Inwazja bakterii jelitowych na komórki nabłonka jelitowego in vitro jest znacznie zwiększona dzięki pionowemu modelowi komory dyfuzyjnej

Podsumowanie

Wykonywanie testów hodowli komórkowych w celu zbadania adhezji i inwazji bakterii w warunkach tlenowych jest zazwyczaj niereprezentatywne dla środowiska in vivo. Model pionowej komory dyfuzyjnej umożliwia badanie interakcji ludzkiego patogenu Campylobacter jejuni z komórkami nabłonka jelitowego w warunkach bardziej zbliżonych do in vivo, co skutkuje zwiększoną inwazją bakterii.

Streszczenie

Interakcje patogenów bakteryjnych z komórkami gospodarza zostały dokładnie zbadane przy użyciu metod hodowli komórkowych in vitro. Ponieważ jednak takie testy hodowli komórkowych są przeprowadzane w warunkach tlenowych, te modele in vitro mogą nie odzwierciedlać dokładnie środowiska in vivo, w którym zachodzą interakcje gospodarz-patogen. Opracowaliśmy model infekcji in vitro, który pozwala na kokulturację bakterii i komórek gospodarza w różnych warunkach środowiskowych i gazowych. Model pionowej komory dyfuzyjnej (VDC) naśladuje warunki w jelicie człowieka, w których bakterie będą znajdować się w warunkach bardzo niskiego poziomu tlenu, podczas gdy tkanki będą zaopatrywane w tlen z krwiobiegu. Umieszczenie monowarstw spolaryzowanych komórek nabłonka jelitowego (IEC) wyhodowanych we wkładkach Snapwell w VDC tworzy oddzielne przedziały wierzchołkowe i podstawno-boczne. Przedział podstawno-boczny jest wypełniony pożywką do hodowli komórkowych, uszczelniony i ukrwiony tlenem, podczas gdy komora wierzchołkowa jest wypełniona bulionem, utrzymywana w stanie otwartym i inkubowana w warunkach mikrotlenowych. Zarówno Caco-2, jak i T84 IEC mogą być utrzymywane w VDC w tych warunkach bez żadnego widocznego szkodliwego wpływu na przeżycie komórek lub integralność monowarstw. Eksperymenty kokulturacyjne przeprowadzone na różnych szczepach C. jejuni typu dzikiego i różnych liniach IEC w modelu VDC z warunkami mikrotlenowymi w kompartmencie wierzchołkowym w sposób powtarzalny skutkują wzrostem liczby bakterii oddziałujących (prawie 10-krotnie) i wewnątrzkomórkowych (prawie 100-krotnie) w porównaniu z warunkami hodowli tlenowej¹. Środowisko stworzone w modelu VDC bardziej naśladuje środowisko, z którym spotyka się C. jejuni w jelicie człowieka i podkreśla znaczenie wykonywania testów infekcji in vitro w warunkach, które bardziej naśladują rzeczywistość in vivo. Proponujemy, że wykorzystanie modelu VDC pozwoli na nowe interpretacje interakcji między patogenami bakteryjnymi a komórkami gospodarza.

Wprowadzenie

Interakcje patogenów bakteryjnych z komórkami gospodarza zostały dokładnie zbadane przy użyciu metod hodowli komórkowych in vitro. Za pomocą takich testów hodowli komórkowych szczegółowo zbadano adhezję bakterii do komórek gospodarza, identyfikację receptorów komórek gospodarza, szlaków sygnałowych komórek gospodarza i inwazję bakterii na komórki gospodarza, co zaowocowało wieloma ważnymi obserwacjami. Jednak takie testy hodowli komórkowych przeprowadza się w warunkach tlenowych, które mogą nie być reprezentatywne dla środowiska in vivo. Głównym ograniczeniem modeli in vitro stosowanych do badania infekcji żołądkowo-jelitowych jest to, że warunki hodowli, w tym wysoki poziom tlenu, generalnie sprzyjają przeżyciu komórek eukariotycznych. Jednak warunki w świetle jelita będą prawie beztlenowe. Patogeny jelitowe w środowisku o bardzo niskiej zawartości tlenu wyrażają geny wirulencji, których ekspresja zmienia się w warunkach tlenowych². W związku z tym dane uzyskane przy użyciu standardowych modeli hodowli komórkowych mogą niedokładnie wskazywać na interakcje bakterii z komórkami gospodarza.

Campylobacter jejuni jest głównym czynnikiem wywołującym bakteryjne ostre zapalenie żołądka i jelit na całym świecie, z objawami od łagodnej biegunki do ciężkiego zapalenia zapalnego jelit. Większość zakażeń C. jejuni prowadzi do niepowikłanego zapalenia żołądka i jelit, jednak C. jejuni jest również najczęściej identyfikowanym czynnikiem zakaźnym w neuropatiach obwodowych, w tym w zespole Guillaina-Barrégo (GBS). Szacuje się, że w Wielkiej Brytanii każdego roku odnotowuje się ponad 500 000 przypadków zapalenia jelit spowodowanego zakażeniem C. jejuni, a przewidywany koszt dla brytyjskiej gospodarki wynosi 580 milionów funtów. W krajach rozwijających się C. jejuni jest główną przyczyną śmiertelności wśród dzieci. Pomimo niewątpliwego znaczenia zakażenia Campylobacter i dziesięcioleci badań, w tym dokładnej analizy opartej na genomice, patogeneza C. jejuni jest nadal słabo poznana, w przeciwieństwie do innych patogenów jelitowych, takich jak Salmonella, Escherichia coli, Shigella i Vibrio cholerae. Brak wygodnego modelu małego zwierzęcia jest jednym z głównych powodów tego³. Ponadto szeroko stosowane modele zakażeń in vitro są bardziej nieodpowiednie do badania mikroaerofilnych C. jejuni niż do innych patogenów jelitowych, które są fakultatywnymi beztlenowcami. Podczas gdy C. jejuni jest uznawany za patogen inwazyjny, mechanizmy inwazji C. jejuni na komórki nabłonka jelitowego (IEC) są nadal niejasne^4,5. Wykazano, że inwazja C. jejuni jest zależna od mikrofilamentów, mikrotubul, kombinacji obu lub żadnego z^{nich 5}. Zamieszanie w tej dziedzinie wynika najprawdopodobniej ze stosowania niewłaściwych warunków do badania in vitro.

Do zbadania interakcji C. jejuni z komórkami gospodarza użyto wielu różnych testów hodowli komórkowych. Linie komórkowe Caco-2⁶, INT 407⁷ i T84⁸ zostały wykorzystane do badania zdolności adhezyjnych i inwazyjnych różnych szczepów C. jejuni. Jednak poziomy adhezji i inwazji bakterii C. jejuni z IEC są znacznie niższe niż w przypadku innych patogenów jelitowych⁹. Kokulturacja C. jejuni z IEC jest zwykle przeprowadzana w inkubatorze CO₂ w warunkach zbliżonych do poziomów tlenu atmosferycznego, wymaganych do przetrwania IEC. Ekspresja genu C. jejuni będzie bardzo różna w środowisku o niskiej zawartości tlenu w świetle jelita w porównaniu z atmosferycznymi warunkami tlenowymi.

Zastosowano system pionowej komory dyfuzyjnej (VDC), który pozwala na kokulturację bakterii i komórek gospodarza w różnych warunkach środowiskowych i gazowych^1,10,11. System ten naśladuje warunki w jelicie człowieka, w których bakterie będą znajdować się w warunkach bardzo niskiego poziomu tlenu, podczas gdy tkanki będą zaopatrywane w tlen z krwiobiegu. Spolaryzowane monowarstwy IEC wyhodowane w specjalnych filtrach 0,4 μm umieszczono w VDC, tworząc komorę wierzchołkową i podstawno-boczną, które indywidualnie wypełniono odpowiednio bulionem bakteryjnym i pożywką do hodowli komórkowych (ryc. 1). VDC umieszczono w inkubatorze ze zmienną atmosferą zawierającą 85% N₂, 5 % O₂ i 10 % CO₂ w temperaturze 37 °C, co stanowi optymalne warunki dla C. jejuni. Komora wierzchołkowa pozostała otwarta i wystawiona na działanie atmosfery mikrotlenowej w inkubatorze ze zmienną atmosferą, podczas gdy zamknięta komora podstawno-boczna była zaopatrywana w tlen poprzez ciągłe podawanie mieszaniny gazów 5% CO₂ / 95% O₂ z rurką wylotową zapobiegającą wzrostowi ciśnienia. Przeżycie komórek Caco-2 i integralność monowarstwy w tych warunkach potwierdzono poprzez monitorowanie transnabłonkowego oporu elektrycznego (TEER) w całej monowarstwie przez 24 godziny, aby wykazać przeżycie monowarstwy komórki Caco-2 i fizyczną separację przedziałów wierzchołkowych i podstawno-bocznych w warunkach niskiego poziomu tlenu w przedziale wierzchołkowym. TEER monowarstw w VDC utrzymywanych w inkubatorze ze zmienną atmosferą (warunki mikrotlenowe) oraz w standardowym inkubatorze CO₂ do hodowli komórkowych (warunki tlenowe) nie wykazało istotnych różnic, co wskazuje na integralność monowarstwy komórek w różnych warunkach atmosferycznych¹. W warunkach mikrotlenowych ścisłe połączenia pozostawały obecne i równomiernie rozmieszczone między granicami komórek z wzorem barwienia okludyny podobnym do komórek utrzymywanych w warunkach tlenowych¹.

Interakcje C. jejuni z komórkami Caco-2 i T84 w VDC były badane poprzez ocenę interakcji bakteryjnej (adhezja i inwazja) oraz inwazji. Użyto dwóch różnych szczepów C. jejuni typu dzikiego¹. C. jejuni 11168H jest hiperruchliwą pochodną oryginalnego szczepu sekwencyjnego NCTC11168. Szczep 11168H wykazuje znacznie wyższy poziom kolonizacji w modelu kolonizacji piskląt i dlatego jest uważany za odpowiedni szczep do wykorzystania w badaniach interakcji gospodarz-patogen. 81-176 jest ludzkim izolatem i jest jednym z najbardziej inwazyjnych, szeroko badanych szczepów laboratoryjnych. Szczepy C. jejuni dodawano do przedziału wierzchołkowego VDC w warunkach mikrotlenowych lub tlenowych. Zaobserwowaliśmy, że wyższe wskaźniki zarówno interakcji, jak i inwazji odnotowano dla C. jejuni w warunkach mikrotlenowych¹. Zwiększone interakcje z C. jejuni nie były spowodowane wzrostem liczby bakterii w warunkach mikrotlenowych¹. Dane te potwierdzają naszą hipotezę, że środowisko o niskim poziomie tlenu w przedziale wierzchołkowym VDC wzmacnia interakcje bakteria-gospodarz i wskazuje, że inwazyjne właściwości C. jejuni są zwiększone w tych warunkach. Był to pierwszy raport dotyczący wykorzystania modelu VDC do badania inwazyjnego patogenu bakteryjnego i podkreśla znaczenie przeprowadzania testów infekcji in vitro w warunkach, które bardziej naśladują sytuację in vivo. Model VDC może być wykorzystany do badania interakcji gospodarz-patogen dla wielu różnych gatunków bakterii.

Protokół

1. Wzrost monowarstw IEC na specjalnych filtrach 0,4 μm

1. Hodowla komórek Caco-2 w zmodyfikowanej pożywce egzogennej (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej 10% (v/v) płodowej surowicy cielęcej, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny i 1% (v/v) aminokwasów endogennych w standardowym inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C w 5% CO₂ i 95% powietrzu. Wysiewaj 4 x 10⁵ Caco-2 IEC na filtr 0,4 μm i rozwijaj do polaryzacji przez 21 dni, zmieniając pożywkę co 2-3 dni.
2. Zmierz TEER, aby potwierdzić stan polaryzacji monowarstwy za pomocą miernika rezystancji woltowoom. W naszych badaniach TEER 21-dniowych komórek Caco-2 hodowanych w tych filtrach 0,4 μm wynosi 700–800^Ωcm2.

2. Przygotowanie C. jejuni i pożywki bakteryjnej do testu hodowlanego

1. 24 godziny przed pożądanym punktem rozpoczęcia testu kokulturacyjnego VDC przygotować świeżą płytkę agarową z krwią C. jejuni i inkubować w temperaturze 37 °C w warunkach mikrotlenowych (85% N₂, 5 % O₂ i 10 % CO₂) w inkubatorze ze zmienną atmosferą.
2. W tym samym czasie należy wstępnie inkubować 30 ml bulionu z brucelozy w temperaturze 37 °C w warunkach mikrotlenowych w inkubatorze ze zmienną atmosferą.

3. Przygotowanie i sterylizacja półkomór VDC przed testem

1. Całkowicie zanurz półkomory VDC, a także O-ringi i zatyczki w roztworze sterylizacyjnym.
2. Za pomocą sterylnej strzykawki o pojemności 20 ml przepłukać roztwór sterylizacyjny przez wloty gazu w obu półkomorach. Niezastosowanie się do tego może spowodować zanieczyszczenie próbek podczas hodowli.
3. Pozostaw wszystkie składniki zanurzone w roztworze sterylizacyjnym na >1 godzinę.
4. Przepłukać wszystkie elementy świeżą, sterylną wodą, używając innej sterylnej strzykawki o pojemności 20 ml do przepłukania wlotów gazu.

4. Przygotowanie inokulum bakteryjnego

1. Zbierz pół talerza wzrostu C. jejuni z płytki z agarem z krwią przygotowanej poprzedniego dnia do 1 ml wstępnie inkubowanego bulionu z brucelozy. Powinno to dać ~10¹⁰ jtk/ml.
2. Zmierz gęstość optyczną zawiesiny bakteryjnej przy 600 nm w celu półilościowego określenia jednostek tworzących kolonie bakteryjne (CFU).
3. Doprowadzić zawiesinę bakteryjną do pożądanego poziomu inokulum w 4 ml wstępnie inkubowanego bulionu z brucelozy.
4. Przeprowadzić seryjne rozcieńczenie z tej końcowej zawiesiny bakteryjnej, a następnie posiać odpowiednie roztwory na płytkach z agarem krwi w trzech egzemplarzach, a następnie inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze ze zmienną atmosferą przez 48 godzin w celu ilościowego określenia liczby bakteryjnych CFU obecnych w inokulum.

5. Konfiguracja VDC

1. Umieść dolną połowę komory VDC płasko na stole. Zamontuj O-ring na dolnej połowie komory.
2. Odłączyć jeden filtr z IEC od nośnika i przemyć trzykrotnie 400 μl sterylnego PBS. Umieść filtr w dolnej połowie komory, upewniając się, że O-ring pozostaje na swoim miejscu.
3. Delikatnie opuść górną połowę komory na miejsce. Po zmontowaniu dwóch półkomór zacisnąć je razem za pomocą pierścieni zaciskowych. Umieść VDC poziomo na blacie stołu, tak aby dwa otwory były skierowane do góry.
4. Dodać 4 ml inokulum bakteryjnego do półkomory wierzchołkowej.
5. Dodać 4 ml pożywki do hodowli komórkowych do półkomory podstawno-bocznej.
6. Umieść końcówki w otworach w obu połówkach komór.

6. Podłączanie VDC do kolektora gazowego w inkubatorze ze zmienną atmosferą

1. Umieścić VDC w inkubatorze ze zmienną atmosferą w pobliżu kolektora gazowego.
2. Otwórz regulator dopływu gazu podłączony do kolektora gazowego. Podłącz rurkę z kolektora do wlotu gazu na podstawno-bocznej półkomorze VDC. Przymocuj rurę odprowadzającą gaz wyprowadzoną z inkubatora ze zmienną atmosferą do jednego z wylotów w końcówce na półkomorze podstawno-bocznej.
3. Zamknij drugi wylot w końcówce na półkomorze podstawno-bocznej. Otwórz przepływ gazu na kolektorze gazowym, uważając, aby otwierać go bardzo powoli, aby uniknąć nadmiernego ciśnienia gazu, ponieważ może to doprowadzić do wydalenia ośrodka podstawno-bocznego.
4. Celem jest przepływ gazu o wartości 1 pęcherzyka co 2-5 sekund. Okresowo sprawdzaj przepływ gazu w trakcie eksperymentu i w razie potrzeby dostosuj.

7. Demontaż VDC po Coculture

1. Po odpowiednim okresie kokultury należy zamknąć regulator zasilania gazem podłączony do kolektora gazowego. Zamknąć dopływ gazu do VDC na kolektorze. Odłączyć wlot gazu, wylot gazu i korek od VDC.
2. Usunąć VDC z inkubatora o zmiennej atmosferze. Usunąć supernatanty wierzchołkowe i podstawno-boczne i przechowywać w temperaturze -80 °C do późniejszej analizy.
3. Zdejmij pierścień clamps i delikatnie rozłóż VDC. Wyjmij filtr z półkomory i przenieś do sterylnego 6-dołkowego naczynia do hodowli komórkowych. Umyj IEC trzykrotnie 400 μl sterylnego PBS.
4. W celu wyliczenia całkowitej liczby bakterii oddziałujących na siebie, dodaj 400 μl sterylnego PBS zawierającego 0,1% (v/v) Triton X-100 do IEC i inkubuj przez 20 minut w temperaturze pokojowej w celu lizy IEC. Przeprowadzić seryjne rozcieńczanie z tego lizatu komórkowego, a następnie posiawać odpowiednie roztwory na płytkach z agarem krwi w trzech egzemplarzach, a następnie inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze ze zmienną atmosferą przez 48 godzin w celu ilościowego określenia liczby oddziałujących na siebie bakteryjnych CFU.
5. W celu wyliczenia całkowitej liczby atakujących bakterii dodać 400 μl pożywki do hodowli komórkowej DMEM zawierającej 150 μg/ml gentamycyny do IEC i inkubować przez 2 godziny w standardowym inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C w 5% CO₂ i 95% powietrzu w celu zabicia bakterii zewnątrzkomórkowych, a następnie postępować jak w kroku 7.4 powyżej.

8. Czyszczenie VDC po Coculture

Umyj VDC sterylną wodą i przechowuj do następnej rundy eksperymentów.

Wyniki

Eksperymenty z kokulturą szczepu dzikiego C. jejuni oraz komórek IEC w modelu VDC, przy zastosowaniu warunków mikroaerobowych w komorze apikalnej, wykazały zależny od czasu wzrost liczby bakterii oddziałujących (prawie 10-krotny) oraz wewnątrzkomórkowych (prawie 100-krotny) w porównaniu do warunków hodowli aerobowej¹. Obserwacja ta została potwierdzona z wykorzystaniem dwóch różnych szczepów dzikich C. jejuni (11168H i 81-176) oraz dwóch różnych linii IEC (Caco-2 i T84), co podkreśla zasadnoś...

Dyskusja

Wykorzystanie metod hodowli komórkowych in vitro do badania interakcji patogenów bakteryjnych z komórkami gospodarza jest techniką szeroko stosowaną w wielu laboratoriach badawczych. Ponieważ jednak takie testy hodowli komórkowych są przeprowadzane w warunkach tlenowych, te modele in vitro mogą nie odzwierciedlać dokładnie środowiska in vivo , w którym zachodzą interakcje gospodarz-patogen. Szeroko stosowane modele zakażeń in vitro są szczególnie nieodpowiednie do badania mikroaerofiln...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Specjalistyczny pionowy system dyfuzyjny do stosowania z wkładkami Snapwell	Aparat Harvard	66-0001	Kolektor i sześć komór Snapwella Czapki
Aparat	Harvard	66-0020
O-ringi	Aparat Harvard	66-0007
Zaciski	Aparat Harvard	66-0012
Filtry Snapwell (wielkość porów 0,4 μ m)	Corning Costar	3407
Millicell ERS-2 Volt-Ohm		Spektrofotometr Millipore
WPA Lightwave II	Biochrom	80-3003-72

Miernik rezystancji MERS00002