Artykuł metodologiczny

Wykrywanie somatycznych zmian genetycznych w próbkach nowotworowych poprzez wychwytywanie eksonów i masowo równoległe sekwencjonowanie

19.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50710

⸱

18 października 2013

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, 2Human Oncology and Pathogenesis Program, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy przygotowanie bibliotek DNA z kodami kreskowymi i późniejsze przechwytywanie eksonów oparte na hybrydyzacji do wykrywania kluczowych mutacji związanych z rakiem w klinicznych próbkach guzów poprzez masowo równoległe sekwencjonowanie "nowej generacji". Celowane sekwencjonowanie eksonów oferuje korzyści w postaci wysokiej przepustowości, niskich kosztów i głębokiego pokrycia sekwencji, zapewniając w ten sposób wysoką czułość wykrywania mutacji o niskiej częstotliwości.

Streszczenie

Wysiłki mające na celu wykrycie i zbadanie kluczowych mutacji onkogennych okazały się cenne dla ułatwienia odpowiedniego leczenia pacjentów z rakiem. Ustanowienie wysokoprzepustowego, masowo równoległego sekwencjonowania "nowej generacji" pomogło w odkryciu wielu takich mutacji. Aby zwiększyć użyteczność kliniczną i translacyjną tej technologii, platformy muszą być wysokoprzepustowe, opłacalne i kompatybilne z próbkami tkanek zatopionych w parafinie (FFPE) utrwalonych w formalinie, które mogą dawać niewielkie ilości zdegradowanego lub uszkodzonego DNA. W tym miejscu opisujemy przygotowanie bibliotek DNA z kodami kreskowymi i multipleksami, a następnie wychwytywanie docelowych eksonów w oparciu o hybrydyzację w celu wykrywania mutacji związanych z rakiem w świeżo mrożonych nowotworach i guzach FFPE za pomocą masowo równoległego sekwencjonowania. Metoda ta umożliwia identyfikację mutacji sekwencji, zmian liczby kopii i wybranych rearanżacji strukturalnych obejmujących wszystkie docelowe geny. Celowane sekwencjonowanie eksonów oferuje korzyści w postaci wysokiej przepustowości, niskich kosztów i głębokiego pokrycia sekwencji, zapewniając w ten sposób wysoką czułość wykrywania mutacji o niskiej częstotliwości.

Wprowadzenie

Identyfikacja "napędzających" zdarzeń genetycznych nowotworów w kluczowych onkogenach i genach supresorowych odgrywa istotną rolę w diagnostyce i leczeniu wielu nowotworów1. Zakrojone na szeroką skalę badania wykorzystujące masowo równoległe sekwencjonowanie "nowej generacji" umożliwiły w ostatnich latach identyfikację wielu takich genów związanych z rakiem2. Jednak te platformy sekwencjonowania zazwyczaj wymagają dużych ilości DNA wyizolowanego ze świeżo zamrożonych tkanek, co stanowi poważne ograniczenie w charakteryzowaniu i analizowaniu mutacji DNA z zachowanych tkanek, takich jak próbki guzów zatopione w parafinie (FFPE) utrwalone w formalinie. Wzmożone wysiłki na rzecz skutecznego i wiarygodnego charakteryzowania "użytecznych" informacji genomowych z próbek guzów FFPE umożliwią retrospektywną analizę wcześniej pobranych próbek i jeszcze bardziej zachęcą do zindywidualizowanego podejścia do leczenia raka.

Tradycyjnie, laboratoria diagnostyki molekularnej polegały na czasochłonnych, niskoprzepustowych metodologiach, takich jak sekwencjonowanie Sangera i PCR w czasie rzeczywistym do profilowania mutacji DNA. Ostatnio opracowano metody o wyższej przepustowości wykorzystujące multipleksowany PCR lub genotypowanie metodą spektrometrii mas w celu zbadania nawracających mutacji somatycznych w kluczowych genach nowotworowych3-5. Podejścia te są jednak ograniczone, ponieważ testowane są tylko wstępnie oznaczone mutacje "gorące", co czyni je nieodpowiednimi do wykrywania mutacji inaktywujących w genach supresorowych nowotworu. Masowo równoległe sekwencjonowanie ma kilka zalet w porównaniu z tymi strategiami, w tym możliwość badania całych eksonów zarówno pod kątem powszechnych, jak i rzadkich mutacji, możliwość ujawnienia dodatkowych klas zmian genomowych, takich jak przyrosty i straty liczby kopii, oraz większą czułość wykrywania w próbkach heterogenicznych6, 7. Sekwencjonowanie całego genomu stanowi najbardziej kompleksowe podejście do odkrywania mutacji, chociaż jest stosunkowo drogie i wiąże się z dużymi wymaganiami obliczeniowymi w zakresie analizy i przechowywania danych.

Dla zastosowań klinicznych, gdzie tylko niewielka część genomu może być przedmiotem zainteresowania klinicznego, dwie szczególne innowacje w technologii sekwencjonowania były przełomowe. Po pierwsze, poprzez wychwytywanie eksonów oparte na hybrydyzacji, można wyizolować DNA odpowiadające kluczowym genom związanym z rakiem w celu ukierunkowanego profilowania mutacji8, . Po drugie, poprzez ligację molekularnych kodów kreskowych (tj. sekwencji DNA o długości 6-8 nukleotydów) można zebrać setki próbek na serię sekwencjonowania i w pełni wykorzystać stale rosnącą zdolność instrumentów do sekwencjonowania masowo równoległego10. W połączeniu te innowacje umożliwiają profilowanie nowotworów w celu obniżenia kosztów i większej przepustowości, przy mniejszych wymaganiach obliczeniowych11. Co więcej, redystrybuując pokrycie sekwencji tylko do tych genów, które są najbardziej krytyczne dla danego zastosowania, można osiągnąć większą głębokość sekwencjonowania, aby uzyskać wyższą czułość wykrywania zdarzeń o niskiej częstości alleli.

Tutaj opisujemy nasz test IMPACT (Integrated Mutation Profiling of Actionable Cancer Targets), który wykorzystuje wychwytywanie eksonów w pulach bibliotek sekwencji z kodami kreskowymi poprzez hybrydyzację przy użyciu niestandardowych oligonukleotydów do wychwytywania wszystkich egzonów kodujących białka i wybierania intronów 279 kluczowych genów związanych z rakiem (Tabela 1). Strategia ta umożliwia identyfikację mutacji, indeli, zmian liczby kopii i wybranych rearanżacji strukturalnych obejmujących te 279 genów. Nasza metoda jest kompatybilna z DNA wyizolowanym zarówno ze świeżo mrożonych tkanek, jak i z tkanek FFPE, a także aspiratów cienkoigłowych i innych próbek cytologicznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie DNA i odczynników

Uwaga: Ten protokół opisuje jednoczesne przetwarzanie i analizę 24 próbek (np. 12 par guz/normalne), ale może być dostosowany do mniejszych i większych partii. Próbki DNA mogą pochodzić z FFPE lub świeżo zamrożonej tkanki, próbek cytologicznych lub krwi. Zazwyczaj zarówno guz, jak i normalna tkanka tego samego pacjenta są profilowane razem w celu odróżnienia mutacji somatycznych od dziedzicznych polimorfizmów. Protokół rozpoczyna się natychmiast po ekstrakcji DNA.

  1. Podwielokrotność 50-250 ng (zalecane 250 ng) wyekstrahowanego DNA na próbkę, rozcieńczonego w 1x buforze Tris-EDTA (pH 8,0) do końcowej objętości 50 μl, do oddzielnych probówek okrągłodennych Covaris.
  2. Ścinanie DNA na instrumencie Covaris E220 przy następujących ustawieniach ścinania: 360 sekund przy 10 współczynnikach wypełnienia, 175 i 200 cykli na serię.
  3. Rozmrozić koraliki AMPure XP (Tabela 2) do temperatury pokojowej. Rozmrozić wszystkie i enzymy na lodzie przed wykonaniem odpowiedniego etapu.

2. Przygotowanie biblioteki - Moduł naprawy końcowej

  1. Przygotować główną mieszankę naprawy końcowej w sterylnej probówce mikrowirówki, używając następujących objętości na próbkę: 10 μl 10x NEBNext bufor reakcyjny naprawy końca (tabela 2), 5 μl NEBNext mieszanka enzymów naprawy końca (tabela 2), 35 μl sterylnegoH2O, wolnego od nukleaz.
  2. Porcjować 50 μl każdego ściętego DNA do oddzielnych studzienek 96-dołkowej płytki. Do każdej reakcji dodać 50 μl przygotowanej mieszanki głównej do naprawy końcówek. Inkubować w termocyklerze przez 30 minut w temperaturze 20 °C.

3. Sprzątanie po naprawie końcowej

  1. Dodać 2x objętość (200 μl) kulek AMPure XP (Tabela 2) do każdej próbki i delikatnie pipetować całą objętość 10 razy w górę i w dół za pomocą pipetora wielokanałowego. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
  2. Umieścić na stojaku magnetycznym (Tabela 2) w temperaturze pokojowej na 15 minut, aż próbka stanie się czysta.
  3. Delikatnie usunąć i wyrzucić przezroczysty supernatant, uważając, aby nie naruszyć kulek. Pewna ilość płynu może pozostać w studzienkach.
  4. Trzymając probówki na stojaku, delikatnie dodaj 200 μl świeżo przygotowanego 80% etanolu do każdej próbki i inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej przez 30 sekund. Ostrożnie usuń etanol za pomocą pipety.
  5. Powtórz krok 5, co daje w sumie 2 płukania etanolem. Upewnij się, że cały etanol został usunięty. Zdejmij ze stojaka magnetycznego i pozostaw do wyschnięcia w temperaturze RT przez 5 minut.
  6. Ponownie zawiesić wysuszone kulki za pomocą 44,5 μl sterylnegoH2O. Delikatnie, pipetować całą objętość w górę iw dół 10-krotnie, dokładnie mieszając. Upewnij się, że koraliki nie są już przymocowane do boku studni.
  7. Inkubować zawieszone kulki w temperaturze pokojowej przez 2 minuty. Umieścić na stojaku magnetycznym na 5 minut, aż próbka stanie się czysta.
  8. Delikatnie przenieść 42 μl klarownego supernatantu zawierającego próbkę do nowego dołka.
    Na tym etapie procedurę można bezpiecznie przerwać, a próbki przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 7 dni. Aby ponownie uruchomić, przed kontynuowaniem rozmrozić zamrożone próbki na lodzie.

4. Przygotowanie biblioteki - moduł dA-Tailing

  1. Przygotować mieszankę główną dA-Tailing w sterylnej probówce mikrowirówkowej, używając następujących objętości na próbkę: 5 μl 10x NEBNext dA-Tailing Reaction Buffer (Tabela 2), 3 μl (3'-5' egzo-) fragmentu Klenowa (Tabela 2).
  2. Dodać 8 μl przygotowanej mieszanki głównej dA-Tailing do każdego dołka zawierającego 42 μl DNA naprawionego na końcu. Inkubować w termocyklerze przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
  3. Wykonaj czyszczenie po dA-tailingu: Powtórz kroki 3.1-3.8 używając 2x objętości (100 μl) kulek, ale ponownie zawieś w sterylnymH2Odo końcowej objętości 33.75 μl.
    Na tym etapie procedurę można bezpiecznie przerwać, a próbki przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 7 dni. Aby ponownie uruchomić, przed kontynuowaniem rozmrozić zamrożone próbki na lodzie.

5. Przygotowanie biblioteki - Moduł podwiązania adaptera

  1. Przygotować główną mieszankę ligacji w sterylnej probówce mikrowirówki, używając następujących objętości na próbkę: 10 μl 5x NEBNext buforu reakcyjnego do szybkiej ligacji (New England Biolabs, tabela 2), 5 μl szybkiej ligazy DNA T4 (tabela 2).
  2. Dodać 15 μl głównej mieszanki ligacyjnej do każdego dołka zawierającego dA-ogoniaste DNA.
  3. Dodaj 1,25 μl odpowiedniego adaptera z kodem kreskowym 25 μM NEXTflex (Tabela 2) do każdej studzienki. Każda próbka powinna otrzymać oddzielny adapter z kodem kreskowym. Inkubować w termocyklerze przez 15 minut w temperaturze 20 °C.
  4. Wykonaj czyszczenie po podwiązaniu adaptera: Powtórz kroki 3.1-3.8 używając 1x objętość (50 μl) kulek, ale ponownie zawiesić w sterylnymH2Odo końcowej objętości 50 μl.
  5. Powtórzyć kroki 3.1-3.8 dla drugiego oczyszczania 1x objętość (50 μl), ale ponownie zawiesić w sterylnymH2Odo końcowej objętości 23 μl.
    Na tym etapie procedurę można bezpiecznie przerwać, a próbki przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 7 dni. Aby ponownie uruchomić, przed kontynuowaniem rozmrozić zamrożone próbki na lodzie.

6. Wzmocnienie biblioteki

  1. Przygotować główną mieszankę KAPA HiFi w sterylnej probówce do mikrowirówki, używając następujących objętości na próbkę: 25 μl 2x KAPA HiFi HS RM (Tabela 2), po 1 μl 100 μM Primer 1 i Primer 2 (Tabela 3).
  2. Dodać 27 μl mieszanki wzorcowej do każdej studzienki zawierającej produkt ligacji. Ustaw pipetę na 50 μl i delikatnie pipetuj całą objętość w górę i w dół 10 razy.
  3. Umieścić w termocyklerze na następujące cykle PCR: początkowa denaturacja trwająca 45 sekund w temperaturze 98 °C, 10 cykli trwająca 15 sekund w temperaturze 98 °C, 30 sekund w temperaturze 60 °C, 30 sekund w temperaturze 72 °C i końcowe przedłużenie o 1 minutę w temperaturze 72 °C.
  4. Wykonaj czyszczenie po amplifikacji: Powtórz kroki 3.1-3.8 używając 1x objętości (50 μl) koralików AMPure XP i ponownie zawieś w sterylnej wodzie do końcowej objętości 30 μl.
  5. Określ ilościowo stężenie każdej biblioteki za pomocą testu Qubit Wide Range Assay (Life Technologies, tabela 2) zgodnie z instrukcjami producenta.

7. Hybrydyzacja, mycie i wzmacnianie biblioteki Roche Nimblegen SeqCAP EZ

  1. Rozmrozić uniwersalne i indeksowe blokery oligonukleotydów (Tabela 3), bibliotekę SeqCap EZ i składniki wychwytywania Nimblegen (COT DNA, 2x bufor hybrydyzacyjny i składnik hybrydyzacyjny A, tabela 2) na lodzie. Wszystkie blokery oligonukleotydów są przechowywane w zapasach roboczych o pojemności 1 mM. Nasza biblioteka SeqCap EZ to specjalnie zaprojektowana pula sond wychwytujących obejmująca wszystkie egzony kodujące białka 279 genów związanych z rakiem, chociaż mogą być używane inne niestandardowe i katalogowe projekty.
  2. Przygotuj pulę 1 mM indeksowych blokerów oligonukleotydów odpowiadających określonym sekwencjom adapterów z kodami kreskowymi używanymi do przygotowania biblioteki. Połącz 1 μl każdego blokera i wiruj.
  3. Do nowej sterylnej probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml dodaj 5 μl 1 mg/ml COT DNA, 2 μl 1 mM uniwersalnego blokera i 2 μl puli 1 mM indeksowych oligonukleotydów blokujących.
  4. Połącz 24 biblioteki kodów kreskowych w jedną reakcję. Dodać łącznie 1-3 μg zbiorczej biblioteki sekwencji z kodami kreskowymi (przygotowanej powyżej) do mieszaniny wychwytującej. W przypadku 24 próbek zaleca się 100 ng na próbkę. Podczas łączenia guzów i dopasowanych normalnych próbek zalecamy dodanie większej biblioteki guzów (np. 100 ng na guz i 50 ng na normalną), aby zostały zsekwencjonowane na większą głębokość pokrycia.
  5. Zamknij nakrętkę probówki i wykonaj 15-20 otworów w górnej części nasadki za pomocą igły o wadze 18-20 G lub mniejszej. Speed Vac amplifikowaną bibliotekę próbek/COT DNA/oligonukleotydów w próżniowym koncentratorze DNA w wysokiej temperaturze (60 °C).
  6. Po całkowitym wyschnięciu ponownie uwodnić 7,5 μl 2x buforu hybrydyzacyjnego i 3 μl składnika hybrydyzacyjnego A. Probówka powinna teraz zawierać: 5 μg COT DNA, bibliotekę amplifikowanych próbek o zmiennym μg, 1000 pmol oligonukleotydów uniwersalnych i indeksowych, 7,5 μl 2x bufor hybrydyzacyjny, 3 μl składnika hybrydyzacyjnego A w łącznej objętości 10,5 μl.
  7. Zakryj otwory w nasadce małym kawałkiem taśmy laboratoryjnej. Wirować próbkę przez 10 sekund i wirować z maksymalną prędkością przez 10 sekund.
  8. Inkubować próbkę w temperaturze 95 °C przez 10 minut w celu denaturacji DNA, a następnie odwirować z maksymalną prędkością przez 10 sekund w temperaturze pokojowej.
  9. W nowej probówce z paskiem do PCR o pojemności 0,2 ml przygotuj 2,25 μl podwielokrotności sond wychwytujących SeqCap EZ Library i 2,25 μl sterylnegoH2Owolnego od nukleaz i dodaj zawartość kroku 7.7. Delikatnie odpipetuj całą objętość w górę i w dół 10 razy.
  10. Inkubować w termocyklerze w temperaturze 47 °C przez 48-96 godzin. Ustawić i utrzymywać temperaturę pokrywy termocyklera na poziomie 57 °C.
  11. Postępuj zgodnie z instrukcjami opisanymi w rozdziale 6 Podręcznika użytkownika biblioteki NimbleGen SeqCap EX SR v3.0 (Tabela 2), aby uzyskać informacje na temat mycia i odzyskiwania przechwyconego DNA.
  12. Postępuje zgodnie z krokami opisanymi w rozdziale 7 protokołu Roche NimbleGen w celu amplifikacji przechwyconego DNA z następującymi modyfikacjami:
    • Użyj 2x polimerazy KAPA HiFi (Tabela 2) zamiast Phusion High-Fidelity PCR Master Mix
    • Użyj 100 μM Primera 1 i Primera 2 wymienionych w Tabeli 3.
    • Uruchom następujące warunki PCR: początkowa denaturacja w temperaturze 98 °C przez 30 sekund, 11 cykli w temperaturze 98 °C przez 10 sekund, 60 °C przez 30 sekund, 72 °C przez 30 sekund i końcowe przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 5 minut. Trzymaj w temperaturze 4 °C.
  13. Określić ilościowo stężenie amplifikowanego wychwyconego DNA za pomocą testu wysokiej czułości kubitu (tabela 2) zgodnie z instrukcjami producenta.
  14. Analizę jakości przechwyconego DNA za pomocą chipa HS Agilent Bioanalyzer DNA (Tabela 2) zgodnie z instrukcjami producenta.
    • Wydajność PCR powinna wynosić co najmniej 100 ng (zakres 100-1,000 ng).
    • Średnia długość fragmentu powinna wynosić od 150 do 400 par zasad.

8. Sekwencjonowanie Hi-Seq Illumina

  1. Rozcieńczyć amplifikowane wychwycone DNA do 2 pM i załadować próbkę na pojedynczy tor komory przepływowej Illumina HiSeq 2000. Para bazowa Sequence paired-end 75 odczytuje się zgodnie z instrukcjami producenta. Z naszego doświadczenia wynika, że jeden tor wystarczy, aby wytworzyć 500-700 razy unikalne pokrycie sekwencji na próbkę w 279 genach w puli 24 próbek.
  2. Oprogramowanie Illumina (Real Time Analysis) konwertuje obrazy o wysokiej rozdzielczości na intensywność klastrów, aby uzyskać podstawowe połączenia i wyniki jakości. Użyj CASAVA do demultipleksowania danych zgodnie z tożsamością kodu kreskowego i generowania indywidualnych plików FASTQ dla każdej próbki.

9. Analiza danych

  1. Przycinanie sekwencji adaptera od końca sekwencji 3' jest odczytywane w plikach FASTQ za pomocą Cutadapt (http://code.google.com/p/cutadapt/). Minimalna długość nakładania się (-O) wynosi 3 ze współczynnikiem błędu (-e) wynoszącym 1%. Minimalna długość bazowa do przechowywania sparowanych odczytów po przycięciu wynosi 25.
  2. Wyrównaj odczyty sekwencji do referencyjnego ludzkiego genomu hg19 za pomocą narzędzia Burrows-Wheeler Aligner (BWA)12. Wykonaj etapy przetwarzania końcowego, w tym zduplikowane znakowanie, lokalne wyrównanie wielu sekwencji i ponowną kalibrację podstawowego wyniku jakości przy użyciu zestawu narzędzi do analizy genomu (GATK) zgodnie z ich standardowymi najlepszymi praktykami (http://www.broadinstitute.org/gatk/guide/topic?name=best-practices)13. W przypadku profilowania wielu próbek od tego samego pacjenta (np. guza dopasowanego i prawidłowego) należy przeprowadzić miejscowe wyrównanie wielu sekwencji razem. Wynikiem tych etapów przetwarzania końcowego jest oddzielny plik BAM dla każdej próbki, który zawiera wszystkie informacje o sekwencji, jakości i dopasowaniu i może być załadowany bezpośrednio do przeglądarki Integrative Genomics Viewer (IGV) w celu wizualizacji odczytów i wariantów sekwencji14.
  3. Obliczanie wskaźników wydajności sekwencji za pomocą narzędzi Picarda (http://picard.sourceforge.net/). Wskaźniki informacyjne obejmują współczynnik wyrównania, rozkład wielkości fragmentów, odchylenie pokrycia związane z zawartością GC, specyficzność przechwytywania na celu, współczynnik duplikatów PCR, złożoność biblioteki i średnie pokrycie celu. Wartości reprezentatywne przedstawiono na rysunku 1. Częstości alleli we wspólnych miejscach polimorfizmu obliczone za pomocą DepthOfCoverage z GATK są wykorzystywane do monitorowania zanieczyszczenia niepowiązanym DNA i zapewnienia, że dopasowane próbki pochodzą od tych samych pacjentów.
    Poniższe analizy obliczeniowe zależą od obecności dopasowanych próbek guza i normalnych w celu wykrycia somatycznych zmian genetycznych. Niedopasowane nowotwory mogą być również analizowane przy użyciu oddzielnej normalnej próbki kontrolnej, ale większości mutacji somatycznych nie można łatwo odróżnić od dziedzicznych wariantów sekwencji.
  4. Wywołaj warianty somatycznego pojedynczego nukleotydu (SNV) dla każdej pary prawidłowy guz za pomocą wywołującego mutację somatyczną, takiego jak muTect15, SomaticSniper16 lub Strelka17. Używamy muTect ze zmodyfikowanymi kryteriami filtrowania, dopuszczającymi warianty z niską (niezerową) liczbą alleli w normalnej próbce, o ile częstość alleli jest co najmniej 5 razy większa w guzie. Warianty powtarzające się w panelu normalnych DNA są usuwane jako prawdopodobne systematyczne artefakty sekwencjonowania lub dopasowania. Każdy filtr przechodzący SNV jest następnie dokładnie sprawdzany za pomocą IGV.
  5. Wywołaj indele somatyczne dla każdej pary guz-normalny za pomocą algorytmów takich jak SomaticIndelDetector13 , Dindel18 lub SOAPindel19. Używamy SomaticIndelDetector z następującymi kryteriami: co najmniej 10% częstość alleli z co najmniej 3 odczytami wspierającymi lub co najmniej 2% częstość alleli z co najmniej 10 odczytami wspierającymi. Dopuszczamy indele z niską (niezerową) liczbą alleli w normalnej próbce, o ile częstość alleli jest co najmniej 5 razy większa w guzie. Indele zwane w panelu normalnych DNA są usuwane, jak wyżej. Każdy filtr przechodzący przez indel jest następnie dokładnie sprawdzany za pomocą IGV.
  6. Ekstrapoluj status numeru kopii z pokrycia sekwencji w eksonach docelowych. Dla każdej pojedynczej próbki należy przeprowadzić normalizację lessową średniego pokrycia sekwencji dla wszystkich eksonów docelowych, regresję w stosunku do procentu GC. Dostosuj nieznormalizowane wartości pokrycia, odejmując pasowanie lessowe i dodając medianę pokrycia dla całej próby. Oblicz stosunek znormalizowanego pokrycia sekwencji we wszystkich docelowych eksonach dla par guz-normalny. W przypadku braku dopasowanej próbki prawidłowej i/lub w celu zmniejszenia szumu, można zastosować inne normalne kontrole diploidalne o dopasowanej płci, w których brakuje wariantów liczby kopii linii zarodkowej. Określ zyski i straty liczby kopii somatycznych na podstawie wzrostu lub spadku współczynnika pokrycia.
  7. Zadzwoń do rearanżacji somatycznych obejmujących geny nowotworowe, w których co najmniej jeden punkt przerwania genomu mieści się w docelowym przedziale genomu lub w jego pobliżu. Sugerowane algorytmy to GASV20, Breakdancer21, CREST22 i dRanger23. Inwersje wewnątrzchromosomowe, delecje i duplikacje tandemowe można rozróżnić na podstawie względnej pozycji i orientacji odczytów pomocniczych w niezgodnych parach. Wszystkie zmiany w aranżacjach kandydatów powinny być ręcznie sprawdzane za pomocą IGV. Zalecamy walidację eksperymentalną za pomocą PCR i sekwencjonowania Sangera w domniemanych punktach przerwania przegrupowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Jedną pulę 24 zbarkodowanych bibliotek sekwencyjnych (12 par guz-tkanka prawidłowa) przechwycono przy użyciu sond odpowiadających wszystkim egzonom kodującym białka 279 genów nowotworowych i zsekwencjonowano jako odczyty 2 x 75 bp w jednym kanale ogniwa przepływowego HiSeq 2000. Biblioteki guza i tkanki prawidłowej połączono w stosunku 2:1. Metryki wydajności próbek dla puli zamrożonych próbek DNA guza przedstawiono na Rysunku 1, w tym stopień dopasowania, rozkład wielkości fragmentów, swoistość przechwy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Nasz test IMPACT zapewnia wysoki współczynnik dopasowania, wysoki wskaźnik namierzenia, wysoki zasięg celu i wysoką czułość wykrywania mutacji, indeli i zmian liczby kopii. Wykazaliśmy zdolność naszego testu IMPACT do sekwencjonowania DNA zarówno ze świeżo mrożonych, jak i archiwalnych próbek FFPE o niskiej zawartości DNA. Wykonując ukierunkowane sekwencjonowanie eksonów kluczowych genów związanych z rakiem, można osiągnąć bardzo głębokie pokrycie sekwencji eksonów tych najbardziej krytycznych genów, maksymalizując w ten...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Dr Berger otrzymał honoraria za konsultacje i fundusze na badania od Foundation Medicine, firmy zajmującej się diagnostyką nowotworów.

Podziękowania

Dziękujemy dr Agnes Viale i Głównemu Laboratorium Genomiki MSKCC za pomoc techniczną. Protokół ten został opracowany przy wsparciu Centrum Badań nad Rakiem Geoffreya Beene'a i Fundacji Farmer Family Foundation.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
NEBNext End Repair ModuleNew England BiolabsE6050L 
NEBNext dA-Tailing Module NewEngland BiolabsE6053L 
NEBNext Moduł szybkiej ligacjiNew England BiolabsE6056L 
Agencourt AMPure XPBeckman Coulter Genomics 
Kody kreskowe NEXTflex bez PCR – 24Bioo Scientific514103 
Zestaw wzmacniający bibliotekę HiFiKAPA BiosystemsKK2612 
COT Ludzkie DNA, Diagnostyka fluorometrycznaRoche 05480 647 001 
NimbleGen SeqCap EZ Zestaw do hybrydyzacji i myciaRoche NimbleGen05 634 261 001 
Przynęty SeqCap EZ LibraryRoche NimbleGen 
Zestaw do oczyszczania QIAquick PCRQiagen28104 
Zestaw testowy Qubit dsDNA Broad Range (BR) LifeTechnologiesQ32850 
Zestaw do oznaczania wysokiej czułości (HS) Qubit dsDNALife TechnologiesQ32851 
Zestaw Agilent DNA HSAgilent Technologies5067-4626, 4627 
Bioanalizator Agilent 2100Agilent Technologies 
Covaris E220Covaris 
Stojak magnetyczny 96AmbionAM10027 
Illumina Hi-Seq 2000Illumina 

Bibliografia

  1. Stratton, M. R., Campbell, P. J., Futreal, P. A. The cancer genome. Nature. 458 (7239), 719-724 (2009).
  2. Meyerson, M., Gabriel, S., Getz, G. Advances in understanding cancer genomes through second-generation sequencing. Nat. Rev. Genet. 11 (10), 685-696 (2010).
  3. Thomas, R. K., Baker, A. C., Debiasi, R. M., et al. High-throughput oncogene mutation profiling in human cancer. Nat. Genet. 39 (3), 347-351 (2007).
  4. Macconaill, L. E., Campbell, C. D., Kehoe, S. M., et al. Profiling critical cancer gene mutations in clinical tumor samples. PLoS One. 4 (11), e7887(2009).
  5. Dias-Santagata, D., Akhavanfard, S., David, S. S., et al. Rapid targeted mutational analysis of human tumours: a clinical platform to guide personalized cancer medicine. EMBO Mol. Med. 2 (5), 146-158 (2010).
  6. Macconaill, L. E., Van Hummelen, P., Meyerson, M., Hahn, W. C. Clinical implementation of comprehensive strategies to characterize cancer genomes: opportunities and challenges. Cancer Discov. 1 (4), 297-311 (2011).
  7. Taylor, B. S., Ladanyi, M. Clinical cancer genomics: how soon is now. J. Pathol. 223 (2), 318-326 (2011).
  8. Gnirke, A., Melnikov, A., Maguire, J., et al. Solution hybrid selection with ultra-long oligonucleotides for massively parallel targeted sequencing. Nat. Biotechnol. 27 (2), 182-189 (2009).
  9. Mamanova, L., Coffey, A. J., Scott, C. E., et al. Target-enrichment strategies for next-generation sequencing. Nat. Methods. 7 (2), 111-118 (2010).
  10. Craig, D. W., Pearson, J. V., Szelinger, S., et al. Identification of genetic variants using bar-coded multiplexed sequencing. Nat. Methods. 5 (10), 887-893 (2008).
  11. Wagle, N., Berger, M. F., Davis, M. J., et al. High-throughput detection of actionable genomic alterations in clinical tumor samples by targeted, massively parallel sequencing. Cancer Discov. 2 (1), 82-93 (2012).
  12. Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).
  13. Depristo, M. A., Banks, E., Poplin, R., et al. A framework for variation discovery and genotyping using next-generation DNA sequencing data. Nat. Genet. 43 (5), 491-498 (2011).
  14. Robinson, J. T., Thorvaldsdottir, H., Winckler, W., et al. Integrative genomics viewer. Nat. Biotechnol. 29 (1), 24-26 (2011).
  15. Cibulskis, K., Lawrence, M. S., Carter, S. L., et al. Sensitive detection of somatic point mutations in impure and heterogeneous cancer samples. Nat. Biotechnol. 31 (3), 213-219 (2013).
  16. Larson, D. E., Harris, C. C., Chen, K., et al. SomaticSniper: identification of somatic point mutations in whole genome sequencing data. Bioinformatics. 28 (3), 311-317 (2012).
  17. Saunders, C. T., Wong, W. S., Swamy, S., Becq, J., Murray, L. J., Cheetham, R. K. Strelka: Accurate somatic small-variant calling from sequenced tumor-normal sample pairs. Bioinformatics. 28 (14), 1811-1817 (2012).
  18. Albers, C. A., Lunter, G., Macarthur, D. G., Mcvean, G., Ouwehand, W. H., Din del Durbin, R. Accurate indel calls from short-read data. Genome Res. 21 (6), 961-973 (2011).
  19. Li, S., Li, R., Li, H., et al. Efficient identification of indels from short paired reads. Genome Res. 23 (1), 195-200 (2013).
  20. Sindi, S., Helman, E., Bashir, A., Raphael, B. J. A geometric approach for classification and comparison of structural variants. Bioinformatics. 25 (12), 222-230 (2009).
  21. Chen, K., Wallis, J. W., Mclellan, M. D., et al. BreakDancer: an algorithm for high-resolution mapping of genomic structural variation. Nat. Methods. 6 (9), 677-681 (2009).
  22. Wang, J., Mullighan, C. G., Easton, J., et al. CREST maps somatic structural variation in cancer genomes with base-pair resolution. Nat. Methods. 8 (8), 652-654 (2011).
  23. Drier, Y., Lawrence, M. S., Carter, S. L., et al. Somatic rearrangements across cancer reveal classes of samples with distinct patterns of DNA breakage and rearrangement-induced hypermutability. Genome Res. 23 (2), 228-235 (2012).
  24. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat. Rev. Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
  25. Roychowdhury, S., Iyer, M. K., Robinson, D. R., et al. Personalized oncology through integrative high-throughput sequencing: a pilot study. Sci. Transl. Med. 3 (111), 111ra121 (2011).
  26. Kerick, M., Isau, M., Timmermann, B., et al. Targeted high throughput sequencing in clinical cancer settings: formaldehyde fixed-paraffin embedded (FFPE) tumor tissues, input amount and tumor heterogeneity. BMC Med. Genomics. 4, 68(2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mutacje somatycznebiblioteki DNA z kodami kreskowymiwychwyt poprzez hybrydyzacjzmiany liczby kopiireorganizacje strukturalnepr bki tkanek FFPEgenomika nowotwor wsekwencjonowanie nowej generacji

Powiązane artykuły