Czuła i specyficzna metoda ilościowa do oznaczania białka C wiążącego miozynę sercową w surowicy za pomocą elektrochemiluminescencyjnego testu immunologicznego

Summary

Pomiar biomarkerów w złożonych próbkach biologicznych coraz częściej pomaga w podejmowaniu decyzji klinicznych. Opisujemy wysoce czułą metodę jednoczesnego pomiaru białka C wiążącego miozynę sercową, kinazy kreatynowej MB i troponiny sercowej I w próbkach surowicy od osób z zawałem mięśnia sercowego i zdrowych osób z grupy kontrolnej.

Abstract

Biomarkery stają się coraz ważniejsze w podejmowaniu decyzji klinicznych, a także w naukach podstawowych. Diagnozowanie zawału mięśnia sercowego (MI) jest w dużej mierze oparte na wykrywaniu białek specyficznych dla serca w surowicy lub osoczu pacjentów jako wskaźnika uszkodzenia mięśnia sercowego. Po niedawnym wykazaniu, że białko wiążące miozynę sercową-C (cMyBP-C) jest wykrywalne w surowicy po zawale mięśnia sercowego, zaproponowaliśmy je jako potencjalny biomarker zawału serca. Biomarkery są zwykle wykrywane za pomocą tradycyjnych testów immunoenzymatycznych związanych z kanapkami. Jednak ta technika wymaga dużej objętości próbki, ma mały zakres dynamiki i może mierzyć tylko jedno białko na raz.

Tutaj pokazujemy multipleksowy test immunologiczny, w którym trzy białka serca mogą być mierzone jednocześnie z wysoką czułością. Pomiar cMyBP-C w uniplexie lub razem z kinazą kreatynową MB i troponiną sercową wykazał porównywalną czułość. Technika ta wykorzystuje metodę Meso Scale Discovery (MSD) polegającą na multipleksowaniu na 96-dołkowej płytce w połączeniu z elektrochemiluminescencją w celu detekcji. Chociaż wymagane są tylko małe objętości próbek, uzyskuje się wysoką czułość i duży zakres dynamiki. Korzystając z tej techniki, zmierzyliśmy poziom cMyBP-C, kinazy kreatynowej MB i troponiny sercowej I w próbkach surowicy od 16 osób z zawałem mięśnia sercowego i porównaliśmy wyniki z 16 osobami kontrolnymi. Byliśmy w stanie wykryć wszystkie trzy markery w tych próbkach i stwierdziliśmy, że wszystkie trzy biomarkery są zwiększone po zawale mięśnia sercowego. Technika ta jest zatem odpowiednia do czułego wykrywania biomarkerów serca w próbkach surowicy.

Introduction

Pomiar małych ilości białka w złożonych próbkach biologicznych, takich jak surowica, ma coraz większe znaczenie kliniczne dla leczenia pacjentów, jak również dla nauk podstawowych. Na przykład wzrost poziomu biomarkerów sercowych w surowicy, takich jak troponina I, w warunkach klinicznych jest zgodny z ostrym zawałem mięśnia sercowego (MI)¹. Do wykrywania białek w próbkach surowicy najczęściej stosowaną techniką jest standardowy test immunoenzymatyczny (ELISA), ponieważ ma wysoką czułość i pozwala na bezwzględną kwantyfikację analitu. Jednak tradycyjne testy ELISA wymagają stosunkowo dużej ilości próbki (zwykle 100 μl), mają wysoki sygnał tła w niektórych płynach biologicznych i są ograniczone do pomiaru tylko jednego analitu na test ELISA².

Niedawno wprowadzono nową technikę testów immunologicznych, która pozwala obejść wiele z tych wad. Ten zmodyfikowany test, opracowany przez MSD, wykorzystuje elektrochemiluminescencję (ECL) do wykrywania sygnału, co pozwala na uzyskanie bardzo niskiego tła i zwiększonej czułości, umożliwiając wykorzystanie małych objętości próbek. Elektrochemiluminescencja opiera się na cząsteczce reporterowej rutenu (II) trisbipirydalu, która jest przyłączona do przeciwciał wykrywających. Ta cząsteczka reporterowa emituje światło o długości fali 620 nm po elektrycznej stymulacji dna 96-dołkowej płytki, która ma zintegrowane elektrody węglowe³. Ponadto, dzięki zastosowaniu powlekania punktowego, wiele przeciwciał wychwytujących można pokryć w jednym dołku (do 10 na płytce 96-dołkowej), co pozwala na jednoczesną kwantyfikację różnych białek w jednej próbce⁴. Technika ta została ostatnio wykorzystana do pomiaru profili cytokin prozapalnych w surowicy^5,6. Płytki multipleksowe firmy MSD wypadają korzystnie w porównaniu z innymi platformami testowymi^{multipleksów 7}.

Używając MSD jako głównej platformy testowej, opracowaliśmy niestandardową płytkę 3-plex, która może jednocześnie określać ilościowo poziom białka C wiążącego miozynę sercową (cMyBP-C), kinazy kreatynowej MB (CK-MB) i troponiny sercowej I (cTnI), a wyniki zostały porównane z wykrywaniem cMyBP-C za pomocą monopleksu. CK-MB i cTnI są dobrze znanymi biomarkerami zawału serca. Jednak wzrost tych biomarkerów może być spowodowany patologiami innymi niż zawał mięśnia sercowego, np. zapaleniem mięśnia sercowego lub niewydolnością nerek⁸. Przemawia to za dodaniem dodatkowych biomarkerów w celu zwiększenia swoistości diagnozy zawału serca. Niedawno wykazaliśmy, że cMyBP-C jest również potencjalnym biomarkerem dla MI⁹. cMyBP-C jest białkiem związanym z grubym włóknem^{, które} ulega ekspresji w sercu, ale nie w mięśniach szkieletowych lub gładkich. Tak więc zwiększony poziom cMyBP-C w układzie krążenia jest specyficznym wskaźnikiem uszkodzenia serca¹³.

W tym badaniu porównaliśmy wykrywanie cMyBP-C metodą uniplex z użyciem niestandardowego testu 3-plex do pomiaru poziomu cMyBP-C, CK-MB i cTnI w surowicy pacjentów z zawałem mięśnia sercowego. W przyszłości ta charakterystyczna technika może być wykorzystywana do diagnozowania zawału mięśnia sercowego u pacjentów zgłaszających się z bólem w klatce piersiowej na izbie przyjęć.

Komisja rewizyjna instytucji (IRB) Uniwersytetu Loyola w Chicago zatwierdziła badanie do użycia niezidentyfikowanych próbek ludzkich i użycia testu immunologicznego (LU# 20392).

Protocol

1. Test Uniplex cMyBP-C

1. Dzień przed eksperymentem pokryj 96-dołkową płytkę wzorcową MSD przeciwciałem wychwytującym. W przypadku cMyBP-C należy użyć 30 μl mysiego przeciwciała monoklonalnego anty-cMyBP-C (bez żelatyny) o stężeniu 5 μg/ml rozcieńczonego w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
2. Ponieważ studzienka jest hydrofobowa, odpipetuj roztwór do dolnego rogu studzienki, a następnie postukaj w boki płytki, aby rozprowadzić roztwór po całej studzience.
3. Płytkę pokrywa się zgrzewarką do płytek i inkubuje O/N w temperaturze 4 °C bez wstrząsania.
4. Usuń roztwór przeciwciała wychwytującego, wystukując roztwór nad zlewem, a następnie na stos ręczników papierowych. Niespecyficzne wiązanie z płytką blokuje się przez dodanie 150 μl 5% (w/v) roztworu blokera A (wysokiej jakości BSA) w PBS do każdego dołka.
5. Uszczelnić płytkę i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, wytrząsając z prędkością 700 obr./min.
6. Na etapie blokowania należy przygotować wzorce i próbki. Wykonać serię wzorcową, rozcieńczając rekombinowany fragment białka cMyBP-C (aminokwasy 1 - 271) do początkowego stężenia 2 000 ng / ml w 1% (w/v) blokerze A/PBS. Następnie należy seryjnie rozcieńczyć w stosunku 5 do 1% (w/v) bloker A/PBS. Łącznie użyto 7 wzorców + 1 ślepą próbę (sam bloker A/PBS 1% (w/v)).
7. Usunąć roztwór blokujący i przemyć płytkę 3x 150 μl 0,05% (v/v) Tween-20/PBS. Za każdym razem usuń roztwór myjący, odwracając talerz nad zlewem. Po trzecim etapie mycia energicznie przesuń talerz nad zlew i energicznie poklep talerz o warstwę ręczników papierowych, aż całkowicie wyschnie. Jest to kluczowy krok, ponieważ objętości inkubacji są małe, a pozostały roztwór do mycia znacznie rozcieńczy następną inkubację.
8. Odpipetować 25 μl wzorców i próbek do studzienek. Uszczelnić płytkę i inkubować w temperaturze pokojowej, wytrząsając z prędkością 700 obr./min przez 1 godzinę.
9. Przygotować roztwór przeciwciała wykrywającego o stężeniu 1 μg/ml w 1% blokerze A/PBS. Jako przeciwciało wykrywające służy wykonane na zamówienie przeciwciało cMyBP-C (aminokwasy epitopowe 2 - 14) ze znakowaniem MSD SULFO-TAG. Dostępne są zestawy do znakowania SULFO-TAG, dzięki czemu znakowanie dowolnego przeciwciała jest stosunkowo prostą procedurą.
10. Powtórz krok prania zgodnie z opisem w kroku 1.4.
11. Dodać 25 μl roztworu przeciwciała wykrywającego do każdej studzienki, uszczelnić płytkę i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę na wytrząsarce płytek ustawionej na 700 obr./min.
12. W okresie inkubacji uruchom płytkę demonstracyjną MSD (płytkę z diodami LED), aby zapewnić prawidłowe działanie Sector Imager i oprogramowania (patrz rozdział Odczynnik). Należy również rozcieńczyć bufor do odczytu, który jest dostarczany przez MSD, dodając 5 ml 4x buforu do odczytu do 15 ml wody destylowanej.
13. Powtórz krok prania zgodnie z opisem w kroku 1.4.
14. Dodać 150 μl bufora do odczytu do każdego dołka za pomocą pipety wielokanałowej. Należy unikać pęcherzyków powietrza (odpowiednią metodą jest pipetowanie odwrotne). Po dodaniu bufora odczytu należy natychmiast zeskanować płytę w programie Sector Imager.

2. Test 3-plex cMyBP-C, CK-MB i cTnI

1. 96-dołkową płytkę 3-plex i roztwory rozcieńczalnika pozostawia się do zrównoważenia do RT przed użyciem. Ta płytka jest wstępnie pokryta przeciwciałami wychwytującymi dla cMyBP-C, CK-MB i cTnI przez MSD.
2. Dodać 25 μl 1% (w/v) blokera A/PBS do każdego dołka. Postukaj w boki płytki, aby upewnić się, że cała studzienka jest pokryta roztworem.
3. Uszczelnij płytkę zgrzewarką do płyt, umieść płytkę na wytrząsarce do płyt i potrząsaj z prędkością 700 obr./min przez 30 minut.
4. W międzyczasie przygotowywana jest seria rozcieńczeń poszczególnych kalibratorów. Ponieważ każda studzienka ma trzy przeciwciała wychwytujące, trzy kalibratory muszą być zmieszane i seryjnie rozcieńczone przed użyciem. Rozcieńczyć rekombinowane cMyBP-C, CK-MB (MSD) i cTnI (MSD) razem w 1% (w/v) blokerze A/PBS, aby utworzyć jedną próbkę z 2,000 ng / ml cMyBP-C, 100 ng / ml CK-MB i 25 ng / ml cTnI (próbka A).
5. Dla każdego wzorca przygotowuje się końcową objętość co najmniej 100 μl. Aby ukończyć serię standardową, należy seryjnie rozcieńczyć próbki o współczynnik 5. Użyj 25 μl próbki A w 100 μl 1% (w/v) blokera A/PBS, aby utworzyć próbkę B. Następnie użyj 25 μl próbki B w 100 μl 1% (w/v) blokera A/PBS, aby utworzyć próbkę C i tak dalej. Próbki ludzkiej surowicy od 16 osób z zawałem mięśnia sercowego i 16 osób kontrolnych wykorzystano do pomiaru poziomów cMyBP-C, CK-MB i cTnI. Próbki te rozcieńczono 2x w 1% (w/v) blokerze A/PBS.
6. Dodać 25 μl wzorców i rozcieńczonych próbek do 25 μl już obecnych w studzienkach płytki 3-plex. Ważne jest, aby dołączyć ślepą próbę (tylko rozcieńczalnik). Aby ustalić technikę, próbki są ładowane w trzech egzemplarzach technicznych. W przeciwnym razie wystarczą duplikaty.
7. Ponownie uszczelnić płytkę (można ponownie użyć zgrzewarki do płytek) i inkubować na wytrząsarce płytek (700 obr./min) w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.
8. Tuż przed zakończeniem inkubacji przygotowuje się roztwór przeciwciała detekcyjnego. Stosowany rozcieńczalnik to 1% (w/v) bloker A w PBS. Wszystkie trzy przeciwciała detekcyjne znakowane sulfo rozcieńcza się razem do końcowego stężenia 1 μg/ml każde. Przeciwciała detekcyjne są zwykle dostarczane przy 50-krotnym stężeniu podstawowym.
9. Do sporządzenia pełnej płytki 96-dołkowej potrzeba 2 700 μl całkowicie rozcieńczonego roztworu (z uwzględnieniem błędu pipetowania). Dodać 54 μl każdego przeciwciała wykrywającego do 2,538 μl 1% (w/v) blokera A/PBS.
10. Po 2 godzinach usuń roztwory, energicznie przesuwając talerz nad zlewem. Przemyć studzienki 3x 150 μl 0,05% Tween-20 w PBS. Dodać 25 μl roztworu przeciwciała detekcyjnego do każdej studzienki za pomocą pipety wielokanałowej, a boki płytki należy postukać, aby upewnić się, że cała studzienka jest pokryta roztworem.
11. Uszczelnij płytkę i inkubuj przez 1 godzinę, wytrząsając z prędkością 700 obr./min.
12. W okresie inkubacji uruchom płytkę demonstracyjną MSD (płytkę z diodami LED), aby zapewnić prawidłowe działanie Sector Imager i oprogramowania. Rozcieńczyć również bufor do odczytu, który jest dostarczany przez MSD, dodając 5 ml 4x buforu do odczytu do 15 ml wody destylowanej.
13. Powtórz krok prania opisany w kroku 2.8.
14. Dodać 150 μl bufora do odczytu do każdego dołka za pomocą pipety wielokanałowej. Unikanie pęcherzyków powietrza ma kluczowe znaczenie (odpowiednią metodą jest pipetowanie wsteczne). Po dodaniu bufora odczytu należy natychmiast zeskanować płytę w programie Sector Imager.

Results

Podstawowe zasady i przebieg testu 3-plex są pokazane na rysunku 1, a ogólny przebieg pracy jest opisany w Tabeli 1. Testy Uniplex działają na tej samej zasadzie, z wyjątkiem tego, że cała studzienka dolna jest pokryta jednym przeciwciałem wychwytującym. Wykrywanie sygnału odbywa się za pomocą ECL, w którym sygnał elektryczny jest doprowadzany do dna studni. To z kolei inicjuje lokalną produkcję światła poprzez reakcję chemiczną bufora odczytu z etykietą SULFO-TAG na przeciwciałie detekc...

Discussion

W tym badaniu pokazujemy możliwość zastosowania multipleksowego testu immunologicznego do wykrywania wielu biomarkerów sercowych w surowicy pacjentów. Technika ta ma wiele zalet w porównaniu z tradycyjnym testem ELISA. Po pierwsze, ECL w zestawie testowym jest używany zamiast wykrywania kolorymetrycznego. W ECL sygnał elektryczny stymuluje lokalną produkcję mierzonej właściwości (światła), odłączając w ten sposób zdarzenie stymulacji od sygnału, co zmniejsza tło¹⁴. Pozwala to na uzyskanie wysokiej czułości, co...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reodczynniki
MSD Read-Buffer T (4X) z surfaktantem	Meso Scale Discovery	R92TC-2
Tween-20	Acros	9005-64-5
MSD Blocker Odkrycie	skali mezo	R93BA-1
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami, 10X	Fisher BioReagents	BP399-4	Filtruj przed użyciem
Przeciwciało C wiążące białko wiązania miozyny, monoklonalne myszy (E7), wolne od żelatyny	Santa Cruz	SC-137180L	Do powlekania przeciwciało musi być wolne od
Płytki i sprzęt
Multi-Array 96-dołkowa standardowa płytka	Mezo Scale Discovery	L15XA-3
Prototypowa 3-pleksowa, czteropunktowa, 96-dołkowa płytka z cMyBP-C, cTnI i CK-MB	Meso Scale	Discovery N452A-1
Folia uszczelniająca ThermaSeal Produkty	Life Science Inc.	ST-3098
MSD SECTOR Imager 2400A		w skali mezo
Cyfrowa wytrząsarka do mikromiareczkowania MTS 2/4	IKA	3208001