Test egzonukleazy oparty na fluorescencji w celu scharakteryzowania DmWRNexo, ortologu ludzkiej egzonukleazy progeroidalnej WRN i jej zastosowania do innych nukleaz

Nukleazy odgrywają istotną rolę w komórkach w usuwaniu uszkodzonego DNA, rozwiązywaniu struktur nonduplex, takich jak połączenia Hollidaya i zapewnianiu zdolności do korekty podczas replikacji DNA, zarówno wewnętrznej w polimerazach DNA, jak i zewnętrznej do nich¹. Nukleazy mogą działać albo poprzez sekwencyjną degradację DNA z wolnych końców (egzonukleazy), albo przez rozszczepianie wewnętrznych wiązań fosfodiestrowych w dłuższej cząsteczce DNA (endonukleazy). Utrata aktywności nukleazy może skutkować wysoce specyficznymi fenotypami niestabilności genomu. Podczas gdy mutacja BLM należącej do rodziny helikazy RecQ powoduje nadmiernie wysokie wskaźniki wymiany chromatyd siostrzanych i globalnie podwyższone wskaźniki zachorowań na raka (przegląd Payne'a i Hicksona²), mutacja wysoce spokrewnionego białka WRN prowadzi do przedwczesnego starzenia^{się 3}; główną istotną różnicą między tymi dwoma członkami rodziny jest obecność domeny egzonukleazy 3'-5' z WRN⁴. Dowody na kluczową rolę egzonukleazy WRN w utrzymaniu stabilności genomu zgromadzono z analizy genotypów u pacjentów z WS⁵, wraz z badaniami mutacji punktowych i delecji w komórkach ludzkich, poparte badaniami krystalograficznymi izolowanej domeny egzonukleazy⁶. Jednak współpraca i wzajemne oddziaływanie między aktywnością egzonukleazy WRN a jej centralną aktywnością helikazy⁷ utrudnia wyodrębnienie funkcjonalności każdego z nich i ich względnego wkładu w stabilność genomu. U roślin i zwierząt z niższych warstw metazoanowych aktywność egzonukleazy WRN występuje na pojedynczym polipeptydzie pozbawionym aktywności helikazy^8-10 (przegląd w Cox i Boubriak¹¹); wykazano biochemicznie u Arabidopsis, że ta egzonukleaza działa koordynacyjnie z pokrewną helikazą WRN, skutecznie odtwarzając połączone aktywności enzymatyczne obserwowane u kręgowców WRN⁹. Badaliśmy egzonukleazę WRN u Drosophila, ponieważ doskonałe narzędzia genetyczne pozwalają na analizę wpływu mutacji egzonukleazy (bez wpływu na przypuszczalną pokrewną helikazę) na poziomie całego organizmu i poprzez rozwój^10,12. Ponadto sklonowaliśmy, poddaliśmy ekspresji i oczyszczeniu rekombinowanej egzonukleazy Drosophila WRN (DmWRNexo), co pozwoliło na pełną analizę biochemiczną jej właściwości enzymatycznych^13,14.

Analiza nukleazy in vitro tradycyjnie była przeprowadzana przy użyciu radioznakowanych oligonukleotydów, oceniając degradację poprzez szukanie drabinek produktów na żelach akrylamidowych^4,8,15. Chociaż są to testy wrażliwe, nie są one ilościowo odtwarzalne z dnia na dzień ze względu na rozpad promieniotwórczy znakowanych substratów. Ponadto obchodzenie się z odczynnikami promieniotwórczymi i ich usuwanie stanowi poważne zagrożenie dla środowiska i zdrowia; Coraz większym problemem staje się również pozyskiwanie radioznaków. Alternatywna najnowsza metoda polega na ocenie ilości końcowego produktu degradacji za pomocą spektrometrii mas¹⁶. Jest to jednak czasochłonne (zajmuje kilka dni), wymaga specjalistycznego sprzętu, a odczyt to ilość produktu końcowego (pojedynczego nukleotydu), więc nie nadaje się do czułych pomiarów takich aspektów, jak procesywność enzymatyczna lub do określenia, czy niektóre nukleotydy, sekwencje lub modyfikacje prowadzą do wstrzymania lub zatrzymania nukleazy. Aby przezwyciężyć te problemy, dostosowaliśmy tradycyjne testy na bazie żelu do stosowania z fluorescencyjnymi substratami oligonukleotydowymi, generując stabilnie znakowane substraty, które mogą być używane w sposób powtarzalny przez długi czas, a tym samym umożliwiają bezpośrednie porównanie aktywności nukleazy w różnych warunkach.

1. Przygotowanie oligonukleotydów substratowych

1. Syntetyzuj niestandardowe oligonukleotydy.
   1. Zaprojektuj jeden jednoniciowy oligonukleotyd z cząsteczką fluoresceiny sprzężoną z 5'; będzie to szkielet dla każdego substratu. (Zauważ, że dotyczy to egzonukleazy 3'-5'; dla egzonukleazy o polaryzacji 5'-3' użyj nici szkieletowej sprzężonej z 3'). Jeśli polaryzacja nie jest znana, należy przetestować zarówno 3', jak i 5'.
   2. Zaprojektuj nici komplementarne w taki sposób, aby po wyżarzaniu do fluorescencyjnie znakowanego oligonukleotydu tworzyły się wybrane substraty dupleksowe. Należy zauważyć, że nić komplementarna nie jest sprzężona z fluoroforem. Przy zamówieniu określ OCZYSZCZANIE STRONY (odsalanie nie jest wystarczające).
   3. Zapasy oligonukleotydów należy przechowywać buforowane w 10 mM przy 1 nmol/μl w temperaturze -20 °C i w ciemności.
2. Wymieszaj oligonukleotyd znakowany szkieletem z każdym komplementarnym nieznakowanym oligonukleotydem w stosunku molowym 1:1,2 znakowanego: nieznakowane w buforze (10 mM Tris-HCl pH 7,6, 1 mM EDTA pH 8,0, 50 mM NaCl). (Uwaga: stosunek 1:1 jest najbardziej pożądany, ale ważniejsze jest, aby CAŁA oznaczona nić była związana. Mogą działać proporcje 1:1 - 1:1,5.)
3. Podgrzać łaźnię wodną lub blok grzewczy do temperatury 95 °C i umieścić w nim mieszaninę wyżarzającą na 3 minuty, a następnie wyłączyć i pozostawić całość do powolnego ostygnięcia (1 °C/min) do temperatury poniżej 30 °C.
4. Sprawdź pełne wyżarzanie znakowanego oligonukleotydu, uruchamiając powstały substrat duplex na natywnym 10% żelu poliakrylamidowym (10% 19:1 akrylamid:bis-akryloamid w 1x Tris-Boran-EDTA (TBE, 89 mM zasada Tris, 89 mM kwas borowy, 2 mM EDTA) spolimeryzowany 0,05% w/v nadsiarczanu amonu (APS) i 0,005% v/v TEMED). Wizualizacja za pomocą PhosphorImager (patrz sekcja 5 poniżej).

2. Przygotowanie żeli akrylowych

1. Ustaw system odlewania żelu, np. zestaw do odlewania żelu Hoefer SE400 z płytkami o wymiarach 16 cm x 18 cm i podkładkami dystansowymi 1,5 mm.
   1. Dokładnie wyczyść szklane płytki i przekładki za pomocą detergentu i wody. Nosić czyste rękawice, aby uniknąć ponownego zabrudzenia płytek olejem z palców, co utrudniłoby spójne tworzenie żelu.
   2. Opłucz płytki dużą ilością wody destylowanej (dejonizowanej), aby usunąć pozostałości detergentu, a następnie przetrzyj niestrzępiącą się chusteczką (np. Kimwipe).
   3. Na koniec spryskaj 70% etanolem i przetrzyj - szklane płytki powinny skrzypieć, jeśli są czyste. Odstawić w pozycji pionowej, aby resztki etanolu odparowały.
   4. Wyczyść resztę sprzętu do formowania żelu wodą destylowaną (w razie potrzeby najpierw użyj detergentu) i wysusz.
   5. Zamontuj szklane płytki i przekładki w urządzeniu do formowania żelu, upewniając się, że system jest szczelny.
2. Przygotować roztwór żelu do pożądanej zawartości procentowej poliakryloamidu
   1. Do testu nukleazy należy użyć denaturujących 14% żeli poliakrylamidowych z 8 M mocznikiem w 1x TBE.
   2. Aby przygotować 100 ml (wystarczy na 2 żele z dużym nadmiarem na wyciek) weź 48,05 g mocznika do szerokiej zlewki i dodaj 35 ml 40% roztworu akrylamidu 19:1 i 10 ml 10x TBE (890 mM Tris, 890 mM kwas borowy, 20 mM EDTA, pH 8,3 z NaOH). UWAGA: Nosić rękawiczki - akrylamid jest silną neurotoksyną. Rozpuść mocznik za pomocą mieszadła i magnetycznej płytki mieszającej (zajmie to trochę czasu).
   3. Po rozpuszczeniu dodaj do 100 ml wodę dejonizowaną miliQ. Filtruj i sterylizuj za pomocą membrany 0,22 μm. Jeśli nie ma być użyty natychmiast, należy go krótko odgazować za pomocą sprzętu ssącego i przechowywać w ciemności (wystarczy na kilka dni). Nie przechowywać w lodówce, ponieważ mocznik wytrąci się.
3. Polimeryzuj i odlej żel.
   1. Wziąć mocznik-akryloamid i dodać 0,5 ml 10% (m/v) nadsiarczanu amonu (APS, uzupełnionego w wodzie destylowanej) i 50 μl TEMED. Powoli obracaj pojemnik, aby wymieszać bez podawania powietrza (co zahamuje polimeryzację) i wlej do żelu. Działaj szybko, w przeciwnym razie żel może stwardnieć przed zakończeniem nalewania.
   2. Dodaj odpowiedni grzebień, aby uformować studzienki do ładowania próbki (dobrane zgodnie z zestawem żelowym i numerem próbki do analizy, np. grzebienie z 15 lub 29 zębami nadają się do stosowania z zestawem do żelu Hoefer). Sprawdź, czy pod zęby grzebienia nie dostały się pęcherzyki powietrza.
   3. Pozostaw do zastygnięcia. Monitoruj wycieki. Pełna polimeryzacja jest opóźniona na grzebieniach w wyniku kontaktu z atmosferą. Gdy dołki będą twarde, reszta żelu zostanie ustawiona.
   4. Zdejmij grzebienie i wypłucz niespolimeryzowany akryloamid za pomocą wody i pipety.
4. Przygotuj żel do biegania.
   1. Umieść odlewany żel w systemie do biegania żelu i dodaj odpowiednią ilość 1x buforu do pracy TBE do dolnej komory i do dołków żelowych. Żel jest teraz gotowy do załadowania.

3. Przygotowanie rekombinowanego białka DmWRNexo oznaczonego przez His-taga

1. Bakteryjna ekspresja białka DmWRNexo
   1. Za pomocą pętli inokulacyjnej zebrać bakterie, zeskrobując powierzchnię zapasów glicerolu utrzymywanych w temperaturze -80 °C (bakterie to E. coli T7 Iq LysY (NEB) transformowane za pomocą pIVEX2.3d-DmWRNexo). Na płytkach z agarem LB (10 g tryptonu, 5 g ekstraktu drożdżowego, 5 g NaCl, 15 g agaru uzupełnionego do 1 l wodą destylowaną o pH dostosowanym do 7,4) rozsypać na płytkach LB (10 g tryptonu, 5 g / ml ekstraktu drożdżowego, 5 g NaCl, 15 g agaru z wodą destylowaną i pH dostosowanym do 7,4). Inkubować odwróconą przez noc w temperaturze 37 °C.
   2. Pobrać pojedynczą kolonię z płytki do 50 ml LB (10 g tryptonu, 5 g ekstraktu drożdżowego, 5 g NaCl uzupełnionego do 1 l wodą destylowaną) uzupełnionego 50 μg/ml ampicyliny (uzupełnionej w wodzie i wysterylizowanej filtrem do 0,22 μm). Rosnąć z wytrząsaniem w temperaturze 220 obr./min w temperaturze 37 °C przez noc.
   3. Zaszczepić 1,8 l (porcje po 600 ml każda w trzech kolbach stożkowych o pojemności 2 l, aby zapewnić odpowiednie napowietrzenie) LB-ampicyliny za pomocą nocnej kultury o pojemności 50 ml i osiągnąć OD₆₀₀ ~ 0,8. Dodać IPTG do końcowego stężenia 0,7 mM i inkubować w temperaturze 26 °C (aby zapobiec agregacji białek) z wytrząsaniem przez 4-8 godzin.
   4. Zebrać osad komórkowy przez odwirowanie przy 8 000 obr./min 4 °C przez 10 minut - użyć 6 sterylnych plastikowych butelek wirówkowych o pojemności 500 ml z 300 ml zawiesiny komórek w każdej. Odrzuć supernatant i ponownie zawieś osad w małej objętości (10 ml) oryginalnego wzmacniacza LB, przenieś do 15 ml probówki Falcon, a następnie ponownie odwiruj z prędkością 5 000 obr./min, aby osad został ponownie osadzony w osadach - ponownie usuń supernatant i zamroź w temperaturze -80 °C (pomaga to w lizie).
2. Liza komórek bakteryjnych
   1. Uzupełnić 3,2 ml buforu do lizy zawierającego 1 ml 5 M NaCl, 1 ml 1 M DTT, 200 μl 1 M benzamidyny i 1 ml 10 mg/ml lizozymu (zawieszonego w wodzie destylowanej).
   2. Do każdej osadki pochodzącej z 300 ml zawiesiny bakteryjnej dodać 320 μl buforu do lizy. Zawiesić jak najwięcej - użyj "odpiłowanej" końcówki p1000 i mieszaj, a także pipetując w górę iw dół. Inkubować na lodzie 20 min. Dodać kolejne 100 μl buforu do lizy i dobrze wymieszać, a następnie przenieść jak najwięcej zawieszonego lizatu do probówki do mikrofuge (będzie bardzo lepki i trudny do pipetowania).
   3. Odwirować lizat z prędkością 14 000 obr./min we wstępnie schłodzonym wirniku do mikrofuge w temperaturze 4 °C przez 30 minut, a następnie przenieść supernatant do czystej probówki do mikrodyminacji: zawiera ona rekombinowane białko.
3. Oczyszczenie z jego pułapki
   1. Przygotowanie odczynników: Oznaczyć 5 probówek do mikrodyfugów dla każdego z następujących stężeń imidazolu: 40 mM, 60 mM, 100 mM, 300 mM i 500 mM (np. oznaczenie 40-1, 40-2, 40-3 itd.), które zostaną użyte do zebrania frakcji kolumny. Przechowuj probówki na lodzie na stojaku z otwartymi pokrywkami (ale przykryj luźno folią spożywczą lub podobnym, aby zachować czystość podczas przygotowywania wszystkiego innego). Uzupełnić 25 ml 20 mM imidazolu i 10 ml bulionu każdego z pozostałych stężeń imidazolu w 25 ml probówkach uniwersalnych, używając 1x PBS (8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na₂HPO₄, 0,24 g KH₂PO₄, pH dostosowane do 7,4 i uzupełnione do 1 l wodą destylowaną) jako rozcieńczalnik.
   2. Dostosować lizat bakteryjny do 20 mM imidazolu, używając odpowiedniej objętości 2 M roztworu podstawowego imidazolu i dostosować objętość do co najmniej 1 ml (<5 ml) przy użyciu 20 mM imidazolu.
   3. Przemyć 1 ml kolumny His-Trap (Amersham) 10 ml wody MilliQ za pomocą strzykawki o pojemności 5 lub 10 ml z blokadą Luer lock i delikatnym ręcznym naciskiem, a następnie wyrównać kolumnę, przepuszczając 10 ml 20 mM imidazolu uzupełnionego w PBS (patrz krok 3.3.1 powyżej).
   4. Załaduj lizat na kolumnę. Gdy lizat jest ładowany na kolumnę, może wystąpić znaczne ciśnienie wsteczne; Jest to całkowicie normalne. Nie należy ulegać pokusie przykładania zbyt dużej siły do strzykawki i utrzymywać stały, równomierny nacisk. Zwykle obserwuje się łagodną zmianę koloru, gdy lizat dostaje się do kolumny. Zebrać płyn do butelki Sterilin bijou (pojemność 7 ml) i przechowywać na lodzie.
   5. Przemyć kolumnę 10 ml 20 mM imidazolu i zebrać go do uniwersalnej probówki o pojemności 25 ml na lodzie, oznaczonej jako "przemycie".
   6. Przepuścić 5 ml imidazolu o stężeniu 40 mM przez kolumnę, zbierając frakcje o objętości 1 ml do każdej z probówek do mikrofuge (oznaczonych 40.1, 40.2, 40.3 itd.): należy uważnie obserwować tłok strzykawki, ponieważ pozwala to na odmierzenie 1 ml.
   7. Teraz kolejno przepuść przez 5 ml każdego z 60 mM, 100 mM, 300 mM i 500 mM imidazolu, ponownie zbierając 5 x 1 ml frakcji przy każdym stężeniu soli.
4. Analiza ułamków kolumnowych
   1. Plama punktowa: Umieść 2 μl każdej frakcji kolumny (a także załaduj, przelej i umyj) na arkuszu nitrocelulozy - jest to łatwiejsze, jeśli zostanie to wstępnie obrysowane siatką za pomocą miękkiego ołówka). Pozostawić do wyschnięcia na powietrzu. Przetwarzaj ilos, blokując przez 15 minut do 1 godziny temperaturę pokojową w 5% beztłuszczowym mleku w proszku sporządzonym w PBS z 0,2% v/v Tween 20, a następnie umyj w PBS-Tween kilka razy i inkubuj z przeciwciałem HRP-anty-his rozcieńczonym w stosunku 1:500 w PBS-Tween przez 30-60 minut. Dokładnie przemyj za pomocą PBS-Tween, a następnie PBS i wykryj związane przeciwciało za pomocą wzmocnionej chemiluminescencji (ECL), uwidocznionej na Hyperfilm MP. Ten dot blot daje doskonałe wyobrażenie o frakcjach pików przed analizą SDS-PAGE i może w razie potrzeby informować o kolejnych etapach oczyszczania (np. jeśli problemem jest stabilność białka, możliwe jest zebranie frakcji pikowych na podstawie wyników dot blot i załadowanie bezpośrednio do żelowych kolumn filtracyjnych - patrz krok 3.5 poniżej).
   2. SDS-PAGE: Zbierz 50 μl każdej frakcji kolumny do oznakowanej probówki do mikrofuge zawierającej 50 μl 2x barwników ładujących SDS-PAGE (4% w/v SDS, 20% v/v glicerolu, 120 mM Tris-HCl pH 6,8 z 200 mM DTT). Gotować te próbki przez 5 minut w temperaturze 95-100 °C (uwaga: w przypadku używania gorącego bloku bez podgrzewanej pokrywki należy wykonać mały otwór w pokrywie każdej probówki za pomocą wąskiej igły strzykawkowej, aby zapobiec "eksplodowaniu" probówek podczas nagrzewania). Uruchom 10% miniżele SDS-PAGE, ładując 10 μl każdej frakcji kolumny i zabarwij jaskrawym błękitem Coomassie, aby sprawdzić frakcje szczytowe i % czystości białka. W razie potrzeby możliwe jest również wykonanie western blot dla białka znakowanego przez niego poprzez przeniesienie białek oddzielonych przez SDS-PAGE na nitrocelulozę; zablokować błony 5% mlekiem beztłuszczowym w PBS-0,2% Tween 20, a następnie przemyć i wysondować przeciwciałem anty-his sprzężonym z HRP (1:500), jak w przypadku plamy punktowej.
5. Aby zwiększyć czystość, frakcje pikowe z kolumny his-trap można zebrać i załadować do żelowej kolumny filtracyjnej Superdex 75 z elucją, w której zawartość soli wzrasta (jak opisano wcześniej Boubriak i wsp.¹³ oraz Mason i wsp. ^{Rozdział 14}).

4. Test nukleazy

1. Wykonaj zapasy robocze substratów.
   1. Stosować substrat 20 pmol na reakcję (choć można to zmieniać w zależności od pytania, które należy rozwiązać), więc wygodny zapas roboczy to 200 pmol/μl (tj. 10x). Zapasy robocze są tworzone w małych objętościach bufora do wyżarzania (10 mM Tris-HCl pH7,6, 1 mM EDTA pH 8,0, 50 mM NaCl) lub w 10 mM Tris-HCl pH 7,0 (do pH 8,5, w zależności od nukleazy) bez soli lub EDTA, w zależności od czułości enzymu lub testu, który należy przeprowadzić.
   2. Przechowywać w temperaturze 4 °C i w ciemności (zawinąć w folię). Podłoża wytrzymują wiele tygodni bez utraty integralności dupleksu lub sygnału fluorescencyjnego.
2. Oznaczenie stężenia białka egzonukleazy za pomocą analizy kolorymetrycznej lub spektrometrii UV przy Abs₂₆₀.
   1. Przechowywać w małych porcjach w temperaturze -80 °C.
   2. Jeśli próbki są jednokrotnie zamrażane/rozmrażane, należy przyjąć współczynnik nieprawidłowego fałdowania białka wynoszący 5% (lub określić empirycznie dla każdego białka, które ma być oznaczone) i odpowiednio dostosować stężenia.
   3. Odrzuć białka do oznaczenia aktywności egzonukleazy po dwóch cyklach zamrażania/rozmrażania i odnotuj stan białka dla każdego eksperymentu.
3. Zaprojektuj, eksperymentuj i opracuj ilości mieszanki wzorcowej (MM) dla próbek.
   1. Wykonaj MM zawierający wszystkie składniki wspólne dla badanych próbek (zwykle wszystko oprócz enzymu lub substratu), aby zmniejszyć zmienność między próbkami.
   2. Należy uwzględnić błąd pipetowania podczas uzupełniania MM, np. obliczyć objętości dla próbek N, przygotowując wystarczającą ilość próbek dla próbek (N + 0,1N).
   3. Ustaw reakcje w całkowitej objętości 20 μl/próbkę, zawierającą 1 pmol enzymu i 20 pmol substratu (domyślnie przed optymalizacją - oczywiście ilości różnią się w zależności od tego, co jest testowane, np. zmień ilość enzymu, jeśli testowany jest efekt stężenia enzymu). Dla DmWRNexo stwierdzono empirycznie, że optymalny bufor dla aktywności nukleazy zawiera 40 mM Tris-HCl pH 8,0, 4 mM MgCl₂, 5 mM ditiotreitol z 0,1 mg/ml BSA klasy biologii molekularnej.
4. Ustawianie reakcji.
   1. Wszystkie odczynniki należy przechowywać w temperaturze 4 °C (wiadro na lód lub kriorak).
   2. Uzupełnić mieszaninę wzorcową i podwielokrotność do odpowiedniej liczby sterylnych probówek do mikrofuge o pojemności 0,5 ml, wolnych od DNaz. Uwzględnij kontrolę bez enzymów, aby uwidocznić początkowy substrat (kontrola niezdegradowana).
   3. Ustaw blok grzewczy na temperaturę odpowiednią dla aktywności enzymu (37 °C, z końcowym punktem czasowym 30 minut było optymalne dla DmWRNexo, chociaż może być konieczne empiryczne określenie przez porównanie aktywności wybranego enzymu w zakresie temperatur i czasów). Potencjalne inhibitory enzymów powszechnie występujące w powinny być dokładnie przetestowane (np. EDTA hamuje DmWRNexo, podobnie jak nadmiar ATP¹⁴, przypuszczalnie przez chelatację Mg²⁺ krytycznego dla aktywności nukleazy). Należy pamiętać, że nawet wysokie stężenia imidazolu (>300 mM) nie mają wpływu ani na aktywność enzymu DmWRNexo, ani nie wygaszają fluorescencji.
   4. Uzupełnić roztwór STOP (80% formamidu, 1x TBE). To jest na poziomie 3x. W razie potrzeby może zawierać barwniki, takie jak błękit bromofenolowy. Sklep w RT.
   5. W pobliżu bloku grzewczego należy zainstalować następujące odczynniki: ostatni odczynnik(i), który należy dodać do mieszaniny reakcyjnej (zwykle enzymu); pipetor i końcówki o pojemności 1-10 μl, timer, kriorak lub wiadro na lód oraz roztwór STOP.
5. Rozpocznij reakcję.
   1. Ustaw minutnik rozpoczynający dodawanie enzymu do pierwszej probówki. Umieść rurkę w bloku grzewczym.
   2. Kontynuuj dodawanie enzymu do pozostałych probówek w odpowiednich odstępach czasu. (15 sekund jest wystarczające dla prostych reakcji, które wymagają tylko roztworu STOP do zakończenia). Umieść w bloku grzewczym, gdy tylko enzym zostanie dodany.
6. Zatrzymaj reakcję.
   1. Gdy zegar osiągnie właściwy czas (na przykład 15 minut), dodaj 10 μl roztworu STOP do pierwszej próbki i wymieszaj pipetując. Umieść natychmiast na lodzie/w krioraku.
   2. Kontynuuj zatrzymywanie reakcji w odpowiednich odstępach czasu i w tej samej kolejności, w jakiej zostały ustawione, tak aby każda reakcja miała dokładnie taki sam czas inkubacji.
7. Próbki są teraz gotowe do załadowania na przygotowany żel denaturujący.
   1. Załaduj połowę (lub całość) każdej próbki za pomocą końcówek do ładowania żelu w celu dokładnego pipetowania. Na poziomach oligonukleotydów użytych w reakcji, połowa reakcji da dobry wynik do wizualizacji i pozwoli na powtórzenie (np. jeśli początkowy żel nie przebiega prawidłowo).
   2. Wygodnie jest załadować 1x roztwór STOP zawierający barwnik (np. błękit bromofenolowy) na jeden lub więcej torów, aby upewnić się, jak działa żel.
   3. Fluorescencyjne oligonukleotydy o znanych rozmiarach mogą być uruchamiane razem z próbkami jako znacznik wielkości.
8. Uruchom żel.
   1. Dodać górną komorę buforową do aparatu żelowego i napełnić bieżącą komorą buforową (1x TBE), upewniając się, że próbki nie są naruszone. Sprawdź, czy nie ma wycieku bufora.
   2. Podłącz zestaw żelowy do zasilania i pracuj pod napięciem 200 V (stałe napięcie) przez 150-200 minut lub do momentu, gdy niebieski barwnik bromofenolowy (jeśli używasz) znajdzie się około dwóch trzecich drogi w dół żelu (biegnie wokół poziomu 10nt DNA w tym procentowym żelu). Monitoruj wycieki buforu, które mogą przekrzywić się lub uniemożliwić separację.
   3. Zatrzymaj żel i wyjmij go z uruchomionego aparatu.

5. Analiza i obrazowanie żelu

1. Określ czułość termowizora, który ma być używany, np. Fuji FLA-3000 PhosphorImager/Fluorescence Imager może wykrywać fluorescencję fluoresceiny za pomocą niebieskiego lasera 473 nm, wykorzystując największe ustawienie czułości F1000 i najmniejszy odczyt piksela (rozdzielczość) 50 μm.
2. Zeskanuj żel.
   1. Ostrożnie usuń przekładki i jedną płytkę żelową. Dokładnie (ale ostrożnie) spłucz żel pozostały na drugiej płytce żelowej, aby usunąć ślady wytrąconego mocznika, które w przeciwnym razie będą przeszkadzać w skanowaniu.
   2. Umieść płytkę (z nadal dołączonym żelem) żelem w dół na szklanej powierzchni uchwytu żelu i umieść ją w termowizorze. Zwróć uwagę na współrzędne żelu na szkle (jeśli nie wypełnia całej powierzchni).
   3. Otwórz odpowiednie oprogramowanie na podłączonym komputerze i zeskanuj zanotowany obszar skanowania, w którym znajduje się żel. Użyj najlepszych warunków określonych jak w kroku 5.1. Wynikowy plik będzie stosunkowo duży (kilka MB), ale w razie potrzeby obraz można przyciąć i skompresować.
   4. Zapisz, a następnie wyeksportuj jako plik, który może być odczytany przez oprogramowanie analityczne, np. wyeksportuj jako .tiff do analizy za pomocą ImageJ.
3. Przeanalizuj dane.
   1. Udany test egzonukleazy spowoduje degradację substratu sekwencyjnie wzdłuż oligonukleotydu w kierunku fluoroforu, co spowoduje powstanie charakterystycznego drabinkowatego wzoru fluorescencyjnych fragmentów DNA na żelu. Gatunki o większej ruchliwości na żelu (które biegną dalej) są mniejsze niż niezdegradowany substrat wyjściowy i dlatego reprezentują produkty degradacji egzonukleazy.
   2. Za pomocą narzędzia "Żele" w ImageJ można określić ilościowo względną intensywność gatunków na każdym pasie w zależności od ich mobilności, w celu określenia poziomów degradacji, a tym samym aktywności egzonukleazy w każdej próbce.

Przeprowadzenie analizy in vitro aktywności egzonukleazy wymaga kilku kroków przygotowawczych oprócz właściwej analizy. Przegląd procedur przedstawiono na rysunku 1.

Przed przeprowadzeniem testów egzonukleazy opartych na fluorescencji, kluczowe jest zoptymalizowanie wykrywania fluorescencyjnie znakowanego substratu oligonukleotydowego po oddzieleniu na żelach mocznikowo-akrylowych za pomocą odpowiedniego systemu obrazowania fluorescencyjnego. Wybór filtra jest niezwykle ważny, ponieważ może mieć znaczący wpływ na czułość całego testu - nasz substrat oligonukleotydowy jest znakowany fluoresceiną, więc wymaga filtra, który umożliwia wzbudzenie przy 470 nm i emisję przy 520 nm. Za pomocą tego filtra można zwiększyć zdolność wykrywania niskich stężeń podłoża (lub produktu) poprzez dostosowanie zarówno czułości, jak i rozdzielczości kamery. Należy zauważyć, że istnieje pewna tolerancja pod względem szerokości pasma filtra, ponieważ nieoptymalny wybór filtra (ex 520/em 580 nm) nadal pozwala na częściowe wykrycie podłoża, choć ze znacznie niższą czułością (rysunek 2C). Sugerujemy użycie kombinacji znakowanych ustawień stężenia oligonukleotydów i imagera, które umożliwiają niezawodne wykrywanie substratu (rysunek 2B i ciemnoszare paski na prawym panelu rysunku 2), dzięki czemu produkty degradacji, które są obecne w mniejszych ilościach w każdym paśmie, gdy substrat jest sekwencyjnie rozdrobniony, mogą być niezawodnie wykryte.

Udany test egzonukleazy spowoduje sekwencyjną degradację substratu w kierunku fluoroforu (w zależności od polaryzacji badanego egzonukleazy, może to być etykieta końcowa 5' lub 3' na jednej nici dupleksu), co skutkuje charakterystycznym drabinkowym wzorem DNA na żelu reprezentatywnym dla degradacji egzonukleazy (np. przebieg degradacji w czasie jest pokazany na rysunku 3). Można również stosować jednoniciowe oligonukleotydy, ale należy pamiętać, że nukleazy mogą wykazywać wymóg długości do rozszczepienia ss DNA15,17, więc fałszywie ujemne wyniki mogą wynikać z użycia zbyt krótkiego oligonukleotydu. Kinetykę aktywności enzymu można przybliżyć, wykonując densytometrię obrazów żelu z eksperymentu w czasie i określając ilościowo ilość pozostałego niezdegradowanego substratu w porównaniu z ilością obecną w mniejszych fragmentach (tj. produktach degradacji - patrz rysunek 2 Masona i wsp.Na przykład 14). Jedną z prostych metod jest równomierne podzielenie żelu na cztery pionowe sekcje, a następnie uzyskanie odczytów densytometrycznych każdej ćwiartki. Pozwala to uniknąć problemów z niewielkimi zmianami w ruchliwości substratu w żelu, choć oczywiście nie pozwala na czułe pomiary, takie jak rozszczepienie jednego lub kilku nukleotydów od podłoża. Ważne jest, aby znormalizować pomiary densytometryczne w odniesieniu do regionu żelu pozbawionego DNA (np. pozostawić co najmniej jeden pas pusty) i obliczyć degradację w stosunku do kontroli opartej wyłącznie na oligonukleotydach, która jest ładowana dla każdego eksperymentu (patrz Mason i wsp.Rozdział 14).

Po zoptymalizowaniu pod kątem wykrywania, test może być używany do wykrywania zróżnicowanych działań zarówno jakościowo, jak i ilościowo. Na przykład obecność lub brak aktywności można określić dla mutantów nukleazy w porównaniu z białkiem typu dzikiego (Figura 4), podczas gdy różne substraty mogą być również testowane pod kątem ich zdolności do degradacji przez badaną nukleazę (Figura 4). Jeśli wymagane są pomiary procesywności, możliwe jest dodanie nadmiaru nieznakowanego oligonukleotydu w określonym punkcie czasowym i określenie aktywności rozszczepienia po dodaniu. Wysoce przetworzony enzym będzie kontynuował rozszczepianie znakowanego substratu, podczas gdy słabo przetwarzający enzym będzie wykazywał znacznie zmniejszoną zdolność do rozszczepiania znakowanego substratu, gdy dysocjuje od substratu i ponownie wiąże się z nieznakowanym oligonukleotydem, który jest w nadmiarze molowym (np. patrz Mason i wsp.14 Rysunek 2).

Podobnie, intensywność i migracja pasm drabiny dostarczy danych o aktywności i przetwarzalności danej egzonukleazy, zarówno wewnętrznie, jak i w warunkach różnicowych, takich jak dostępność kationów lub temperatura. Jak opisano wcześniej14, DmWRNexo jest częściowo procesowy, ale nie rozszczepia łatwo matrycy 50 nukleotydów znakowanej fluoresceiną 5' do końca w warunkach zastosowanych tutaj. Pojedyncze prążki nukleotydowe są zatem rzadko spotykane w przypadku tego enzymu i substratu. Jednak test może łatwo wykryć produkty rozszczepienia pojedynczego nukleotydu, co obserwujemy, gdy DmWRNexo (egzonukleaza 3'-5') działa na substrat znakowany fluoresceiną 3' (patrz rysunek 3 Masona i wsp.14). Rzeczywiście, określenie kierunkowości aktywności egzonukleazy uzyskuje się poprzez analizę przy użyciu substratów ze szkieletem znakowanym na końcu 5' lub 3' - egzonukleaza 3' natychmiast rozszczepi fluorofor z nici znakowanej 3', czyniąc późniejszą aktywność drabinkową niewidoczną dla analizy i powodując tylko jeden gatunek o bardzo wysokiej ruchliwości widoczny na żelu (patrz Rysunek 3 Masona i wsp.14). Endonukleazy, które przecinają się wewnętrznie, będą pokazywać produkty w określonych ruchomościach, a nie po drabinie. Podobnie, zmienione zasady, które nie są podatne na rozszczepienie nukleazy, spowodują silne miejsca pauzy lub zatrzymania, które mogą być wykryte jako bardziej intensywne pasma reprezentujące ustanie rozszczepienia na tych zmodyfikowanych zasadach (np. Zobacz rysunek 7 z Mason et al.Rozdział 14).

Nieoptymalne wyniki obejmują rozmazywanie, tj. niespecyficzną degradację. Inne kwestie, o których należy pamiętać, to problemy z żelem, które powodują słabą separację, np. gdy żel nie związał się równomiernie (ryc. 5), w żelu znajdują się pęcherzyki lub bufor przecieka podczas elektroforezy. Ważne jest również, aby podłoża były sprawdzane przed użyciem, ponieważ mogły się oddzielić lub ulec degradacji, w takim przypadku należy je ponownie wyżarzyć lub wyrzucić. Utrata aktywności białka w cyklach zamrażania/rozmrażania lub niewystarczające stężenia mogą prowadzić do negatywnych wyników, chociaż ważne jest, aby zoptymalizować je pod kątem wymagań dotyczących i innych wymagań, np. ATP w wysokich stężeniach może hamować DmWRNexo, prawdopodobnie poprzez miareczkowanie jonów Mg2+ 15.

Rysunek 1. Schemat przebiegu procedur podejmowanych podczas przeprowadzania testu egzonukleazy na bazie fluorescencji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

Rysunek 2. Optymalizacja wykrywania podłoża fluorescencyjnego za pomocą luminowizora. Pojedynczy żel o podwójnych rozcieńczeniach 50-merowego fluorescencyjnie znakowanego substratu oligonukleotydowego poddano działaniu Phosphorimagera przy użyciu różnych warunków filtrowania (A, B: 470 ex/520 em, co jest optymalne dla fluoresceiny, lub C: 520 em/580 ex) i zmieniając czułość lub rozdzielczość. Ciemnoszare pola wskazują stężenia oligonukleotydów, które można niezawodnie wykryć z wysoką czułością i rozdzielczością; Jaśniejsze szare pola wskazują te stężenia, przy których sygnał może być nadal wykrywany, chociaż sygnał jest znacznie słabszy. Niezacienione obszary tabeli reprezentują stężenia oligonukleotydów, których nie można było wykryć przy użyciu ustawień filtra, czułości i rozdzielczości wskazanych na obrazach żelu A, B i C. Należy zauważyć, że 20 pmol substratu 50 nukleotydów odpowiada w przybliżeniu 312,5 ng. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Rysunek 3. Typowe wyniki testów substratów znakowanych fluorescencyjnie i egzonukleazy. (A) Schematyczne przedstawienie dupleksowego substratu oligonukleotydowego (5'OV) z wysięgiem 5' na nieznakowanej nici prowadzącej i 5' etykietą fluoresceiny na rozszczepionej nici, jak stosuje się w tych testach. (B) Przebieg w czasie degradacji 5' zwisającego podłoża przez oczyszczony DmWRNexo w temperaturze 37 °C. Enzym wiąże się z 5' zwisem nici prowadzącej i sekwencyjnie rozszczepia znakowaną nić w kierunku 3'-5', w wyniku czego powstaje drabina fragmentów o coraz mniejszych rozmiarach, które szybciej przesuwają się po żelach akrylamidowych. W tym eksperymencie użyto 10 pmol substratu oligonukleotydowego DmWRNexo i 20 pmol oligonukleotydu w reakcji 20 μl. ("FL" oznacza położenie niezdegradowanego dupleksowego podłoża fluorescencyjnego 5'OV duplex). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

Rysunek 4. Testowanie wpływu mutacji punktowej domeny katalitycznej egzonukleazy na zdolność enzymu DmWRNexo do rozszczepiania substratu dupleksowego z nawisem 5' lub struktury pęcherzykowej. W obu przypadkach podłoże jest znakowane fluoresceiną tylko na jednym pasmie tylko na końcu 5'. W reakcji 20 μl oczyszczone 12,5 pmol białko DmWRNexo (wagowo lub dwupunktowy mutant D82A E84A) inkubowano w temperaturze 37 °C z oligonukleotydem 25 pmol, jak pokazano na schemacie powyżej, a produkty analizowano na żelach mocznikowo-akrylowych po 15 lub 30 minutach ("FL" oznacza położenie niezdegradowanego substratu fluorescencyjnego). "wt" oznacza białko DmWRnexo typu dzikiego, podczas gdy "mut" jest dwupunktową wersją zmutowaną (D82A E84A). Wyniki te były przydatne w potwierdzeniu przypisania miejsca aktywnego enzymu, które opierało się na homologii do ludzkiej domeny egzonukleazy WRN wraz z modelowaniem strukturalnym in silico. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większy obraz.

Rysunek 5. Jeden przykład słabego wyniku. W wyniku nierównomiernej polimeryzacji żelu, znakowane fluorescencyjnie podłoże nie przebiega z taką samą pozorną ruchliwością na wszystkich pasach. Może to prowadzić do nieprawidłowej interpretacji danych dotyczących rozszczepienia, mimo że oczywiste jest, że podłoża na torach 3, 9 i 15 zostały rozszczepione prawie do końca, z częściowym rozszczepieniem na pasie 16. Zwróć uwagę, że niektóre pasy ruchu wydają się mieć ściśniętą szerokość, a także nieprawidłową mobilność prowadzącą do wykrytego "uśmiechu". Stosowanie identycznych warunków polimeryzacji (np. świeży APS, odpowiednie stężenia TEMED oraz stabilna i stała temperatura pokojowa) może pomóc w uniknięciu takich problemów. "FL" oznacza położenie niezdegradowanego podłoża fluorescencyjnego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większy obraz.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.