Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Funkcjonalne badanie neurogenezy podwzgórza u dorosłych z ogniskowym hamowaniem radiologicznym

11.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50716

⸱

14 listopada 2013

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Biology, California Institute of Technology, 2Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, Neurology, and Ophthalamology, Johns Hopkins University School of Medicine, 3Department of Radiation Oncology & Molecular Radiation Sciences, Johns Hopkins University School of Medicine, 4Department of Radiation Oncology, University Of Washington Medical Center, 5Institute for Cell Engineering and High-Throughput Biology Center, Johns Hopkins University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Funkcja neuronów u dorosłych ssaków pozostaje aktywnym obszarem badań. Promieniowanie jonizujące hamuje powstawanie nowych neuronów. Korzystając z napromieniania ogniskowego pod kontrolą tomografii komputerowej (CFIR), trójwymiarowe anatomiczne celowanie w określone populacje progenitorów nerwowych może być teraz wykorzystane do oceny funkcjonalnej roli neurogenezy dorosłych.

Streszczenie

Funkcjonalna charakterystyka neuronów urodzonych u dorosłych pozostaje poważnym wyzwaniem. Podejścia mające na celu zahamowanie neurogenezy dorosłych poprzez inwazyjne dostarczanie wirusa lub transgeniczne zwierzęta mają potencjalne zakłócenia, które utrudniają interpretację wyników tych badań. Pojawiają się jednak nowe narzędzia radiologiczne, które pozwalają na nieinwazyjne badanie funkcji wybranych grup neuronów urodzonych w wieku dorosłym poprzez dokładne i precyzyjne celowanie anatomiczne u małych zwierząt. Ogniskowe promieniowanie jonizujące hamuje narodziny i różnicowanie się nowych neuronów oraz umożliwia celowanie w określone neuronalne regiony progenitorowe. Aby naświetlić potencjalną funkcjonalną rolę, jaką odgrywa neurogeneza podwzgórza u dorosłych w regulacji procesów fizjologicznych, opracowaliśmy nieinwazyjną technikę napromieniania ogniskowego, aby selektywnie hamować narodziny neuronów urodzonych u dorosłych w medianie wyniesienia podwzgórza. Opisujemy metodę dostarczania promieniowania w podczerwieni(CFIR) pod kontrolą tomografii komputerowej, aby umożliwić precyzyjne i dokładne celowanie anatomiczne u małych zwierząt. CFIR wykorzystuje trójwymiarowe prowadzenie obrazu wolumetrycznego do lokalizacji i ukierunkowania dawki promieniowania, minimalizuje narażenie na promieniowanie do niedocelowych obszarów mózgu i pozwala na konforemny rozkład dawki z ostrymi granicami wiązki. Protokół ten pozwala na zadawanie pytań dotyczących funkcji neuronów urodzonych w wieku dorosłym, ale także otwiera obszary na pytania w obszarach radiobiologii, biologii nowotworów i immunologii. Te narzędzia radiologiczne ułatwią przełożenie odkryć na stole laboratoryjnym na łóżko pacjenta.

Wprowadzenie

Ostatnie odkrycia wykazały, że mózg dorosłego ssaka może ulegać niezwykłemu stopniowi plastyczności. Neurony urodzone w wieku dorosłym są generowane przez całe dorosłe życie w wyspecjalizowanych niszach mózgu ssaków1. Jaka jest funkcja tych neuronów urodzonych w wieku dorosłym? A co więcej, czy odgrywają rolę w fizjologii i zachowaniu? Badania na ten temat tradycyjnie koncentrowały się na strefie podkomorowej komór bocznych i strefie podziarnistej hipokampa; Jednak ostatnie badania scharakteryzowały neurogenezę w innych obszarach mózgu, takich jak podwzgórze ssaków2. Neurogenezę odnotowano w podwzgórzu po urodzeniu i u dorosłych2-10, a funkcja tych nowonarodzonych neuronów podwzgórza pozostaje aktywnym obszarem badań.

Funkcjonalna charakterystyka neuronów urodzonych u dorosłych pozostaje znaczącym wyzwaniem dla dziedziny neuronauki w ogóle. Selektywne hamowanie określonych populacji progenitorów neuronalnych pozostaje ograniczone przez brak dostępnych markerów molekularnych, które są unikalne dla pojedynczych populacji progenitorów neuronalnych11. W związku z tym selektywna delecja neuronów urodzonych w wieku dorosłym z tych neuronalnych komórek progenitorowych poprzez celowanie genetyczne pozostaje trudna. Podobnie, dostarczanie wirusa do neuronów urodzonych w wieku dorosłym cierpi z powodu potencjalnych zmiennych zakłócających, takich jak wprowadzanie urazów i stanów zapalnych do środowiska12.

Pojawiają się jednak nowe narzędzia radiologiczne, które pozwalają obejść te zawiłości i zbadać te pytania poprzez dokładne i precyzyjne celowanie anatomiczne u małych zwierząt. Promieniowanie jonizujące hamuje narodziny i różnicowanie się nowych neuronów i pozwala na nieinwazyjną metodę celowania w populacje progenitorów neuronów13-15. Niedawno opisaliśmy obszar zarodkowy mediany wyniosłości podwzgórza (ME) ssaków, który nazwaliśmy strefą proliferacyjną podwzgórza (HPZ)2. Odkryliśmy, że gdy młode dorosłe samice myszy otrzymywały dietę wysokotłuszczową (HFD), poziomy neurogenezy u myszy karmionych HFD były znacznie wyższe niż ich normalne kontrole karmione karmą (NC) w tym regionie ME2. Aby sprawdzić, czy neurogeneza dorosłych w obrębie podwzgórza ME reguluje metabolizm i wagę, staraliśmy się zakłócić ten proces. Środkowa wyniosłość to mała jednostronna struktura u podstawy trzeciej komory, z której uwalniane są hormony regulatorowe. W celu zahamowania proliferacji i późniejszej neurogenezy bez zmiany innych funkcji fizjologicznych tego obszaru mózgu, opracowaliśmy nieinwazyjną technikę napromieniania ogniskowego, aby selektywnie hamować narodziny nowo narodzonych dorosłych neuronów w medianie wyniosłościpodwzgórza 2.

Wiele grup wykorzystało promieniowanie do stłumienia neurogenezy w regionach kanonicznych14-28. Jednak wcześniejsze podejścia radiologiczne były na ogół ukierunkowane na duże obszary lub często nieumyślnie również na wiele obszarów mózgu, w których odnotowano neurogenezę, co utrudnia jednoznaczne powiązanie jakichkolwiek zaobserwowanych defektów behawioralnych z defektami w określonych populacjach progenitorów neuronalnych. Możliwość bardziej ukierunkowanego napromieniania zapewniają platformy radiologiczne, które łącząobrazowanie pod kontrolą tomografii komputerowej z dostarczaniem promieniowania w podczerwieniwiązki elektrycznej(CFIR), aby umożliwić precyzyjne celowanie anatomiczne29-36. Wiązki promieniowania o średnicy zaledwie 0,5 mm są dostępne do celowania w określone populacje progenitorów nerwowych35. Ta metodologia pozwala nam celować w ME podwzgórza i zatrzymać proliferację oraz zablokować neurogenezę u małych zwierząt. Po leczeniu radiologicznym tych populacji progenitorów można przeprowadzić testy fizjologiczne i behawioralne w celu wyjaśnienia potencjalnej funkcji komórek urodzonych w wieku dorosłym. Celowanie ogniskowe jest szczególnie ważne dla naszej aplikacji, ponieważ przysadka mózgowa znajduje się blisko środkowej wyniosłości podwzgórza; Napromienianie przysadki mózgowej może wpływać na funkcjonowanie hormonów, a następnie zakłócać wyniki.

Biologiczna podstawa tłumienia neurogenezy po napromieniowaniu nadal pozostaje niejasna. Poprzednie badania nad promieniowaniem opierały się na wiązkach o dużej powierzchni i wykazały, że tłumienie neurogenezy odbywa się za pośrednictwem odpowiedzi zapalnej14, 37. W związku z tym nie jest jasne, czy wysoce ogniskowe promieniowanie może hamować neurogenezę, ponieważ nie wywołuje ono znaczącej reakcji zapalnej. Jednak ostatnie badania przeprowadzone przez naszą grupę nad klasycznym regionem neurogennym w hipokampie wykazały, że wysoce ogniskowe napromienianie dawką 10 Gy może hamować neurogenezę przez co najmniej 4 tygodnie po napromieniowaniu35.

Aby zbadać funkcję neuronów podwzgórza urodzonych u dorosłych w środkowej wysokości, używamy precyzyjnego urządzenia do promieniowania, które jest w stanie dostarczyć obrazowanie CT w połączeniu z wiązkami promieniowania o małej średnicy, aby zahamować neurogenezę ME. Za pomocą lampy rentgenowskiej przymocowanej do suwnicy, która obraca się w zakresie 360°, dostarczamy wiązkę mikropromieniowania wiązką łukową za pomocą zrobotyzowanego stolika na próbkę, który umożliwia obracanie zwierzęcia podczas radioterapii (rysunek 1). Detektor promieniowania rentgenowskiego o wysokiej rozdzielczości służy do pozyskiwania obrazów, gdy suwnica znajduje się w pozycji poziomej33. Na potrzeby tego badania zrekonstruowano obrazy CT z izotropowym rozmiarem woksela 0,20 mm. Wbudowana tomografia komputerowa pozwoliła na identyfikację celu, gdy zwierzę znajduje się w pozycji zabiegowej. Cel został zlokalizowany za pomocą oprogramowania do planowania dawki nawigacyjnej CT, które zostało dołączone do naszej dostępnej na rynku platformy radiologicznej. Po zlokalizowaniu naszego ROI za pomocą obrazowania CT, zwierzę zostało przeniesione do odpowiedniej pozycji zabiegowej za pomocą zrobotyzowanego stolika próbki, który ma cztery stopnie swobody (X, Y, Z, θ). Dzięki połączeniu kątów nachylenia stopnia suwnicy i robota, wiązki mogą być dostarczane z niemal każdego kierunku względem zwierzęcia, a stereotaktyczne zabiegi przypominające łuk są możliwe29. W tych i wszystkich innych badaniach obrazowych myszy umieszczono w urządzeniu unieruchamiającym, które umożliwia dostarczanie znieczulającego izofluranu przy jednoczesnym ograniczeniu ruchu. Łóżko unieruchamiające jest kompatybilne z tomografią komputerową i łączy się z robotycznym stopniempróbki 34.

Oczekujemy, że CFIR dostarczy koncepcyjne postępy w wielu obszarach badawczych. Chociaż używamy radiologicznego celowania w medianę podwzgórza jako dowodu zasady tej techniki, CFIR może być używany do celowania w dowolny obszar ciała dowolnego małego organizmu modelowego w zasadzie. Na przykład w neuronaukach przewidujemy, że ta technika może być wykorzystana do oceny funkcji aktywnie proliferujących populacji progenitorów, które sugeruje się istnienie w innych narządach okołokomorowych, takich jak obszar postrema38, 39, narząd podskórny40 i przysadka41. Długotrwałe kontrowersje dotyczące funkcjonalnej roli neurogenezy u dorosłych i identyfikacji przyczynowej roli w zachowaniu mogą być teraz lepiej rozwiązane. U ptaków śpiewających technika ta może zająć się rolą neurogenezy dorosłych w utrzymaniu silnego i sezonowego zachowania śpiewu ptaków42, które zostało utrudnione przez zdolność do selektywnego hamowania neurogenezy w określonych regionach mózgu. Zrozumienie tego solidnego modelu behawioralnego może rzucić nowe światło na rolę neurogenezy dorosłych w regulacji innych zachowań dymorficznych płciowo. Alternatywnie, w dziedzinie metabolizmu, CFIR może być wykorzystany do zbadania aspektów roli proliferacji hepatocytów i jej roli w metabolizmie i równowadze energetycznej. Wprowadzenie tej techniki zwiększa możliwość postępu koncepcyjnego w wielu dyscyplinach badawczych.

W tym artykule demonstrujemy możliwości CFIR do precyzyjnego anatomicznego celowania ogniskowej wiązki promieniowania. Chociaż początkowo opracowaliśmy tę platformę badawczą promieniowania małych zwierząt (SARRP) na potrzeby naszych badań, obecnie dostępne są inne podobne urządzenia, które mogą osiągnąć podobne napromieniowanie ogniskowe pod kontrolą CT43, 44. W związku z tym uogólniamy ten protokół CFIR z krokami wymaganymi dla wszystkich platform badawczych, a nie tymi specyficznymi dla SARRP. Zaletą CFIR w porównaniu z poprzednimi podejściami radiologicznymi do hamowania neurogenezy jest to, że technika ta umożliwia trójwymiarowe prowadzenie obrazu wolumetrycznego w celu lokalizacji i ukierunkowania dawki, dawka konforemna minimalizuje narażenie na niedocelowe obszary mózgu, a geometria wiązki o wysokiej precyzji pozwala na konforemny rozkład dawki z ostrymi granicami wiązki. Opisujemy, jak korzystać z obrazowania pod kontrolą tomografii komputerowej w celu docelowania dawki w określony obszar anatomiczny, a następnie jak wizualizować rozkład dawki promieniowania bezpośrednio w tkance za pomocą barwienia immunohistochemicznego dla γ-H2AX, markera dwuniciowych pęknięć DNA35, 45-48. Zastosowanie tego podejścia do selektywnego napromieniania nisz neurogennych może mieć znaczące implikacje w ujawnieniu funkcjonalnej roli nowo urodzonych dorosłych neuronów w fizjologii i chorobie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Użycie zwierząt

Uzyskaj zgodę od instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt dla standardowych protokołów opieki i użytkowania. Obecny protokół został opracowany do badań ogniskowego napromieniania na 5,5-10 tygodniowych dorosłych myszach C57BL6 / J, jak opisano wcześniej (Figura 2)2. Można jednak również stosować inne grupy wiekowe i małe gatunki zwierząt (szczury, chomiki, wiewiórki ziemne itp.), pod warunkiem, że dostępne są skuteczne protokoły anestezjologiczne i radiograficzny atlas referencyjny umożliwiający identyfikację obszaru zainteresowania (ROI).

1. Kalibracja platformy radiologicznej sterowanej tomografem komputerowym

Wykonaj z wyprzedzeniem kalibracje dawki promieniowania na platformie radiologicznej dla każdego rozmiaru kolimatora i typu używanego filtra lampy rentgenowskiej. Aby skierować wiązkę promieniowania łukowego na żądane miejsce docelowe, należy użyć oprogramowania do planowania dawki promieniowania49 dostępnego na większości komercyjnych platform radiacyjnych w celu obliczenia wymaganego czasu dostawy w oparciu o dawkę promieniowania, głębokość obszaru zainteresowania (ROI) na podstawie tomografii komputerowej myszy oraz prędkość obrotową platformy robotycznej; Szczegóły na ten temat są pominięte w tym protokole, ponieważ różnią się one w zależności od platformy radiacyjnej. W celu uwidocznienia brzusznego podwzgórza2 (ryc. 3) za pomocą obrazowania CT należy użyć lampy rentgenowskiej z ogniskowym 0,4 mm i energią wiązki 100 kVp z filtracją 1 mm Al. Do ogniskowego naświetlania HPZ należy użyć lampy rentgenowskiej o napięciu 225 kVp, 13 mA i ogniskowej 1 mm z filtracją 0,15 mm Cu, aby dostarczyć 10 Gy promieniowania na głębokość tkanki 0,6 cm w czasie leczenia 4,6 min. Kierowanie między różnymi ROI będzie wymagało obliczenia różnych parametrów.

  1. Jeśli badasz wpływ diety wysokotłuszczowej na neurogenezę w medianie wyniosłości, jak opisano wcześniej2, uzyskaj czterotygodniowe samice myszy C57BL6 / J z laboratoriów Jackson Mouse i trzymaj cztery myszy w klatce. Zmień jedzenie z normalnej karmy na dietę wysokotłuszczową w wieku pięciu tygodni. Pozwól myszom zaaklimatyzować się w nowym mieszkaniu i jedzeniu. Wykonaj leczenie CFIR w wieku 5,5 tygodnia. Przewiezienie pacjentów do sali operacyjnej, w której znajduje się platforma radiologiczna. Zminimalizuj poziom stresu podczas przenoszenia. Przygotować komorę anestezjologiczną z gazem izofluranowym. Następnie dodaj pojedynczą mysz do komory. Równolegle przygotuj poduszkę grzewczą (niskie ustawienie) do obróbki końcowej.
  2. Gdy mysz znajdzie się pod i nie będzie już reagować na ucisk poduszki stopy, przynieś badanego na platformę radiologiczną i umieść na łóżku unieruchamiającym stopnia robotycznego. Umieść usta pacjenta w kubku anestezjologicznym w kształcie stożka nosowego, a zęby w osłonie przeciwgryzowej (ryc. 1D). Połóż mysz płasko na łóżku unieruchamiającym i sprawdź, czy nadal nie reaguje. Jeśli tak, przyklej mysz do łóżka taśmą z gazy. Przyklejając mysz do łóżka, upewnij się, że głowa jest wypoziomowana do płaszczyzny poziomej. Można to ustalić, podciągając uszy i sprawdzając, czy są wypoziomowane. Gdy mysz znajdzie się we właściwej pozycji, zamknij ołowianą osłonę ochronną.
  3. Zdobądź skan tomografii komputerowej za pomocą oprogramowania pokładowego platformy radiologicznej eksperymentatora (będzie się to różnić w zależności od platformy), które zapewni trójwymiarowy anatomiczny skan strukturalny badanego myszy. Sprawdź, czy głowica myszy jest wypoziomowana do płaszczyzny poziomej. Jeśli nie, powtarzaj kroki 1.2 - 1.3, aż głowa fotografowanej osoby zostanie wypoziomowana.
  4. Zidentyfikuj ROI na podstawie obrazu CT. Oblicz odległość od ROI do powierzchni czaszki pod kątem 45° do płaszczyzny poziomej, jak pokazano na rysunku 3E.
  5. Korzystając z oprogramowania pokładowego, wykonaj zdjęcie rentgenowskie obiektu myszy z góry, jak pokazano na rysunku 4A. Następnie zdejmij mysz z platformy radiologicznej, załóż poduszkę grzewczą i monitoruj, aż stanie się aktywna.
  6. Na podstawie obrazów tomografii komputerowej korony oblicz średnią głębokość anatomiczną ROI co najmniej trzech myszy w celu określenia dawki porodowej. Jako przykład z poprzedniego badania2, w którym 10 Gy napromieniowania podano do brzusznego podwzgórza, głębokość ROI od czaszki (pod kątem 45°) wynosi 0,66 cm (patrz ryc. 3E). Wiedząc o tym, naukowcy wykorzystali oprogramowanie do planowania dawki (DPS) zainstalowane na ich platformie radiologicznej, aby obliczyć odpowiednią prędkość obrotową i długość leczenia, aby osiągnąć pożądaną dawkę do zwrotu z inwestycji.
  7. Po określeniu czasu trwania leczenia i prędkości obrotowej stopnia robotycznego za pomocą oprogramowania do planowania dawki, zmierz rozkład dawek obliczonych parametrów za pomocą folii wrażliwych na promieniowanie GAFchromowe osadzonych w plastikowym modelu myszy odpowiadającym wodzie. W tym celu należy osadzić trzy wrażliwe na promieniowanie folie GAFchromowe między czterema pionowo ułożonymi blokami z tworzywa sztucznegorównoważnymi wodą 29, jak pokazano na rysunku 4B.
  8. Umieść makietę modelu myszy zawierającą folie GAFchromic na stoliku zrobotyzowanym i uruchom ogniskową wiązkę promieniowania z nowo obliczonymi parametrami. Na przykład, aby celować w brzuszne podwzgórze, wprowadź parametry filtra Cu 0,15 mm, 225 kVp, 13 mA, ustawienia wiązki promieniowania o średnicy 1 mm, kąta bramowego 45°, obrotu 1,3°/s i 4,6 min, aby osiągnąć dawkę radiologiczną ROI wynoszącą 10 Gy.
  9. Po napromieniowaniu należy sprawdzić filmy pod kątem wzoru i intensywności dawki promieniowania. W przypadku obrotu pod kątem 360° z parametrami podanymi w celu ukierunkowania na podwzgórze brzuszne, obserwuje się ciemny pierścień na filmie powyżej izocentrum, małą wyraźną plamkę na folii izocentrycznej i jaśniejszy pierścień na filmie poniżej izocentrum odpowiadający podawaniu promieniowania wiązką stożkową (ryc. 4B).
  10. Nałóż izocentryczną folię GAFchromową na promienie rentgenowskie myszy, na podstawie których obliczono parametry. Napromieniowany punkt ogniskowy w izocentrum powinien nakładać się na żądany obszar ROI, jak pokazano na rysunku 4C.

Alternatywna metoda: Jeśli trudności w osiągnięciu ROI mózgu utrzymują się, użyj kontrastu jodu wstrzykiwanego dooponowo, aby poprawić wizualizację komór pod obrazami CT. Dla zwięzłości, procedura ta została pominięta w tym protokole, ale została wcześniej opisana35, 50. Kontrast jodowy zapewni dodatkowe punkty orientacyjne w komorach (ryc. 5A).

2. Określanie dokładności wiązki promieniowania

Dalej potwierdź dokładność wiązki CFIR poprzez bezpośrednią wizualizację wiązki promieniowania w tkance2, 35, 51. Aby to zrobić, wykonaj immunohistochemię w celu wykrycia γH2AX 51, białka histonowego i wczesnego markera pęknięć podwójnej nici DNA. Badani mysi muszą być przesyceni przezsercowo i utrwaleni w ciągu jednej godziny od napromieniowania. Po napromieniowaniu szybko następuje naprawa DNA, a poziom ΥH2Ax znacznie się obniża35.

  1. Powtórz kroki 1.1 - 1.3.
  2. Po zidentyfikowaniu celu na tomografii komputerowej, obiekt myszy jest przesuwany pod kontrolą robota, aby wyrównać ten cel z wiązką dostarczającą promieniowanie. Wprowadź obliczone parametry (prędkość obrotową i długość leczenia, aby osiągnąć pożądaną dawkę) z kroku 1.6 do oprogramowania do planowania dawki i rozpocznij leczenie. Zabieg jest wykonywany z suwnicą skierowaną pod kątem 45° od pionu, podczas gdy mysz obraca się wokół osi zorientowanej pionowo.
  3. Po napromienianiu wykonaj perfuzję przezsercową u myszy. Wykonaj perfuzję w ciągu jednej godziny52. Po perfuzji zanurz mózgi w 4% PFA/PBS i delikatnie kołysz przez noc w temperaturze 4 °C.
  4. Następnego ranka umyj 5 minut w PBS 3x, aby usunąć utrwalacz paraformaldehydu. Następnie zanurzyć w 30% sacharozie w 1x PBS na bujaku w temperaturze 4 °C.
  5. Delikatnie kołysz w temperaturze 4 °C (zwykle 12-16 godzin), aż mózg opadnie na dno rurki. Służy to jako etap krioprotekcji. Gdy mózg opadnie, usuń mózg perforowaną łyżką, aby zapobiec nadmiarowi 30% sacharozy / 1x transfer PBS. Szybko zatopić w podłożu zamrażającym na suchym lodzie. Zawiruj pożywkę do zamrażania za pomocą końcówki pipety i wyrównaj mózg w plastikowej formie.
  6. Po całkowitym zamrożeniu przenieś bloki mózgu do zamrażarki o temperaturze -20 °C w celu przechowywania.
  7. W dniu, w którym będzie wykonywana immunohistochemia, należy przeprowadzić przekrój koronalny na grubość 40 μm i cienkim pędzlem umieścić na 24-dołkowej płytce zawierającej PBS. Sekcje powinny być przechowywane w odpowiedniej kolejności seryjnej do barwienia immunologicznego w celu określenia pokrycia napromienianiem obszaru docelowego.
  8. Podgrzać 0,01 M roztwór cytrynianu sodu do temperatury 80 °C w łaźni wodnej w celu przygotowania do etapu pobierania antygenu. Równocześnie, podczas podgrzewania cytrynianu sodu, wykonaj 5 min mycia 3x w 0,01 M PBS.
  9. Gdy roztwór cytrynianu sodu osiągnie temperaturę 80 °C, zanurz skrawki mózgu w roztworze buforowym cytrynianu sodu. Pozostawić w łaźni wodnej o temperaturze 80 °C na 1 godzinę.
  10. Usuń skrawek i pozwól, aby roztwór cytrynianu sodu osiągnął temperaturę pokojową, a następnie wykonaj trzy 5-minutowe płukania w 0,01 M PBS.
  11. Zablokuj skrawki mózgu na 1 godzinę w PBS-Triton zawierającym 5% normalnej koziej surowicy.
  12. Inkubować skrawki mózgu przez noc w PBS-Triton zawierającym 5% normalnej surowicy koziej o stężeniu 1:700 mysiego przeciwciała pierwszorzędowego anty-fosfo-H2AX w temperaturze 4 °C.
  13. Następnego dnia wykonaj 15 minutowe mycie 3x w 0,01 M PBS-Triton.
  14. Inkubować skrawki mózgu PBS-Triton zawierające 5% normalnej surowicy koziej z kozim przeciwciałem wtórnym przeciwko myszy, sprzężonym z fluorforem 488 nm w stężeniu 1:500 przez 2 godziny.
  15. Wykonaj 15 minutowe mycie 3x w 0,01 M PBS-Triton.
  16. Wykonaj barwienie 4',6-diamidino-2-fenyloindolem (DAPI) (1:5,000 w PBS) przez 10 minut, aby uwidocznić jądro. Następnie myj skrawki mózgu przez 5 minut za pomocą PBS.
  17. Montaż na naładowanych elektrostatycznie szkiełkach mikroskopowych za pomocą sekcji pływającej w PBS. Zetrzyj nadmiar PBS i pozostaw szkiełka do wyschnięcia. Nakryj szkiełka za pomocą podłoża montażowego i pozostaw szkiełka do wyschnięcia w ciemności w temperaturze pokojowej przez noc.
  18. Zrób zdjęcia seryjnych odcinków koronalnych za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Barwienie immunologiczne ΥH2Ax (zielone) wskazuje miejsce napromieniowania. DAPI (niebieski) to plama jądrowa (rysunek 5B).

3. Przygotowanie badanych myszy do ogniskowego napromieniowania

Zbadaj wyniki barwienia immunologicznego ΥH2Ax. Po uzyskaniu satysfakcji z kalibracji i ukierunkowania wiązki promieniowania, przystąp do eksperymentu. W tym momencie całkowity czas potrzebny do leczenia myszy (od ustawienia zwierzęcia do zakończenia dostarczania wiązki) wynosi około 10-15 minut w przypadku leczenia 10-Gy wiązką 1 mm.

  1. Zamów czterotygodniowe samice myszy C57BL6/J z laboratoriów Jackson Mouse. Trzymaj cztery myszy w klatce i zmień karmę z normalnej karmy na dietę wysokotłuszczową w wieku pięciu tygodni. Myszy do dziurkowania uszu, aby nadać im unikalne znaki identyfikacyjne. Codziennie monitoruj stan zdrowia myszy. Uwaga: metalowe markery nie mogą być używane, ponieważ spowodują one powstawanie smug na antyterrorystach.
  2. Zważ myszy dzień przed radioterapią lub pozorowanym leczeniem. Podziel myszy na dwie kohorty w celu naświetlania lub leczenia pozorowanego i upewnij się, że nie ma znaczącej różnicy w wadze między kohortami. W dniu leczenia, gdy myszy mają sześć tygodni, należy ponownie zważyć wszystkie myszy i zapisać ich masę. Delikatnie przetransportuj obie kohorty na platformę radiologiczną. Zadbaj o to, aby zminimalizować poziom stresu.
  3. Przygotować komorę anestezjologiczną z gazem izofluranowym. Znieczulenie przeprowadź dwie myszy, jedną w grupie z góry określonej napromieniającej, a drugą w grupie kontrolnej pozorowanej. Przygotuj zestaw poduszek grzewczych w niskim ustawieniu do leczenia pooperacyjnego.
  4. Wykonaj kroki 1.2 - 1.4, aby mysz otrzymała napromieniowanie. W przypadku myszy pozorowanej należy trzymać mysz w komorze anestezjologicznej podczas leczenia. Upewnij się, że komora anestezjologiczna znajduje się w pobliżu platformy CFIR, aby uwzględnić wszelkie skutki dla promieniowania otoczenia. Po zidentyfikowaniu celu na tomografii komputerowej, przesuń obiekt myszy pod kontrolą robota, aby wyrównać ten cel z wiązką dostarczającą promieniowanie. Wprowadź obliczone parametry (prędkość obrotową i długość leczenia) do oprogramowania do planowania dawkowania.
  5. Po zakończeniu napromieniania należy umieścić zarówno myszy pozorowane, jak i napromieniowane na poduszce grzewczej i monitorować, aż się obudzą.
  6. Zwróć zarówno myszy pozorowane, jak i napromieniowane do zakładu dla zwierząt. Monitoruj każdego dnia. Waż myszy co pół tygodnia. Aby potwierdzić napromienianie docelowej strefy proliferacyjnej podwzgórza, należy podać dootrzewnowe wstrzyknięcia BrdU (50 mg / kg) trzy dni po leczeniu i zbadać neurogenezę między grupami poprzez wspólne znakowanie immunohistochemii dla BrdU i markera neuronalnego miesiąc po początkowej ekspozycji na BrdU (Figura 6)2.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Ocena celowania i dokładności pod kontrolą CT

Kalibracja mechaniczna systemu jest kluczowa dla zapewnienia, że wiązki pod różnymi kątami przecinają się w jednym punkcie. Kalibrację przeprowadzono za pomocą półautomatycznej metody opartej na obrazowaniu, w której dokładność wyrównania end-to-end została określona na 0,2 mm29. Dokładność ta jest niezwykle istotna, ponieważ objętość struktury ciała podstawnego podwzgórza jest niewielka2. Aby przetestować tę kalibrację, zmierzon...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Napromienianie ogniskowe sterowane tomografią komputerową (CFIR) to nowatorskie i kompletne podejście systemowe zdolne do dostarczania pól promieniowania do celów u małych zwierząt pod kontrolą robota za pomocą naprowadzania CT32. Zdolność CFIR do dostarczania wysoce skoncentrowanych wiązek do małych modeli zwierzęcych stwarza nowe możliwości badawcze łączące badania laboratoryjne i translację kliniczną. W tym artykule opisano podejście CFIR do precyzyjnego dostarczania promieniowania w celu specyficznego ukie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

J.W. posiada umowy o finansowaniu badań i konsultacjach z Xstrahl, Inc.

Podziękowania

Dziękujemy C. Montojo, J. Reyesowi i M. Armourowi za porady techniczne i pomoc. Praca ta była wspierana przez grant amerykańskich Narodowych Instytutów Zdrowia F31 NS063550 (dla D.A.L.), nagrodę Basil O'Connor Starter Scholar Award oraz granty z Klingenstein Fund i NARSAD (dla S.B.). S.B. jest wybitnym młodym naukowcem w dziedzinie badań medycznych im. W.M. Kecka.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Platforma badawcza SARRPXstrahlRS225Ahttp://www.xstrahl.com/xstrahlrs225.htm
Bunkier napromieniania SARRPXstrahlOpcjonalnie, ale narażenie na promieniowanie powinno być ograniczone za pomocą alternatywnej osłony ołowiowej
Folia chromowa GAFIPSGAFchromic ETB2
Mysz phantomGammex457Kup płyty wodne o wymiarach 0,5 cm x 30 cm x 30 cm od Gammex i przyciąć do żądanego rozmiaru.
Mysie przeciwciało anty-fosfohistonowe H2AX Ser139Millipore, Inc.05-636klon JBW301
Wysokotłuszczowa dieta dla gryzoniResearch DietD12492i60% kalorii w postaci tłuszczu, żywność powinna być napromieniowana
IsofluraneBaxter Healthcare Corporation10019-360-40
0,01 M Cytrynian soduFisher Scientific1,471 g cytrynianu sodu rozpuszczonego w 500 ml wody dejonizowanej
Zjeżdżalnie Superfrost Plus FisherScientific12-550-15
DAPIFisher Scientificprzeciwbarwa jądrowa
Preferowane jest podłoże montażoweFisher ScientificVectashield lub Gelvatol

Bibliografia

  1. Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian brain: significant answers and significant questions. Neuron. 70, 687-702 (2011).
  2. Lee, D. A., et al. Tanycytes of the hypothalamic median eminence form a diet-responsive neurogenic niche. Nat. Neurosci. 15, 700-702 (2012).
  3. Lee, D. A., Blackshaw, S. Functional implications of hypothalamic neurogenesis in the adult mammalian brain. Int. J. Dev. Neurosci. 30, 615-621 (2012).
  4. Pencea, V., Bingaman, K. D., Wiegand, S. J., Luskin, M. B. Infusion of brain-derived neurotrophic factor into the lateral ventricle of the adult rat leads to new neurons in the parenchyma of the striatum, septum, thalamus, and. 21, 6706-6717 (2001).
  5. Kokoeva, M. V., Yin, H., Flier, J. S. Neurogenesis in the hypothalamus of adult mice: potential role in energy balance. Science. 310, 679-6783 (2005).
  6. Pierce, A. A., Xu, A. W. De novo neurogenesis in adult hypothalamus as a compensatory mechanism to regulate energy balance. J. Neurosci. 30, 723-7230 (2010).
  7. Ahmed, E. I., et al. Pubertal hormones modulate the addition of new cells to sexually dimorphic brain regions. Nat. Neurosci. 11, 995-997 (2008).
  8. Xu, Y., et al. Neurogenesis in the ependymal layer of the adult rat 3rd ventricle. Exp. Neurol. 192, 251-264 (2005).
  9. Kokoeva, M. V., Yin, H., Flier, J. S. Evidence for constitutive neural cell proliferation in the adult murine hypothalamus. J. Comp. Neurol. 505, 209-220 (2007).
  10. Perez-Martin, M., et al. IGF-I stimulates neurogenesis in the hypothalamus of adult rats. Eur. J. Neurosci. 31, 1533-1548 (2010).
  11. Shimogori, T., et al. A genomic atlas of mouse hypothalamic development. Nat. Neurosci. 13, 767-775 (2010).
  12. Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian central nervous system. Annu. Rev. Neurosci. 28, 223-250 (2005).
  13. Limoli, C. L., et al. Radiation response of neural precursor cells: linking cellular sensitivity to cell cycle checkpoints, apoptosis and oxidative stress. Radiat. Res. 161, 17-27 (2004).
  14. Monje, M. L., Mizumatsu, S., Fike, J. R., Palmer, T. D. Irradiation induces neural precursor-cell dysfunction. Nat. Med. 8, 955-962 (2002).
  15. Wojtowicz, J. M. Irradiation as an experimental tool in studies of adult neurogenesis. Hippocampus. 16, 261-266 (2006).
  16. Mizumatsu, S., et al. Extreme sensitivity of adult neurogenesis to low doses of X-irradiation. Cancer Res. 63, 4021-4027 (2003).
  17. Snyder, J. S., Hong, N. S., McDonald, R. J., Wojtowicz, J. M. A role for adult neurogenesis in spatial long-term memory. Neuroscience. 130, 843-8452 (2005).
  18. Santarelli, L., et al. Requirement of hippocampal neurogenesis for the behavioral effects of antidepressants. Science. 301, 805-809 (2003).
  19. Saxe, M. D., et al. Ablation of hippocampal neurogenesis impairs contextual fear conditioning and synaptic plasticity in the dentate gyrus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 17501-17506 (2006).
  20. Duan, W., et al. Sertraline slows disease progression and increases neurogenesis in N171-82Q mouse model of Huntington's disease. Neurobiol. Dis. 30, 312-322 (2008).
  21. Rola, R., et al. Radiation-induced impairment of hippocampal neurogenesis is associated with cognitive deficits in young mice. Exp. Neurol. 188, 316-330 (2004).
  22. Hellstrom, N. A., Bjork-Eriksson, T., Blomgren, K., Kuhn, H. G. Differential recovery of neural stem cells in the subventricular zone and dentate gyrus after ionizing radiation. Stem Cells. 27, 634-641 (2009).
  23. McGinn, M. J., Sun, D., Colello, R. J. Utilizing X-irradiation to selectively eliminate neural stem/progenitor cells from neurogenic regions of the mammalian brain. J. Neurosci. Methods. 170, 9-15 (2008).
  24. Panagiotakos, G., et al. Long-term impact of radiation on the stem cell and oligodendrocyte precursors in the brain. PLoS One. 2, e588(2007).
  25. Shinohara, C., Gobbel, G. T., Lamborn, K. R., Tada, E., Fike, J. R. Apoptosis in the subependyma of young adult rats after single and fractionated doses of X-rays. Cancer Res. 57, 2694-2702 (1997).
  26. Tada, E., Parent, J. M., Lowenstein, D. H., Fike, J. R. X-irradiation causes a prolonged reduction in cell proliferation in the dentate gyrus of adult rats. Neuroscience. 99, 33-41 (2000).
  27. Tada, E., Yang, C., Gobbel, G. T., Lamborn, K. R., Fike, J. R. Long-term impairment of subependymal repopulation following damage by ionizing irradiation. Exp. Neurol. 160, 66-77 (1999).
  28. Hopewell, J. W., Cavanagh, J. B. Effects of X irradiation on the mitotic activity of the subependymal plate of rats. Br. J. Radiol. 45, 461-465 (1972).
  29. Matinfar, M., Ford, E., Iordachita, I., Wong, J., Kazanzides, P. Image-guided small animal radiation research platform: calibration of treatment beam alignment. Phys. Med. Biol. 54, 891-905 (2009).
  30. Matinfar, M., et al. Small animal radiation research platform: imaging, mechanics, control and calibration. Med. Image Comput. Comput. Assist. Interv. 10, 926-934 (2007).
  31. Matinfar, M., Iordachita, I., Ford, E., Wong, J., Kazanzides, P. Precision radiotherapy for small animal research. Med. Image Comput. Comput. Assist. Interv. 11, 619-626 (2008).
  32. Matinfar, M., Iordachita, I., Wong, J., Kazanzides, P. Robotic Delivery of Complex Radiation Volumes for Small Animal Research. IEEE Int. Conf. Robot. Autom. 2010, 2056-2061 (2010).
  33. Wong, J., et al. small animal radiation research platform with x-ray tomographic guidance capabilities. Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 71, 1591-1599 (2008).
  34. Armour, M., Ford, E., Iordachita, I., Wong, J. CT guidance is needed to achieve reproducible positioning of the mouse head for repeat precision cranial irradiation. Radiat. Res. 173, 119-123 (2010).
  35. Ford, E. C., et al. Localized CT-guided irradiation inhibits neurogenesis in specific regions of the adult mouse brain. Radiat. Res. 175, 774-783 (2011).
  36. Redmond, K. J., et al. A radiotherapy technique to limit dose to neural progenitor cell niches without compromising tumor coverage. J. Neurooncol. 104, 579-587 (2011).
  37. Fike, J. R., Rola, R., Limoli, C. L. Radiation response of neural precursor cells. Neurosurg. Clin. N. Am. 18, 115-127 (2007).
  38. Bauer, S., Hay, M., Amilhon, B., Jean, A., Moyse, E. In vivo neurogenesis in the dorsal vagal complex of the adult rat brainstem. Neuroscience. 130, 75-90 (2005).
  39. Hourai, A., Miyata, S. Neurogenesis in the circumventricular organs of adult mouse brains. J. Neurosci. Res. 91, 757-770 (2013).
  40. Bennett, L., Yang, M., Enikolopov, G., Iacovitti, L. Circumventricular organs: a novel site of neural stem cells in the adult brain. Mol. Cell. Neurosci. 41, 337-347 (2009).
  41. Gleiberman, A. S., et al. Genetic approaches identify adult pituitary stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6332-6337 (2008).
  42. Goldman, S. A., Nottebohm, F. Neuronal production, migration, and differentiation in a vocal control nucleus of the adult female canary brain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80, 2390-2394 (1983).
  43. Chow, J. C., Leung, M. K., Lindsay, P. E., Jaffray, D. A. Dosimetric variation due to the photon beam energy in the small-animal irradiation: a Monte Carlo study. Med. Phys. 37, 5322-5329 (2010).
  44. Maeda, A., et al. In vivo optical imaging of tumor and microvascular response to ionizing radiation. PLoS One. 7, e42133(2012).
  45. Vasireddy, R. S., et al. Evaluation of the spatial distribution of gammaH2AX following ionizing radiation. J. Vis. Exp. (42), e2203(2010).
  46. Short, S. C., et al. DNA repair after irradiation in glioma cells and normal human astrocytes. Neuro. Oncol. 9, 404-411 (2007).
  47. Gavrilov, B., et al. Slow elimination of phosphorylated histone gamma-H2AX from DNA of terminally differentiated mouse heart cells in situ. Biochem. Biophys. Res. Commun. 347, 1048-1052 (2006).
  48. Nowak, E., et al. Radiation-induced H2AX phosphorylation and neural precursor apoptosis in the developing brain of mice. Radiat. Res. 165, 155-164 (2006).
  49. Jacques, R., Taylor, R., Wong, J., McNutt, T. Towards real-time radiation therapy: GPU accelerated superposition/convolution. Comput. Methods Programs Biomed. 98, 285-292 (2010).
  50. Chaichana, K. L., Levy, A. P., Miller-Lotan, R., Shakur, S., Tamargo, R. J. Haptoglobin 2-2 genotype determines chronic vasospasm after experimental subarachnoid hemorrhage. Stroke. 38, 3266-3271 (2007).
  51. Mah, L. J., et al. Quantification of gammaH2AX foci in response to ionising radiation. J. Vis. Exp. (38), e1957(2010).
  52. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J. Vis. Exp. (65), e3564(2012).
  53. Banath, J. P., Macphail, S. H., Olive, P. L. Radiation sensitivity, H2AX phosphorylation, and kinetics of repair of DNA strand breaks in irradiated cervical cancer cell lines. Cancer Res. 64, 7144-7149 (2004).
  54. Tryggestad, E., Armour, M., Iordachita, I., Verhaegen, F., Wong, J. W. A comprehensive system for dosimetric commissioning and Monte Carlo validation for the small animal radiation research platform. Phys. Med. Biol. 54, 5341-5357 (2009).
  55. Lein, E. S., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445, 168-176 (2007).
  56. Tuli, R., et al. Development of a novel preclinical pancreatic cancer research model: bioluminescence image-guided focal irradiation and tumor monitoring of orthotopic xenografts. Transl. Oncol. 5, 77-84 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Na wietlanie ogniskowenaprowadzanie za pomoc tomografii komputerowejdok adno wi zki promieniowaniabrzuszna cz podstawy podwzg rzachromiczne filmy GAFp kni cia dwuniciowe DNAdieta wysokot uszczowahamowanie neurogenezystereotaktyczna terapia ukowa
Funkcjonalne badanie neurogenezy podwzgórza u dorosłych z ogniskowym hamowaniem radiologicznym
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.