ponadto niedobory gleju jelitowego mogą prowadzić do nieprawidłowych stanów chorobowych motoryki przewodu pokarmowego, określanych mianem "neuroglejopatii" 12. W związku z tym przedstawiona tutaj hodowla ENS daje kilka typów komórek, które są dojrzałe do badań.

Zaletami tej metodologii są łatwość izolacji, niedrogie wymagania dotyczące narzędzi oraz krótki czas na opanowanie techniki przez doświadczony personel laboratoryjny. Ograniczenia tej metodologii obejmują niską ogólną wydajność komórek wynikającą z dużej objętości tkanek oraz wykluczenie neuronów ENS ze splotów błony śluzowej i podśluzówkowej. Procedura ta będzie bardzo korzystna dla naukowców specjalizujących się w elektrofizjologii, immunohistochemii, PCR jednokomórkowym i innych metodologiach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury opieki nad zwierzętami i eksperymentów były zgodne i zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Virginia Commonwealth University.

1. Przygotowanie sterylnych szkiełek nakrywkowych z poli-D-lizyny i lamininy na płytkach 24-dołkowych

  1. Wszystkie procedury dla kroku 1 są wykonywane w sterylnych warunkach, pod kapturem i przy użyciu sterylnych odczynników. Szkiełka nakrywkowe i podwójnie dejonizowaną wodę (ddH2O) należy wcześniej wysterylizować. Przygotowanie płytek można wykonać do dwóch tygodni przed izolacją neuronów.
  2. Pod maską użyj sterylnych kleszczyków, aby umieścić autoklawizowane szklane szkiełka nakrywkowe w 12 dołkach 24-dołkowej płytki.
  3. Przygotuj zapas poli-D-lizyny z wyprzedzeniem. Dodać 50 ml sterylnego ddH2O do 5 mg poli-D-lizyny. Odwirować i przechowywać w 3 ml porcji w temperaturze -20 °C. Podwielokrotności rozmrozić przed użyciem.
  4. Aby uzyskać końcowe stężenie 1 ml bulionu z poli-D-lizyny na 25 cm2: odpipetować 80 μl poli-D-lizyny na wierzchu każdego szklanego szkiełka nakrywkowego (2 cm2). Pozostaw roztwór na 10 minut.
  5. Usunąć poli-D-lizynę za pomocą próżni i spłukać szkiełka nakrywkowe 3x sterylnym ddH2O.
  6. Pozostaw talerze do wyschnięcia na co najmniej 2 godziny pod maską.
  7. Płytki mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C lub -20 °C przed przystąpieniem do powlekania lamininą.
  8. Przygotuj bulion z lamininy z wyprzedzeniem. Rozmrozić lamininę na lodzie i trzymać na lodzie podczas użytkowania. Rozcieńczyć do stężenia 50 μg/ml; zwróć uwagę na koncentrację partii; Każda partia będzie inna. W zależności od stężenia w partii, do każdej fiolki lamininy dodaje się około 20 ml ddH2O. Podwielokrotność porcji (5 ml) i przechowywać w temperaturze -80 °C. Przed użyciem rozmrozić porcje na lodzie.
  9. Szkiełka nakrywkowe pokryć 5 μg/cm2 lamininy; odpipetować 200 μl lamininy na każde szkiełko nakrywkowe.
  10. Inkubować roztwór lamininy na szkiełkach nakrywkowych przez 1 godzinę.
  11. Odessać pozostały roztwór lamininy i raz spłukać szkiełka nakrywkowe ddH2O. Unikać skrobania powierzchni szkiełek nakrywkowych.
  12. Przechowywać płytki w temperaturze 4 °C przez okres do dwóch tygodni.

2. Zaawansowane przygotowanie rozwiązań do izolacji neuronów

  1. Przygotować roztwór Krebsa (w mM: 118 NaCl, 4,6 KCl, 1,3 NaH2PO4, 1,2 MgSO4, 25 NaHCO3, 11 glukozy i 2,5 CaCl2). Umieść 13,79 g NaCl (FW 58,44), 0,686 g KCl (FW 74,55), 0,312 g NaH2PO4 (FW 120), 0,289 gMgSO4 (FW 120,4), 4,20 g NaHCO3 (FW 84,01), 3,96 g glukozy (FW 180,2) i 0,555 g CaCl2 (FW 111) w 2 L ddH20. Schłodzić do temperatury 4 °C.
  2. Przygotuj pożywkę płuczącą (pożywka F12 z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i antybiotykiem/antybiotykiem/antybiotykiem): Do 500 ml butelki pożywki F12 dodaj 50 ml FBS i 5 ml Antybiotyku/Antybiotyku 100x Płynu (Gibco).
  3. Przygotuj pożywkę neuronów jelitowych (pożywka neuropodstawowa A z B-27, 2 mM L-glutamina, 1% FBS, 10 ng / ml, neurotroficzny czynnik glejowy (GDNF) i antybiotyk/antybiotyk / antybiotyk 100x płyn). Aby przygotować bulion GDNF, dodaj 1 ml ddH2O do 10 μg GDNF i zamroź z powrotem w 50 μl porcji, przechowuj w temperaturze -80 °C. Aby uzyskać 50 ml fiolkę z kompletnymi pożywkami neuronowymi, połącz 47,5 ml pożywki Neurobasal A, 1 ml B-27 (50x), 500 μl FBS, 500 μl 200 mM L-glutaminy (Gibco), 50 μl bulionu GDNF i 500 μl antybiotyku/antybiotyku 100x płynu. Pożywki są produkowane w małych partiach po 50 ml, aby zapewnić świeżość GDNF i uniknąć zanieczyszczenia dużych ilości tej drogiej mieszaniny pożywek komórkowych.

3. Zbieranie preparatu do badania podłużnych mięśni/splotów mięśniowo-jelitowych (LMMP) od myszy

  1. Przed przeprowadzaniem doświadczeń na zwierzętach powinny istnieć odpowiednie krajowe i instytucjonalne zasady etyczne. Dorosłe szwajcarskie myszy Webster o wadze ponad 25 g (zwykle w wieku powyżej 8 tygodni) są trzymane w grupach po 6 sztuk przed eksperymentami. Tkanki od dwóch myszy są używane do izolacji neuronów jelitowych jelita krętego i gleju, a trzy myszy są używane do izolacji komórek okrężnicy.
  2. Przygotuj obszar operacyjny. Zbierz małe nożyczki chirurgiczne, kleszcze pod kątem, waciki, trzy szklane zlewki o pojemności 200 ml i szklany/plastikowy pręt (pędzel). Upewnij się, że wszystkie materiały są dokładnie umyte i wypłukane przed użyciem, aby zminimalizować zanieczyszczenie. Ten krok można wykonać dzień przed eksperymentem.
  3. Umieść roztwór Krebsa na lodzie i bąbelkuj karbogenem (95% tlenu, 5% CO2) przez co najmniej 30 minut, aby ustabilizować pH.
  4. Włącz różne urządzenia i ciepłe chemikalia, aby ustabilizowały się w żądanych temperaturach; podgrzej łaźnię wodną do 37 °C, schłodzić wirówkę do 4 °C, umieść zrównoważony roztwór soli Hanka (HBSS) i 0,5% trypsyny w łaźni wodnej (37 °C). Kompletne pożywki neuronowe i płuczkę należy przechowywać w lodówce.
  5. Umieść 150 ml lodowatego Bąbelkowego Krebsa w trzech szklanych zlewkach o pojemności 200 ml oznaczonych jako "brudny", "czysty" i "LMMP". Zlewka bąbelkowa z napisem "LMMP" z karbogenem.
  6. Po uzyskaniu zgody komisji bioetycznej poddać mysz eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy lub uduszenieCO2
    7. .
  7. Umieść mysz w pozycji grzbietowej na powierzchni operacyjnej, oczyść skórę 70% EtOH i unieś skórę brzucha za pomocą kleszczy. Za pomocą nożyczek otwórz jamę brzuszną i odsłoń wewnętrzne narządy trawienne.
  8. Usuń długość przewodu pokarmowego, podnosząc odcinek jelita krętego i odsłaniając jego krezkę. Przetnij krezkę nożyczkami, aby delikatnie usunąć i rozplątać jelito kręte i okrężnicę, uważając, aby nie wyciągnąć krezki z jelita krętego / okrężnicy.
  9. Po rozplątaniu jelita grubego na całej długości usuń jelito kręte, przecinając jelito dystalnie do żołądka i proksymalnie do jelita ślepego. Uwaga: tę procedurę można również wykonać z tkanką okrężnicy, usuwając okrężnicę od dystalnej do jelita ślepego do bliższego odbytu.
  10. Tkanki można dalej podzielić na proksymalną i dystalną okrężnicę oraz jelito czcze i jelito kręte. Reszta tej procedury będzie odnosić się do izolacji jelita krętego; procedura jest taka sama dla izolacji okrężnicy LMMP. Umieść całe jelito kręte w szklanym pojemniku z lodowatym Krebsem oznaczonym jako "brudny".
  11. Stwórz narzędzie do czyszczenia jelita krętego; stęp dużą igłę o wadze 20 g za pomocą kamienia do pilnika i przymocuj ją do dużej strzykawki (10 ml) zawierającej lodowato zimnego Krebsa.
  12. Oczyść kał z jelita krętego, dzieląc jelito kręte na trzy lub więcej dużych kawałków. Wyjmij część jelita krętego ze zlewki i umieść igłę na końcu kawałka jelita krętego.
  13. Delikatnie przeprowadź Krebsa przez część jelitową, aż cały kał zostanie usunięty do oddzielnego pojemnika na odpady. Umieść oczyszczoną część w pojemniku Krebsa oznaczonym jako "czysty". Powtarzaj, aż całe jelito kręte zostanie oczyszczone.
  14. Aby usunąć LMMP, pokrój jelito kręte na małe segmenty, około 2 - 4 cm. Umieść segment jelita krętego na plastikowym lub szklanym pręcie; jelito kręte powinno ściśle przylegać, ale nie powinno być luźne ani napięte (~2 mm). Usuwanie LMMP należy rozpocząć od delikatnego usunięcia kawałków krezki nadal przyczepionych do przewodu pokarmowego (GI) za pomocą kleszczy. Zapobiegaj obracaniu się przewodu pokarmowego wokół pręta, delikatnie przypinając rurkę do pręta za pomocą kciuka.
  15. Oddziel LMMP od leżącego poniżej mięśnia okrężnego; najpierw delikatnie pocieraj krawędź kleszczy wzdłuż całej linii, do której przymocowana była krezka, od góry do dołu segmentu, delikatnie tworząc przerwę w mięśniu podłużnym. Następnie delikatnie zetrzyj mięsień podłużny za pomocą bawełnianego wacika zwilżonego Krebsem.
  16. Zacznij od górnej części przerwy w mięśniu podłużnym i odgarniaj najlżejszym ruchem poziomym, wywierając bardzo lekki nacisk, aż mięsień podłużny zacznie oddzielać się od mięśnia okrężnego; zrób to wzdłuż całego paska wzdłuż punktu przyczepu krezki.
  17. Następnie delikatnie zacznij pracować wokół rurki przewodu pokarmowego, poruszając się od góry do dołu i z powrotem, gdy mięsień podłużny jest powoli oddzielany od mięśnia okrężnego wokół rurki. Po zakończeniu LMMP w naturalny sposób odpadnie z pozostałej części rurki przewodu pokarmowego.
  18. Powstały cienki pasek mięśnia podłużnego umieścić w zlewce oznaczonej "LMMP". Powtórz te czynności dla wszystkich segmentów.
  19. Po zebraniu wszystkich pasków LMMP z jednej myszy, powtórz procedurę dla wszystkich innych używanych myszy. Dokładnie wypłukać "brudne" i "czyste" zlewki przed ponownym użyciem.
  20. Wypłucz LMMP 3x, aby usunąć zanieczyszczenie biologiczne. Napełnij trzy probówki Eppendorfa o pojemności 2 ml lodowatym Krebsem. Umieścić paski LMMP w pierwszej probówce i wirować przez 30 sekund w temperaturze 356 x g w wirówce schłodzonej do temperatury 4 °C. Ostrożnie usunąć supernatant za pomocą pipety i przesunąć paski LMMP do następnej czystej probówki wypełnionej Krebsem. Powtórz tę procedurę dla każdej pozostałej rurki.

4. Skrót LMMP

  1. Przygotować roztwór trawiący, umieszczając 13 mg kolagenazy typu 2 i 3 mg masy ciała w 10 ml roztworu Krebsa z pęcherzykami karbogenu.
  2. Umieść segmenty opłukanego LMMP w roztworze wytrawiającym i użyj nożyczek, aby pokroić LMMP na drobne kawałki.
  3. Trawić LMMP przez 60 minut w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej z shakerem, delikatnie bąbelkując karbogenem.
  4. Po zakończeniu trawienia zebrać komórki przez wirowanie przez 8 minut przy 356 x g w wirówce schłodzonej do 4 ° C.
  5. Od tego momentu wszystkie zabiegi powinny być wykonywane w sterylnych warunkach w kapturze do hodowli komórkowych! Wszystkie odczynniki i pojemniki należy wysterylizować przed użyciem.
  6. Podczas wirowania przygotuj 0,05% roztwór trypsyny, umieszczając 1 ml podgrzanej 0,25% trypsyny i 4 ml podgrzanego HBSS w sterylnej probówce do hodowli komórkowych o pojemności 50 ml.
  7. Po odwirowaniu usunąć i wyrzucić supernatant. Nie używaj odkurzacza; To prawdopodobnie zassie osad komórkowy z powodu niskich prędkości wirowania. Ostrożnie usunąć osad komórkowy i umieścić go w czystej probówce z 5 ml 0,05% roztworu trypsyny.
  8. Trawić komórki w 0,05% roztworze trypsyny w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C z wstrząsaniem przez 7 min. Nie należy przekraczać 7 minut całkowitego leczenia trypsyną, w przeciwnym razie neurony zginą.
  9. Zneutralizuj trypsynę za pomocą 10 ml zimnego płynu do płukania po 7 minutach leczenia trypsyną.
  10. Odwirowywać komórki przez 8 minut przy 356 x g. Wyjmij i wyrzuć nośniki.
  11. Podczas wirowania zrównoważyć fragment wysterylizowanej siatki Nitex na sterylnej probówce do hodowli komórkowej o pojemności 15 ml.
  12. Po odwirowaniu usunąć i wyrzucić supernatant. Delikatnie ponownie zawiesić mieszaninę komórkową, rozcierając ją w 3 ml kompletnych pożywek neuronowych. Unikaj generowania pęcherzyków powietrza podczas tego etapu i wszystkich przyszłych etapów, w których mieszanina komórek jest rozcierana. Wszystkie tarcia powinny być wykonywane bardzo delikatnie. Przefiltruj roztwór komórkowy przez siatkę Nitex do czystej probówki do hodowli komórkowej o pojemności 15 ml.
  13. Opcjonalnie: Zakręć probówkę do hodowli komórkowej i umieść w chłodzonym mikserze Hula (lub dowolnym mikserze, który zapewnia obrót) z delikatnym toczeniem i przechylaniem na 30 minut. Ten krok jest opcjonalny, ale zalecany.
  14. Opcjonalnie: Po mikserze Hula dodaj 2 ml zimnego płynu do płukania, aby umyć komórki.
  15. Zebrać komórki przez odwirowanie (8 min, 356 x g). Usunąć i odrzucić supernatant.
  16. Ponownie zawiesić komórki w kompletnym pożywce neuronowej o objętości 1,200 μl. Delikatnie rozcieraj komórki za pomocą plastikowej końcówki do pipety o pojemności 1 ml. Nie wytwarzaj pęcherzyków powietrza. Pipetuj powoli i delikatnie, aż większość kawałków zostanie rozdrobniona, a komórki zawieszone w płynie.
  17. Dodać 750 μl kompletnej pożywki do każdej z 12 studzienek zawierających wstępnie powlekane szklane szkiełko nakrywkowe i dodać 100 μl roztworu rozcieranych komórek.
  18. Inkubować neurony w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
  19. Zmieniaj połowę nośnika komórkowego co 2 dni.
  20. Neurony są gotowe do zapisów elektrofizjologicznych po 1 - 2 dniach w hodowli.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Bezpośrednio po izolacji komórek pochodzących z LMMP neurony i inne typy komórek nie będą łatwo dostrzegalne. Można zaobserwować żywe, okrągłe komórki o nieokreślonym fenotypie, a także detrytus tkankowy z niecałkowicie strawionych fragmentów tkanek i tkanki łącznej. Te zanieczyszczenia nie stanowią problemu i zostaną w większości usunięte podczas pierwszej wymiany pożywki za dwa dni. Nie należy próbować czyścić szkiełek przed tym terminem, ponieważ usunięte zostaną również zdrowe, żywotne komórki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Wykorzystane zwierzęta

Ten protokół został zoptymalizowany dla szwajcarskich myszy Webster. Jednak tę metodę można łatwo dostosować do innych małych ssaków, takich jak szczury i inne szczepy myszy. Z powodzeniem przeprowadziliśmy wstępne izolacje myszy C57 i nokautowanie receptora opioidowego μ. Jednak możliwe jest również, że inne szczepy myszy mogą być problematyczne ze względu na zmiany morfologiczne w przewodzie pokarmowym. Ponadto znane są różnice między szczepami myszy (C57Bl/6 vs. Balb/c) ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie istnieją żadne główne konkurencyjne interesy.

Podziękowania

Grant Narodowego Instytutu Zdrowia DA024009, DK046367 & T32DA007027.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Odczynniki
Fisherbrand Szkło nakrywkowe do szkieł nakrywkowych (średnica 12 mm)Fisher Scientific12-545-82 
Poli-D-lizynaSigmaP6407- 5 mg 
24-dołkowa płytka do hodowli komórkowejCELLTREAT229124Może używać dowolnej marki
LamininBD Biosciences354 232 
ddH2OMoże przygotować w laboratorium 
15 ml sterylna probówka wirówkowaGreiner Bio-one188261Może używać dowolnej marki
50 ml sterylnej probówki wirówkowejGreiner Bio-one227261Może używać dowolnej marki
NaClFisher BioReagentsBP358-212MW 58.44
KClFisher BioReagentsBP366-500MW 74.55
NaH2PO4 .2H2OFisher ChemicalsS369-3MW137.99
MgSO4Sigma AldrichM7506-500GMW 120.4
NaHCO3Sigma AldrichS6014-5KGMW 84.01
glukozaFisher ChemicalsD16-1MW 180.16
CaCl22H2OSigma AldrichC5080-500GMW 147.02
F12 MediaGibco11330 
Płodowa surowica bydlęcaQuality Biological Inc.110-001-101HIMoże używać dowolnej marki
Antybiotyk/Antybiotyk 100x płynGibco15240-062 
Neurobasal A mediaGibco10888 
200 mM L-glutaminaGibco25030164 
Neurotroficzny czynnik glejowy (GDNF)NeuromikaPR27022 
Nożyczki preparacyjne z ostrymi końcówkamiFisher Scientific8940Może używać kleszczy
tkanek dowolnejFisher Scientific13-812-41Może używać dowolnej marki
Aplikatory z bawełnianą końcówkąFisher Scientific23-400-101Może używać dowolnej marki
250 ml Szklana zlewka z podziałkąFisher ScientificFB-100-250Może używać dowolnej marki
2 L Szklana kolba ErlenmyerFisher ScientificFB-500-2000Może używać dowolnej marki
Plastikowy pręt (pędzel dziecięcy)Crayola05 3516Może używać dowolnej marki
CarbogenAirgasUN 31565% CO2
10 ml Strzykawka Leur-lockBecton Dickinson309604Może używać dowolnej marki
21 G x 1 1/2 cala. Igła podskórnaBecton Dickinson305167Może używać dowolnej marki
Kolagenaza typu 2WorthingtonLS004174 
Albumina surowicy bydlęcej AmerykańskaAB00440 
2 ml Mikrowirówki EppendorfFisher Scientific13-864-252Może używać dowolnej marki
Nitrex Mesh 500 µ MElko Filtering Co100560Może używać dowolnej marki
Zestaw pipetFisher Scientific21-377-328Może używać dowolnej marki
Kamień do ostrzeniaFisher ScientificNC9681212Może używać dowolnej marki
Equipment
LabGard ES 425 Szafka bezpieczeństwa biologicznego (kaptur do hodowli komórkowych)NuaireNU-425-400Może używać dowolnego Marka
10 L Kąpiel wodna z wytrząsaniemEdvotek5027Może używać dowolnej marki
Mikrowirówka 5417REppendorf5417RMoże używać jednej większej wirówki z adapterami rozmiaru
Wirówka Allegra serii 6Beckman Coulter366816Może używać dowolnej marki
HuluMixer Sample MixerInvitrogen15920D 
Inkubator CO2 z płaszczem wodnym AutoFlowNuiareNU-4750Może używać dowolnej marki
Waga analitycznaMettler ToledoXS104Może używać dowolnej marki
do marki

Bibliografia

  1. Furness, J. B. The enteric nervous system and neurogastroenterology. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 9 (5), 286-294 (2012).
  2. Gershon, M. D. The enteric nervous system: A second brain. Hosp. Pract. (Minneap). 34 (7), 31-32 (1999).
  3. Gershon, A. A., Chen, J., Gershon, M. D. A model of lytic, latent, and reactivating varicella-zoster virus infections in isolated enteric neurons. J. Infect. Dis. 197, 61-65 (2008).
  4. Wakabayashi, K., Mori, F., Tanji, K., Orimo, S., Takahashi, H. Involvement of the peripheral nervous system in synucleinopathies, tauopathies and other neurodegenerative proteinopathies of the brain. Acta. Neuropathol. 120 (1), 1-12 (2010).
  5. Hirst, G. D., Holman, M. E., Spence, I. Two types of neurones in the myenteric plexus of duodenum in the guinea-pig. J. Physiol. 236 (2), 303-326 (1974).
  6. Clerc, N., Furness, J. B., Bornstein, J. C., Kunze, W. A. Correlation of electrophysiological and morphological characteristics of myenteric neurons of the duodenum in the guinea-pig. Neuroscience. 82 (3), 899-914 (1998).
  7. Rugiero, F., et al. Analysis of whole-cell currents by patch clamp of guinea-pig myenteric neurones in intact ganglia. J. Physiol. 538 (Pt. 2), 447-463 (2002).
  8. Jessen, K. R., Saffrey, M. J., Baluk, P., Hanani, M., Burnstock, G. The enteric nervous system in tissue culture. III. studies on neuronal survival and the retention of biochemical and morphological differentiation. Brain Res. 262 (1), 49-62 (1983).
  9. Smith, T. H., Grider, J. R., Dewey, W. L., Akbarali, H. I. Morphine decreases enteric neuron excitability via inhibition of sodium channels. PLoS One. 7 (9), e45251(2012).
  10. Abdo, H., et al. Enteric glial cells protect neurons from oxidative stress in part via reduced glutathione. FASEB J. 24 (4), 1082-1094 (2010).
  11. Aube, A. C., et al. Changes in enteric neurone phenotype and intestinal functions in a transgenic mouse model of enteric glia disruption. Gut. 55 (5), 630-637 (2006).
  12. Bassotti, G., et al. Enteric glial cells and their role in gastrointestinal motor abnormalities: Introducing the neuro-gliopathies. World J. Gastroenterol. 13 (30), 4035-4041 (2007).
  13. Neal, K. B., Parry, L. J., Bornstein, J. C. Strain-specific genetics, anatomy and function of enteric neural serotonergic pathways in inbred mice. J. Physiol. 587 (Pt. 3), 567-586 (2009).
  14. Phillips, R. J., Walter, G. C., Powley, T. L. Age-related changes in vagal afferents innervating the gastrointestinal tract. Auton. Neurosci. 153 (1-2), 90-98 (2010).
  15. Furness, J. B. Types of neurons in the enteric nervous system. J. Auton. Nerv. Syst. 81 (1-3), 87-96 (2000).
  16. Gulbransen, B. D., Sharkey, K. A. Novel functional roles for enteric glia in the gastrointestinal tract. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 9 (11), 625-632 (2012).
  17. Pomeranz, H. D., Rothman, T. P., Chalazonitis, A., Tennyson, V. M., Gershon, M. D. Neural crest-derived cells isolated from the gut by immunoselection develop neuronal and glial phenotypes when cultured on laminin. Dev. Biol. 156 (2), 341-361 (1993).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

mięsień podłużnytrawienie enzymatyczneizolacja komórekimmunohistochemiaelektrofizjologiaobrazowanie wapniaPCR pojedynczych komórekbarwienie GFAP
Preparat in vitro izolowanych neuronów jelitowych i gleju ze splotu mięśniowo-jelitowego dorosłej myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.