Artykuł metodologiczny

Szybki protokół integracji macierzy pozachromosomalnych o wysokiej szybkości transmisji z genomem C. elegans

9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50773

⸱

9 grudnia 2013

 ,  ,  , 
1Université Claude Bernard Lyon, 2Centre de Génétique et de Physiologie Moléculaires et Cellulaires, CNRS UMR 5534

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje szybką i mało materiałochłonną procedurę integracji transgenicznych układów pozachromosomalnych z genomem Caenorhabditis elegans za pomocą promieniowania ultrafioletowego (UV). Co więcej, protokół ten jest szczególnie odpowiedni dla linii transgenicznych, które przesyłają macierze pozachromosomalne z dużą szybkością.

Streszczenie

Mikroiniekcja DNA do cytoplazmy syncytialnej gonady Caenorhabditis elegans jest główną techniką używaną do ustanowienia linii transgenicznych, które wykazują częściowe i zmienne tempo transmisji układów pozachromosomowych do następnego pokolenia. Ponadto zwierzęta transgeniczne są mozaikowe i wyrażają transgen w zmiennej liczbie komórek. Macierze pozachromosomalne można zintegrować z genomem C. elegans za pomocą promieniowania UV w celu stworzenia niemozaikowych szczepów transgenicznych ze 100% szybkością transmisji transgenu. W tym zakresie potomstwo F1 zwierząt transgenicznych napromieniowanych promieniowaniem UV jest badane pod kątem zwierząt z heterozygotyczną integracją transgenu, co prowadzi do 75% szybkości transmisji mendlowskiej do potomstwa F2. Jednym z wyzwań tej metody jest rozróżnienie procentu transmisji transgenicznej w populacji przed (X% zwierząt transgenicznych) i po integracji (≥75% transgenicznych zwierząt F2). W związku z tym metoda ta wymaga wyboru niezintegrowanej linii transgenicznej z odsetkiem zwierząt transgenicznych, który jest znacznie niższy niż segregacja mendlowska wynosząca 75%. W związku z tym niezintegrowane linie transgeniczne z szybkością transmisji w układzie pozachromosomalnym do następnego pokolenia ≤60% są zwykle preferowane do integracji, a integracja transgenowa w szczepach wysoce transmisyjnych jest trudna. Tutaj pokazujemy, że efektywność integracji macierzy pozachromosomalnych z genomem wzrasta przy użyciu wysoce transgenicznych linii transgenicznych (≥80%). Opisany protokół pozwala na łatwą selekcję kilku niezależnych linii z homozygotyczną integracją transgenową do genomu po naświetlaniu promieniowaniem UV transgenicznych robaków wykazujących wysoki wskaźnik transmisji w macierzy pozachromosomalnej. Co więcej, ta metoda jest dość szybka i mało materiałochłonna. Możliwość szybkiego generowania różnych linii, które wyrażają określony zintegrowany transgen, jest bardzo interesująca dla badań koncentrujących się na wzorcu i regulacji ekspresji genów, lokalizacji białek i nadekspresji, a także dla rozwoju markerów subkomórkowych.

Wprowadzenie

Transgeny są szeroko stosowane w C. elegans do szerokiego zakresu zastosowań. Szczepy transgeniczne są zwykle generowane przez wstrzyknięcie DNA do syncytialnej gonady hermafrodyty1,2. DNA przenoszące interesujący nas transgen jest koiniekowane wraz z plazmidami kodującymi markery koiniekcyjne1,3,4. Markery koiniekcyjne to ustalone transgeny prowadzące albo do ekspresji białka fluorescencyjnego, albo do określonego fenotypu behawioralnego lub morfologicznego. Wstrzyknięte DNA przegrupowują się, tworząc wielokopijne macierze pozachromosomowe; W ten sposób interesujący nas transgen i marker koiniekcji są przekazywane razem5,4. Linie transgeniczne są wybierane w pokoleniu F2 zwierząt, którym wstrzyknięto zastrzyki, kierując się fenotypem wywołanym ekspresją markera koiniekcyjnego (fluorescencja lub fenotyp specyficzny)1. Linie transgeniczne wykazują częściowe i zmienne szybkości transmisji macierzy pozachromosomalnych do następnego pokolenia. W zależności od szczepu, 10-100% (100% jest rzadkim zdarzeniem) zwierząt dziedziczy układy pozachromosomalne. Ponadto zwierzęta transgeniczne są mozaikowe i wyrażają transgen w zmiennej liczbie komórek. Ten mozaicyzm jest prawdopodobnie skorelowany z szybkością transmisji do następnego pokolenia. Rzeczywiście, zarówno w linii rozrodczej, jak i komórkach somatycznych szybkość transmisji zależy od segregacji macierzy pozachromosomalnych podczas podziałów komórkowych. Jednym ze sposobów uniknięcia tego problemu jest zintegrowanie transgenu z genomem. Klasycznie rzecz biorąc, integracja transgenu z chromosomem opiera się na napromieniowaniu (ultrafioletowym lub gamma) transgenicznych robaków przenoszących macierze pozachromosomowe3. Krótko mówiąc, 50-100 zwierząt hermafrodytycznych jest napromienianych w stadium larwalnym L4. W pokoleniu F1 wybiera się od 200 do 800 zwierząt transgenicznych, które są indywidualnie hodowane na płytkach. Zgodnie z segregacją mendlowską, transgeniczne zwierzęta F1 posiadające heterozygotyczną integrację transgenu z genomem wyprodukowałyby 1/2 transgenicznych potomków, którzy są heterozygotyczni pod względem zintegrowanej macierzy, 1/4 transgenicznych potomków będących homozygotycznymi pod względem zintegrowanej macierzy i 1/4 potomków, którzy nie zintegrowali macierzy (Figura 1). W ten sposób płytki zawierające pokolenie F2 są poddawane wizualnym badaniom przesiewowym pod kątem ≥75% zwierząt transgenicznych, co obserwuje się na podstawie ekspresji markera do iniekcji. Zakłada się, że około 1/3 zwierząt F2 wybranych jako kandydaci integrujący jest homozygotycznych pod względem zintegrowanej macierzy i produkuje 100% homozygotycznych zwierząt F3. W związku z tym z każdej wybranej płytki hoduje się indywidualnie od trzech do ośmiu transgenicznych zwierząt F2 i wybiera się płytki ze 100% transgenicznymi potomkami. Następnie osiem zwierząt F3 jest indywidualnie hodowanych, aby potwierdzić 100% dziedziczenie transgenu.

Główne wady tej metody to:

  1. wymaga wizualnego badania przesiewowego kilkuset płytek F1 dla ≥75% transgenicznego potomstwa F2, co jest czasochłonne ze względu na zmienny i nieprzewidywalny procent transmisji niezintegrowanych macierzy pozachromosomowych. Alternatywnie, aby uniknąć przesiewania płytek F1, po napromieniowaniu zwierząt P0 można przeprowadzić kilka kolejnych etapów głodzenia; Następnie wybrano 100 transgenicznych zwierząt i przeprowadzono badania przesiewowe pod kątem 100% transgenicznego potomstwa3.
  2. Nie jest przystosowany do szczepów wykazujących odsetek transmisji w macierzy pozachromosomalnej wyższy niż 60%, ponieważ odsetek ten jest trudny do odróżnienia od 75%.
  3. ponieważ można stosować tylko szczepy o stosunkowo niskim współczynniku transmisji, konieczna jest duża liczba napromieniowanych transgenicznych zwierząt P0, a także obserwacja wielu zwierząt F1 i F2, co jest bardzo czasochłonne i wymaga znacznej liczby płytek.

Napromienianie robaków przypuszczalnie powoduje pęknięcia dwuniciowych w DNA i integracja pozachromosomalnych układów w chromosomy następuje podczas naprawy DNA. W związku z tym prawdopodobne jest, że szanse na pomyślną integrację za pośrednictwem napromieniania są wprost proporcjonalne do liczby komórek linii rozrodczej noszących układ pozachromosomalny. Szczepy o wysokiej szybkości transmisji mogą zawierać więcej transgenicznych macierzy DNA niż szczepy o niskiej szybkości transmisji, jak sugerowano w2, i wykazywać większą liczbę komórek linii rozrodczej zawierających macierze pozachromosomowe. W związku z tym doszliśmy do wniosku, że w liniach o wysokiej transmisji, transgeny mogą być łatwiejsze do zintegrowania niż w liniach o niskiej szybkości transmisji. Jednak standardowy protokół wyklucza możliwość integracji transgenów o wysokiej częstotliwości transmisji, ponieważ odsetek zwierząt transgenicznych z niezintegrowaną matrycą pozachromosomalną jest trudny do odróżnienia od odsetka potomstwa zwierzęcia F1 niosącego heterozygotyczną integrację transgenu z genomem (ryc. 1).

Tutaj pokazujemy, że dla konkretnego transgenu, liczba zintegrowanych linii odzyskanych po naświetleniu światłem ultrafioletowym (UV) zależy od początkowego procentu transmisji niezintegrowanej matrycy. Przedstawiamy ulepszony protokół integracji transgenu za pośrednictwem promieniowania UV, który jest szczególnie istotny dla linii wykazujących wysoką szybkość transmisji w macierzy transgenowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Hodowla transgenicznych nicieni przed integracją

Linie transgeniczne mogą być generowane zgodnie z opisem wpunkcie 1. Linie te zwykle zawierają plazmid markera koiniekcyjnego prowadzący albo do ekspresji białka fluorescencyjnego, albo do określonego fenotypu behawioralnego lub morfologicznego na danym etapie rozwoju1,3. Ten protokół integracji może być stosowany do szczepów wykazujących ekspresję fluorescencyjnych lub niefluorescencyjnych markerów koiniekcji. W poniższym przykładzie użyto szczepu z fluorescencyjnym markerem do współiniekcji.

  1. Przygotuj płytki hodowlane:
    1. Przygotować około 500 szalek Petriego o średnicy 60 mm, zalanych w sposób aseptyczny po 10 ml pożywki dla nicieni (NGM)6,7.
    2. Wysiewać każdą płytkę 0,3 ml nasyconej kultury Escherichia coli OP50 zgodnie ze standardową procedurą6,7.
  2. Oceń szybkość transmisji linii transgenicznej, która ma zostać zintegrowana:
    1. Dla każdej linii transgenicznej wybierz dziesięć fluorescencyjnych dorosłych osobników na dziesięć oddzielnych płytek hodowlanych pod fluorescencyjnym stereoskopem za pomocą kilofa robakowego, jak opisano w7.
    2. Hodować zwierzęta w inkubatorze dla robaków w temperaturze 15–25 °C (w zależności od tła genetycznego), aby umożliwić robakom rozmnażanie się.
    3. Obserwuj potomstwo każdego dnia, aby ocenić, na jakim etapie rozwoju marker koiniekcji ulega ekspresji i można go najlepiej zaobserwować. Ekspresję większości obecnie stosowanych markerów koiniekcji obserwuje się w stadium larwalnym L4 lub w wieku dorosłym.
    4. Ocenić szybkość transmisji potomstwa, określając procent fluorescencyjnego potomstwa przez obserwację pod fluorescencyjnym stereoskopem.
  3. Wybierz linię transgeniczną do integracji transgenowej:
    1. Wybierz linię transgeniczną o jak najwyższym współczynniku transmisji (najlepiej ≥80%).
  4. Uzyskanie populacji zwierząt transgenicznych zsynchronizowanych w stadium larwalnym L4 w celu integracji:
    1. Wybierz 30 fluorescencyjnych dorosłych osobników na pięć płytek hodowlanych (sześć zwierząt na talerzu).
    2. Pozwól robakom złożyć jaja przez 3-4 godziny w temperaturze 15 °C.
    3. Wyeliminuj dorosłe osobniki z talerzy po sprawdzeniu, czy na talerzu znajduje się co najmniej 30 jaj.
    4. Hodować zwierzęta w inkubatorze z robakami w temperaturze 15–25 °C do momentu, gdy potomstwo osiągnie stadium larwalne L4 (96 godzin w temperaturze 15 °C lub 36 godzin w temperaturze 25 °C).

2. Naświetlanie promieniowaniem UV i odzyskiwanie transgenicznych robaków

  1. Napromienianie robakami:
    1. Wybierz 30-100 fluorescencyjnych transgenicznych zwierząt L4 na osobne płytki hodowlane (15-20 zwierząt na płytce).
    2. Umieść płytki ze zdjętymi pokrywkami w usieciowaniu UV. Napromieniować robaki w stężeniu 0,012 J/cm2. Należy pamiętać, że szczepy są mniej lub bardziej wrażliwe na promieniowanie UV, a wyniki mogą być różne w zależności od zastosowanego promiennika UV. Można badać zakres dawek w zakresie 0,010-0,015 J/cm2.
  2. Odzyskiwanie robaków po napromieniowaniu:
    1. Umieścić płytki z napromieniowanymi robakami na noc w temperaturze 15 °C w celu odzyskania.
    2. Sprawdź liczbę zwierząt, które żyją. W naszych rękach wskaźnik przeżycia wynoszący około 80-90% jest przystosowany do skutecznego napromieniania.
    3. Zwierzęta poddane napromienianiu należy hodować w temperaturze 15–25 °C do momentu, gdy potomstwo osiągnie stadium rozwojowe umożliwiające obserwację ekspresji markera jednoczesnego wstrzykiwania, jak ustalono w kroku 1.2.

3. Izolacja zintegrowanych linii transgenicznych

  1. Selekcja zwierząt F1:
    1. Pojedyncze 150-200 fluorescencyjnych zwierząt F1 na oddzielnych płytkach hodowlanych. W przypadku linii o dużej przepuszczalności (≥80%) wystarczy 100 zwierząt F1.
    2. Utrzymywać płytki F1 w temperaturze 15-25 °C do czasu, gdy potomstwo osiągnie odpowiedni etap do obserwacji fluorescencyjnych zwierząt F2.
    3. Odrzucić wszystkie płytki F1 wykazujące albo i) brak potomstwa, co wskazuje, że zwierzę F1 było bezpłodne lub padło, albo ii) brak lub tylko kilka fluorescencyjnych zwierząt F2, co wskazuje, że zwierzę F1 nie przekazało transgenu w oczekiwanej szybkości. Ten krok jest szybki i stanowi prawdziwą zaletę w porównaniu ze standardowym protokołem, który wymaga oszacowania procentu fluorescencyjnych robaków F2 w celu wybrania płytek F1 wykazujących ≥75% fluorescencyjnego potomstwa (Tabela 1).
  2. Selekcja zwierząt F2:
    1. Pojedyncze cztery fluorescencyjne transgeniczne zwierzęta F2 z każdej wybranej płytki F1. W przypadku stosowania transgenów fluorescencyjnych (na przykład mCherry8, gfp9 lub dsRed10) należy wybrać robaki F2 o wysokim poziomie fluorescencji, ponieważ może to wskazywać, że zwierzęta te są homozygotyczne pod względem zintegrowanej macierzy. Należy pamiętać, że podczas wybierania zwierząt F2 bardzo ważne jest, aby nie nosić ze sobą jaj ani larw, aby uniknąć wyników fałszywie ujemnych w następnym kroku.
    2. Hoduj zwierzęta F2 w temperaturze 15-25 °C.
  3. Izolacja i walidacja zintegrowanych szczepów transgenicznych:
    1. Płytki przesiewowe F2 dla 100% fluorescencyjnych transgenicznych robaków F3. Ekran jest dość szybki, ponieważ obecność pojedynczego niefluorescencyjnego robaka wskazuje, że płytkę należy wyrzucić. Zwierzę F2 homozygotyczne pod względem zintegrowanego transgenu da 100% homozygotyczne fluorescencyjne potomstwo.
    2. Pobrano osiem fluorescencyjnych zwierząt F3 z wybranych płytek, aby potwierdzić 100% dziedziczenie transgenu. Teoretycznie na tym etapie wystarczy wybrać jedno zwierzę. Jednak wybranie ośmiu fluorescencyjnych zwierząt F3 może być konieczne, aby uniknąć wyboru zwierząt niepłodnych lub niezdrowych, ponieważ napromieniowanie może losowo wywołać mutacje, które wpływają na geny ważne dla fizjologii robaków.
    3. Jeśli to możliwe, należy zachować kilka niezależnych, zintegrowanych szczepów transgenicznych, tj. szczepów odzyskanych od różnych zwierząt F1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Integracje transgenów w dwóch różnych liniach przekazujących macierze pozachromosomalne z niemal taką samą częstotliwością (50-60%) przeprowadzono przy użyciu protokołu standardowego i ulepszonego (Tabela 1). Protokół standardowy pozwolił na uzyskanie trzech niezależnych linii zintegrowanych po naświetlaniu UV 91 transgenicznych zwierząt w stadium L4, natomiast protokół ulepszony pozwolił na uzyskanie jednej linii zintegrowanej po naświetlaniu UV 30 transgenicznych zwierząt w stadium L4. Sugeruje to, że ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisany tutaj protokół zapewnia skuteczną metodę integracji pozachromosomalnych macierzy transgenicznych z genomem C. elegans. Korzystając z różnych linii niezintegrowanych, które przenosiły ten sam transgen Pdyc-1::d yc-1::gfp (pKG45) z różną szybkością (10-15%, 50-60% i >80%), wykazaliśmy, że liczba zintegrowanych szczepów odzyskanych po napromieniowaniu UV zależy od początkowego poziomu transmisji linii niezintegrowanej (Tabela 2). Dlatego transgeny są łatwiejsze do zintegrowania w l...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnego interesu finansowego.

Podziękowania

Autorzy dziękują Claire Lecroisey i Laurentowi Ségalatowi za wygenerowanie niezintegrowanego Pdyc-1::d yc-1::gfp; Szczepy transgeniczne Pmyo-2::d sRed i Pmyo-3::gfp. Dziękujemy Andy'emu Fire'owi za dar plazmidu Pmyo-2::d sRed oraz Pameli Hoppe za dar plazmidu Pmyo-3::gfp. Praca ta została założona przez Francuskie Narodowe Centrum Badań Naukowych (CNRS) i Uniwersytet Claude'a Bernarda w Lyonie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AgarProlabo20768.292do przygotowania NGM (pożywki dla nicieni) (6,7)
NaClChimie-Plus40045do przygotowania NGM
Bacto-peptonBD211820do przygotowania NGM
KH2PO4Roth3904-1do przygotowania NGM
K2HPO4Prolabo26930.293do przygotowania NGM
MgSO4RothP027.2do przygotowania NGM
CaCl2Prolabo22317.297do przygotowania NGM
CholesterolRectapurdo przygotowania
NGM LB-bulionSigmaL3022do hodowli OP50 bakterie
SPRZĘT
Usieciowanie UVFischer ScientificDługość fali 254 nm
Mikroskop SteREO Discovery V8Carl Zeiss, Inc.
szalki Petriego, 60 mmCMLBPS55E6
Drut platynowy 0,25 mmAlfa Aesar7440-06-4Do zrobienia kilofa do robaków (7)

Bibliografia

  1. Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J. Vis. Exp. (18), e833(2008).
  2. Mello, C., Kramer, J. M., Stinchlomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10 (12), 3959-3970 (1991).
  3. Transformation and microinjection. WormBook. Evans, T. C. , The C. elegans Research Community, WormBook. (2006).
  4. Hobert, O. PCR Fusion-Based Approach to Create Reporter Gene Constructs for Expression Analysis in Transgenic C. elegans. BioTechniques. 32, 728-730 (2002).
  5. Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans. Mol. Cell. Biol. 5, 3484-3496 (1985).
  6. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  7. Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis. J. Vis. Exp. (47), e2293(2011).
  8. Merritt, C., Rasoloson, D., Gallo, C., Voronina, E., Ko, D., Seydoux, G. A modular vector kit for transgenesis in C. elegans. International Worm Meeting. , (2007).
  9. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W., Green Prasher, D. Fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263, 802-805 (1994).
  10. Fleenor, J., Fire, A. Discosoma sp. Red Fluorescent Protein (dsRED) as a reporter in C. elegans. Worm Breeder's Gazette. 16 (3), 16(2000).
  11. Lecroisey, C., et al. ZYX-1, the unique zyxin protein of Caenorhabditis elegans, is involved in dystrophin-dependent muscle degeneration. Mol. Biol. Cell. , (2013).
  12. Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans. Genetics. 157 (3), 1217-1226 (2001).
  13. Frøkjaer-Jensen, C., et al. Single-copy insertion of transgenes in Caenorhabditis elegans. Nat. Genet. 40 (11), 1375-1383 (2008).
  14. Dickinson, D. J., Ward, J. D., Reiner, D. J., Goldstein, B. Engineering the Caenorhabditis elegans genome using Cas9-triggered homologous recombination. Nat. Methods. 10 (10), 1028-1034 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Na wietlanie UVselekcja linii transgenicznychprzesiew fluorescencyjnyintegracja homozygotycznaanaliza szybko ci transmisjiprzesiew potomstwa F1selekcja p ytek F2generowanie niezale nych szczep w

Powiązane artykuły