Artykuł metodologiczny

Mysi model przeszczepu szyjki macicy przy użyciu zmodyfikowanej techniki mankietowej

DOI:

10.3791/50753

⸱

12 października 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center of Operative Medicine, Department of Visceral, Transplant and Thoracic Surgery, Innsbruck Medical University, 2Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Johns Hopkins University School of Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Model przeszczepu mysiego serca szyjnego doskonale nadaje się do badań immunologicznych i niedokrwiennych uszkodzeń reperfuzyjnych. Zmodyfikowaliśmy procedurę przy użyciu techniki mankietu bez szwów i przeprowadziliśmy ponad 1000 udanych przeszczepów przy użyciu tego podejścia.

Niniejszym podajemy dodatkowe szczegóły tej techniki, aby uzupełnić film.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modele mysie są szczególnie interesujące w badaniach, ponieważ dostępna jest szeroka gama przeciwciał monoklonalnych oraz komercyjnie zdefiniowanych szczepów wsobnych i nokautujących do przeprowadzania mechanistycznych badań in vivo. Podczas gdy modele przeszczepu serca wykorzystujące technikę szwów zostały po raz pierwszy z powodzeniem opracowane na szczurach, translacja na równie rozpowszechniony mysi odpowiednik nigdy nie została osiągnięta ze względu na techniczną złożoność procedury mikrochirurgicznej. W przeciwieństwie do tego, techniki mankietów bez szwów, również opracowane początkowo u szczurów, zostały z powodzeniem przystosowane do stosowania u myszy1-3. Ta technika rewaskularyzacji obejmuje dwa główne etapy: I) naczynie biorcze nad mankietem z polietylenu; II) naciągnięcie naczynia dawczego na naczynie dawcze i przytrzymanie go w miejscu za pomocą opaski obwodowej. Zapewnia to ciągłość warstwy śródbłonka, krótki czas działania i bardzo wysoką drożność4.

Korzystając z tej techniki do zespolenia naczyniowego, przeprowadziliśmy ponad 1000 przeszczepów szyjki macicy z ogólnym wskaźnikiem sukcesu wynoszącym 95%. W przypadku dopływu tętniczego tętnicę szyjną wspólną i proksymalny łuk aorty zespolono w wyniku perfuzji wstecznej przeszczepionego serca. W celu drenażu żylnego tętnicę płucną przeszczepu zespolono z żyłą szyjną zewnętrzną biorcy5.

Niniejszym podajemy dodatkowe szczegóły tej techniki, aby uzupełnić film.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transplantacja serca stanowi terapię z wyboru dla pacjentów cierpiących na różne schyłkowe choroby serca. Postęp w technikach chirurgicznych, skuteczniejsza profilaktyka zakażeń i nowatorskie schematy immunosupresyjne doprowadziły do znacznej poprawy wyników przeszczepiania narządów6. Jednak długoterminowa przeżywalność przeszczepów nie poprawiła się rygorystycznie w ciągu ostatnich lat7. Przewlekłe odrzucenie, charakteryzujące się miażdżycą tętnic po przeszczepie, nadal stanowi główną przeszkodę w długoterminowym przeżyciu przeszczepu8-11.

Model heterotopowego przeszczepu serca u myszy dostarcza ważnego i ważnego narzędzia do analizy mechanizmu immunologicznego zarówno podczas ostrego, jak i przewlekłego odrzucenia12-15.

Do tej pory najczęstszym modelem przeszczepu jest nadal przeszczep serca myszy w jamie brzusznej przy użyciu techniki szwów. Aorta wstępująca serca dawcy jest zespolena z aortą brzuszną, a tętnica płucna jest zespolena z żyłą główną dolną biorcy. Duża część trudności mikrochirurgicznych modelu szwu opiera się na małym rozmiarze naczyń, które są zszywane16,17.

W przeciwieństwie do modelu szwów, serce jest umieszczane w okolicy szyi biorcy, gdzie zewnętrzna żyła szyjna jest zespolena z tętnicą płucną, a tętnica szyjna wspólna z aortą dawcy.

Uzasadnieniem rozwoju modelu przeszczepu szyjki macicy za pomocą techniki mankietowej było posiadanie modelu zwierzęcego, co pozwala na osiągnięcie wysokich wskaźników sukcesu z podstawowymi umiejętnościami mikrochirurgicznymi, które pozwolą na szerokie zastosowanie tego modelu. Głównymi zaletami tej metody jest znacznie mniej występujących powikłań związanych ze zespoleniem, takich jak krwotoki i zakrzepica, w porównaniu z modelem szewu18.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zwierzęta są trzymane w obiekcie wolnym od patogenów barierowych. Wszystkie zwierzęta otrzymują opiekę człowieka zgodnie z "Zasadami opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi" sformułowanymi przez National Society for Medical Research" oraz "Przewodnikiem opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych" opracowanym przez Narodową Akademię Nauk i opublikowanym przez National Institutes of Health (publikacja NIH nr 86-23, Poprawiony w 1985 r.). Wszystkie eksperymenty są zatwierdzone przez austriackie Ministerstwo Edukacji, Nauki i Kultury.

1. Przygotowanie odbiorcy

  1. Znieczulić zwierzę biorcy za pomocą domięśniowego wstrzyknięcia ksylazyny (5 mg/kg masy ciała) i ketaminy (100 mg/kg masy ciała).
  2. Usuń wszystkie włosy z bocznej części szyjki macicy zwierzęcia i trzykrotnie wyszoruj pole operacyjne za pomocą chlorheksdyny.
  3. Umieść mysz w pozycji leżącej na plecach na polu operacyjnym.
  4. Następnie wykonaj nacięcie skóry od nacięcia szyjnego do prawej dolnej żuchwy.
  5. Następnie tępo zmobilizuj prawą żyłę szyjną zewnętrzną (EJV) i podziel gałęzie między ligatury.
  6. Następnie podziel EJV między ligatury, upewniając się, że pozostawiono wystarczającą długość, aby wyciąć bliższy kikut nad korpusem mankietu.
  7. Następnie usuń prawy płat gruczołu podżuchwowego.
  8. W przypadku zespolenia żylnego przełóż bliższy koniec EJV przez mankiet polietylenowy i przymocuj go do uchwytu mankietu za pomocą mikrozacisku.
  9. Usuń ligaturę na końcu naczynia, przeciągnij światło nad mankietem i przymocuj je za pomocą 8-0 jedwabna pętelka (rysunek 1a).
  10. Następnie przeciąć prawy mięsień mostkowo-obojczykowo-sutkowy za pomocą kauteryzacji dwubiegunowej, aby uzyskać dostęp do wspólnej tętnicy szyjnej.
  11. Następnie należy zmobilizować tętnicę szyjną wspólną i przeciąć naczynie między więzadłami.
  12. Następnie należy zmobilizować tętnicę szyjną wspólną i przeciąć naczynie między więzadłami.
  13. Przełóż dystalny koniec naczynia przez mankiet i przymocuj go za pomocą zacisku tętniczego.
  14. Usuń więzadło na końcu naczynia i rozciągnij światło za pomocą rozszerzaczy naczyń krwionośnych. Następnie, analogicznie do EJV, przełóż tętnicę przez mankiet i napraw ją za pomocą 8-0 jedwabna pętelka.

2. Zaopatrzenie w serce

  1. Znieczulić mysz dawcę wstrzyknięciem domięśniowym ksylazyny (5 mg/kg masy ciała) i ketaminy (100 mg/kg masy ciała). Następnie usuń wszystkie włosy z okolicy brzucha zwierzęcia. Trzykrotnie wyszoruj pole operacyjne za pomocą chlorheksdyny. Następnie umieść mysz w pozycji leżącej na polu operacyjnym, jak opisano wcześniej.
  2. Po nacięciu brzucha w linii środkowej cofnij wnętrzności za pomocą końcówek Q w lewo, aby odsłonić żyłę główną dolną (IVC).
  3. Wstrzyknąć 400 μl roztworu heparyny i sodu w stosunku 1:4 do IVC w celu heparynizacji.
  4. Wykonaj torakotomię i złóż przednią ścianę klatki piersiowej nad czaszką, aby uzyskać dostęp do serca.
  5. Następnie usuń grasicę i wykonaj nacięcia wentylacyjne w lewej i prawej żyle głównej górnej.
  6. Następnie należy wykonać perfuzję serca w sposób wsteczny roztworem HTK o temperaturze 4 ° Celsjusza poprzez kaniulację łuku aorty za pomocą strzykawki 27 G na poziomie gałęzi ramienno-głowowej.
  7. Podwiązaj żyłę główną dolną i górną z 8-0 jedwabiu i podzielić je dystalnie do ligatur.
  8. Następnie podziel łuk aorty na poziomie poprzedniej kaniulacji i wypreparuj pień płucny i podziel go jak najdalej dystalnie.
  9. Następnie zwiąż żyły płucne podwiązaniem zbiorczym i podziel je dystalnie do ligatur.
  10. Na koniec należy usunąć serce z miejsca dawczego i przechowywać je w roztworze HTK o temperaturze 4° Celsjusza (ryc. 1b).

3. Implantacja

  1. Umieść przeszczep serca w okolicy szyi biorcy w pozycji odwróconej do góry nogami (ryc. 1c).
  2. Następnie przeciągnij pień płucny serca nad konstrukcją mankietu żylnego biorcy i przymocuj go jedwabną pętlą (ryc. 1d).
  3. W ten sam sposób należy wykonać zespolenie między aortą przeszczepu a przerwaną tętnicą zwierzęcia biorcy (ryc. 1e).
  4. Następnie najpierw zdejmij zacisk żylny, a następnie zacisk tętniczy. Serce ulega reperfuzji i zaczyna bić w ciągu 1-2 minut. Podczas reperfuzji zwilżyć serce ciepłą (35° Celsjusza) solą fizjologiczną.
  5. Na koniec zamknij ranę chirurgiczną za pomocą szwów ciągłych 6-0 (ryc. 1e).

4. Opieka pooperacyjna, punkt końcowy

  1. Po operacji podać do 0,3 ml soli fizjologicznej w celu wymiany płynów.
  2. Umieść zwierzę pod lampą grzewczą do momentu wybudzenia się ze znieczulenia.
  3. Po przebudzeniu zwierzę należy odesłać do pomieszczenia socjalnego, gdzie otrzymuje ono pożywienie i wodę ad libitum.
  4. Aby zminimalizować ból w ciągu pierwszych 7 dni po operacji, należy podawać karprofen (4 mg/kg mc. co 12 godzin podskórnie (podskórnie). Ponadto buprenorfinę (0,1 mg/kg) należy podawać bezpośrednio po operacji co 12 godzin przez 5 dni.
  5. Uzyskiwać co tydzień masę ciała (g) każdego biorcy zwierzęcia, aby ocenić prawidłowe spożycie składników odżywczych. Jeśli istnieją dowody na utratę masy ciała o więcej niż 10-15% w porównaniu z masą ciała w dniu operacji, apatię, kalekę lub bardzo zgięte plecy, należy złożyć zwierzę w ofierze za pomocą końcowej inhalacji izofluranu przed osiągnięciem klinicznego punktu końcowego. Złóż również ofiarę ze zwierzęcia po tym, jak serce zostało odrzucone.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 2 pokazuje reprezentatywne dane dotyczące przeżycia alloprzeszczepów serca od dawców BALB/c po przeszczepie do w pełni niedopasowanych biorców MHC C57BL/6. Serca są odrzucane w 7 ± 1 dniu po przeszczepie. Badanie palpacyjne przeszczepionego przeszczepu jest czułą metodą wykrywania zależnego od czasu przebiegu odrzucenia przeszczepu allogenicznego. Wszystkie syngeniczne przeszczepy serca wykonane w naszej serii przeżyły w nieskończoność (>150 dni).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Odrzucenie unaczynionych przeszczepów allogenicznych pociąga za sobą mnóstwo różnych etapów, które można jedynie niewystarczająco ocenić za pomocą modeli in vitro . Zjawiska takie jak uwrażliwienie biorców, przetwarzanie antygenu w wtórnych narządach limfatycznych, ale także różnicowanie i proliferacja komórek kompetentnych immunologicznie są lepiej scharakteryzowane in vivo. Modele zwierzęce są zatem idealnym narzędziem do badań translacyjnych16. Modele mysie nadal stanowią złoty standard w ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie to zostało wsparte grantem #207 "Medizinischer Forschungsfond Tirol", grantem #2010022010 "MUI-START Förderungsprogramm" Uniwersytetu Medycznego w Innsbrucku.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają żadnych konkurencyjnych interesów finansowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Yasargil Clip Mini Permanent 7 mmAesculapFE720K
Mikroklips do naczyńS & TB1 00396 V
MikronożyczkiFST14075-11
Rozszerzacz naczyńS & TD-5a.2 00125
MikrokleszczeFSTDumont 11271- 30
ClipapplicatorS & TCAF-4 00072
Klips do mikronaczyńS & TB1 00396 V

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brandacher, G., et al. Tetrahydrobiopterin compounds prolong allograft survival independently of their effect on nitric oxide synthase activity. Transplantation. 81, 583-589 (2006).
  2. Schneeberger, S., et al. The effect of secretory leukocyte protease inhibitor (SLPI) on ischemia/reperfusion injury in cardiac transplantation. Am J Transplant. 8, 773-782 (2008).
  3. Sucher, R., et al. IDO and regulatory T cell support are critical for cytotoxic T lymphocyte-associated Ag-4 Ig-mediated long-term solid organ allograft survival. JImmunol. 188, 37-46 (2012).
  4. Yamashita, K., et al. Heme oxygenase-1 is essential for and promotes tolerance to transplanted organs. FASEB J. 20, 776-778 (2006).
  5. Kienzl, K., et al. Proteomic profiling of acute cardiac allograft rejection. Transplantation. 88, 553-560 (2009).
  6. Aurora, P., et al. Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: tenth official pediatric lung and heart/lung transplantation report--2007. J Heart Lung Transplant. 26, 1223-1228 (2007).
  7. Häyry, P. Chronic allograft vasculopathy new strategies for drug development. Transplant Proc. 30, 3989-3990 (1998).
  8. Hosenpud, J. D. Immune mechanisms of cardiac allograft vasculopathy an update. Transpl Immunol. 1, 237-249 (1993).
  9. Libby, P., Pober, J. S. Chronic rejection. Immunity. 14, 387-397 (2001).
  10. Kouwenhoven, E. A., de Bruin, R. W., Heemann, U. W., Marquet, R. L., Ijzermans, J. N. Late graft dysfunction after prolonged cold ischemia of the donor kidney inhibition by cyclosporine. Transplantation. 68, 1004-1010 (1999).
  11. Kouwenhoven, E. A., Ijzermans, J. N., de Bruin, R. W. Etiology and pathophysiology of chronic transplant dysfunction. Transpl Int. 13, 385-401 (2000).
  12. Chen, Z. H. A technique of cervical heterotopic heart transplantation in mice. Transplantation. 52, 1099-1101 (1991).
  13. Huang, X., Chen, D., Chen, L. [A modified model of cervical heterotopic cardiac transplantation for chronic rejection research]. Zhongguo Xiu Fu Chong Jian Wai Ke Za Zhi. 22, 1508-1510 (2008).
  14. Hasegawa, T., Visovatti, S. H., Hyman, M. C., Hayasaki, T., Pinsky, D. J. Heterotopic vascularized murine cardiac transplantation to study graft arteriopathy. Nat Protoc. 2, 471-480 (2007).
  15. Wang, C. Y., et al. Suppression of murine cardiac allograft arteriopathy by long-term blockade of CD40-CD154 interactions. Circulation. 105, 1609-1614 (2002).
  16. Matsuura, A., Abe, T., Yasuura, K. Simplified mouse cervical heart transplantation using a cuff technique. Transplantation. 51, 896-898 (1991).
  17. Tomita, Y., et al. Improved technique of heterotopic cervical heart transplantation in mice. Transplantation. 64, 1598-1601 (1997).
  18. Zhou, Y., Gu, X., Xiang, J., Qian, S., Chen, Z. A comparative study on suture versus cuff anastomosis in mouse cervical cardiac transplant. Exp Clin Transplant. 8, 245-249 (2010).
  19. Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Primarily vascularized allografts of hearts in mice. The role of H-2D, H-2K, and non-H-2 antigens in rejection. Transplantation. 16, 343-350 (1973).
  20. Kamada, N., Calne, R. Y. Orthotopic liver transplantation in the rat. Technique using cuff for portal vein anastomosis and biliary drainage. Transplantation. 28, 47-50 (1979).
  21. Zimmermann, F. A., et al. Techniques for orthotopic liver transplantation in the rat and some studies of the immunologic responses to fully allogeneic liver grafts. Transplant Proc. 11, 571-577 (1979).
  22. Maglione, M., et al. Donor pretreatment with tetrahydrobiopterin saves pancreatic isografts from ischemia reperfusion injury in a mouse model. Am J Transplant. 10, 2231-2240 (2010).
  23. Heron, I. A technique for accessory cervical heart transplantation in rabbits and rats. Actapathologica et microbiologica Scandinavica Section A, Pathology. 79, 366-372 (1971).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Przeszczep serca myszyanastomoza naczyniowaprocedura mikrochirurgicznaprzeszczep heterotopowywsp lna t tnica szyjnazewn trzna y a szyjnaperfuzja wstecznawska nik sukcesuimmunologia przeszczepiania

Powiązane artykuły