Artykuł metodologiczny

Metody ekstrakcji białka całkowitego i elektroforezy żelowej 2D dla gatunków Burkholderia

29.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50730

⸱

15 października 2013

 ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Centre for Understanding and Preventing Infection in Children, University of British Columbia

W tym artykule

Podsumowanie

Członkowie rodzaju Burkholderia są patogenami o znaczeniu klinicznym. Opisujemy metodę całkowitej ekstrakcji białek bakteryjnych, wykorzystującą mechaniczne rozerwanie i elektroforezę żelową 2D do późniejszej analizy proteomicznej.

Streszczenie

Badanie wewnątrzkomórkowych poziomów białek gatunków bakterii ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia mechanizmów patogennych chorób wywoływanych przez te organizmy. W tym miejscu opisano procedurę ekstrakcji białek z gatunków Burkholderia opartą na mechanicznej lizie za pomocą kulek szklanych w obecności kwasu etylenodiaminotetraoctowego i fluorku fenylometylosulfonylu w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem. Metoda ta może być stosowana dla różnych gatunków Burkholderia, dla różnych warunków wzrostu i prawdopodobnie nadaje się do zastosowania w badaniach proteomicznych innych bakterii. Po ekstrakcji białek opisano dwuwymiarową (2-D) technikę proteomiczną elektroforezy żelowej w celu zbadania globalnych zmian w proteomach tych organizmów. Metoda ta polega na rozdzieleniu białek zgodnie z ich punktem izoelektrycznym poprzez ogniskowanie izoelektryczne w pierwszym wymiarze, a następnie rozdzielenie na podstawie masy cząsteczkowej za pomocą elektroforezy w żelu akrylamidowym w drugim wymiarze. Wizualizacja oddzielonych białek odbywa się za pomocą barwienia srebrem.

Wprowadzenie

Rodzaj Burkholderia obejmuje ponad 62 gatunki, organizmy Gram-ujemne wyizolowane z szerokiego zakresu nisz i jest podzielony na dwie główne grupy1,2. Pierwszy klaster obejmuje organizmy ludzkie, zwierzęce i fitotroficzne, a większość badań koncentrowała się na gatunkach chorobotwórczych z tej grupy ze względu na ich znaczenie kliniczne. Najbardziej zjadliwymi przedstawicielami są B. pseudomallei i B. mallei (które powodują odpowiednio melioidozę i nosaciznę)3,4 oraz patogeny oportunistyczne (17 zdefiniowanych gatunków kompleksu Burkholderia cepacia, BCC)5, które wywołują chorobę w mukowiscydozie (CF) i przewlekłej chorobie ziarniniakowej (CGD)1. Drugi klaster, z ponad 30 gatunkami niepatogennymi, obejmuje bakterie związane z roślinami lub środowiskiem i są uważane za potencjalnie korzystne dla gospodarza2.

Liczne komplikacje wynikają z infekcji bakteryjnej patogennymi członkami rodzaju Burkholderia, takie jak przenoszenie patogenu między pacjentami, rozprzestrzenianie się choroby i niepowodzenie leczenia z powodu wewnętrznej lub nabytej oporności na antybiotyki, co utrudnia wyeliminowanie w większości przypadków6-9. W związku z tym lepsze zrozumienie podstaw powstania infekcji bakteryjnej ma zasadnicze znaczenie w leczeniu chorób wywoływanych przez te organizmy. Aby uzyskać wgląd w powstawanie infekcji, potrzebne są szeroko zakrojone badania składników bakteryjnych związanych z patogenezą. Badania koncentrujące się na analizie proteomicznej organizmów Burkholderia przy użyciu podejść proteomicznych opisywały białka, które są zaangażowane w patogenezę bakterii, a także zmiany w ich profilach proteomowych10-16.

Metody ekstrakcji białek za pomocą sonikacji i cykli zamrażania i rozmrażania w buforze do lizy zawierającym wysokie stężenie mocznika, tiomocznika w połączeniu z detergentem i amfolitami zostały zastosowane w badaniach proteomicznych Burkholderia 10-13. Chociaż mocznik jest dość skuteczny w denaturacji białek, może ustanowić równowagę w roztworze wodnym z izocyjanianem amonu, który może reagować z grupami aminokwasowymi, tworząc w ten sposób artefakty (reakcja karbamylacji)17. Dlatego zaleca się włączenie amfolitów nośnych, które działają jako zmiatacze cyjanianów i unikają temperatur powyżej 37 °C17. Ponadto, aby zapobiec wszelkim zakłóceniom chemicznym buforu do lizy z kwantyfikacją białka, ten sam bufor do lizy można użyć do wygenerowania krzywej wzorcowej, tak aby próbki i wzorce miały to samo tło10. Inne metodologie obejmują stosowanie alkalicznych i detergentów o okresach inkubacji cieplnej17,18; Jednak warunki te mogą wywoływać zmiany w proteomie, a niektóre detergenty nie są kompatybilne z aplikacją proteomiczną, chyba że uwzględnione są kolejne etapy usuwania detergentu17,18.

Po odpowiedniej ekstrakcji i kwantyfikacji, globalna ekspresja białka każdego pojedynczego białka może być badana za pomocą podejść proteomicznych, takich jak dwuwymiarowa (2-D) elektroforeza żelowa. Technika ta została po raz pierwszy opisana przez O'Farella19 i polega na rozdzieleniu białek zgodnie z ich punktem izoelektrycznym poprzez ogniskowanie izoelektryczne w pierwszym wymiarze, a następnie zgodnie z ich masą cząsteczkową za pomocą elektroforezy w żelu akrylamidowym w drugim wymiarze. Ze względu na swoją rozdzielczość i czułość, technika ta jest potężnym narzędziem do analizy i wykrywania białek ze złożonych źródeł biologicznych19,20. Ta technika separacji jest obecnie dostępna w podejściach skoncentrowanych na białkach, z wielką zaletą polegającą na rozwiązywaniu izoform białek spowodowanych modyfikacjami potranskrypcyjnymi lub przetwarzaniem proteolitycznym. Zmiany ilościowe można wykryć, porównując intensywność odpowiedniego miejsca po zabarwieniu żelu20. Technika ta nie nadaje się jednak do identyfikacji bardzo dużych białek, białek błonowych, białek skrajnie zasadowych i kwaśnych lub hydrofobowych i jest techniką nieco pracochłonną i czasochłonną20. Dostępne stają się nowe podejścia skoncentrowane na peptydach (nieoparte na żelu), które są bardziej niezawodne i obiektywne i mogą być stosowane do porównań ilościowych za pomocą metod różnicowego znakowania stabilnych izotopów, takich jak znakowanie cysteiną za pomocą znakowania powinowactwa kodowanego izotopowo (ICAT)21 oraz znakowanie grup aminowych za pomocą znakowania izotopów dla względnej i bezwzględnej oceny ilościowej (iTRAQ)22. Zastosowanie pojedynczej techniki proteomicznej może dostarczyć niewystarczających informacji; W związku z tym zastosowanie dwóch uzupełniających się podejść proteomicznych jest niezbędne do najpełniejszej oceny zmian w proteomie. Niemniej jednak elektroforeza żelowa 2D jest szeroko stosowana i może być rutynowo stosowana do ilościowej ekspresji kilku białek w różnych organizmach.

Tutaj opisujemy procedury ekstrakcji białek całokomórkowych i elektroforezy żelowej 2D dla gatunków Burkholderia, które zostały zaadaptowane i zoptymalizowane na podstawie Podręcznika Zasad i Metod Elektroforezy 2-D GE Healthcare 80-6429-60AC 2004 (www.amershambiosciences.com). Ekstrakcję białka przeprowadzono za pomocą ubijaka do kulek szklanych w obecności PBS zawierającego 5 mM EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy) i 1 mM PMSF (fluorek fenylometylosulfonylu). Procedura ta pozwala na ilościowe oznaczanie białek przy minimalnej degradacji i można ją dostosować do podejść proteomicznych, jak wcześniej opisano15,23,24. Elektroforezę żelową 2D przeprowadzono przy użyciu unieruchomionego gradientu pH 4-7 o długości 24 cm, a białka rozdzielono zgodnie z ich punktem izoelektrycznym. Następnie białka rozdzielono ze względu na ich masę cząsteczkową za pomocą żelu poliakrylamidowego SDS. Dodatkowo opisaliśmy metodę barwienia srebrem do wizualizacji białek punktowych oraz metodę barwienia srebrem, która jest kompatybilna z analizą spektrometrii mas. Łącznie procedury te mogą pozwolić na identyfikację ważnych białek z gatunku Burkholderia, które mogą być zaangażowane w patogenezę.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Wzrost kultury (Dni 1+2)

  1. Wyhodować kulturę starterową: 3 ml bulionu Luria Bertani (LB) w probówce typu snap top o pojemności 15 ml, w temperaturze rotatora 37 °C przez noc. Rozcieńczyć wzrost przez noc do OD600 wynoszącego 0,6. Dodać 1 ml tego rozcieńczenia do 100 ml bulionu LB w kolbie Erlenmeyera o pojemności 250 ml. Inkubować w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 250 obr./min przez 16 godzin do fazy stacjonarnej (SP), w celu lepszego przybliżenia, w hodowli okresowej, warunków infekcji i zapewnienia ekspresji bakteryjnych czynników wirulencji pod kontrolą czynników sygnałowych fazy stacjonarnej, takich jak rpoS i quorum sensing. Alternatywnie, bakterie wyhodowane we wczesnej fazie SP lub w środkowej lub późnej fazie logarytmicznej mogą być wykorzystane do uzyskania informacji na temat fazy adaptacji bakterii.
  2. Po 16 godzinach zmierz OD600 i upewnij się, że kultura osiągnęła SP w porównaniu z wcześniej skonstruowaną krzywą wzrostu w identycznych warunkach.

2. Ekstrakcja białka (Dzień 3)

  1. Wszystkie podłoża i roztwory schłodzić wcześniej w lodówce na noc. Wszystkie czynności należy wykonywać za pomocą rurek w wiaderku na lód. Schłodzić wstępnie mikrowirówkę i wirówkę Beckman Coulter High Performance (lub równoważną) do temperatury 4 °C i wirnika wewnątrz (wirnik = JA-20, wirówka = J2-HS).
  2. Przygotować świeży roztwór 0,1 M fluorku fenylometanosulfonylu (PMSF, 174,19 g/mol) w acetonie, rozpuszczając 0,0174 g PMSF ("UWAGA" PMSF jest toksyczny i, należy używać osłon twarzy i rękawiczek) w 1 ml acetonu ("UWAGA" aceton jest toksyczny i łatwopalny, należy używać osłon twarzy i rękawic).
  3. Uzupełnić roztwór PBS/EDTA/PMSF: 0,1 ml 0,1 M PMSF, 0,1 ml 0,5 M EDTA i 9,8 ml PBS. Sprawdź, czy OD 16-godzinnej kultury jest mniej więcej tam, gdzie powinien być w SP.
  4. Pobrać 35 ml kultury bakteryjnej i przenieść do probówki wirówkowej Oakridge i odwirować kulturę w temperaturze 4 500 × g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
  5. Usunąć sklarowany osad do pojemnika na odpady, dodać 35 ml schłodzonego PBS i ponownie zawiesić osad. Ponownie odwirować w temperaturze 4 500 × g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
  6. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić w 1 ml zimnego PBS. Przenieść do sterylnego 2 ml Eppendorfa i odwirować przez 1 minutę na wysokich obrotach w mikrowirówce w temperaturze 14 000 × g w temperaturze 4 °C. Usunąć i wyrzucić supernatant.
  7. Dodać 1 ml roztworu PBS/EDTA/PMSF, ponownie zawiesić osad i przenieść do probówki z nakrętką o pojemności 2 ml (z o-ringiem) zawierającej ~0,5 ml szklanych kulek (wstępnie wysterylizowanych). Dodać ponownie zawieszony osad do probówki zawierającej szklane kulki i rozdrabniać je w temperaturze 4 °C przez 1 minutę w chłodni. Zrób to 3 razy, umieszczając próbkę na lodzie po każdym uderzeniu.
  8. Wirować przy 14 000 x g przez 1 minutę w mikrowirówce. Usunąć supernatant i umieścić go w sterylnej probówce z polistyrenu o pojemności 5 ml.
  9. Aby zwiększyć wydajność, dodaj 1 ml roztworu PBS/EDTA/PMSF do tej samej probówki zawierającej szklane kulki. Ubijaj probówkę w temperaturze 4 °C przez 1 minutę. Zrób to 2x, kładąc próbkę na lodzie po uderzeniu. Odwirować przy 14 000 x g przez jedną minutę na wirówce, usunąć supernatant i dodać do supernatantu z kroku 2.8. Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml i 0,20 μm przefiltrować supernatant z probówki polistyrenowej do nowej sterylnej probówki Eppendorfa o pojemności 2 ml.
  10. Na tym etapie próbki należy oznaczyć pod kątem ilości białka przy użyciu zestawu do ekstrakcji białka Pierce MicroBCA, a podwielokrotności 200 μg należy zamrozić w temperaturze -80 °C do czasu, gdy będzie to wymagane.

3. Przygotowanie próbki (Dzień 4)

  1. Przygotować 25 ml roztworu podstawowego do rehydratacji (8 M mocznika, 2% CHAPS, 2% bufor IPG, 0,002% błękit bromofenolowy) i przechowywać w 2,5 ml podwielokrotności w temperaturze -20 °C. Dodać 7 mg ditiotreitolu (DTT, 154,2 g/mol) tuż przed użyciem do 2,5 ml podwielokrotności roztworu podstawowego do rehydratacji.
  2. Roztwory rozmrożone należy przetworzyć z kroku 2.10 za pomocą zestawu do oczyszczania 2D z końcowym ponownym zawieszeniem w 450 μl roztworu podstawowego do rehydratacji przygotowanego w kroku 3.1.

4. Ogniskowanie izoelektryczne pierwszego wymiaru (IEF) (Dzień 4)

Wszystkie kroki w tej sekcji korzystają z systemu Ettan IGPhor IEF.

  1. Ustaw paski pierwszego wymiaru IPG: wyczyść uchwyty pasków roztworem do czyszczenia pasków, a następnie umyj wodą Milli-Q, pozostaw do góry nogami do wyschnięcia. Przypisać każdą próbkę do numeru uchwytu paska żelowego.
  2. Załaduj próbkę z etapu ponownego uwodnienia do drugiego szerszego obszaru od końca (-). Użyj czystych kleszczyków, aby wyciągnąć paski żelu z opakowania. Usuń warstwę ochronną z pasków żelowych. Linie paski szorstką stroną do dołu w powolnym, przesuwanym ruchu, aby zmoczyć paski po drodze od (-) końca do (+) końca.
  3. Połóż wilgotną bibułę ze sterylizowaną wodą na elektrodzie i pod paskami żelu, aby zapobiec wypaleniu. Opłucz pęsetę między rundami oczyszczoną wodą i etanolem. Usuń wszystkie pęcherzyki, pokryj cienko olejem mineralnym, aby zapobiec wysuszeniu. Wyłóż uchwyty pasków żelowych na maszynie.
  4. Uruchom 12 godzin w temperaturze 20 °C w celu nawodnienia, 1 godzinę w temperaturze 200 V, 1 godzinę w temperaturze 500 V, 1 godzinę w temperaturze 1 000 V, 0,5 godziny w temperaturze 4 000 V, 12 godzin w temperaturze 8 000 V, 24 godziny w temperaturze 300 V i można go w tym czasie wyjąć.
  5. Po zakończeniu IEF zaleca się wykonanie elektroforezy w żelu poliakrylamidowym SDS w drugim wymiarze, chyba że paski IPG są zamrażane w temperaturze -80 °C w Saran Wrap pokrytym olejem mineralnym do przyszłej analizy. Alternatywnie, w celu uniknięcia smug punktowych spowodowanych dostępem do naziemnej telewizji cyfrowej, możliwe jest włączenie drugiego kroku równoważenia pasków IPG przed drugim wymiarem z buforem zawierającym jodoacetamid.

5. Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym SDS drugiego wymiaru (Dzień 5)

Wszystkie kroki w tej sekcji są wykonywane przy użyciu aparatu do elektroforezy Ettan DALTsix.

  1. Aby zmontować urządzenie do odlewania żelu, dokładnie wyczyść wszystkie elementy i upewnij się, że kółko żelowe jest wypoziomowane, a szare gumowe wiązanie jest nasmarowane żelem silikonowym. Umieść gumowy trójkątny korek na spodzie. Następnie naprzemiennie umieszczaj separator i szklane płytki tak, aby krótsza płyta szklana była skierowana do przodu. Upewnij się, że separatory znajdują się z tyłu i z przodu. Wypełnij pozostałą przestrzeń wypełniaczami (około 5 arkuszy) tak, aby góra była płaska. Załóż panel przedni z czerwoną końcówką na zewnątrz. Użyj clamps, aby dokręcić każdą stronę i dokręcić dolne.
  2. Przygotowanie żelu: Dodać 297,3 ml Duracrylu ("UWAGA" Duracryl jest toksycznym przyłbicą i osłonami twarzy i rękawicami), 147 ml Tris Buffer 1,5 M pH 8,8 i 143,3 ml wody Milli-Q do kolby z końcówką próżniową zawierającą mieszadło. Przykryj pokrywką i mieszaj roztwór z umiarkowaną prędkością przy włączonym odkurzaczu przez 20 minut. Próżnia służy do odgazowania roztworu. Przygotować świeży 10% roztwór nadsiarczanu amonu (APS, 218,8 g/mol): 0,2 g APS na 2 ml wody Milli-Q.
  3. Dodawanie mieszaniny żelu do odlewu żelowego: Po zakończeniu próżni dodać 6 ml 10% dodecylosiarczanu sodu (SDS, 228,38 g/mol) z boku kolby, aby uniknąć umieszczania większej liczby pęcherzyków w roztworze. Dodać APS, wymieszać, dodać 0,25 ml N,N,N',N'-tetrametyloetylenodiaminy (TEMED, 116,20 g/mol) ("UWAGA" TEMED jest łatwopalny, należy używać przyłbic ochronnych i rękawic) i zamieszać.
  4. Wlać mieszaninę żelu do odlewu żelowego przez lejek umieszczony z tyłu aparatu. Wlej do cala poniżej krótkiego talerza. Dodaj 1,5 ml nasyconego wodą butanolu na wierzch żelu i owiń wierzch saran wrap, aby uniknąć odwodnienia. Odczekaj 1 godzinę, aby zapewnić pełną polimeryzację.
  5. Sprawdzanie żelu: Gdy żel jest gotowy (sprawdź kolbę), zdemontuj kółko żelowe przy zlewie. Sprawdź integralność żelu podczas płukania szklanych płytek ciepłą wodą; Nie pozwól, aby woda dostała się do płyty. Wylej butanol i dwukrotnie spłucz wierzch żelu wodą, aby pozbyć się butanolu. Ponownie napełnij górę wodą i odstaw, jeśli żele nie zostaną użyte od razu.
  6. Przygotowanie pasków: Przygotować równoważny roztwór buforowy z zamrażarki (6 M mocznika, 75 mM Tris-HCl pH 8,8, 29,9% SDS, 0,002% błękitu bromofenolowego). Można go wstępnie przygotować i przechowywać w podwielokrotnościach o pojemności 10 ml w temperaturze -20 °C. Rozpuścić 0,1 g naziemnej telewizji cyfrowej w 10 ml roztworu buforowego równoważącego. Jedna tubka może być używana do dwóch pasków IPG. Umieść żele z paska zadrukowaną stroną do dołu na buforze i pozostaw na 30 minut. Pamiętaj, który koniec jest który.
  7. Przygotowanie jednostki do elektroforezy (aparat do separacji 2D): Dodaj 4,5 l 1x buforu do elektroforezy (25 mM Tris Base [121,1 g/mol], 192 mM glicyny [288,38 g/mol] i 0,1% w/v SDS [288,38 g/mol]) do działającego zbiornika. Ten bufor może być używany do 3x. Włącz urządzenie do elektroforezy. Sprawdź poziom wody w maszynie chłodzącej wodę i napełnij ją wodą, jeśli jest niski. Włącz maszynę, naciśnij tryb, aby sprawdzić wyznaczoną temperaturę, która powinna wynosić 10 °C.
  8. Przygotować 1 l 2x buforu bieżącego i 1 l 1x buforu bieżącego i przechowywać je w temperaturze 4 °C. Przygotować roztwór uszczelniający agarozę: Odważyć 0,25 g agarozy i rozpuścić w 50 ml 1x buforu bieżącego. Pulsuj przez 15 sekund każdy.
  9. Konfiguracja jednostki elektroforezy: Użyj pęsety, aby wyjąć każdy pasek i usunąć nadmiar bufora z obu stron czystym ręcznikiem papierowym. NIE dotykaj pasków. Wylej wodę na wierzch żelu i wyłóż wierzch żelu 1x buforem do biegania. Użyj czystej pęsety i umieść paski na długiej płytce, stroną z żelem skierowaną do siebie. Dodaj 1x bufor do pasków, aby go nasmarować. Wsuń paski dalej w dół za pomocą plastikowych pasków. Usuń wszystkie pęcherzyki znajdujące się między paskiem a żelem.
  10. Dodaj roztwór uszczelniający agarozę na wierzch paska, aby go uszczelnić. Powtórz dla pozostałych pasków. Umieść szklane płytki zawierające żele w kołysce żelowej i opuść do zbiornika żelu. Upewnij się, że poziom bufora 1x w komorze zewnętrznej znajduje się na wyznaczonej dolnej linii przed założeniem górnej komory.
  11. Umieść ramę górnej komory buforowej na górze szklanych płyt i upewnij się, że jest całkowicie doła, dociskając dno do dołu. Użyj lejka i dodaj 2x biegnący bufor do górnej komory aż do środkowej linii. Użyj lejka i dodaj 1x bufor biegowy do zewnętrznej komory, aż dotrze do górnej linii. Umieść pokrywę na górze i włącz jednostkę do elektroforezy i zasilacz.
  12. Uruchom przez noc pod napięciem 52 V, 96 mA, 5 W. Sprawdź, czy prąd płynie, szukając pęcherzyków na srebrnym przewodzie w pobliżu góry. Prowadź żel, aż linia prowadząca znajdzie się 1 cm od dołu.
  13. Białka mogą być również analizowane przy użyciu sprzętu i odczynników innych firm, takich jak BIORAD czy Hoefer, zgodnie z instrukcjami producenta.

6. Srebrne barwienie żeli do wizualizacji żelu (Dzień 5-6)

  1. Przygotować roztwór utrwalający 1 (800 ml etanolu, 200 ml kwasu octowego i 1 000 ml wody Milli-Q w dygestoriach do plastikowego wiadra). Roztwór jest dobry na 6 żeli. Wyłącz wszystkie urządzenia i wyjmij całą środkową część urządzenia do elektroforezy i wciągnij ją do zlewu. Umieść również białą podstawkę w zlewie. Wyciągnij górną tacę zawierającą 2x uruchomiony bufor.
  2. Zdemontować aparaturę i usunąć żele ze szklanych płytek do roztworu utrwalającego 1. Żele można zidentyfikować, odcinając rogi po ich wyjęciu ze szklanych płytek, przy czym liczba wyciętych rogów odpowiada kolejności żelu w kółku.
  3. Umieścić pojemnik z roztworem utrwalającym i żelami na kołysce na co najmniej 1 godzinę do nocy w temperaturze 4 °C.
  4. Przenieś żele do utrwalenia roztworu 2 (20 ml 50% aldehydu glutarowego, 600 ml etanolu, 5 g tetrationianu potasu (302,46 g/mol), 136 g octanu sodu (82,03 g/mol) i wodę Milli-Q do 2,000 ml) i umieść na kołysce na 1 godzinę.
  5. Umyj żele 4x po 15 minut w wodzie Milli-Q.
  6. Zabarwić żele w roztworze azotanu srebra (4 g azotanu srebra (169,87 g/mol), 500 μl formaldehydu i wody Milli-Q do 2,000 ml) przez 30 minut lub do 48 godzin.
  7. Żel myć przez 1 minutę w wodzie Milli-Q.
  8. Przenieść do roztworu wywoływacza (60 g węglanu sodu (105,99 g/mol), 300 μl formaldehydu, 15 mg tiosiarczanu sodu (158,11 g/mol) i wodę Milli-Q do 2,000 ml) przez 5-30 minut, aż żel zostanie zabarwiony.
  9. Umieść żele w roztworze zatrzymującym (100 g Tris-Base (121,14 g/mol), 40 ml kwasu octowego i wody Milli-Q do 2 000 ml) na 10 minut.
  10. W celu przechowywania należy przenieść żele do roztworu glicerolu (40 ml glicerolu lub 400 ml, jeśli pożądane jest długotrwałe przechowywanie, i 1 600 ml wody Milli-Q) na 10 minut, a następnie wysuszyć je za pomocą suszarki do żelu.
  11. Żele można wizualizować po barwieniu za pomocą systemów obrazowania, takich jak skaner/densytometr, fotografować za pomocą transiluminatora światła lub imagera żelowego. Oprogramowanie do analizy obrazu, takie jak PDQuest 2-D analysis firmy BIORAD, może być następnie wykorzystane do uzyskania informacji ilościowych i jakościowych z białek w próbce.

7. Barwienie srebrem w żelu do analizy spektrometrii mas

  1. Utrwal żele w 50% metanolu i 5% kwasie octowym przez 1 godzinę.
  2. Prać w 50% metanolu przez co najmniej 10 minut do nocy.
  3. Myć w wodzie destylowanej 3x przez 10 min.
  4. Uczulać 0,02% tiosiarczanem sodu (158,11 g/mol) 2x przez 15 min.
  5. Umyć 3x w SCHŁODZONEJ wodzie destylowanej 3x przez 10 min.
  6. Zanurzyć żel w SCHŁODZONYM 1% roztworze azotanu srebra (169,87 g/mol) na co najmniej 20 minut do 1 godziny w temperaturze 4 °C
  7. Myć 2x przez 1 min wodą destylowaną. Zmień tacę/wiadro.
  8. Rozwijać w 0,04% formaldehydzie w 2% bezwodnym węglanie sodu (105,99 g/mol) i wyrzucić, gdy dość szybko zmieni kolor na żółty; mieć trzy partie i być gotowym do wymiany co 5 minut.
  9. Umyć w 5% kwasie octowym, a następnie przechowywać w 1% kwasie octowym.
  10. Przed użyciem opłucz 1,5 ml probówki Eppendorf (aby zatrzymać wycięcia punktowe) etanolem klasy USP i wysuszyć na powietrzu.
  11. Oczyść kleszcze, żyletki i powierzchnie 100% metanolem.
  12. Spryskaj rękawice i powierzchnie etanolem.
  13. Miejsca wycinkowe w okapie przepływowym lub obszarze czystego powietrza. Plamy można również wycinać za pomocą automatycznego obcinacza punktowego.
  14. Umieść je w tubkach Eppendorf i wyślij na lodzie lub przechowuj w lodówce.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Analiza porównawcza profili białkowych wyekstrahowanych z tej samej kultury bakterii w dwóch różnych terminach wykazała podobne wzory prążków, co wskazuje na pomyślną ekstrakcję białek. Masa cząsteczkowa wyekstrahowanych białek mieściła się w zakresie 10-150 kDa. Rysunek 1 przedstawia reprezentatywny żel barwiony błękitem Coomassie z ekstrakcjami białek całokomórkowych z izolatów klinicznych Burkholderia multivorans (członka BCC) hodowanych w bulionie LB lub drożdżowo-manitolowym (YEM) i zbieran...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisano metodę przygotowania białek, która pozwala na ekstrakcję większości białek Burkholderia z dobrą odtwarzalnością. Wykazano to, uzyskując ten sam profil białkowy z dwóch niezależnych preparatów wykonanych w różnych dniach przy użyciu tej samej kultury bakteryjnej wyhodowanej w bulionie LB lub YEM, jak pokazano na rysunku 1. Ekstrakcja była skuteczna w przypadku bakterii hodowanych w płynnych pożywkach; Nie testowaliśmy jednak tej metody pod kątem bakterii hodowanych na płytkach. Metoda ta ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez stypendium z Uniwersytetu Kolumbii Brytyjskiej (do B.V.) oraz granty od Cystic Fibrosis Canada i Canadian Institutes Badań nad Zdrowiem (do D.P.S.). Dziękujemy Jacqueline Chung za wstępne przygotowanie protokołów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
odczynniki
Fluorek fenylometanosulfonylu (PMSF)SigmaP7626Toksyczny,
acetonFisherA18-1Łatwopalny
bufor PBSBioscienceR028
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)FisherBP118-500toksyczny
Szklane kulki (0.1 mm)Produkty BioSpec11079101
Probówki wirówkowe Nalgene Oak Ridge, poliwęglan (50 ml)VWR21009-342
Zestaw do ekstrakcji białek MicroBCAPierce23235
Probówki do mikrowirówek 2,0 ml stożkowe z nakrętką i O-ringiemFisher02-681-375
Zestaw do czyszczenia 2-DGE Healthcare80-6484-51
MocznikInvitrogen15505-050Drażniący
CHAPSAmersham Biosciences17-1314-01
Ditiothreitol (DTT)MPBiomedical, LCC856126Drażniący
Immobiline DryStrips pH 4-7 24 cmAmersham Biosciences176002-46
DuracrylProteomic Solutions80-0148Bardzo toksyczny, rakotwórczy
Nadsiarczan amonuFisherBP179-100Łatwopalny, toksyczny,
N,N,N',N'--tetrametyloetylenodiamina (TEMED)Invitrogen15524-010Łatwopalny
dodecylosiarczan sodu (SDS)FisherBP166-500Ostra toksyczność, łatwopalny
AgarozaInvitrogen15510-027
EtanolFisherHC1100-1GLŁatwopalny, toksyczny
kwas octowyFisherA491-212Łatwopalny,
aldehyd glutarowyFisherG151-1Bardzo toksyczny,, niebezpieczny dla środowiska
Tetrationian potasuSigmaP2926Drażniący
Octan soduEM Science7510
Azotan srebraSigma209139, niebezpieczna dla środowiska
FormaldehydSigma252549Toksyczny
Tiosiarczan soduSigmaS7026
Tris BaseEMD9230
GlicynaMPBiomedical, LCC808831
GlicerolMPBiomedical, LCC800688
MetanolFisherA412-4Łatwopalny, toksyczny, zagrażający zdrowiu
Węglan sodu bezwodnyEMDSX0400-3Toksyczny
olej mineralnyACROS415080010
Equipment
Wirnik ultrawirówki JA-20Beckman Coulter334831
Mini BeadbeaterBiospec Products3110BX
Izoelektryczny system ustawiania ostrości Ettan IPGphor II i akcesoriaGE Healthcare80-6505-03www.amershambiosciences.com
Ettan DALT Duży pionowy system elektroforezyGE Healthcare80-6485-27www.amershambiosciences.com

Bibliografia

  1. Drevinek, P., Mahenthiralingam, E. Burkholderia cenocepacia in cystic fibrosis: epidemiology and molecular mechanisms of virulence. Clin. Microbiol. Infect. 16, 821-830 (2010).
  2. Suarez-Moreno, Z. R., et al. Common Features of Environmental and Potentially Beneficial Plant-Associated Burkholderia. Microb. Ecol. , (2011).
  3. Wiersinga, W. J., van der Poll, T., White, N. J., Day, N. P., Peacock, S. J. Melioidosis: insights into the pathogenicity of Burkholderia pseudomallei. Nat. Rev. Microbiol. 4, 272-282 (2006).
  4. White, N. J. Melioidosis. Lancet. 361, 1715-1722 (2003).
  5. Mahenthiralingam, E., Urban, T. A., Goldberg, J. B. The multifarious, multireplicon Burkholderia cepacia complex. Nat. Rev. Microbiol. 3, 144-156 (2005).
  6. Speert, D. P., Henry, D., Vandamme, P., Corey, M., Mahenthiralingam, E. Epidemiology of Burkholderia cepacia complex in patients with cystic fibrosis. Canada. Emerg. Infect. Dis. 8, 181-187 (2002).
  7. Dance, D. A., Wuthiekanun, V., Chaowagul, W., White, N. J. The antimicrobial susceptibility of Pseudomonas pseudomallei. Emergence of resistance in vitro and during treatment. J. Antimicrob. Chemother. 24, 295-309 (1989).
  8. Thibault, F. M., Hernandez, E., Vidal, D. R., Girardet, M., Cavallo, J. D. Antibiotic susceptibility of 65 isolates of Burkholderia pseudomallei and Burkholderia mallei to 35 antimicrobial agents. J. Antimicrob. Chemother. 54, 1134-1138 (2004).
  9. Govan, J. R. W., et al. Evidence for transmission of Pseudomonas cepacia by social contact in cystic fibrosis. Lancet. 342, 15-19 (1993).
  10. Thongboonkerd, V., et al. Altered proteome in Burkholderia pseudomallei rpoE operon knockout mutant: insights into mechanisms of rpoE operon in stress tolerance, survival, and virulence. J. Proteome. Res. 6, 1334-1341 (2007).
  11. Park, K. H., Lipuma, J. J., Lubman, D. M. Comparative proteomic analysis of B. cenocepacia using two-dimensional liquid separations coupled with mass spectrometry. Anal Chim. Acta. 592, 91-100 (2007).
  12. Wongtrakoongate, P., Mongkoldhumrongkul, N., Chaijan, S., Kamchonwongpaisan, S., Tungpradabkul, S. Comparative proteomic profiles and the potential markers between Burkholderia pseudomallei and Burkholderia thailandensis. Mol. Cell Probes. 21, 81-91 (2007).
  13. Harding, S. V., et al. The identification of surface proteins of Burkholderia pseudomallei. Vaccine. 25, 2664-2672 (2007).
  14. Madeira, A., Santos, P. M., Coutinho, C. P., Pinto-de-Oliveira, A., Sa-Correia, I. Quantitative proteomics (2-D DIGE) reveals molecular strategies employed by Burkholderia cenocepacia to adapt to the airways of cystic fibrosis patients under antimicrobial therapy. Proteomics. 11, 1313-1328 (2011).
  15. Zlosnik, J. E. A., Speert, D. P. The Role of Mucoidy in Virulence of Bacteria from the Burkholderia cepacia Complex: A Systematic Proteomic and Transcriptomic Analysis. J. Infect. Dis. 202, 770-781 (2010).
  16. Riedel, K., Carranza, P., Gehrig, P., Potthast, F., Eberl, L. Towards the proteome of Burkholderia cenocepacia H111: setting up a 2-DE reference map. Proteomics. 6, 207-216 (2006).
  17. Weiss, W., Gorg, A. Sample solublization buffers for two-dimensional electrophoresis. Methods Mol. Biol. 424, 35-42 (2008).
  18. von der Haar, T. Optimized protein extraction for quantitative proteomics of yeasts. PLoS One. 2, e1078(2007).
  19. O'Farrell, P. H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J. Biol. Chem. 250, 4007-4021 (1975).
  20. Gorg, A., Weiss, W., Dunn, M. J. Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics. Proteomics. 4, 3665-3685 (2004).
  21. Gygi, S. P., Rist, B., Griffin, T. J., Eng, J., Aebersold, R. Proteome analysis of low-abundance proteins using multidimensional chromatography and isotope-coded affinity tags. J. Proteome Res. 1, 47-54 (2002).
  22. Ross, P. L., et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol. Cell Proteomics. 3, 1154-1169 (2004).
  23. Velapatiño, B., Limmathurotsakul, D., Peacock, S. J., Speert, D. P. Identification of differentially expressed proteins from Burkholderia pseudomallei isolated during primary and relapsing melioidosis. Microbes. Infect. 14, 335-340 (2012).
  24. Chung, J. W., Speert, D. P. Proteomic identification and characterization of bacterial factors associated with Burkholderia cenocepacia survival in a murine host. Microbiology. 153, 206-214 (2007).
  25. Rotz, L. D., Khan, A. S., Lillibridge, S. R., Ostroff, S. M., Hughes, J. M. Public health assessment of potential biological terrorism agents. Emerg. Infect. Dis. 8, 225-230 (2002).
  26. Thon, J. N., et al. Comprehensive proteomic analysis of protein changes during platelet storage requires complementary proteomic approaches. Transfusion. 48, 425-435 (2008).
  27. Wu, T. In New and Emerging Proteomic Techniques. Methods Mol. Biol. 328, 71-95 (2006).
  28. Lopez, M. F., et al. A comparison of silver stain and SYPRO Ruby Protein Gel Stain with respect to protein detection in two-dimensional gels and identification by peptide mass profiling. Electrophoresis. 21, 3673-3683 (2000).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ogniskowanie izoelektryczneSDS PAGEbarwienie srebremlizowanie koralkami szklanymikwantyfikacja bia ekanaliza proteomiczna

Powiązane artykuły