Technika przeszczepiania tkanki twarzy "Extreme Anterior Domain" pomiędzy embrionami Xenopus laevis została opracowana. Tkanka może być przenoszona z jednego tła ekspresji genów do drugiego, co pozwala na badanie lokalnych wymagań dotyczących rozwoju twarzoczaszki i sygnalizowania interakcji między regionami twarzy.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Przeszczepy twarzy w zarodkach Xenopus laevis
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wady wrodzone twarzoczaszki występują w 1 na 700 żywych urodzeń, ale etiologia jest rzadko znana ze względu na ograniczoną wiedzę na temat rozwoju twarzoczaszki. Aby określić, gdzie szlaki sygnałowe i tkanki działają podczas modelowania rozwijającej się twarzy, opracowano technikę "przeszczepu twarzy" w zarodkach żaby Xenopus laevis. Obszar przypuszczalnej tkanki twarzy ("Extreme Anterior Domain" (EAD)) jest usuwany z zarodka dawcy na etapie pąka ogonowego i przeszczepiany do zarodka gospodarza w tym samym stadium, z którego usunięto równoważny obszar. Można to wykorzystać do wygenerowania chimerycznej twarzy, w której tkanka gospodarza lub dawcy ma utratę lub zysk funkcji w genie i/lub zawiera etykietę linii. Po wygojeniu wynik rozwoju jest monitorowany i wskazuje role szlaku sygnałowego w obrębie dawcy lub otaczających tkanek gospodarza. Xenopus jest cennym modelem do rozwoju twarzy, ponieważ obszar twarzy jest duży i łatwo dostępny do mikromanipulacji. Wiele zarodków można oznaczyć w krótkim czasie, ponieważ rozwój następuje szybko. Odkrycia dotyczące żaby są istotne dla rozwoju człowieka, ponieważ procesy twarzoczaszki wydają się konserwatywne między Xenopus a ssakami.
Wprowadzenie
Aby zrozumieć mechanizmy leżące u podstaw wad wrodzonych twarzoczaszki1-2, należy zidentyfikować ważne tkanki i ich wkład sygnalizacyjny podczas rozwoju twarzoczaszki. U żaby Xenopus laevis część twarzy, w tym usta i nozdrza, tworzy się z "skrajnej domeny przedniej" (EAD), gdzie ektoderma i endoderma są bezpośrednio zestawione3-4. EAD działa również jako centrum sygnalizacyjne, wpływając na otaczające tkanki, w tym grzebień nerwowy czaszki, który tworzy szczęki i inne obszary twarzy5. Aby zidentyfikować geny, które przyczyniają się do funkcjonowania EAD, opracowano technikę "przeszczepu twarzy", w której tkanka jest przeszczep....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie odczynników
- 10x MBS: Przygotuj 1 l 10x zmodyfikowanego roztworu soli Bartha (MBS)17. Patrz Tabela 1, Odczynniki, składniki i instrukcje. Do wszystkich roztworów używaj wody destylowanej. Wymieszać w zlewce za pomocą mieszadła, aż do całkowitego rozpuszczenia. Wszystkie roztwory należy sporządzać w temperaturze pokojowej.
- 1x MBS: Rozcieńczyć 100 ml 10x roztworu MBS w 900 ml wody destylowanej, aby uzyskać 1 l 1x MBS. Dodać 0,7 ml 1 M roztworu CaCl2 .
- 0,1 x MBS: Rozcieńczyć 1 x MBS, aby przygotować 1 l 0,5 x roztworu MBS i 2 l 0,1 x MBS roztworu. Do 1 l 0,1 x MBS roztworu dodać 1 ml ro....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Przeszczepiona tkanka powinna zostać w pełni wprowadzona do głowy biorcy po transplantacji, jak pokazano na Rysunku 3A, a na pysku embrionu powinien zostać odpowiednio umieszczony szklany mostek, jak pokazano na Rysunku 2Bc. Aby przeszczep zakończył się sukcesem, przeszczepiona tkanka dawcy musi mieć odpowiedni rozmiar dopasowany do otworu w organizmie biorcy. Tkanka EAD nie powinna w żaden sposób wystawać z głowy, co przedstawiono na Rysunkach 3B i 3C. .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Krytyczne kroki i ograniczenia: Zabieg przeszczepu twarzy EAD jest czasochłonny i pracochłonny. Wymaga praktyki, pewnych rąk i zręczności, aby się doskonalić. Protokół przeszczepu twarzy opiera się na zdolności badacza do skutecznego usuwania i przeszczepiania tkanki. Jeśli wprowadzenie przeszczepu do twarzy gospodarza zajmie zbyt dużo czasu, twarz gospodarza zacznie się kurczyć i goić. Kleszcze mogą być używane do delikatnego rozszerzania okolicy twarzy. Jeśli jednak doszło do znacznego skurczu rany, przeszczep n.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Dziękujemy Radkowi Sindelce za pomoc, oraz Cas Bresilla za pomoc w hodowli żab i przygotowaniu zarodków. Praca ta została sfinansowana przez NIH za pośrednictwem grantu R01DE021109 dla H.L.S. Laura Jacox została sfinansowana przez Herschel Smith Graduate Fellowship na Uniwersytecie Harvarda oraz indywidualne stypendium F30 F30DE022989-01 za pośrednictwem NIDCR.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Pipeta Pasteura | VWR | 14672-400 | Szkło wapienne |
| Rozmiar 5 3/4 cala | bawełniana | ||
| pipeta z podziałką | VWR | 16001-180 | Jednorazowe |
| #5/45 kleszcze | Fine Science Tools firmy Dupont medical | 11251-35 | Kątowe 45° |
| Kleszcze standardowe | Fine Science Tools | 11000-20 | Proste; końcówka ząbkowana; stal nierdzewna |
| Rurka kapilarna (do igieł) | FHC | 30-30-1 | Borosil 1,0 mm OD x 0,5 mm ID/Włókno |
| Szkiełko nakrywkowe | VWR | 48393 252 | 24 x 60 mm mikro szkło osłonowe; |
| Ficoll 400 | Sigma-Aldrich | F9378 | |
| Sutter Instrument Co | : wycofany z produkcji Filament: FB300B | Najbardziej podobnym, obecnie dostępnym ściągaczem igieł jest P-97. W przypadku filamentów należy używać kwadratowych żarników Sutter 3,00 mm o szerokości 3,0 mm. | |
| Model P-80 | Płonący / brązowy ściągacz | ||
| Stereomikroskop | Zeiss | ||
| Stereomikroskop Oświetlenie firmy Fostec | Fostec | Użyj kasetonu świetlnego z 2 ramionami światłowodowymi. | |
| Niklowany uchwyt na szpilki | Fine Science Tools | 26018-17 | Średnica otworu szczęk: 0-1 mm |
| Niklowany uchwyt na szpilki Moria | Fine Science Tools | 26016-12 | Średnica rozwarcia szczęk: 0-1 mm |
| Igły wolframowe | Fine Science Tools | 10130-05 | 0,125 mm Średnica pręta |
| Van Aken Plastalina | Blick | #33268-2981 | |
| Modelina - biała, czerwona lub żółty | |||
| mMessage mMashine SP6 lub T7 Kit | Ambion | AM1340 |
Bibliografia
- Gorlin, R. J., Cohen, M., Levin, L. Syndromes of the head and neck. , Oxford University Press. UK. (1990).
- Trainor, P. Craniofacial birth defects: The role of neural crest cells in the etiology and pathogenesis of Treacher Collins syndrome and the potenti....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
