Embrionalny naskórek zarodków Drosophila w bardzo późnym stadium dostarcza systemu in vivo do szybkiej analizy reakcji na nakłucie rany i może być łączony z manipulacjami genetycznymi lub chemicznymi zabiegami mikroiniekcji w celu przyspieszenia badań nad gojeniem się ran w celu translacji na modele ssaków.
Artykuł metodologiczny
Test mikroiniekcji rany i lokalizacja in vivo reporterów odpowiedzi naskórka na ranę w zarodkach Drosophila.
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zarodek Drosophila rozwija solidną warstwę naskórka, która służy zarówno do ochrony wewnętrznych komórek przed surowym środowiskiem zewnętrznym, jak i do utrzymania homeostazy komórkowej. Uraz kłuty szklanymi igłami stanowi bezpośrednią metodę wywołania szybkiej reakcji naskórka na ranę, która aktywuje reportery transkrypcyjne rany, które można uwidocznić za pomocą zlokalizowanego sygnału reporterowego w żywych zarodkach lub larwach. Nakłucie lub uraz laserowy dostarcza również sygnałów, które sprzyjają rekrutacji hemocytów do miejsca rany. Co zaskakujące, poważne (na wskroś) uszkodzenia kłute u zarodków w późnym stadium rzadko zakłócają normalny rozwój embrionalny, ponieważ ponad 90% takich zranionych zarodków przeżywa do dorosłości, gdy zarodki są wstrzykiwane do pożywki olejowej, która minimalizuje natychmiastowy wyciek hemolimfy z miejsc nakłucia. Zabieg leczenia ran wymaga mikromanipulacji zarodkami Drosophila, w tym ręcznego wyrównania zarodków na płytkach agarowych i przeniesienia wyrównanych zarodków na szkiełka mikroskopowe. Test odpowiedzi na rany naskórkowe Drosophila zapewnia szybki system do testowania wymagań genetycznych różnych funkcji biologicznych, które sprzyjają gojeniu się ran, a także sposób na badanie przesiewowe potencjalnych związków chemicznych, które sprzyjają gojeniu się ran. Krótki cykl życiowy i łatwa procedura hodowli sprawiają, że Drosophila jest potężnym organizmem modelowym. Gojenie się czystych ran Drosophila wydaje się koordynować reakcję regeneracyjną naskórka z wrodzoną odpowiedzią immunologiczną w sposób, który jest nadal badany, co stanowi doskonały system do znajdowania konserwatywnych mechanizmów regulacyjnych wspólnych dla Drosophila i zranień naskórka ssaków.
Wprowadzenie
Manipulowanie zarodkami Drosophila za pomocą techniki mikroiniekcji jest dobrze znanym testem1. Znaczenie metody reporterowej odpowiedzi na ranę naskórkową polega na połączeniu protokołu nakłucia/mikroiniekcji z reporterami fluorescencyjnymi i wizualizacji odpowiedzi in vivo na uszkodzenie naskórka w zarodkach Drosophila. Celem tej metody jest umożliwienie szerszemu gronu naukowców wykorzystania Drosophila jako narzędzia do badania procesów regulujących odpowiedź transkrypcyjną na uszkodzenie nakłucia naskórka. Jednowarstwowy naskórek u Drosophila zapewnia prosty system do badania reakcji rany naskórkowej po urazie kłutym2. Zarodek Drosophila jest solidnym systemem modelowym do genetycznej analizy etapów gojenia się ran, w tym reakcji rany, stanu zapalnego i reepitelializacji3. Dzieje się tak po części dlatego, że wiele lub większość mutantów zygotycznych przeżywa do końca embriogenezy i rozwija bariery naskórkowe, nawet jeśli wzorce rozwojowe idą bardzo źle. Poprzednia charakterystyka dobrze zachowanego czynnika transkrypcyjnego Grainy head (Grh) wykazała, że geny docelowe Grh, dekarboksylaza Dopa (Ddc) i hydroksylaza tyrozynowa (ple) są aktywowane transkrypcyjnie wokół miejsc uszkodzenia4. Drosophila jako organizm modelowy do reagowania na rany stanowi uzupełniający kierunek badań w celu przyspieszenia badań nad gojeniem się ran u ssaków5. Późniejsze badania zidentyfikowały dodatkowe geny indukowane ranami Drosophila i opracowały "zestaw narzędzi" wielu fluorescencyjnych reporterów ran do monitorowania reakcji naskórka in vivo na czyste zranienia6. Ostatnie doniesienia na temat regulacji gojenia się ran Drosophila skupiły się na fenotypie zamykania ran, umożliwiając odkrycie wielu szlaków regulujących migrację komórek7,8. Dzięki analizie fluorescencyjnych reporterów ran, nasze badania zidentyfikowały nowy zestaw genów wymaganych do zlokalizowanej ekspresjigenów indukowanych przez naskórek 9. Jedną z zalet metody reporterowej reakcji na ranę jest to, że wyniki dostarczają więcej informacji na temat mechanizmu przekazywania sygnałów z miejsca urazu do sąsiednich komórek. Jednak jedną z wad metody zgłaszania odpowiedzi na rany jest to, że wyniki nie łączą się bezpośrednio z fenotypami w gojeniu się lub gojeniu ran. Szersze zastosowanie protokołu nakłuwania ran czystych w genetycznych i chemicznych badaniach przesiewowych pozwoli na zidentyfikowanie nowych regulatorów odpowiedzi transkrypcyjnej na zranienie naskórka i dalsze przełożenie odkryć dotyczących gojenia się ran na modele leczenia urazów u ssaków.
Protokół
Protokół leczenia ran zarodkowych Drosophila można podsumować w pięciu krokach: (1) Pobranie zarodka, (2) Przygotowanie zarodka, (3) Zranienie zarodka, (4) Mikroiniekcja zarodka, oraz (5) Utrwalenie zarodka.
1. Pobieranie zarodków
- Zbierz dorosłe muchy, 2-3 dni po zamknięciu dodaj 50 samic i 25 samców do klatki pobierania zarodków.
- Umieszczaj świeży sok jabłkowy agar i talerz drożdży każdego ranka przez 3 dni.
Uwagi: W celu optymalnego pobrania zarodków, należy przechodzić cykl u muszek według 12-godzinnego harmonogramu dobowego w inkubatorze w temperaturze 25 °C (05:00 świeci "ON" i 17:00 świeci "OFF"); Samice much reagują na zmiany w cyklu świetlnym i składają większe ilości jaj podczas przełączania ze świateł "WŁĄCZONYCH" na "WYŁĄCZONE"10,11. - Po południu dnia 3 umieść świeży sok jabłkowy i talerz z agarem drożdżowym na klatce i zbieraj zarodki przez 2 godziny. Umieść nową płytkę drożdżową na klatce i zachowaj talerz zbiorczy na 2 godziny.
- Przechowywać płytkę zbiorczą przez dodatkowe 14 godzin w temperaturze 25 °C, aby zarodki uległy starzeniu.
Uwagi: Gojenie się ran można ocenić na dowolnym etapie rozwoju Drosophila; Reportery transkrypcyjne indukowane raną opisane w tej pracy mają optymalną aktywność między etapami 15-16 12. Pod koniec 17 stadium zarodek jest zbyt stary, aby łatwo przebić dojrzewający naskórek i skutecznie aktywować reportery rany lub wykryć transkrypcję wywołaną raną. Aby umożliwić czas pobierania i zranienia w godzinach szczytu laboratoryjnego, postępujemy zgodnie z harmonogramem pobierania zarodków przez 2 godziny (16:00-18:00), wymieniamy płytkę pobraniową na nową o godzinie 18:00, starzejemy płytkę pobraniową w temperaturze 25 °C przez 14 godzin (przez noc) i zwijamy zarodki o godzinie 08:00 (następnego dnia).
2. Przygotowanie zarodków
Uwagi: Ten protokół obejmuje użycie wielu narzędzi i przedmiotów, które są ostre lub wykonane ze szkła. Ze wszystkimi ostrymi narzędziami i szklanymi przedmiotami należy obchodzić się ostrożnie, aby uniknąć obrażeń ciała.
- Delikatnie usuń zarodki z płytek zbiorczych za pomocą pędzla, dodając 2-3 ml wody do płytki i mieszając. Przenieś wodę i zarodki z płytki na nylonową siatkę i probówkę zbiorczą.
- Dodać 4-5 ml wybielacza do nakrętki plastikowej płytki Petriego i zanurzyć pokryty siatką koniec probówki zawierającej zarodki w wybielaczu przez 2 minuty, co spowoduje usunięcie zewnętrznej skorupki zarodka. Ręcznie obróć probówkę pobraną kilka razy, aby zapobiec zbrylaniu się zarodków w wybielaczu. Opłucz zarodki wodą 10x i osusz pokrytą siatką probówkę zawierającą zdekorionowane zarodki na ręczniku papierowym.
- Użyj igły preparującej, aby przenieść ∼50 zarodków z siatki nylonowej na płytkę agarową. Na talerz agarowy dodajemy zielony barwnik spożywczy, aby dodać kontrastu i pomóc w wyrównaniu zarodków. Pod mikroskopem preparacyjnym wykonaj dwa równoległe rzędy ∼25 zarodków, ustawiając zarodki na szkiełku tak, aby były pod kątem prostym do igły do nakłucia w aparacie do mikroiniekcji. Pozostaw trochę miejsca (około 1 długości zarodka) między zarodkami w celu wymiany gazowej. Dwa równoległe rzędy powinny być oddalone od siebie o około 5 mm.
- Umieść szkiełko z podwójną taśmą klejącą na wyrównanych zarodkach i ostrożnie dociśnij szkiełko, aby przenieść zarodki z zielonej płytki na szkiełko. Następnie wysuszyć zarodki na powietrzu przez ∼25 minut, aby zmniejszyć ciśnienie wewnętrzne na zarodek i zapobiec pęknięciu podczas zranienia.
- Umieść 2-3 krople mieszanki oleju halowęglowego na zarodkach, aby zapobiec dalszemu odwodnieniu.
3. Zranienie zarodka
- Umieścić szkiełko zarodkowe w mikroskopie iniekcyjnym. Znajdź zarodki w polu widzenia i ćwicz poruszanie stolikiem mikroskopu odwróconego.
Uwagi: Przed rozpoczęciem pracy z igłą należy skupić się na środkowej płaszczyźnie zarodka wzdłuż osi grzbietowo-brzusznej. Aby umożliwić skuteczne zranienie wyrównanych zarodków, należy rozpocząć nawijanie rzędu bliżej aparatu igłowego. Przesuń stolik, aby górna część rzędu wyrównanych zarodków znalazła się w polu widzenia. - Ostrożnie umieścić i zabezpieczyć wyciągniętą igłę w uchwycie igły. Użyj mikromanipulatora, aby przesunąć igłę w dół w kierunku szkiełka. Wyrównaj igłę z zarodkiem, w tej samej płaszczyźnie ogniskowej. Gdy igła znajdzie się w ostrości na zarodku, nie należy przesuwać igły za pomocą mikromanipulatora.
- Przesuń stolik, aby przebić zarodek na wskroś, a następnie przejdź do następnego zarodka w rzędzie. Po zakończeniu nawijania pierwszego rzędu użyj mikromanipulatora, aby przesunąć igłę całkowicie w górę i odsunąć ją od stolika przed przesunięciem szkiełka; Ręcznie obróć suwak o 180° i nawiń drugi rząd.
- Przechowuj zarodki w oleju halowęglowym w temperaturze pokojowej i kontynuuj utrwalanie zarodków, jeśli wykonujesz hybrydyzację in situ lub barwienie przeciwciałami (patrz krok procedury 5). Alternatywnie, przechowuj zarodki przez 4-6 godzin w oleju halowęglowym i kontynuuj transkrypcyjną fluorescencyjną wizualizację reporterową rany (Reprezentatywne wyniki).
Uwagi: W celu wizualizacji reportera fluorescencyjnego znieczulamy zarodki za pomocą 50% 1-fenoksy-2-propanolu13. Zarodki są usuwane z oleju halowęglowego i umieszczane na nowym szkiełku. Wokół zarodków umieszczamy szklane koraliki, dodajemy kilka kropli środka znieczulającego i nakładamy na zarodki szkiełko nakrywkowe.
4. Mikroiniekcja zarodka
Uwagi: Aparatura do mikroiniekcji, której używamy w protokole, nie jest zautomatyzowana, aby dostarczyć określoną objętość podczas testu. Do roztworu dodajemy barwnik, aby uwidocznić mikroiniekcję i staramy się znormalizować dostarczoną objętość. Jeśli do zarodka zostanie wstrzyknięta zbyt duża ilość roztworu, błona witelinowa pęknie.
- Załadować igłę od tyłu 1 μl roztworu chemicznego plus barwnik (np. 0,6 M H2O2 ). Pozwolić, aby działanie kapilarne wciągnęło roztwór chemiczny do końcówki igły.
- Aby złamać igłę, umieść szkiełko nakrywkowe pod kątem na szkiełku i pokryj krawędź mieszanką oleju halowęglowego. Ustawić ostrość zamontowanej igły na krawędzi kątowego szkiełka nakrywkowego i delikatnie przesuwać krawędź szkiełka nakrywkowego po końcówce igły, aż do złamania. Uciskać aparat do mikroiniekcji i sprawdzić, czy roztwór chemiczny wraz z barwnikiem wypływa z igły.
- Umieść szkiełko zawierające wyrównane zarodki na stoliku mikroskopowym. Przystąp do skupienia zarodka i igły w tej samej płaszczyźnie. Jednocześnie nakłuć i wstrzyknąć mikroroztwór chemiczny i barwnik do każdego zarodka.
Uwagi: Zatkane igły występują często; Złamać nową igłę, aby uniknąć niepełnego mikrowstrzyknięcia. końcówka igły nie zwija się tak czysto jak kątowa końcówka igły. Ustawienie szkiełka nakrywkowego pod kątem innym niż 90° podczas pękania jest optymalne dla uzyskania kątowej końcówki igły.
5. Utrwalanie formaldehydu
Uwagi: Chemikalia użyte do tej fiksacji Drosophila są szkodliwe. Podczas obchodzenia się z chemikaliami należy używać środków ochrony osobistej (np. rękawic, fartucha laboratoryjnego i okularów ochronnych). Postępuj zgodnie z indywidualnymi wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi utylizacji chemikaliów podlegających regulacjom.
- Po zranieniu odczekaj 15, 30, 60 lub więcej minut, aż nastąpi transkrypcyjna aktywacja genów wywołanych raną. Aby usunąć zarodki ze szkiełek do wstrzykiwań, ostrożnie odcedź mieszankę oleju halowęglowego z szkiełek, oprzyj szkiełko o stojak i osusz koniec chusteczką Kimwipe.
- Za pomocą szklanej pipety przepłukać heptan na szkiełku i umyć płyn do płukania na szklanej szalce Petriego. Heptan rozpuści taśmę i uwolni zarodki. Kontynuuj płukanie, aż wszystkie zarodki zostaną usunięte ze szkiełka. Przejdź do następnego szkiełka, aż wszystkie zarodki zostaną usunięte ze szkiełek.
- Przenieść roztwór heptanu i zarodków ze szklanego naczynia do fiolki scyntylacyjnej o pojemności 20 ml. Wstrząsać fiolką przez 2-3 minuty, usunąć heptan i dodać 5 ml świeżego heptanu.
- Dodać 5 ml świeżego roztworu utrwalającego (przepis znajduje się na liście odczynników). Zakręć fiolkę i przymocuj do wytrząsarki platformy orbitalnej. Potrząsać fiolką zawierającą zarodki przez 25 minut z prędkością 220-230 obr./min.
- Po wstrząśnięciu pozwól, aby bąbelki na granicy faz pękły. Całkowicie usuń dolną, wodną fazę za pomocą pipety, unikając wyciągania zarodków. Dolna warstwa składa się z roztworu utrwalającego i powinna być odpowiednio zutylizowana.
- Dodać 5 ml metanolu, zakręcić fiolkę i energicznie wstrząsać ręką przez 20-30 sekund, zamieszać i położyć na ławce. Zranione zarodki pozostaną na skrzyżowaniu i nie opadną na dno.
Uwagi: Po utrwaleniu błona witelinowa nieuszkodzonego zarodka zwykle pęka podczas etapu odwodnienia metanolem. Jednak błona witeliny w zranionym zarodku jest już uszkodzona, a etap odwodnienia nie usunie błony witelinowej. Do wypełnienia protokołu utrwalenia wymagana jest ręczna dewicynacja. - Ostrożnie usuń górną warstwę heptanu, a następnie dodaj 5 ml świeżego metanolu. Potrząśnij fiolką, a zarodki powinny zatonąć.
- Usunąć metanol i roztwór zarodków za pomocą szklanej pipety transferowej i zebrać w probówce z nylonowej siatki w szklanym naczyniu.
- Usuń metanol i spłucz zarodki 1x roztworem PBS.
- Przenieś zarodki z nylonowej siatki na talerz z sokiem jabłkowym. Rozłóż zarodki wzdłuż powierzchni płytki.
- Przenieś zarodki na szkiełko z podwójną taśmą samoprzylepną. Przykryj zarodki 1x PBS.
Uwagi: Zarodki mają tendencję do zlepiania się z powodu błony witelinowej. Użycie miejsca z sokiem jabłkowym pozwala na szybkie oddzielenie zbitych zarodków. Zarodki muszą zostać usunięte z płytki i przeniesione na szkiełko z podwójną taśmą samoprzylepną, ponieważ zarodki zapadają się w płytce agarowej po przyłożeniu siły w celu usunięcia zarodka z błony witeliny. - Ostrożnie popchnij zarodki igłą do preparowania, aby "przebić" błonę witelinową. Zarodek powinien zatonąć w PBS.
- Użyj szklanej pipety, aby przenieść 1x PBS plus zarodki do probówki o pojemności 1,5 ml. Opłucz zarodki 1x PBS i przechowuj w temperaturze 4 °C. Przystąp do odwodnienia zarodków za pomocą serii Ethanol:PBS i kontynuuj hybrydyzację in situ lub protokół immunolokalizacji14.
Wyniki
Aby uzyskać wyniki przedstawione w tej metodzie, otwarta ramka odczytu białka zielonej fluorescencji (GFP) zostaje połączona z sekwencją promotora/enhancera indukowanego zranieniem z genu Dopa Decarboxylase (Ddc), natomiast DsRed zostaje połączona z sekwencją enhancera zranienia z genu tyrosine hydroxylase (ple)4,6. W żywym embrionie Drosophila dojrzewanie fluorescencyjnego białka reporterowego zranienia jest optymalne 4-6 h po zranieniu, co pozwala na akumulację wystarczającej ilości białka do wizualizacji, a także daje czas białku fluorescencyjnemu na utlenienie do stanu fluorescencyjnego15. Do obserwacji lokalizacji reportera wystarczający jest złożony mikroskop fluorescencyjny. Aby uzyskać większe powiększenie lokalizacji reportera, optymalne jest zastosowanie mikroskopu konfokalnego w celu wygenerowania projekcji maksymalnej z wielu przekrojów optycznych (Rycina 1). Konfokalne obrazowanie in vivo embrionów Drosophila jest utrudnione przez szybkie falowania embrionu. Pełny widok embrionu można uzyskać za pomocą obiektywu 20X, a zbliżenie miejsca zranienia za pomocą obiektywu 40X. Widok z góry lokalizacji epidermalnego reportera zranienia można obrazować za pomocą 10 następujących po sobie przekrojów optycznych o grubości 1 µm. Widok boczny lokalizacji epidermalnego reportera zranienia można obrazować za pomocą 40 następujących po sobie przekrojów optycznych o grubości 1 µm.
Stosując standardowe metody krzyżowania genetycznego, możliwe jest połączenie reporterów rany z mutacjami genetycznymi. Przykładem przedstawionym w niniejszej pracy jest Flotillin-2 (Flo-2), ponieważ mutanty Flo-2 z utratą funkcji (allela null wygenerowana poprzez insercję elementu P) oraz z nadmiarem funkcji (nadekspresja wygenerowana przez powszechną ekspresję we wszystkich komórkach) wykazują, że produkt genu Flo-2 jest niezbędny i wystarczający do zahamowania lokalizacji reporterów rany Ddc-GFP9 (Ryciny 2A i 2B). Wykorzystując protokół mikroiniekcji, można sprawdzić, czy wprowadzenie roztworów chemicznych nadaktywuje lub hamuje lokalizację reporterów rany. Zarodki poddane uszkodzeniu chemicznemu były jednocześnie raniwe i iniektywne roztworem w stosunku 1:4 barwnika błękitu toluidyny 1% i rozpuszczonych związków. Barwnik błękit toluidyny pozwolił na wizualne potwierdzenie wstrzyknięcia rozpuszczonych związków do jamy ciała. Zarodki kontrolne były raniwe za pomocą złamanej igły zawierającej stosunek 1:4 barwnika błękitu toluidyny 1% i rozpuszczalnika bez związku chemicznego. Dwoma przykładami przedstawionymi w niniejszej pracy są nadtlenek wodoru (H2O2) i metylo-β-cyklodekstryna (MβCD), ponieważ oba roztwory chemiczne są wystarczające do globalnej aktywacji lokalizacji reporterów rany Ddc-GFP9 (Ryciny 2C i 2D). Nadtlenek wodoru (H2O2) rozcieńczono w H2O do stężenia 0.6 M. Metylo-β-cyklodekstrynę (MβCD) rozpuszczono w 1 mM NaOH do stężenia 3 mM. Korzystając z protokołu fiksacji zarodków, można wykryć aktywację transkrypcji genów odpowiedzi na ranę w zlokalizowanej domenie, otaczającej miejsce rany. Przykładem przedstawionym w niniejszej pracy jest hybrydyzacja in situ sond RNA w celu wykrycia transkryptów Ddc i ple4,6,9 (Ryciny 3A i 3B).
Rycina 1. Lokalizacja reporterów rany Ddc-GFP i ple-DsRed. Obrazy w świetle przechodzącym i fluorescencyjne w ranionych zarodkach typu dzikiego. (A) Widok z góry reportera rany Ddc-GFP. (B) Widok z góry reportera rany ple-DsRed. Wszystkie obrazy zostały zarejestrowane za pomocą konfokalnego mikroskopu Leica SP2 z obiektywem 20X. Strzałki wskazują miejsce rany. Linie przerywane na panelach danych wyznaczają obrysy zarodków. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.
Rycina 2. Lokalizacja reportera rany Ddc-GFP w mutantach genetycznych i embrionach po mikroiniekcjach chemicznych. Obrazy w świetle widzialnym i fluorescencyjne obrazowanie zranionych embrionów mutantów Flotillin-2 (Flo-2). (A) Mutanty Flo-2 {KG00210} z utratą funkcji, rozszerzenie aktywności reportera we wszystkich komórkach epidermy. (B) Mutanty Flo-2 (armadillo-GAL4, UAS-Flo2) z nadmiarową funkcją, zahamowanie aktywności reportera we wszystkich komórkach epidermy. (C) Mikroiniekcja roztworu nadtlenku wodoru (H2O2), rozszerzenie aktywności reportera we wszystkich komórkach epidermy. (D) Mikroiniekcja roztworu metylo-β-cyklodekstryny (MβCD), rozszerzenie aktywności reportera we wszystkich komórkach epidermy. Wszystkie obrazy zostały zarejestrowane przy użyciu konfokalnego mikroskopu Leica SP2 z obiektywem 20X. Strzałki wskazują miejsce rany. Linie przerywane na panelach z danymi wyznaczają obrysy embrionów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.
Rysunek 3. Detekcja transkryptów RNA genów odpowiedzi na zranienie. Obrazy fluorescencyjne hybrydyzacji in situ i detekcji RNA w zranionych embrionach wild type. Transkrypty RNA Ddc (A) oraz ple (B) gromadzą się wokół miejsca zranienia. Wszystkie obrazy zostały wykonane przy użyciu konfokalnego mikroskopu Leica SP2 z obiektywem 20X. Strzałki wskazują miejsce zranienia. Linie przerywane na panelach danych wyznaczają obrysy embrionów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.
Tabela 1. Podsumowanie reporterów odpowiedzi na ranienie naskórka. Wstawki czterech reporterów odpowiedzi na ranienie (Ddc, ple, msn, kkv) są dostępne zarówno na drugim, jak i trzecim chromosomie. Wszystkie reportery odpowiedzi na ranienie aktywują gen fluorescencyjny (GFP lub DsRed) w ograniczonej liczbie komórek naskórka otaczających miejsce urazu punkcyjnego w tle wild type (np. fenotyp „lokalny”). Reportery odpowiedzi na ranienie Ddc i msn wymagają Grh do aktywacji genu fluorescencyjnego po urazie punkcyjnym (np. fenotyp „brak”). Wszystkie reportery ranienia wymagają Flo-2 do lokalizacji genu fluorescencyjnego po urazie punkcyjnym (np. fenotyp „globalny”). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.
Dyskusja
Natychmiastowa transkrypcyjna reakcja regulacyjna na sygnały zewnętrzne pozwala komórkom koordynować zlokalizowaną odpowiedź na bodźce zewnątrzkomórkowe, które mogą obejmować stres, uszkodzenia lub infekcje. Niewłaściwa kontrola zlokalizowanej odpowiedzi może mieć szkodliwy wpływ na sąsiednie komórki, a także marnotrawstwo zasobów na naprawę urazu. Zarodek Drosophila stanowi doskonały system do przeprowadzania podstawowych eksperymentów gojenia się ran w niedrogim i łatwym w utrzymaniu organizmie modelowym. Potencjał współpracy między badaniami nad innymi organizmami modelowymi a Drosophila stanowi wyjątkową okazję do zbadania wielu kwestii biologicznych.
Dodatkową techniką zgłaszania ran jest genetyczne połączenie zmutowanych teł, co stanowi skuteczną metodę badania udziału nowych genów w aktywacji szlaku odpowiedzi naskórkowej rany. Mamy reportery transkrypcyjne indukowane raną naskórka dostępne zarówno na 2, jak i 3 chromosomie 5. W tym badaniu wykorzystujemy systemy nadekspresji UAS i GAL416. W przypadku badań z letalnymi zmutowanymi allelami określamy tło genetyczne za pomocą fluorescencyjnego chromosomu równoważącego, np. Kruppel-GFP 17. Przeanalizowaliśmy lokalizację reportera rany w kilku tłach genetycznych (Tabela 1).
Możliwą modyfikacją techniki jest połączenie mikroiniekcji i zranienia. Mikroiniekcja może być stosowana do wprowadzania roztworu chemicznego do zarodka. Przetestowano kilka związków chemicznych, które stwierdzono, że regulują aktywność osób zgłaszających rany naskórkowe9. Ta metoda jednoczesnego ranienia i mikroiniekcji może być przydatna do zwiększenia liczby komórek w zarodku Drosophila , które reagują na sygnał rany i może być bezpośrednio wykorzystana do monitorowania zmian ekspresji genów po zranieniu18. Przyszłym zastosowaniem techniki mikroiniekcji będzie testowanie nowych substancji chemicznych regulujących reakcję naskórka na rany.
Drosophila jako system modelowy do badań genetycznych oferuje szeroki zakres prostych protokołów, które skutecznie rozwiązują złożone pytania. Ostatnie doniesienia na temat wykonalności technik Drosophila podkreślają wykorzystanie migracji hemocytów19 i pasożytniczego zakażenia os20 jako sposobu na dalsze poszerzenie wpływu społeczności badawczej Drosophila . Oprócz badań nad gojeniem się ran, Drosophila dostarcza klasycznego modelu regeneracji z systemem dysków wyobrażeniowych21,22. Połączone postępy w badaniach nad regeneracją wyobrażonego dysku i zranieniami kłutymi/mikroiniekcjami stanowią doskonały system do odkrywania dobrze zachowanych składników naprawy tkanek.
Oświadczenia
Nie stwierdzono konfliktu interesów.
Podziękowania
Ten protokół został opracowany we współpracy z poprzednimi członkami McGinnis Lab, Kim A. Mace i Joseph C. Pearson. Dziękujemy za nieustanne wysiłki Bloomington Drosophila Stock Center za ich pracę na rzecz organizacji i dystrybucji cennych zasobów. Prace te były wspierane przez fundusze z National Institutes of Health (R01 GM077197 i K12 GM68524) oraz rodziny Herberta Sterna. MTJ jest obecnie wspierany przez grant o numerze 5G12RR003060-26 z National Center for Research Resources oraz grant o numerze 8G12MD7603-27 z National Institute on Minority Health and Health Disparities. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy National Institute On Minority Health And Health Disparities lub National Institutes of Health.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| drożdże | Sigma Aldrich | 51475 | |
| sok jabłkowy | Ogólny | ||
| agar | Fisher Scientific | 50-824-297 | |
| wybielacz | Ogólny | ||
| olej halowęglowy, 700 W | Sigma Aldrich | H8898 | |
| , 27 W | Sigma Aldrich | H8773 | |
| 1- fenoksy-2-propanol | Sigma Aldrich | 484423 | |
| nadtlenek wodoru | Fisher Scientific | H324 | |
| metylo-β-cyklodekstryna | Sigma Aldrich | C4555 | |
| błękit toluidynowy | Sigma Aldrich | 89640 | |
| formaldehyd, 16% | Polysciences, Inc | 18814-20 | toksyczny chemiczny |
| heptan | Fisher Scientific | H360-1 | toksyczny chemiczny |
| metanol | Fisher Scientific | A412-1 | toksyczny chemiczny |
| 10x PBS | Fisher Scientific | 50-899-90013 | |
| 0,5 M EGTA | Fisher Scientific | 50-255-956 | |
| Bez RNaz H2O | Fisher Scientific | BP2819-100 | |
| Drosophila inkubator | Genessee Scientific | 59-197 | |
| klatka na muchy | Genessee Scientific | 59-100 | |
| probówka do pobierania zarodków | Genessee Scientific | 46-101 | |
| plastikowa szalka Petriego | Fisher Scientific | 50-202-037 | |
| taśma dwustronna | Ogólny | ||
| pędzel Ogólny | |||
| igła preparcyjna | Fisher Scientific | 08-965A | |
| szkiełko nakrywkowe | Thermo Scientific | 3306 | |
| szkiełko mikroskopowe | ostrymi przedmiotami | Thermo Scientific | 4445 |
| preparacyjny | Carl Zeiss | Stemi-2000 | |
| FHC | 30-30-1 | ostry przedmiot | |
| ściągacz do igieł | Narishige | PC10 | |
| uchwyt na igłę do mikroiniekcji | Mikromanipulator Narishige | MINJ4 | |
| Mikroskop odwrócony | Narishige | ||
| szalka Petriego | Fisher Scientific | 08-747A | szkło na ostre przedmioty |
| Scientific | 22-063-172 | ||
| żarówka do przenoszenia | Fisher Scientific | 03-448-25 | |
| Kimwipe Fiolka scyntylacyjna | 06-666A | ||
| wytrząsarka orbitalna | Fisher Scientific | 14-259-260 | |
| 05-408-129 | |||
| skaning laserowy konfokalny | Leica | SP2 | |
| roztwór utrwalający | (5 ml) | ||
| 16% formaldehyd | 2,5 ml | toksyczna substancja chemiczna | |
| 10x PBS | 0,5 ml | ||
| 0,5 M EGTA | 0,5 ml | ||
| bez RNaz H2O | 1,5 ml | ||
| Mieszanka oleju halowęglowego | (10 ml) | ||
| olej halowęglowy, 700 W | 5 ml | ||
| olej halowęglowy, 27 W | 5 ml |
Bibliografia
- Germeraad, S. Genetic transformation in Drosophila by microinjection of DNA. Nature. 262 (5565), 229-231 (1976).
- Payre, F. Genetic control of epidermis differentiation in Drosophila. Int. J. Dev. Biol. 48 (2-3), 207-215 (2004).
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453 (7193), 314-321 (2008).
- Mace, K. A., Pearson, J. C., McGinnis, W. An epidermal barrier wound repair pathway in Drosophila is mediated by grainy head. Science. 308 (5720), 381-385 (2005).
- Ting, S. B., Caddy, J., et al. A homolog of Drosophila grainy head is essential for epidermal integrity in mice. Science. 308 (5720), 411-413 (2005).
- Pearson, J. C., Juarez, M. T., Kim, M., Drivenes, Ø, McGinnis, W. Multiple transcription factor codes activate epidermal wound-response genes in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (7), 2224-2229 (2009).
- Campos, I., Geiger, J. A., Santos, A. C., Carlos, V., Jacinto, A. Genetic screen in Drosophila melanogaster uncovers a novel set of genes required for embryonic epithelial repair. Genetics. 184 (1), 129-140 (2010).
- Lesch, C., Jo, J., Wu, Y., Fish, G. S., Galko, M. J. A targeted UAS-RNAi screen in Drosophila larvae identifies wound closure genes regulating distinct cellular processes. Genetics. 186 (3), 943-957 (2010).
- Juarez, M. T., Patterson, R. A., Sandoval-Guillen, E., McGinnis, W. Duox, Flotillin-2, and Src42A are required to activate or delimit the spread of the transcriptional response to epidermal wounds in Drosophila. PLoS Genet. 7 (12), e1002424(2011).
- Allemand, R. Influence of light condition modification on the circadian rhythm of vitellogenesis and ovulation in Drosophila melanogaster. J. Insect Physiol. 22 (8), 1075-1080 (1976).
- Allemand, R. Rhythm of vitellogenesis and ovulation in photoperiod ld 12:12 of Drosophila melanogaster. Insect Physiol. 22 (7), 1031-1035 (1976).
- Pierre, S. E., Thurmond, J. FlyBase 101 - the basics of navigating FlyBase. Nucleic Acids Res. 40 (D1), D706-D714 (2012).
- Wyeth, R. C., Croll, R. P., Willows, A. O. D., Spencer, A. N. 1-Phenoxy-2-propanol is a useful anaesthetic for gastropods used in neurophysiology. J. Neurosci. Methods. 176 (2), 121-128 (2009).
- Kosman, D., Mizutani, C. M., Lemons, D., Cox, W. G., McGinnis, W., Bier, E. Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos. Science. 305 (5685), 846(2004).
- Barolo, S., Castro, B., Posakony, J. W. New Drosophila transgenic reporters: insulated P-element vectors expressing fast-maturing RFP. BioTechniques. 36 (3), 436-440 (2004).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Casso, D., Ramírez-Weber, F., Kornberg, T. B. GFP-tagged balancer chromosomes for Drosophila melanogaster. Mech. Dev. 91 (1-2), 451-454 (2000).
- Patterson, R. A., Juarez, M. T., Hermann, A., Sasik, R., Hardiman, G., McGinnis, W. Serine proteolytic pathway activation reveals an expanded ensemble of wound response genes in Drosophila. PloS one. 8 (4), e61773(2013).
- Evans, I. R., Zanet, J., Wood, W., Stramer, B. M. Live imaging of Drosophila melanogaster embryonic hemocyte migrations. J. Vis. Exp. (36), e1696(2010).
- Small, C., Paddibhatla, I., Rajwani, R., Govind, S. An introduction to parasitic wasps of Drosophila and the antiparasite immune response. J. Vis. Exp. (63), e3347(2012).
- Repiso, A., Bergantiños, C., Corominas, M., Serras, F. Tissue repair and regeneration in Drosophila imaginal discs. Dev. Growth Differ. 53 (2), 177-185 (2011).
- Worley, M. I., Setiawan, L., Hariharan, I. K. Regeneration and transdetermination in Drosophila imaginal discs. Annu. Rev. Genet. 46, 289-310 (2012).
Przedruki i uprawnienia
