Pokazujemy prosty test multipleksowego PCR do szybkiego badania przesiewowego i typowania Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) typu I-V dla opornego na metycylinę Staphylococcus aureus, i przedstawiamy niektóre z istotnych kroków i niuansów proceduralnych, które sprawiają, że jest to skuteczne w adaptacji tego testu do indywidualnych laboratoriów.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Test multipleksowy PCR do typowania gronkowcowego chromosomu kasety mec typów od I do V w gronkowca złocistego opornym na metycylinę
W tym artykule
Informacja o sprostowaniu
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Podsumowanie
Streszczenie
Typowanie chromosomu kasety gronkowcowej mec (SCCmec) jest bardzo ważnym narzędziem molekularnym do zrozumienia epidemiologii i pokrewieństwa szczepów klonalnych opornego na metycylinę Staphylococcus aureus (MRSA), szczególnie w obliczu pojawiających się na całym świecie ognisk MRSA związanych ze społecznością (ca-MRSA). Tradycyjne schematy typowania PCR klasyfikująSCC mec poprzez ukierunkowanie i identyfikację poszczególnych typów kompleksów genów mec i ccr, ale wymagają użycia wielu zestawów starterów i wielu indywidualnych eksperymentów PCR. Zaprojektowaliśmy i opublikowaliśmy prosty test multipleksowy PCR do szybkiego badania przesiewowego głównych typów i podtypówmec SCC od I do V, a następnie zaktualizowaliśmy go w miarę pojawiania się nowych informacji o sekwencji. Ten prosty test jest ukierunkowany na poszczególne typySCC mec w jednej reakcji, jest łatwy do interpretacji i jest szeroko stosowany na całym świecie. Jednak ze względu na wyrafinowany charakter testu i dużą liczbę starterów obecnych w reakcji, istnieje możliwość wystąpienia trudności przy dostosowywaniu tego testu do poszczególnych laboratoriów. Aby ułatwić proces tworzenia testu MRSA SCCmec, tutaj pokazujemy, jak skonfigurować nasz multipleksowy test PCR i omawiamy niektóre z istotnych kroków i niuansów proceduralnych, które sprawiają, że jest on skuteczny.
Wprowadzenie
Staphylococcus aureus oporny na metycylinę (MRSA) nabył i włączył do swojego genomu mobilny element genetyczny o rozmiarze 21-67 kb, określany jako gronkowcowy chromosom kasetowy mec (SCCmec), który zawiera gen oporności na metycylinę (mecA) i inne determinanty oporności na antybiotyki 1. SCCmec charakteryzuje się obecnością końcowych powtórzeń bezpośrednich i odwróconych, dwóch podstawowych składników genetycznych (kompleksu genów mec i kompleksu genów ccr) oraz regionów J (ryc. 1). Kompleks genów mec składa się z IS431mec, mecA i nienaruszonych lub skróconych zestawów genów regulatorowych, mecR1 i mecI, podczas gdy kompleks genów ccr koduje rekombinazy (ccr / ccrAB), które pośredniczą w integracji SCCmec z chromosomem 1 biorcy i jego wycięciu z biorcy. Niedawno opisano dwa nowe geny oporności na mec (mecB i mecC), które wykazują znaczną rozbieżność sekwencji w stosunku do genu mecA 2. Reszta elementumec SCC składa się z regionów J (J1, J2 i J3), które znajdują się pomiędzy i wokół kompleksów mec i ccr i zawierają różne geny lub pseudogeny. Opisano kilka klas kompleksów mec (takich jak A, B, C, D i E) oraz allotypów kompleksu CCR (takich jak 1-8). Różne kombinacje tych złożonych klas i allotypów generują różne typymec SCC. Zgodnie z wytycznymi nomenklatury i klasyfikacji SCCmec Międzynarodowej Grupy Roboczej ds. Klasyfikacji Elementów Chromosomów Kasety Staphylococcal (IWG-SCC), elementyMEC SCC są klasyfikowane do typów w oparciu o charakter kompleksów genów MEC i CCR, a następnie są klasyfikowane do podtypów zgodnie z różnicami w ich DNA 1 regionu J. Klony MRSA są zwykle definiowane przez włączenie informacji o typowaniuSCC mec w połączeniu z informacjami dostarczonymi przez metody typowania oparte na sekwencjach (genowych/genomowych), takie jak typowanie sekwencji wielolocus (ST) i/lub typowanie genu gronkowcowego białka A (spa) (np. ST8-t008-MRSA-IVa). W związku z tym typowanieSCC mec jest bardzo ważnym narzędziem molekularnym do zrozumienia epidemiologii i pokrewieństwa szczepów klonalnych MRSA, szczególnie w przypadku pojawiających się ognisk MRSA związanych ze społecznością (CA-MRSA) występujących na całym świecie.
Tradycyjne schematy typowania PCR klasyfikująSCC mec poprzez ukierunkowanie i identyfikację poszczególnych typów kompleksów genów mec i ccr, ale wymagają użycia wielu (20 do 30) zestawów starterów i wielu indywidualnych eksperymentów PCR. Okuma i wsp., na przykład, wykorzystali 21 starterów i wiele reakcji PCR z pojedynczym celem do wykrywania SCCmec I-IVb 3. Kondo i wsp. opracowali następnie bardziej kompletny test do identyfikacji ccr, mec i głównych różnic w regionach J, ale wymagał on również dużej liczby starterów i wielu reakcji PCR 4. Aby uprościć typowanieSCC mec, opracowano testy multiplex PCR (M-PCR), które umożliwiają przetwarzanie próbek w jednej reakcji PCR. De Lencastre i współpracownicy opracowali M-PCR do szybkiego badania przesiewowego SCCmec I-IV, a następnie zaktualizowali go dla SCCmec I-V, z oddzielnym M-PCR do identyfikacji podtypów SCCmec IV 5,6,7. Jednak testy te są trudniejsze do interpretacji, wymagają 2 reakcji w celu sklasyfikowania podtypów SCCmec IV i skutkują kilkoma podtypami nietypowalnymi. Próbując ulepszyć typowanieSCC mec, zaprojektowaliśmy i opublikowaliśmy prosty test multipleksowy PCR do szybkiego badania przesiewowego głównych typów i podtypówSCC mec od I do V 8, a następnie zaktualizowaliśmy go w miarę dostępności nowych informacji o sekwencji 9. Ten prosty test jest ukierunkowany na poszczególne typySCC mec w jednej reakcji, jest łatwy do interpretacji i jest szeroko stosowany na całym świecie (337 z SCOPUS; zaktualizowano 30 stycznia 2013 r.). Od czasu pierwotnej publikacji otrzymaliśmy wiele próśb o pomoc od grup, które konfigurują ten test w ramach wewnętrznego typowania MRSA SCCmec. Ze względu na wyrafinowany charakter testu i dużą liczbę starterów obecnych w reakcji, istnieje możliwość wystąpienia trudności przy dostosowywaniu tego testu do poszczególnych laboratoriów. Aby ułatwić proces tworzenia testumec MRSA SCC, pokażemy, jak skonfigurować nasz M-PCR do typowaniaSCC mec, a także omówimy niektóre z istotnych kroków i niuansów proceduralnych, które sprawiają, że jest to skuteczne.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Te procedury powinny być przeprowadzone w certyfikowanym laboratorium poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2. Przez cały czas należy używać odpowiednich środków ochrony osobistej, takich jak rękawice i fartuchy laboratoryjne.
1. Przygotowanie próbki
- Wymagane są świeże nocne kultury MRSA na płytkach. Na dzień przed wykonaniem PCR wybierz pojedynczą kolonię MRSA za pomocą sterylnego patyczka hodowlanego i przygotuj ciężką smugę bakterii na płytce z agarem sojowym tryptycznym (TSA). Na jednej płytce można nanieść wiele próbek. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
- Dodać 75 μl sterylnej wody destylowanej do probówki mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Za pomocą sterylnego patyczka hodowlanego zbierz niewielką ilość bakterii z ciężkiej nocnej smugi. Zamieszaj bakterie w sterylnej wodzie, aby przygotować mętny roztwór (ryc. 2). Powtórzyć te czynności dla wszystkich próbek.
- Inkubować probówki w suchym bloku grzewczym ustawionym na 95 °C przez 10 minut w celu lizy bakterii i uwolnienia DNA.
Uwaga: Jeśli roztwór bakteryjny jest zbyt słaby lub zbyt skoncentrowany, skuteczność PCR jest zmniejszona. Podobnie, jeśli temperatura jest wyższa niż 95 °C lub inkubacja trwa dłużej niż 10 minut, skuteczność PCR jest zmniejszona.
- Wyjąć próbki z bloku grzewczego i odstawić w temperaturze pokojowej na 5 minut.
- Odwirować próbki z prędkością 13 000 obr./min przez 1 minutę, tworząc osad z resztek komórkowych i przezroczysty supernatant zawierający DNA. Próbki można przechowywać w temperaturze -20 °C do wykorzystania w przyszłości.
Uwaga: Jeśli używasz wcześniej przygotowanej i zamrożonej próbki, wyjmij probówkę mikrowirówki z zamrażarki i odstaw w temperaturze pokojowej do całkowitego rozmrożenia. Jeśli osad został naruszony, należy ponownie odwirować próbkę.
Uwaga: gDNA przygotowane dowolną inną metodą, w tym ekstrakcją chelex10, lub ekstrakcją kolumnową (QIAmp DNA Mini Kit, Qiagen) jest również dopuszczalne.
2. Przygotowanie do PCR
Uwaga: Próbki kontrolne powinny być włączone do każdej serii PCR i zawierać minimum typów I, II, IIA, III, IVa, IVb, IVc, IVd, IVE i V. Dlatego też dziesięć dodatkowych próbek powinno być dodanych do liczenia podczas przygotowywania mieszanki wzorcowej. DNA do kontroli można przygotować z wyprzedzeniem i przechowywać przez dłuższy czas w zamrażarce.
- Usunąć odczynniki PCR, w tym 10x bufor PCR (bez MgCl2), 50 mM MgCl2, dNTP i startery, z zamrażarki -20 °C i pozostawić do rozmrożenia na czystym stole do PCR (nie dopuszcza się bakterii ani DNA) w temperaturze pokojowej. W tym czasie można przygotować i oznaczyć probówki do PCR o pojemności 0,2 ml.
Jeśli wymagane są nowe zapasy starterów lub dNTP, można je przygotować w następujący sposób:- Przygotować podkłady, rozcieńczając skoncentrowane wywary do 10 μM roztworów roboczych sterylną wodą destylowaną. Podkłady i roztwory robocze można przechowywać w stanie zamrożonym w temperaturze -20 °C do wykorzystania w przyszłości.
- Przygotować dNTP, rozcieńczając zapasy handlowe do roztworu roboczego zawierającego 2 μM każdego dNTP. W celu zminimalizowania liczby cykli zamrażania/rozmrażania, którym poddawane są dNTP, można przygotować zapasy 10 μM każdego dNTP z wyprzedzeniem, 50 μl podwielokrotności umieścić w probówkach mikrowirówek o pojemności 0,5 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C. W razie potrzeby wyjmuje się probówkę o pojemności 10 μM i rozcieńcza do 2 μM każdego dNTP, dodając 200 μl sterylnej wody destylowanej.
- Po rozmrożeniu krótko zwirować, aby wymieszać wszystkie odczynniki, a następnie połączyć zgodnie z tabelą 1. Ważne jest, aby używać polimerazy DNA platyny taq (w przeciwieństwie do zwykłego taq), ponieważ stwierdzono, że wpływa ona na powodzenie reakcji. Zazwyczaj przygotowuje się mieszaninę wzorcową, którą krótko wiruje w celu wymieszania i rozdziela na poszczególne probówki do PCR.
- Zamknij wszystkie probówki do PCR i przejdź do ogólnego stołu roboczego. Dodać matrycę do probówek do PCR, pipetując 2 μl klarownego supernatantu z wcześniej przygotowanych próbek bakteryjnych.
- Przenieś się do dedykowanego miejsca amplifikacji i umieść lampy w termocyklerze zgodnie z następującym protokołem: 94 °C przez 5 minut, a następnie 10 cykli po 94 °C 45 sekund, 65 °C 45 sekund, 72 °C 1,5 min. Po kolejnych 25 cyklach w temperaturze 94 °C 45 s, 52 °C 45 s, 72 °C 2 min nastąpiła 10-minutowa inkubacja w temperaturze 72 °C i zatrzymanie w temperaturze 4 °C.
3. Elektroforeza w żelu agarozowym
(zobacz Lee, P.Y. et al., J. Vis. Exp. (62), e3923, doi:10.3791/3923 (2012) po więcej szczegółów) 11.
Preferowane jest dedykowane miejsce do elektroforezy żelowej. Produkty PCR są uruchamiane na 2,5% żelu agarozowym w 0,5 buforze TBE (110 mM Tris; 90 mM Boranu; 2,5 mM EDTA; pH 8,3).
- Odważyć 2,5 g agarozy i dodać do 100 ml 0,5 x buforu TBE w szklanej kolbie Erlenmeyera. Przykryj kolbę folią spożywczą i gotuj roztwór w kuchence mikrofalowej aż do całkowitego rozpuszczenia. 2,5% żel szybko się wykipi, dlatego przerwij kuchenkę mikrofalową i regularnie mieszaj roztwór.
- Schłodzić agarozę, aż będzie wygodna w dotyku, obracając ją pod zimną wodą lub odpoczywając na ławce przez 5 minut. Wlej agarozę do tacki odlewniczej.
- Wyjąć probówki z termocyklera PCR i przygotować próbki, dodając do każdej próbki 2 μl 6-krotnego barwnika ładującego DNA (40% glicerolu/0,25% błękitu bromofenolowego). Załadować 5-10 μl próbki na studzienkę na żel. Drabina DNA 1 Kb+ lub 100 pz jest odpowiednia dla oczekiwanych rozmiarów prążków.
- Bromek etydyny (EtBr) można dodać do żelu przed jego rozlaniem lub alternatywnie żel można zabarwić w kąpieli EtBr przed wizualizacją. Gotowy żel umieścić w roztworze 0,5 μg/ml EtBr w wodzie destylowanej i delikatnie mieszać na shakerze przez 10 minut. Przenieś żel do czystego pojemnika i odplamiaj w wodzie destylowanej przez kolejne 10 minut.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Zaktualizowana metoda M-PCR pozwala na określenie (sklasyfikowanie) typów SCCmec I-V, a także głównych podtypów SCCmec IV. Test jest skierowany na unikalne i specyficzne loci SCCmec I, II, III, IVa, IVb, IVc, IVd, IVE i V, z jednoczesną detekcją genu mecA. Możliwa jest również wstępna identyfikacja SCCmec VI i VIII, jednak wymagałaby ona dalszych badań w celu potwierdzenia. Rysunek 3 przedstawia reprezentatywne SCCmec I-VI i VIII oraz lokalizacje posz...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisany tutaj test multipleksowy PCR zapewnia prostą, niezawodną metodę klasyfikacji typów i głównych podtypów SCCmec I-V w gronkowcach, przy jednoczesnym rozróżnieniu MRSA od MSSA. Test jest solidny, wygodnie wykonywany w pojedynczej reakcji PCR, a wyniki są łatwe do interpretacji. Test ma ograniczenia polegające na tym, że jest ukierunkowany na poszczególne loci w każdym typieSCC mec , ale nie oferuje kompleksowego typowania kompleksu ccr i mec , a zatem nie może być uważany za złoty...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie stwierdzono konfliktu interesów.
Podziękowania
Dziękujemy T. Ito, K. Hiramatsu, R. Daum, H. de Lencastre i D. Colemanowi za uprzejmy dar w postaci niektórych szczepów referencyjnych użytych w tym badaniu. Prace te były częściowo wspierane finansowo przez Centrum Oporności na Antybiotyki (CAR), Alberta Health Services-Calgary/Calgary Laboratory Services/University of Calgary.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Tryptic Soy Agar | Fisher (BD) | CA90002-700 (236920) | |
| Sterylna woda destylowana | Life Technologies | 10977-015 | |
| Platinum Taq: w tym 10x bufor PCR i 50 mM MgCl2 | Life Technologies | 10966-034 | |
| 100 mM dNTP | Life Technologies | 10297-018 | |
| Tris podstawa | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Kwas borowy | Sigma-Aldrich | B7901 | |
| EDTA | Life Technologies | 15576-028 | |
| Agaroza | Life Technologies | 16500-500 | |
| Glycerol | Life Technologies | 15514-011 | |
| Błękit bromofenolowy | Sigma-Aldrich | B8026 | |
| 1Kb+ drabinka DNA | Life Technologie | 10787-026 | |
| Bromek etydyny | Sigma-Aldrich | E7637 | |
| 1,5 ml Probówki do mikrowirówek | VWR (Axygen Scientific) | 10011-700 | |
| Pałeczki hodowlane | VWR | CA10805-018 | |
| Probówki do PCR | Diamed | AD0210-FCN (nowe #: DIATEC420-1250) | |
| Wirówka | Eppendorf | 5417c | |
| Blok grzewczy | VWR | 13259-030 / 13259-286 | |
| Thermalcycler | Applied Biosystems (2720) | 4359659 | |
| Pozioma, zatapialna komora do elektroforezy żelowej z formą żelową | BioRad | 170-4469 | |
| Zasilacz | BioRad | 164-5050 | |
| Wytrząsarka wahadłowa | VWR | 40000-300 | |
| Molecular Żel do obrazowania Doc System | BioRad | 1708170 |
Bibliografia
- IWG-SCC. Classification of staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec): guidelines for reporting novel SCCmec elements. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (12), 4961-4967 (2009).
- Ito, T., Hiramatsu, K., Tomasz, A., de Lencastre, H., Perreten, V., Holden, M., et al. Guidelines for Reporting Novel mecA Gene Homologues. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 56 (10), 4997-4999 (2012).
- Okuma, K., Iwakawa, K., Turnidge, J. D., Grubb, W. B., Bell, J. M., O'Brien, F. G., et al. Dissemination of new methicillin-resistant Staphylococcus aureus clones in the community. Journal of Clinical Microbiology. 40 (11), 4289-4294 (2002).
- Kondo, Y., Ito, T., Ma, X. X., Watanabe, S., Kreiswirth, B. N., Etienne, J., et al. Combination of multiplex PCRs for staphylococcal cassette chromosome mec type assignment: rapid identification system for mec, ccr, and major differences in junkyard regions. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (1), 264-274 (2007).
- Oliveira, D. C., de Lencastre, H. Multiplex PCR strategy for rapid identification of structural types and variants of the mec element in methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 46 (7), 2155-2161 (2002).
- Milheirico, C., Oliveira, D. C., de Lencastre, H. Update to the multiplex PCR strategy for assignment of mec element types in Staphylococcus aureus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (9), 3374-3377 (2007).
- Milheirico, C., Oliveira, D. C., de Lencastre, H. Multiplex PCR strategy for subtyping the staphylococcal cassette chromosome mec type IV in methicillin-resistant Staphylococcus aureus: 'SCCmec IV multiplex'. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 60 (1), 42-48 (2007).
- Zhang, K., McClure, J. A., Elsayed, S., Louie, T., Conly, J. M. Novel multiplex PCR assay for characterization and concomitant subtyping of staphylococcal cassette chromosome mec types I to V in methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Journal of Clinical Microbiology. 43 (10), 5026-5033 (2005).
- Zhang, K., McClure, J. A., Conly, J. M. Enhanced multiplex PCR assay for typing of staphylococcal cassette chromosome mec types I to V in methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Molecular and Cellular Probes. 26 (5), 218-221 (2012).
- de Lamballerie, X., Zandotti, C., Vignoli, C., Bollet, C., de Micco, P. A one-step microbial DNA extraction method using "Chelex 100" suitable for gene amplification. Research in Microbiology. 143 (8), 785-790 (1992).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J. Vis. Exp. (62), e3923(2012).
- McClure, J. A., Conly, J. M., Elsayed, S., Zhang, K. Multiplex PCR assay to facilitate identification of the recently described Staphylococcal cassette chromosome mec type VIII. Molecular and Cellular Probes. 24 (4), 229-232 (2010).
- Zhang, K., McClure, J. A., Elsayed, S., Conly, J. M. Novel staphylococcal cassette chromosome mec type, tentatively designated type VIII, harboring class A mec and type 4 ccr gene complexes in a Canadian epidemic strain of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (2), 531-540 (2009).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Sprostowanie
Formal Correction: Erratum: Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus
Posted by JoVE Editors on 3/19/2019. Citeable Link.
An erratum was issued for: Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus. There was a typo in Table 1.
In Table 1, the Oligonucleotide sequence for Type III-F5 was updated from:
TTCTCATTGATGCTGAAGCC
To:
GAAACTAGTTATTTCCAACGG
