Artykuł metodologiczny

Tomografia optyczna całych mózgów myszy z rozdzielczością mikronową z konfokalną mikroskopią arkuszową światła

20.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50696

⸱

8 października 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1European Laboratory for Non-linear Spectroscopy (LENS), 2Integrated Research Centre, University Campus Bio-medico of Rome, 3DAEMI, University of Cassino, 4National Institute of Optics (CNR-INO), 5Allen Institute for Brain Science, 6Department of Physics, University of Florence, 7ICON Foundation, Sesto Fiorentino, Italy

W tym artykule

Podsumowanie

W tym artykule opisujemy pełną procedurę eksperymentalną mającą na celu zrekonstrukcję, z wysoką rozdzielczością, anatomii mózgu fluorescencyjnie znakowanych myszy. Opisany protokół obejmuje przygotowanie i oczyszczanie próbki, montaż próbki do obrazowania, przetwarzanie końcowe danych oraz wizualizację wieloskalową.

Streszczenie

Zrozumienie architektury mózgu ssaków w rozdzielczości pojedynczej komórki jest jednym z kluczowych zagadnień neuronauki. Jednak mapowanie somy neuronalnej i projekcji w całym mózgu nadal stanowi wyzwanie dla technologii obrazowania i zarządzania danymi. Rzeczywiście, objętości makroskopowe muszą być rekonstruowane z wysoką rozdzielczością i kontrastem w rozsądnym czasie, tworząc zestawy danych w zakresie TeraByte. Niedawno zademonstrowaliśmy metodę optyczną (konfokalna mikroskopia arkuszowa światła, CLSM) zdolną do uzyskania rekonstrukcji w skali mikronowej całych mózgów myszy znakowanych wzmocnionym białkiem zielonej fluorescencji (EGFP). Łącząc oświetlenie arkuszem światła i detekcję konfokalną, CLSM umożliwia głębokie obrazowanie wewnątrz makroskopowo oczyszczonych próbek z wysokim kontrastem i szybkością. W tym miejscu opisujemy kompletny proces eksperymentalny w celu uzyskania kompleksowych i czytelnych dla człowieka obrazów całych mózgów myszy znakowanych białkami fluorescencyjnymi. Opisano procedury czyszczenia i montażu, wraz z krokami do wykonania tomografii optycznej na całej objętości poprzez pozyskanie wielu równoległych sąsiednich stosów. Pokazaliśmy wykorzystanie niestandardowych narzędzi programowych typu open source, które umożliwiają łączenie wielu stosów i nawigację po danych w wielu rozdzielczościach. Na koniec zilustrowaliśmy kilka przykładów map mózgu: móżdżek transgenicznej myszy L7-GFP, w której wszystkie komórki Purkinjego są selektywnie znakowane, oraz cały mózg myszy thy1-GFP-M, charakteryzujący się losowym rzadkim znakowaniem neuronalnym.

Wprowadzenie

W porównaniu z naszym zrozumieniem molekularnych i komórkowych mechanizmów leżących u podstaw funkcjonowania mózgu, nasza wiedza na temat anatomii subtelnej wygląda na wciąż w powijakach1. W rzeczywistości wciąż brakuje nam kompleksowych map położenia somatów neuronalnych lub projekcji dalekiego zasięgu w całym mózgu. W rzeczywistości wiele wysiłków technologicznych poświęca się rekonstrukcji mózgu myszy z mikroskopijną rozdzielczością. Metody optyczne oparte na seryjnym cięciu próbek zatopionych w żywicy, takie jak mikroskopia skaningowa Knife-Edge (KESM)2, mikrooptyczna tomografia przekrojowa (MOST)3 i fluorescencyjna-MOST (fMOST)4, mogą zapewnić obrazowanie całych mózgów myszy w rozdzielczości trójwymiarowej w rozdzielczości submikronowej. Jednak całkowity czas potrzebny na przygotowanie i zobrazowanie pojedynczej próbki jest rzędu kilku tygodni, co ogranicza praktyczne zastosowanie takich metod. Inna technika oparta na szeregowym cięciu (ale bez zatapiania żywicy), seryjna tomografia dwufotonowa (STP)5, umożliwia obrazowanie w wysokiej rozdzielczości trójwymiarowej. Jednak technika ta została zademonstrowana na całych mózgach myszy tylko przy bardzo rzadkim pobieraniu próbek, zbierając 1 sekcję co 50 μm 5, a według naszej wiedzy STP nie wyprodukowano jeszcze pełnej rekonstrukcji mózgu myszy.

Najnowocześniejszą metodą optyczną do rekonstrukcji całych próbek w trzech wymiarach z dużą prędkością jest mikroskopia świetlna6. W tym schemacie optycznym próbka jest oświetlana cienkim arkuszem światła, a emisja fluorescencji jest zbierana wzdłuż osi prostopadłej do płaszczyzny oświetlenia. W ten sposób wzbudzane są tylko fluorofory ostrzone i możliwe jest uzyskanie przekroju optycznego w konfiguracji szerokiego pola, gwarantując wysoką liczbę klatek na sekundę. W połączeniu z protokołami oczyszczania opartymi na podstawieniu wody o współczynniku załamania światła pasującym do cieczy7, mikroskopia arkuszowa światła została zastosowana do próbek makroskopowych, takich jak całe mózgi myszy8. Jednak rozpraszanie światła wywołane przez próbkę, które wpływa nawet na oczyszczone próbki, degraduje arkusz świetlny, prowadząc do wzbudzenia nieostrych fluoroforów, co powoduje ogólne rozmycie uzyskanych obrazów.

Aby selektywnie zbierać tylko ostre fotony, niedawno połączyliśmy oświetlenie arkusza świetlnego ze schematem detekcji konfokalnej9. W konfokalnej mikroskopii arkuszowej (CLSM) nieostre i rozproszone fotony są odrzucane przez liniowy filtr przestrzenny (szczelinę) przed wykryciem (ryc. 1). Aby uzyskać działanie konfokalne w architekturze arkusza świetlnego, oświetlenie jest wytwarzane za pomocą linii skanującej, a system deskanowania w ścieżce detekcji tworzy statyczny obraz linii skanowania wzbudzenia w miejscu szczeliny. Trzeci system skanowania rekonstruuje dwuwymiarowy obraz na matrycy kamery. CLSM zapewnia 100% poprawę kontrastu w oczyszczonych mózgach myszy w porównaniu z konwencjonalną mikroskopią świetlną, przy zachowaniu częstotliwości odświeżania 10 Hz. Dzięki CLSM możliwe jest zrekonstruowanie całych mózgów myszy z rozdzielczością 2 μm w XY i 9 μm w Z oraz z wystarczającym kontrastem, aby dostrzec pojedyncze neurony znakowane fluorescencyjnie.

W tym artykule opisujemy eksperymentalny proces rekonstrukcji mózgu myszy za pomocą CLSM. Mózgi myszy utrwalone aldehydami są odwadniane w stopniowanej serii tetrahydrofuranu bez nadtlenków, a następnie oczyszczane w wolnym od nadtlenku eterze dibenzylowym (ryc. 2), zgodnie z protokołem opracowanym przez Beckera i wsp.10 Oczyszczona próbka jest następnie ostrożnie umieszczana na płytki z końcówką i umieszczana w komorze obrazowania specjalnie zaprojektowanego konfokalnego mikroskopu z arkuszem światła. Próbkę można zamontować bezpośrednio, zanurzając ją na końcówce płytki (rysunek 3a); alternatywnie można go przykleić na krążku oczyszczonego żelu agarozowego (ryc. 3b) lub umieścić we wnęce zlewki wykonanej z oczyszczonego żelu agarozowego (ryc. 3c). Następnie wykonywana jest tomografia optyczna całego mózgu, ponieważ pobiera się wiele równoległych sąsiednich stosów, aby pokryć całą objętość mózgu (ryc. 4). Pobieranie próbek przed tomografią, które tworzy przybliżoną mapę położenia i kształtu próbki, gwarantuje, że obrazowanie jest wykonywane tylko w objętości zajmowanej przez próbkę. Stosy tomografii są następnie łączone ze sobą za pomocą specjalnego oprogramowania i zapisywane w hierarchicznym schemacie o wielu rozdzielczościach11. Mózgi myszy można w końcu zbadać za pomocą prototypowego oprogramowania do wizualizacji w wielu rozdzielczościach, podobnego do Google Maps. Oba te instrumenty programowe są zintegrowane jako wtyczki z platformą open source Vaa3D12.

W końcu pokazujemy reprezentatywne obrazy mózgów myszy, aby zademonstrować możliwości opisanego eksperymentalnego procesu badania anatomii drobnych myszy.

Protokół

1. Przygotowanie i przechowywanie tkanek

  1. Utrwal mózg myszy za pomocą standardowej perfuzji przezsercowej13 za pomocą 20 ml 0,01 M roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS), a następnie 100 ml paraformaldehydu 4% w 0,01 M PBS. Ostrożnie dostosować pH obu roztworów do 7,6: nieco niższe wartości pH mogą wygasić fluorescencję EGFP.
  2. Wycięte mózgi należy utrwalić przez noc w paraformaldehydzie 4% w temperaturze 4 °C.
  3. Wypłukać dwa razy (po 30 minut) w 0,01 M PBS i przechowywać w 0,01 M PBS w temperaturze 4 °C.

2. Odwodnienie i oczyszczenie

Uwaga: protokół odwodnienia i oczyszczania jest ściśle zgodny z tym opisanym przez Beckera i wsp.10

  1. W celu usunięcia nadtlenków z rozpuszczalnika odwadniającego (tetrahydrofuranu, THF), które silnie tłumią fluorescencję XFP, należy przefiltrować THF zasadowym aktywowanym tlenkiem glinu (stopień aktywności Brockman I, około 250 g/L THF) za pomocą kolumny chromatograficznej. Unikaj pękania kolumny, co zmniejszyłoby usuwanie nadtlenku.
  2. Dodać stabilizator (butylowany hydroksytoluen, 250 mg/l) do roztworu końcowego, nawet jeśli THF był już ustabilizowany przed filtracją. Stabilizator jest w rzeczywistości zatrzymywany przez tlenek glinu: THF bez stabilizatora może wytwarzać duże ilości nadtlenków i może być wybuchowy i niebezpieczny.
  3. Odwodnić cały mózg myszy w stopniowanej serii THF w czystej wodzie: 50%, 70%, 80%, 90%, 96%, 100%, 1 godzina, a następnie 100% przez noc. Umieścić fiolkę z próbką na obracającym się kole. Aby uniknąć ekspozycji na światło, owinąć fiolki folią aluminiową.
  4. Przefiltrować rozpuszczalnik czyszczący (eter dibenzylowy, DBE) z tlenkiem glinu (aktywowana zasada, klasa aktywności Brockman I, około 250 g/l DBE) za pomocą lejka filtrującego.
  5. Oczyść próbkę w 100% DBE. Zmień roztwór po 3 i 6 godzinach.

3. Montaż próbki

  1. Kiedy mózg wydaje się przezroczysty na oko (zwykle 1 godzinę po drugiej zmianie DBE), zamontuj go na przechylonej płytce obrazowej za pomocą jednej z następujących metod:
    1. Montaż bezpośredni - Delikatnie zanurz próbkę na jednej z końcówek (Rysunek 3a).
    2. Krążek agarozowy - Zanurz krążek wykonany z 6% żelu agarozowego na końcówkach. Delikatnie przymocuj próbkę do krążka agarozy za pomocą kleju akrylowego (Rysunek 3b). Odczekaj około 1 minuty na utwardzenie.
    3. Zlewka agarozowa - Zanurz zlewkę wykonaną z 3% żelu agarozowego na końcach. Delikatnie umieścić próbkę na dnie zlewki (Rysunek 3c).

Uwaga 1: Montaż w zlewce agarozowej powinien być preferowany, gdy ważne jest obrazowanie próbki w całości; jednak żel agarozowy otaczający próbkę powoduje dodatkowe rozpraszanie światła, które może być szkodliwe dla jakości obrazu. Jeśli niewielka część próbki może zostać wykluczona z obrazowania, lepiej jest zamontować próbkę na krążku agarozy lub bezpośrednio na końcówce. Pierwsza metoda najlepiej nadaje się do utrzymania mózgu w pozycji poziomej (z wyłączeniem obrazowania brzusznej lub grzbietowej części mózgu), druga do utrzymania mózgu w pionie (z wyłączeniem obrazowania części opuszki węchowej lub rdzenia kręgowego).

Uwaga 2: żel agarozowy powinien być przygotowany w wodzie, a następnie odwodniony za pomocą THF (50% i 100% po 4 godziny) i oczyszczony w DBE 100% przez 4 godziny lub do momentu, gdy stanie się wyraźnie przezroczysty.

  1. Po zamontowaniu próbki zgodnie z jedną z poprzednich metod, umieść płytkę obrazową w komorze próbki za pomocą pęsety. Napełnij komorę roztworem czyszczącym.

4. Przygotowanie do tomografii

  1. Usuń szczelinę, aby zebrać jak najwięcej fluorescencji.
  2. Oświetl próbkę niską mocą lasera, aby zapobiec fotowybielaniu.
  3. Przesuń próbkę w trzech kierunkach za pomocą sterowanego programowo systemu mikropozycjonowania. Dla każdego kierunku należy określić minimalne i maksymalne współrzędne, dla których próbka jest oświetlona i znajduje się w polu widzenia kamery (rysunek 4a).
  4. Wstawić powyższe współrzędne jako parametry podprogramu "Tomografia wstępna". Należy również określić odległość między sąsiednimi kominami, które mają być używane w tomografii, oraz krok pobierania próbek przed tomografią w kierunku z.
  5. Uruchom tomografię wstępną, która zbiera obrazy w każdym stosie z próbkowaniem z określonym w (4.4).

Uwaga: Zebrane obrazy są wykorzystywane przez oprogramowanie do przygotowania przybliżonej mapy kształtu i pozycji próbki (Rysunek 4b), co pozwala ograniczyć akwizycję tomografii tylko do objętości faktycznie zajmowanej przez próbkę, skracając czas obrazowania, a tym samym fotowybielanie.

5. Akwizycja tomografii

  1. Przenieść próbkę na zewnątrz arkusza świetlnego za pomocą systemu mikropozycjonowania.
  2. Zwiększ moc lasera i zatrzymaj ruch wszystkich systemów skanujących, aby oświetlić tylko ustaloną linię w środku pola widzenia.
  3. Zamontuj szczelinę i wyrównaj ją za pomocą sygnału autofluorescencji z roztworu czyszczącego. Powinieneś wyraźnie widzieć linię szczeliny w środku pola widzenia.
  4. Ponownie aktywuj system skanowania, zmniejsz moc lasera i przenieś próbkę do wnętrza arkusza świetlnego za pomocą systemu mikropozycjonowania. Należy pamiętać, że moc lasera użytego ze szczeliną będzie wyższa niż ta użyta bez niej, ponieważ filtr przestrzenny blokuje niebagatelną część światła.
  5. Dostosuj amplitudę i przesunięcie systemów skanowania i deskanowania za pomocą oprogramowania sterującego, aż obrazy będą wyraźne i jasne.
  6. Uruchom oprogramowanie do akwizycji tomografii, po ustawieniu odpowiedniego kroku z dla eksperymentu. Wolumin zostanie zobrazowany w wielu równoległych, częściowo nakładających się stosach (Rysunek 5a), a obrazy zostaną zapisane w hierarchicznej strukturze folderów.

6. Łączenie i wizualizacja

  1. Uzupełnij uzyskaną objętość syntetycznymi czarnymi obrazami (tj. obrazami tego samego typu i wymiarami co pobrane, ale o zerowej intensywności) za pomocą zautomatyzowanego oprogramowania (Rysunek 4c). Ten krok jest obowiązkowy, aby oprogramowanie do szycia poradziło sobie z pełną objętością sześcienną.
  2. Uruchom oprogramowanie Vaa3D (do pobrania za darmo ze strony http://www.vaa3d.org/) z zainstalowanymi wtyczkami TeraStitcher i TeraManager.
  3. Załaduj wtyczkę TeraStitcher. Wybierz katalog zawierający obrazowany wolumin, wskaż względne orientacje osi (w odniesieniu do układu współrzędnych prawoskrętnych odniesienia) i rozmiar woksela.
  4. Uruchom pierwszą część szwu. Oprogramowanie obliczy względne przemieszczenie między parami stosów i znajdzie ogólne optymalne rozmieszczenie dla wszystkich stosów razem (rysunek 5b).
  5. Zaznacz, aby zapisać zszyty wolumin w formacie pojedynczej rozdzielczości lub w formacie wielu rozdzielczości. Ten ostatni umożliwia wizualizację w wielu rozdzielczościach za pomocą wtyczki TeraManager. W obu przypadkach, jeśli obraz o wyższej rozdzielczości jest większy niż kilka gigabajtów, wybierz również tryb zapisywania wielu stosów i określ rozmiar poszczególnych stosów podrzędnych. Umożliwi to sprawny dostęp do przechowywanych danych.
  6. Uruchom drugą część szwu. Oprogramowanie scali wyrównane stosy i zapisze je w trybie jedno- lub wielostosowym (rysunki 5c i 5d). Na koniec zamknij wtyczkę TeraStitcher.
  7. Załaduj wtyczkę TeraManager. Wybierz folder z woluminem wielostosowym o wielu rozdzielczościach i wskaż rozmiar woksela oraz orientacje osi. Wolumin zostanie załadowany w minimalnej rozdzielczości.
  8. Aby powiększyć do wyższej rozdzielczości, wybierz punkt orientacyjny za pomocą trybu kliknięcia prawym przyciskiem myszy Vaa3D, a następnie powiększ za pomocą przewijania myszy. Alternatywnie możesz bezpośrednio wybrać ROI, aby powiększyć za pomocą kliknięcia prawym przyciskiem myszy lub określić współrzędne interesującego Cię woluminu.
  9. Aby powiększyć z powrotem do niższej rozdzielczości, po prostu użyj przewijania myszy.

Wyniki

Opisany protokół można wykorzystać do rekonstrukcji z rozdzielczością mikronową całych mózgów myszy lub ich wyciętych fragmentów, bez konieczności fizycznego sekcjonowania. Jako reprezentatywny wynik na Rysunku 6 przedstawiono cały móżdżek myszy L7-GFP (10. dzień po urodzeniu). U tego zwierzęcia wszystkie neurony Purkinjego są znakowane EGFP. Po powiększeniu widoczna jest typowa struktura lamelarna kory móżdżku (Rysunek 7). Dalsze powiększenie pozwala na wyraźne rozróżnienie ciała każdej komórki Purkinjego (Rysunek 8). Opisany protokół może zatem służyć do analizy przestrzennej organizacji neuronów w różnych badaniach nad rozwojem układu nerwowego.

Jako drugi reprezentatywny wynik przedstawiamy obrazy z nieprzeciętego mózgu dorosłej myszy thy1-GFP-M. U tego zwierzęcia transgenicznego EGFP jest ekspresyjne w losowym, rozproszonym podzbiorze neuronów. Prawa połowa mózgu została pokazana na Rysunku 9. Wraz z dalszym zwiększaniem powiększenia (Rysunki 10 oraz 11), wypustki neuronalne stają się rozróżnialne. Wynik ten demonstruje, że opisany protokół umożliwia obrazowanie z rozdzielczością mikronową w całych mózgach dorosłych myszy, co otwiera możliwość badania anatomii całego mózgu z rozdzielczością komórkową w mysich modelach chorób neurodegeneracyjnych.

Schemat układu optycznego; widok z góry i z boku drogi światła dla wzbudzenia laserem 488 nm.
Rysunek 1. Schemat optyczny konfokalnej mikroskopii arkusza światła (CLSM). (a) Widok z góry urządzenia, pokazujący drogę wzbudzenia. Emisja lasera z diodowo pompowanego lasera stałego (DPSS) 488 nm, po rozszerzeniu i kolimacji przez pierwszy teleskop, wpada do akustooptycznego filtra strojonego (AOTF), który reguluje intensywność wiązki. Następnie drugi teleskop dodatkowo rozszerza wiązkę. Lustro galwanometryczne skanuje wiązkę w pionie (wzdłuż osi y), która jest ogniskowana przez soczewkę wewnątrz komory z preparatem. (b) Widok z boku urządzenia, pokazujący drogę detekcji. Światło zbierane przez obiektyw detekcyjny jest odskanowywane w pionie przez lustro galwanometryczne i ogniskowane przez soczewkę, co tworzy stały obraz poruszającej się linii wzbudzenia. W pozycji stałego obrazu umieszczony jest liniowy filtr przestrzenny (szczelina). Za szczeliną lustro galwanometryczne umieszczone w systemie soczewek 4f rekonstruuje dwuwymiarowy obraz na matrycy urządzenia ładunkowo-sprzężonego z mnożeniem elektronów (EM-CCD). Filtr pasmowy fluorescencji usuwa całe rozproszone światło wzbudzenia przed detekcją. Reprezentatywne promienie światła wzbudzenia, detekcji oraz detekcji przefiltrowanej przez filtr pasmowy przedstawiono odpowiednio jako promienie niebieskie, jasnoniebieskie i zielone. Wskazano ogniskowe wszystkich soczewek faktycznie zastosowanych w mikroskopie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.

Schemat środków do przejaśniania tkanek naczyniowych; porównanie rozpuszczalników PBS, THF i DBE w układzie eksperymentalnym.
Rycina 2. Przejaśnianie preparatów. Utrwalone formaldehydem mózgi myszy, przechowywane w PBS 0.1 M w temperaturze 4 °C (a), są odwadniane w szeregu stężeń tetrahydrofuranu (THF, b), a następnie przejaśniane w 100% dibenzylu eterze (DBE, c). Etap odwadniania powoduje również pewien skurcz tkanki.

Schemat procesu fiksacji mózgu z etapami: a) pozycjonowanie, b) stabilizacja, c) zamknięcie w środowisku.
Rycina 3. Montaż preparatu do obrazowania CLSM. Oczyszczony mózg można umieścić bezpośrednio na nachylonej płytce montażowej (a), przykleić do oczyszczonego dysku agarowego (b) lub umieścić w oczyszczonym zlewce agarowym (c).

Schemat procesu rekonstrukcji 3D; obejmuje osie wektorowe i segmentację wokseli do analizy.
Rysunek 4. Akwizycja tomograficzna. Procedura przedtomograficzna pobiera próbki z prostopadłościanu zawierającego mózg (a), aby określić liczbę i długość równoległych, sąsiadujących stosów niezbędnych do obrazowania całego preparatu (b). Po tomografii generowane są czarne obrazy w celu uzupełnienia wirtualnie pozyskanej objętości do kształtu prostopadłościanu (c).

Schematy przestrzennego rozmieszczenia struktur 3D w obrębie prostopadłościanów, podkreślające zmienność skalowania.
Rysunek 5. Szycie wolumetryczne. Zebrane stosy obrazów częściowo na siebie nachodzą (a), co umożliwia ich precyzyjne wyrównanie za pomocą wtyczki TeraStitcher (b). Następnie wtyczka łączy wyrównane stosy w reprezentację wielorozdzielczą, albo w formie pojedynczego stosu (c), albo wielu stosów (d).

Obraz mikroskopowy anatomii pierścienicy; badanie biologiczne struktury i funkcji mięśni.
Rycina 6. Cały móżdżek myszy P10 L7-GFP, w której wszystkie neurony Purkinjego są znakowane EGFP. Pasek skali, 1 mm.

Obraz tkanki mózgowej z mikroskopu fluorescencyjnego, ilustrujący organizację komórkową.
Rycina 7. Powiększenie fragmentu móżdżku przedstawionego na Rycini 6, ukazujące typową strukturę lamelarną kory móżdżku. Pasek skali, 500 μm.

Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej komórek korzenia przedstawiający analizę struktury komórkowej i wzorca wzrostu.
Rycina 8. Dalsze powiększenie fragmentu móżdżku przedstawionego na Rycini 6. Wyraźnie widoczne są somaty komórek Purkinjego. Pasek skali, 200 μm.

Obraz z mikroskopu fluorescencyjnego tkanki mózgowej przedstawiający rozkład białek, potencjał analizy spektralnej.
Rycina 9. Prawa połowa mózgu dorosłej myszy thy1-GFP-M, charakteryzująca się rzadkim, nieswoistym znakowaniem neuronów EGFP. Pasek skali, 1 mm.

Fluorescencja sieci neuronalnej, obraz mikroskopowy, wizualizacja szlaku nerwowego w tkance mózgowej.
Rycina 10. Powiększenie fragmentu połowy mózgu przedstawionej na Rycini 9, ukazujące część hipokampa i kory. Pasek skali, 200 μm.

Mikroskopia fluorescencyjna sieci neuronalnej; obrazowanie neuronów, wizualizacja połączeń synaptycznych.
Rycina 11. Dalsze powiększenie fragmentu połowy mózgu przedstawionej na Rycinie 9. Można wyraźnie rozróżnić kilka neurytów w korze. Pasek skali, 50 μm.

Dyskusja

CLSM w połączeniu z oczyszczaniem chemicznym stanowi potężne narzędzie do badania neuroanatomii całych mózgów myszy znakowanych sondami fluorescencyjnymi, białkami lub syntetycznymi barwnikami. Ponieważ światło emitowane poza płaszczyzną ogniskowej jest blokowane przez fizyczny filtr przestrzenny, obrazowanie o wysokim kontraście jest możliwe również w grubych próbkach, przy zachowaniu wysokiej liczby klatek na sekundę typowej dla architektury arkuszy świetlnych.

Główną kwestią, z którą należy się zmierzyć przy stosowaniu opisanych metod, jest maksymalizacja kontrastu. W rzeczywistości dostępny sygnał jest redukowany zarówno przez czynniki chemiczne, jak i optyczne. Z chemicznego punktu widzenia procedury oczyszczania oparte na rozpuszczalniku organicznym mogą wygaszać emisję z białek fluorescencyjnych i innych barwników fluorescencyjnych7. Filtracja rozpuszczalnika w celu usunięcia nadtlenków, zgodnie z opisem Beckera i wsp.10, pozwala na utrzymanie dobrego poziomu fluorescencji również w tkankach oczyszczonych rozpuszczalnikiem. Opublikowane metody oczyszczania na baziewody14 nie zmniejszają wydajności fluorescencji, ale skutkują gorszą przezroczystością w przypadku całych mysich mózgów, przynajmniej w przypadku liniowych technik optycznych.

Z drugiej strony, w chwili obecnej nie ma celów komercyjnych z dużą odległością roboczą skorygowaną o zastosowane rozwiązania czyszczące o wysokim współczynniku załamania światła (n ≈ 1,56). W związku z tym niedopasowanie współczynnika załamania światła między ośrodkiem, w którym zanurzona jest próbka, a projektem obiektywu, powoduje silne aberracje sferyczne. Oprócz zmniejszenia rozdzielczości mikroskopu, takie aberracje powodują spadek intensywności obrazu i kontrastu, ponieważ światło jest rozpraszane na szerszym obszarze. Możliwe obejście tego problemu obejmuje użycie optyki adaptatywnej15 i/lub statycznych korektorów asferycznych.

Każda poprawa kontrastu i intensywności obrazu ma również wpływ na szybkość obrazowania, ponieważ można wybrać krótszy czas integracji obrazu. W tej chwili CLSM może sobie pozwolić na prędkość obrazowania około 106 μm3/s, przy czasie naświetlania kamery 100 msek 9. Przy tej prędkości zobrazowanie całego mózgu myszy zajmuje od 1 do 3 dni, w zależności od wielkości próby. Chociaż nie obserwuje się znaczącego pogorszenia jakości obrazu podczas tak długiej sesji obrazowania, głównie z powodu nieodłącznie niskiego fotowybielania oświetlenia arkusza świetlnego6, długi czas potrzebny na zobrazowanie mózgu pojedynczej myszy może w praktyce zmniejszyć możliwość zastosowania CLSM. 10-krotny wzrost wydajności systemu, w połączeniu z wykorzystaniem szybkiej kamery do wykrywania, skróciłby czas obrazowania do kilku godzin, umożliwiając rutynowe korzystanie z opisanego protokołu.

Pomimo wszystkich wyżej wymienionych ograniczeń, obrazowanie CLSM w połączeniu z chemicznym oczyszczaniem tkanek pozwala zrekonstruować całe mózgi myszy z rozdzielczością w skali mikronowej w czasie krótszym niż tydzień. Inne metody optyczne do obrazowania całego mózgu zapewniają wyższą rozdzielczość niż CLSM, ale kosztem dłuższego czasu przygotowania i/lub obrazowania2-4 lub rzadkiego próbkowania z5.

Metody opisane w tym artykule mogą być stosowane w połączeniu z różnymi strategiami znakowania fluorescencyjnego: transgeniczne zwierzęta eksprymujące białka fluorescencyjne w wybranych podzbiorach neuronów, transfekcja wirusowa, iniekcja barwnika intrapażąższowego itp. W praktyce wszystkie strategie barwienia poprzedzające uśmiercenie zwierząt są zgodne z CLSM. W rzeczywistości do tej pory nie wykazano pośmiertnego znakowania fluorescencyjnego całych mózgów myszy; W każdym razie, jeśli taki rodzaj barwienia byłby możliwy w najbliższej przyszłości, liczba próbek, które można zrekonstruować za pomocą CLSM, stanie się znacznie większa, potencjalnie obejmując ludzką tkankę mózgową.

Podsumowując, konfokalna mikroskopia arkuszowa stosowana w połączeniu z oczyszczaniem tkanek i zarządzaniem danymi w wielu rozdzielczościach może pozwolić naukowcom na rekonstrukcję i analizę próbek makroskopowych z rozdzielczością w skali mikronowej, przy wysiłkach technologicznych, które są w zasięgu większości laboratoriów. Potencjalne zastosowania CLSM nie ograniczają się oczywiście do neurobiologii, ale obejmują wszystkie dziedziny badań, w których mikroskopia arkuszowa została już wykorzystana, jak embriogeneza16,17 i anatomia małych zwierząt18.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Badania prowadzące do tych wyników otrzymały dofinansowanie z Siódmego Programu Ramowego Unii Europejskiej (FP7/2007-2013) na podstawie umów o dotacje nr 228334 i 241526. Ten projekt badawczy został również wsparty grantem badawczym Human Frontier Science Program (RGP0027/2009) oraz przez włoskie Ministerstwo Edukacji, Szkolnictwa Wyższego i Badań w ramach flagowego projektu Nanomax oraz przez włoskie Ministerstwo Zdrowia w ramach "Zaproszenia do składania wniosków w zakresie komórek macierzystych". Badania te zostały przeprowadzone w ramach działalności badawczej fundacji ICON wspieranej przez "Ente Cassa di Risparmio di Firenze".

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Tabletki soli fizjologicznej buforowane fosforanamiSigma-AldrichP4417_100TAB
ParaformaldehydeAgar ScientificR1018
Tetrahydrofuran bez nadtlenkówSigma-Aldrich186562
Aktywowany tlenkiem glinu, zasadowy, Brockmann ISigma-Aldrich199443
Eter dibenzylowySigma-Aldrich 108014
Butylowany hydroksytoluenSigma-AldrichW218405
Agaroza Typ III-A, Wysoki EEOSigma-AldrichA9793
Klej akrylowyBostikD2498
Vaa3D oprogramowanieopen sourcedo pobrania bezpłatnie z http://www.vaa3d.org/

Bibliografia

  1. Lichtman, J. W., Denk, W. The big and the small: challenges of imaging the brain's circuits. Science. 334, 618-623 (2011).
  2. Mayerich, D., Abbott, L., McCormick, B. Knife-edge scanning microscopy for imaging and reconstruction of three-dimensional anatomical structures of the mouse brain. J. Microsc. 231, 134-143 (2008).
  3. Li, A., et al. Micro-optical sectioning tomography to obtain a high-resolution atlas of the mouse brain. Science. 330, 1404-1408 (2010).
  4. Gong, H., et al. Continuously tracing brain-wide long-distance axonal projections in mice at a one-micron voxel resolution. Neuroimage. 74, 87-98 (2013).
  5. Ragan, T., et al. Serial two-photon tomography for automated ex vivo mouse brain imaging. Nat. Methods. 9, 255-258 (2012).
  6. Keller, P. J., Dodt, H. U. Light sheet microscopy of living or cleared specimens. Curr. Opin. Neurobiol. 22, 138-143 (2012).
  7. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat. Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
  8. Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat. Methods. 4, 331-336 (2007).
  9. Silvestri, L., Bria, A., Sacconi, L., Iannello, G., Pavone, F. S. Confocal light sheet microscopy: micron-scale neuroanatomy of the entire mouse brain. Opt. Express. 20, 20582-20598 (2012).
  10. Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains. PLoS One. 7, e33916(2012).
  11. Bria, A., Iannello, G. TeraStitcher - A Tool for Fast Automatic 3D-Stitching of Teravoxel-Sized Microscopy Images. BMC Bioinformatics. 13, 316(2012).
  12. Peng, H., Ruan, Z., Long, F., Simpson, J. H., Myers, E. W. V3D enables real-time 3D visualization and quantitative analysis of large-scale biological image data sets. Nat. Biotechnol. 28, 348-353 (2010).
  13. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J. Vis. Exp. (65), e3564(2012).
  14. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat. Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
  15. Booth, M. J., Neil, M. A. A., Wilson, T. Aberration correction for confocal imaging in refractive-index-mismatched media. J. Microsc. 192, 90-98 (1998).
  16. Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305, 1007-1009 (2004).
  17. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322, 1065-1069 (2008).
  18. Jahrling, N., Becker, K., Schonbauer, C., Schnorrer, F., Dodt, H. U. Three-dimensional reconstruction and segmentation of intact Drosophila by ultramicroscopy. Front Syst. Neurosci. 4, 1(2010).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Obrazowanie m zgu myszyutrwalanie tkanekzszywanie obraz wwizualizacja wielorozdzielczaznakowanie bia kami fluorescencyjnymiutrwalanie eterem benzylowymprotok odwadnianianawigacja po oprogramowaniu

Powiązane artykuły