Wykrywanie, wizualizacja i ilościowe określanie wytwarzania reaktywnych form tlenu w systemie modelu Amoeba

Summary

Dostosowaliśmy zestaw protokołów do pomiaru reaktywnych form tlenu (ROS), które mogą być stosowane w różnych modelach komórkowych ameb i ssaków do badań jakościowych i ilościowych.

Abstract

Reaktywne formy tlenu (ROS) obejmują szereg reaktywnych i krótkożyciowych cząsteczek zawierających tlen, które są dynamicznie przekształcane lub eliminowane katalitycznie lub spontanicznie. Ze względu na krótką żywotność większości ROS oraz różnorodność ich źródeł i lokalizacji subkomórkowych, pełny obraz można uzyskać tylko poprzez dokładne pomiary przy użyciu kombinacji protokołów. W tym miejscu przedstawiamy zestaw trzech różnych protokołów wykorzystujących kulki pokryte OxyBurst Green (OBG) lub dihydroethidium (DHE) i Amplex UltraRed (AUR), do jakościowego i ilościowego monitorowania różnych ROS w profesjonalnych fagocytach, takich jak Dictyostelium. Zoptymalizowaliśmy procedury powlekania kulek i wykorzystaliśmy kulki pokryte powłoką OBG oraz mikroskopię na żywo, aby dynamicznie wizualizować wewnątrzfagosomalne generowanie ROS na poziomie pojedynczej komórki. Zidentyfikowaliśmy lipopolisacharyd (LPS) z E. coli jako silny stymulator wytwarzania ROS w Dictyostelium. Ponadto opracowaliśmy średnioprzepustowe testy w czasie rzeczywistym z wykorzystaniem DHE i AUR do ilościowego pomiaru odpowiednio wewnątrzkomórkowej produkcji ponadtlenkowej i zewnątrzkomórkowej_H2O2.

Introduction

Reaktywne formy tlenu (ROS) biorą udział w wielu różnych procesach biologicznych, takich jak obrona gospodarza, sygnalizacja, rozwój tkanek i reakcja na uraz, a także nadciśnienie i rak. Dobrze zbadana maszyneria oksydazy fagosomalnej NADPH jest przeznaczona do szybkiego generowania ROS, znanego jako wybuch oksydacyjny, w celu zabicia bakterii połkniętych w fagosomach neutrofili¹. Ponadto wcześniej uważano, że wyciek elektronów jako produkt uboczny mitochondrialnego łańcucha oddechowego jest odpowiedzialny tylko za nieuregulowane źródło ROS. Ale ostatnio został zidentyfikowany jako ważny mechanizm przyczyniający się do dofagosomalnego zabijania bakterii w makrofagach myszy². W ostatnich latach ameba społeczna, Dictyostelium, stała się potężnym i popularnym modelem do badania wewnętrznych mechanizmów wrodzonej odpowiedzi immunologicznej komórek. Rzeczywiście, Dictyostelium i ludzkie fagocyty mają zaskakująco wysoki poziom zachowania w maszyneriach molekularnych odpowiedzialnych za wykrywanie, pochłanianie i zabijanie^{bakterii 3,4}. Homologi białek i enzymów związanych z produkcją ROS lub detoksykacją, takie jak oksydazy NADPH, katalazy, dysmutazy ponadtlenkowe, można znaleźć zarówno u ludzi, jak i u Dictyostelium. Jako najlepiej przebadana ameba, Dictyostelium ma kilka unikalnych zalet w porównaniu z systemem modelowym ssaków. Rosną w temperaturze pokojowej bez konieczności stosowania CO₂ , z czasem podwojenia 8-10 godzin. Można je łatwo przechowywać jako kultury przylegające lub zawiesinowe. Ponadto, dzięki w pełni zsekwencjonowanemu i opisanemu haploidalnemu genomowi oraz łatwej manipulacji genetycznej, Dictyostelium stał się bardzo atrakcyjnym eksperymentalnym organizmem modelowym.

W poprzednich badaniach, różne chlorowane i fluorowane pochodne fluoresceiny (łącznie znane jako OxyBurst Green, OBG), które emitują fluorescencję po utlenieniu przez ROS, były używane jako reporter ROS. Estryfikowane pochodne permetyczne przez komórkę są używane do pomiaru cytoplazmatycznego ROS, podczas gdy nieprzepuszczalne dla komórek pochodne sprzężone z dektranem lub białkiem są używane do pomiaru zewnątrzkomórkowego ROS. W szczególności kulki pokryte OBG BSA były już wykorzystywane do wykrywania fagosomalnej produkcji ROS w komórkach ssaków⁵. Jednak podejście oparte na czytniku mikropłytek może dać tylko uśrednioną krzywą generowania ROS z populacji komórek. Dzięki obecnemu protokołowi, dzięki zastosowaniu Dictyostelium , profesjonalnego fagocytu i zoptymalizowanych warunków eksperymentalnych, uzyskujemy stabilną i wydajną fagocytozę bez sprzężenia opsoniny z kulkami. DHE jest używany w różnych systemach modelowych, takich jak neutrofile i makrofagi ssaków, do wykrywania produkcji ROS^6-9. Tymczasem istnieją pewne kontrowersje co do specyficzności i czułości metody^8,10. Jako ulepszona wersja Amplex Red, intensywność fluorescencji AUR jest mniej wrażliwa na pH, co czyni go bardziej odpowiednim do pomiaru ROS w środowiskach nieobojętnych lub słabo kwaśnych. AUR został ostatnio zastosowany w kilku systemach ssaków^11,12, ale jego zastosowanie w modelach niessaków, które dość często wymagają słabo kwaśnych pożywek wzrostowych, nie zostało jeszcze zgłoszone. Ponadto nie ma opublikowanego protokołu do ilościowego i dynamicznego pomiaru produkcji i lokalizacji ROS w amebie społecznej Dictyostelium.

Celem prezentowanego zestawu protokołów jest dostarczenie łatwego i wszechstronnego rozwiązania do monitorowania różnych ROS i ich lokalizacji, a także dalsze dostarczanie wglądu w mechanizmy komórkowe związane z ROS. W teście OBG wykorzystaliśmy mikroskopię na żywo do monitorowania całego procesu wytwarzania fagosomalnych ROS po wychwycie kulek pokrytych OBG przez komórki Dictyostelium i zapewniliśmy nowe podejście do badania mechanizmu wewnątrzfagosomalnego zabijania bakterii. Zoptymalizowaliśmy średnioprzepustowe testy DHE i AUR w Dictyostelium, aby zmierzyć odpowiednio wewnątrzkomórkową produkcję ponadtlenkową i zewnątrzkomórkową_H2O2, używając LPS jako silnego stymulatora ROS. Należy zauważyć, że niedawno wykazano, że LPS zwiększa aktywność bakteriobójczą Dictyostelium w stosunku do bakterii fagocytozowanych¹³. Ponadto leczenie DEDTC i katalazą wyraźnie potwierdziło, że te dwie metody specyficznie mierzą różne typy i subkomórkowe lokalizacje ROS w Dictyostelium. Wreszcie, test OBG można dostosować do dowolnej przylegającej komórki fagocytarnej, poprzez dalszą opsonizację kulek ligandami dla receptorów fagocytarnych komórek zwierzęcych. Zasadniczo, testy DHE i AUR mogą być również precyzyjnie dostrojone do pomiarów w dowolnej komórce przylegającej lub nieprzylegającej w odpowiednich warunkach eksperymentalnych.

Protocol

1. Wizualizacja i jakościowy pomiar produkcji ROS w fagosomach

Koraliki pokryte OBG powinny być przygotowane wcześniej. Procedury powlekania kulkami i technika nakładania agaru są zaadaptowane z opublikowanych pozycji^5,14.

1. Dodać 1 ml zawiesiny karboksylowanych kulek krzemionkowych 3,0 μm (około 1,8 x 10⁹ kulek) do probówki o pojemności 1,5 ml, przemyć kulki 3x 1 ml PBS przez szybkie wirowanie i wirowanie.
2. Zawiesić kulki w 1 ml PBS zawierającego 25 mg/ml cyjanamidu (w celu aktywacji karboksylowanych kulek krzemionkowych w celu kowalencyjnego związania wstępnie znakowanego BSA), inkubować na kole przez 15 minut.
3. Przemyć 3x 1 ml buforu sprzęgającego (0,1 M boranu sodu, pH 8,0) przez szybkie wirowanie (wirować z pełną prędkością w mini wirówce stołowej przez 5 sekund lub alternatywnie wirować przy 2 000 x g przez 1 minutę w wirówce stołowej) i wirować w celu usunięcia nadmiaru cyjanamidu.
4. Wymieszać przemyte kulki z 500 μl buforu sprzęgającego zawierającego 1 mg OxyBurst Green (OBG) H2HFF (dihydro-2',4,5,6,7,7'-heksafluorofluoresceiny)-BSA, napełnić probówkę gazowym azotem ze standardowej puszki z gazem przed zamknięciem i inkubować na kole przez 14 godzin (noc) w temperaturze pokojowej w ciemności.
5. Przemyć kulki 2x 1 ml buforu hartowniczego (250 mM glicyny w PBS) w celu usunięcia nieprzereagowanego OBG i dwukrotnie buforem sprzęgającym w celu usunięcia buforu hartowniczego przez szybkie wirowanie i wirowanie.
6. Dodać 1 ml buforu sprzęgającego zawierającego 50 μg estru sukcynimidylowego Alexa fluor 594 do koniugacji z BSA. Napełnij probówkę azotem przed zamknięciem i inkubuj na kole przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej w ciemności.
7. Przemyć kulki 3x 1 ml buforu hartowniczego przez szybkie wirowanie i wirowanie w celu zatrzymania reakcji, a następnie przemyć kulki 3x 1 ml PBS przez szybkie wirowanie i wirowanie.
8. Na koniec ponownie zawiesić kulki w 1 ml PBS z 2 μl 10% w/v azydku w celu długotrwałego przechowywania. Zmierzyć stężenie kulek w zawiesinie za pomocą hemocytometru (zwykle około 1-2 x 10⁹ kulek/ml), napełnić probówkę azotem przed zamknięciem i przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności.
9. Skuteczność powlekania fluoresceiny OBG można zbadać, sprawdzając widmo emisyjne za pomocą wzbudzenia przy 500 nm. Po utlenieniu przez_H2O2w obecności peroksydazy chrzanowej (HRP) intensywność fluorescencji utlenionych kulek w momencie piku emisji (538 nm) jest 11-12 razy wyższa niż w przypadku kulek nieutlenionych powlekanych.
10. Zbierz wykładniczo rosnące komórki Dictyostelium z 10-centymetrowej szalki Petriego, ułóż komórki o różnej gęstości na 3-centymetrowych szalkach z optycznie przezroczystym dnem z tworzywa sztucznego lub szkła i hoduj je przez noc. Wybierz potrawy, które są w około 80% zlewające się do eksperymentu. Opublikowano szczegółowy protokół hodowli komórek Dictyostelium ¹⁵.
11. Zastąp pożywkę hodowlaną pożywką LoFlo (pożywką LF), inkubuj przez 2 godziny przed eksperymentem w celu zmniejszenia zewnątrzkomórkowej i wewnątrzendosomalnej autofluorescencji pożywki hodowlanej HL5C.
12. Równolegle rozpuść 10 ml 1,5% bakto agaru w pożywce LF, wylej agar na płaską powierzchnię (tj. szklaną płytkę o wymiarach 10 cm x 10 cm) w celu utworzenia warstwy agaru o grubości około 1 mm, odczekaj 10-15 minut do zastygnięcia. Pokrój warstwę agaru na kwadraty o wymiarach 2 cm x 2 cm i umieść w podłożu LF do późniejszego wykorzystania.
13. W międzyczasie przygotuj mikroskop z wirującym dyskiem lub mikroskop szerokokątny, ustaw temperaturę komory środowiskowej na 22 °C i dostosuj ustawienia do tego eksperymentu. (Zobacz dodatkowe komentarze w dyskusji).
14. Po 2 godzinach inkubacji odessać pożywkę LF z 3-centymetrowej szalki, ale monowarstwa komórek powinna być nadal pokryta cienką warstwą pożywki. Rozcieńczyć powlekane kulki do 1,5 x 10⁷ kulek/ml i dodać 10 μl na warstwę komórek.
15. Weź jeden kwadratowy arkusz agaru, odcedź nadmiar płynu, ale utrzymuj mokry. Delikatnie połóż kwadrat agaru na wierzchu warstwy komórek. Nie przesuwaj kwadratu agaru, gdy leży na komórkach. Nakładka agarowa służy do zwiększenia kontaktu między kulkami a komórkami, poprawiając w ten sposób wchłanianie, a także nieznacznie ściska komórki, utrzymując je lepiej w płaszczyźnie ogniskowej obiektywu.
16. Umieść pokrywkę na naczyniu, umieść ją na stoliku mikroskopu i automatycznie rób zdjęcia w kanale czerwonym, zielonym i fazowym co 1 minutę przez 2 godziny lub dłużej.
17. Wybierz i skup się na zdarzeniach komórkowych, które zawierają cały proces fagocytozy. Połącz zoptymalizowane 3 kanały i zmontuj obrazy w film za pomocą profesjonalnego oprogramowania do przetwarzania obrazu. Określ ilościowo intensywność fluorescencji każdego wybranego koralika w kanałach czerwonym i zielonym, a stosunek koloru zielonego do czerwonego będzie odzwierciedlał dynamiczną fagosomalną produkcję ROS w komórkach.

2. Ilościowy i średnioprzepustowy pomiar wewnątrzkomórkowej produkcji ponadtlenkowej

1. Zbierz jedno 80% naczynie z Dictyostelium w 10 ml pożywki HL5C. Odwirować komórki Dictyostelium przy 850 x g przez 5 minut, ostrożnie i całkowicie odessać nadmiar pożywki. Ponownie zawiesić komórki w buforze SS6.4 [0,12 M sorbitolu w buforze Sorensena (14,69 mM KH₂PO₄ i 6,27 mM Na₂HPO₄), pH 6,4], zliczyć komórki i rozcieńczyć do końcowej gęstości 6 x 10⁶ komórek/ml (patrz dodatkowe komentarze w dyskusji).
2. Dodać 50 μl zawiesiny komórkowej do każdego dołka białej, nieprzezroczystej płytki 96-dołkowej (patrz dodatkowe komentarze w dyskusji).
3. Rozcieńczyć zapas DHE (30 mM w DMSO) 500 razy za pomocą SS6.4, w razie potrzeby odpipetować 50 μl rozcieńczonego DHE do każdej studzienki za pomocą pipety wielokanałowej. Końcowe stężenie DHE wynosi 30 μM. Reakcja zaczyna się natychmiast.
4. Bodźce lub inhibitory mogą być dodawane w tym momencie lub w innych punktach czasowych zgodnie z konkretnymi potrzebami.
5. Stosować tryb "odczytu od góry" punktu końcowego czytnika mikropłytek fluorescencyjnych, z wzbudzeniem/emisją fluorescencji przy 522 nm/605 nm, odczytywać co 2 minuty przez 1 godzinę, wstrząs medium 5 sekund/min, w temperaturze 22 °C.

3. Ilościowy i wysokoprzepustowy pomiar zewnątrzkomórkowej produkcji_H2O2

1. Wykonaj te same czynności, które opisano w 2.1 i 2.2.
2. Przygotować rozcieńczony HRP, dodając 5 μl bulionu HRP (100 U/ml w wodzie destylowanej) do 10 ml SS6.4, odwirować lub odwrócić probówkę, aby dobrze wymieszać i trzymać na lodzie do późniejszego użycia. Rozcieńczony roztwór HRP ma stężenie 0,05 j./ml.
3. Przygotować mieszaninę reakcyjną AUR, mieszając zapas AUR (10 mM AUR w DMSO) i rozcieńczony roztwór HRP w buforze SS6.4 do końcowych stężeń odpowiednio 6,25 μM i 0,005 U/ml. Na przykład, aby przygotować mieszaninę reakcyjną dla 40 reakcji, zmieszaj 1600 μl SS6.4 z 400 μl rozcieńczonego HRP i 2,5 μl roztworu podstawowego AUR.
4. W razie potrzeby dodać 50 μl mieszaniny AUR do każdej studzienki za pomocą pipety wielokanałowej. Teraz zaczyna się reakcja.
5. Bodźce lub inhibitory mogą być dodawane w tym momencie lub w innych punktach czasowych zgodnie z konkretnymi potrzebami.
6. Stosować tryb "odczytu od góry" punktu końcowego czytnika mikropłytek fluorescencyjnych, ze wzbudzeniem/emisją fluorescencji przy 530 nm/590 nm, odczytywać co 2 minuty przez 1 godzinę, pożywka drgać 5 sekund/min, w temperaturze 22 °C.

Results

Generowanie ROS w fagosomach, może być wizualizowane jakościowo i dynamicznie za pomocą mikroskopii (Plik S1). Czerwona fluorescencja emitowana przez Alexa fluor 594 jest niewrażliwa na pH i pozostaje stała w środowisku fagosomalnym, podczas gdy utlenianie OBG zwiększa jego fluorescencję w kanale zielonym. Widma emisyjne utlenionych i nieutlenionych kulek pokrytych OBG in vitro porównano na rysunku 1B, wykazując znaczny wzrost intensywności po utlenieniu. Aby ułatwić wizualizacj...

Discussion

W porównaniu z poprzednio opisanymi metodami, test OBG dynamicznie wizualizuje proces generowania fagosomalnych ROS na poziomie pojedynczej komórki, zamiast mierzyć średni sygnał ROS z populacji komórek. Takie metody uśredniania populacji mają tendencję do zaciemniania krytycznych informacji spowodowanych niesynchroniczną fagocytozą. Z powodzeniem dostosowaliśmy testy DHE i AUR do Dictyostelium i zoptymalizowaliśmy protokoły. Co najważniejsze, określiliśmy typy i subkomórkowe lokalizacje ROS mierzone za pomocą t...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ODCZYNNIKI
OxyBURST Green H2HFF BSA	Invitrogen	O-13291
Alexa Fluor 594	Invitrogen	A-20004
Karboksylowane kulki krzemionkowe	Kisker Biotech	PSi-3.0COOH
HL5C medium	ForMedium HLC0102
LoFlo medium	ForMedium	LF1001
Agar Bacto	BD	204010
Dihydroethidium	Sigma	37291-25MG
Amplex UltraRed	Invitrogen	A36006
Peroksydaza chrzanowa	Roche	10108090001
Dietyloditiokarbaminian (DEDTC)	Sigma	D3506-100G
Katalaza	Sigma	C9322-1G
Cyjanamid	Sigma	187364-25G
Lipopolisacharydy	Sigma	L2630-25G
SPRZĘT
ibidi μ-Naczynie 35 mm, wysokie	ibidi	81156	Dno wykonane z optycznie przezroczystego tworzywa
sztucznego Szalka MatTek 35 mm	MatTek corporation	P35G-1.5-14-C	Spód wykonany z szkiełko nakrywkowe
Scepter Licznik komórek	Merck Millipore	PHCC00000
Biała 96-dołkowa płytka	Wirówka Nunc	236108
	SORVALL	Legend RT
Czytnik mikropłytek	BioTek	Synergy Mx