Artykuł metodologiczny

Hodowla i utrzymanie Clostridium difficile w środowisku beztlenowym

40K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50787

⸱

14 września 2013

 ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, Emory University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Clostridium difficile to bakteria chorobologiczna, która jest ściśle beztlenowca i powoduje biegunkę związaną z antybiotykami (AAD). Opisano tu metody izolacji, hodowli i utrzymania komórek wegetatywnych i zarodników C. difficile. Techniki te wymagają komory beztlenowej, która wymaga regularnej konserwacji w celu zapewnienia odpowiednich warunków do optymalnej uprawy C. difficile.

Streszczenie

Clostridium difficile to Gram-dodatnia, beztlenowa, sporogenna bakteria, która jest przede wszystkim odpowiedzialna za biegunkę antybiotykową (AAD) i jest znaczącym patogenem szpitalnym. C. Difficile jest niezwykle trudny do wyizolowania i uprawy i jest niezwykle wrażliwy nawet na niski poziom tlenu w środowisku. W tym miejscu przedstawiono metody izolowania C. difficile z próbek kału, a następnie hodowli C. difficile w celu przygotowania zapasów glicerolu do długotrwałego przechowywania. Opisano również techniki przygotowywania i liczenia stad zarodników w laboratorium do różnych dalszych zastosowań, w tym mikroskopii i badań na zwierzętach. Techniki te wymagają komory beztlenowej, która utrzymuje stałe środowisko beztlenowe, aby zapewnić odpowiednie warunki dla optymalnego C. trudny wzrost. Zapewniamy protokoły przenoszenia materiałów do i z komory bez powodowania znacznego zanieczyszczenia tlenem wraz z sugestiami dotyczącymi regularnej konserwacji wymaganej do utrzymania odpowiedniego środowiska beztlenowego dla wydajnego i spójnego C. Uprawa difficile.

Wprowadzenie

Clostridium difficile to Gram-dodatnia, przetrwalnikowa bakteria, która jest obowiązkowym beztlenowcem i potencjalnie śmiertelnym patogenem przewodu pokarmowego dla ludzi i zwierząt. Początkowo opisany w 1935 roku jako organizm komensalny znaleziony w próbkach kału od noworodków1, później wykazano, że C. difficile jest czynnikiem sprawczym rzekomobłoniastego zapalenia jelita grubego związanego z leczeniem antybiotykami2. Zakażenia C. difficile (CDI) są zwykle poprzedzone antybiotykoterapią, która powoduje zakłócenie normalnej flory okrężnicy, tworząc niszę dla rozwoju C. difficile 2. C. difficile jest przenoszony jako uśpiony zarodnik drogą fekalno-oralną, a następnie kiełkuje w przewodzie pokarmowym, wytwarzając komórki wegetatywne zdolne do wytwarzania kilku toksyn i powodując ciężką chorobę i zapalenie jelita grubego3. CDI są często oporne na konwencjonalne metody leczenia, a infekcje te często nawracają4. W rezultacie, CDI są odpowiedzialne za do 4,8 miliarda dolarów kosztów opieki zdrowotnej w Stanach Zjednoczonych5-7.

C. Difficile jest bardzo wrażliwy nawet na niski poziom tlenu w środowisku. Aby C. difficile przetrwała w środowisku i mogła być skutecznie przenoszona z gospodarza na żywiciela, kluczowe znaczenie ma utworzenie metabolicznie nieaktywnych zarodników8. Ponieważ laboratoryjne utrzymanie i manipulowanie C. difficile wymaga kontrolowanego, beztlenowego środowiska, techniki te wymagają użycia komory beztlenowej. Zastosowanie komór beztlenowych doprowadziło do zwiększonego odzysku i izolacji obligatoryjnych beztlenowców9-11 oraz umożliwiło przeprowadzenie szeregu technik molekularnych w atmosferze beztlenowej.

Oprócz C. difficile, opisane tutaj użytkowanie i utrzymanie w komorze beztlenowej mają zastosowanie do innych obligatoryjnych beztlenowców, takich jak inne gatunki Clostridium (np. C. perfringens), inne gatunki przewodu pokarmowego (np. gatunki Bacteroides 12) i patogeny przyzębia (np. gatunki Peptostreptococcus 13).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Uwaga: C. difficile to ludzki i zwierzęcy patogen, który może powodować choroby żołądkowo-jelitowe. Doświadczenia z udziałem C. difficile muszą być przeprowadzane z zachowaniem odpowiednich środków ostrożności bezpieczeństwa biologicznego (BSL-2).

1. Użytkowanie i konserwacja komory beztlenowej

C. difficile jest ściśle beztlenowcowym i jest niezwykle wrażliwy nawet na niskie stężenia tlenu w atmosferze. Dlatego do jego skutecznej manipulacji potrzebne jest kontrolowane, beztlenowe środowisko. Zastosowanie komory beztlenowej (ryc. 1A) zapewnia najbardziej stabilne środowisko i idealne warunki do efektywnej hodowli C. difficile i innych bakterii beztlenowych14. W tym przypadku atmosfera zawierająca mieszaninę gazów (5% CO2, 10% H2, 85% N2) może być stabilnie utrzymywana.

Aby wprowadzić jakiekolwiek przedmioty do komory bez znacznego zanieczyszczenia tlenem, należy użyć śluzy powietrznej (Rysunek 1B). Urządzenie to pełni funkcję wymiany gazu i działa automatycznie, półręcznie lub ręcznie. Śluza powietrzna posiada dwoje drzwi: jedne zapewniają dostęp na zewnątrz śluzy, a drugie zapewniają dostęp do wnętrza komory beztlenowej. W zależności od modelu, śluza może mieć dodatkowe drzwi, które mogą oferować dostęp do przylegającej komory beztlenowej, oszczędzając w ten sposób koszt oddzielnej śluzy. O ile nie przenosisz aktywnie przedmiotów do lub z komory, oba drzwi powinny pozostać zamknięte przez cały czas, aby uniknąć zanieczyszczenia tlenem. Śluza posiada włącznik/wyłącznik z przodu oraz panel zawierający cztery przyciski. Przewody gazowe i wąż pompy próżniowej są podłączone z tyłu śluzy, w pobliżu panelu, na którym znajdują się przełączniki do pełnej ręcznej obsługi urządzenia. Zaleca się zastosowanie dwóch cykli przedmuchiwania przy użyciu gazowego azotu (N2) przed napełnieniem wymiennika mieszanką gazów (5% CO2 , 10 % H2, 85 % N2) w celu zmniejszenia ilości tlenu wprowadzanego do komory. Ważne jest również, aby nigdy nie pozostawiać otwartych drzwi na dłużej niż czas wymagany do wprowadzenia i wyjęcia przedmiotów z węzła wymiany oraz starannie zaplanować eksperymenty w celu zmniejszenia częstotliwości wprowadzania i wyjmowania przedmiotów z komory. Poniżej przedstawiono różne procedury operacyjne dla komór anaerobowych z winylu. Przed wykonaniem tych protokołów upewnij się, że są one zgodne z instrukcjami producenta dostarczonymi z komorą.

  1. Tryb automatyczny
    Jest to tryb programowalny i konfigurowalny, który jest wykonywany w całości przez śluzę powietrzną. Aby zaprogramować śluzę, zapoznaj się z instrukcjami producenta. Zalecany program dla typowego wejścia do komory obejmuje dwa cykle przedmuchiwania przy użyciu gazowego azotu, a następnie ponowne napełnienie śluzy mieszanką gazów, która ściśle odpowiada atmosferze utrzymywanej w komorze. Podczas każdego cyklu próżniowego standardowe procedury fabryczne sugerują podciśnienie do 20 inHg i przedmuchiwanie do 1 inHg.
    1. Upewnij się, że wewnętrzne drzwi śluzy są całkowicie zamknięte.
    2. Otwórz zewnętrzne drzwi śluzy.
    3. Umieść przedmioty w śluzie powietrznej i zamknij zewnętrzne drzwi śluzy. W przypadku wprowadzania płynów należy odkręcić nakrętki do połowy, aby zapewnić sprawną wymianę gazową. Zapieczętowane opakowania i pojemniki należy otworzyć przed rozpoczęciem cyklu; Powstrzymanie się od tego może wypaczyć i uszkodzić plastikowe naczynia i pojemniki. Aby zachować sterylność, otwórz opakowania na tyle, aby umożliwić tylko wydajną wymianę gazową.
    4. Naciśnij przycisk Start.
    5. Poczekaj, aż śluza przejdzie przez program, a na wyświetlaczu pojawi się "Anerobowy".
    6. Otwórz wewnętrzne drzwi śluzy.
    7. Przenieś przedmioty do komory.
    8. Zamknij drzwi wewnętrzne.
  2. Tryb półręczny
    Ten tryb może być używany podczas przenoszenia przedmiotów do lub z komory i jest niezbędny, gdy wymagany jest cykliczny przepływ gazu w komorze.
    1. Upewnij się, że wewnętrzne drzwi śluzy są całkowicie zamknięte.
    2. Otwórz zewnętrzne drzwi śluzy.
    3. Umieść przedmioty w śluzie powietrznej i zamknij zewnętrzne drzwi śluzy. W przypadku wprowadzania płynów należy odkręcić nakrętki do połowy, aby zapewnić sprawną wymianę gazową. Zapieczętowane opakowania, takie jak pętle inokulacyjne i płytki 96-dołkowe, muszą zostać otwarte przed rozpoczęciem cyklu.
    4. Naciśnij przycisk Menu.
    5. Naciśnij przycisk Start. Śluza powietrzna wyświetli funkcję każdego przycisku i nie odpowie, dopóki nie zostanie to zakończone:
      • Strzałka w górę: aktywuje pompę próżniową.
      • Strzałka w dół: inicjuje przepływ azotu (przedmuchiwanie).
      • Start: inicjuje przepływ mieszanki gazów.
      • Menu: powrót do domyślnego wyświetlania.
    6. Naciśnij "W górę", usuwając gaz ze śluzy, aż na wyświetlaczu pojawi się 20 inHg.
    7. Naciśnij "W dół", napełniając śluzę azotem, aż na wyświetlaczu pojawi się mniej niż 1 inHg. Nie przestrzeliwuj, ponieważ spowoduje to wytworzenie nadciśnienia w śluzie, co może wpłynąć na jej integralność.
    8. Powtórz kroki 6 i 7, aby wykonać dodatkowy cykl przedmuchiwania.
    9. Naciskaj "W górę", aż na wyświetlaczu pojawi się 20 inHg.
    10. Naciśnij "Start", napełniając węzeł mieszanką gazową, aż na wyświetlaczu pojawi się mniej niż 1 inHg.
    11. Otwórz wewnętrzne drzwi śluzy.
    12. Przenieś przedmioty do komory.
    13. Zamknij drzwi wewnętrzne.
  3. Tryb ręczny
    Ten tryb może być używany, gdy nie działa tryb automatyczny lub półręczny lub nie ma zasilania śluzy. Ten tryb nie działa, gdy śluza powietrzna jest włączona; Dlatego trudno jest określić ciśnienie w śluzie. Ponieważ czas podciśnienia i przedmuchiwania gazem zależy odpowiednio od natężenia podciśnienia i przepływu gazu, wymagane jest użycie manometru w wymienniku w celu monitorowania ciśnienia i zmniejszenia ryzyka obrażeń ciała i uszkodzenia śluzy.
    1. Upewnij się, że wewnętrzne drzwi śluzy są całkowicie zamknięte.
    2. Otwórz zewnętrzne drzwi śluzy.
    3. Umieść przedmioty, w tym manometr, w śluzie powietrznej i zamknij zewnętrzne drzwi śluzy. W przypadku wprowadzania płynów należy odkręcić nakrętki do połowy, aby zapewnić sprawną wymianę gazową. Zapieczętowane opakowania, takie jak pętle inokulacyjne i płytki 96-dołkowe, muszą zostać otwarte przed rozpoczęciem cyklu.
    4. Znajdź trzy przełączniki z tyłu śluzy powietrznej oznaczone "Przełączniki sterowania ręcznego". Są one indywidualnie oznaczone jako:
      • Odkurzać
      • azot
      • Mieszanka gazów
    5. Przestaw przełącznik Do podciśnienia, aż manometr wskaże około 20 inHg.
    6. Przestaw przełącznik azotu, aż manometr wskaże około 1 inHg.
    7. Przestaw przełącznik Do podciśnienia, aż manometr wskaże około 20 inHg.
    8. Przestaw przełącznik azotu, aż manometr wskaże około 1 inHg.
    9. Przestaw przełącznik Do podciśnienia, aż manometr wskaże około 20 inHg.
    10. Przestaw przełącznik Gas Mix, aż manometr wskaże około 1 inHg.
    11. Otwórz wewnętrzne drzwi śluzy.
    12. Przenieś przedmioty do komory.
    13. Zamknij drzwi wewnętrzne.

2. Hodowla, liczenie i przechowywanie C. difficile z próbek kału

Ta procedura ma na celu odzyskanie C. difficile z próbek kału zawierających zarodniki, a następnie utrzymanie izolowanych kolonii jako komórek wegetatywnych lub zarodników w długoterminowym przechowywaniu jako zapasy glicerolu. Alternatywnie, procedura ta może być stosowana do wyliczenia liczby C. difficile obecnych w próbkach kału (np. z badań na zwierzętach). Aby selektywnie i różnicowo wzbogacić C. difficile, stosuje się agar taurocholat-cefoksytyna-cykloseryna-fruktoza (TCCFA) w celu zahamowania wzrostu normalnej flory kałowej15-16. Cykloseryna jest bakteriostatyczna dla bakterii Gram-ujemnych, podczas gdy cefoksytyna w szerszym zakresie hamuje wzrost zarówno bakterii Gram-ujemnych, jak i -dodatnich, z wyjątkiem C. difficile i większości szczepów wkopaków. Wskaźnik pH, neutralny czerwony, może być włączony do pożywki, ponieważ fermentacja fruktozy spowoduje spadek pH, a następnie zmianę koloru z czerwonego/pomarańczowego na żółty. Aby skutecznie odzyskać zarodniki C. difficile jako bakterie wegetatywne, taurocholan sodu z soli żółciowej stosuje się do indukcji kiełkowania17-18. Ponieważ C. difficile tworzy przetrwalniki, alkohol lub obróbka cieplna próbek może być stosowana w celu zmniejszenia lub wyeliminowania komórek wegetatywnych, ograniczając wzrost zanieczyszczającej flory, co może zwiększyć skuteczność odzyskiwania C. difficile 19. Jak wspomniano powyżej, bardzo ważne jest, aby przed użyciem wstępnie zredukować wszystkie płytki przez co najmniej 1-2 godziny w komorze beztlenowej, aby zapewnić usunięcie resztek tlenu. Suszenie płyt powietrzem przed użyciem w komorze może zmniejszyć kondensację. Ciekłe medium może potrzebować do 24 godzin, aby się zredukować, w zależności od objętości i stosunku powierzchni do powietrza użytego pojemnika.

Przed rozpoczęciem należy umieścić w komorze beztlenowej następujące przedmioty:

  • Próbka kału
  • Sterylne waciki
  • Sterylne pętle inokulacyjne
  • 1x PBS (patrz Materiały)
  • Płyty TCCFA (patrz Materiały)
  • BHIS (pożywka do naparu serca mózgu z ekstraktem drożdżowym) talerze i bulion (patrz Materiały)
  • 50% glicerol (sterylizowany)
  • 10% L-cysteiny (sterylizowanej)
  • Fiolki do przechowywania kriogenicznego

*Alternatywnie, izolowane kolonie można rozprowadzić na płytkach agarowych BHIS, a następnie zeskrobać i ponownie zawiesić w płynnym podłożu BHIS z 15% glicerolem do długotrwałego przechowywania w temperaturze -80°C. **Należy zauważyć, że barwienie metodą Grama nie jest skuteczną strategią identyfikacji C. difficile bezpośrednio z próbek kału23; C. difficile musi być najpierw odizolowany od pozostałej flory obecnej w kale.

  1. Ponownie zawiesić próbkę kału w 1x PBS (można to zrobić w warunkach tlenowych) i upewnić się, że próbka kału jest całkowicie zawieszona w 1x PBS przez wirowanie. W przypadku wyliczania C. difficile z kału, należy zważyć próbkę kału przed dodaniem 1x PBS.
  2. Wykonać seryjne rozcieńczenia zawieszonej próbki kału w 1x PBS w celu odpowiedniej izolacji lub wyliczenia jednostek tworzących kolonie (CFU) na gram stolca.
  3. Stosując technikę aseptyczną, nanieść 100 μl każdego seryjnego rozcieńczenia na płytki TCCFA.
  4. Używając serii sterylnych pętli zaszczepiających, rozprowadź zastosowaną kulturę dla izolowanych kolonii lub równomiernie rozprowadź zastosowaną kulturę na powierzchni płytki TCCFA w celu zliczenia kolonii.
  5. Inkubować płytkę beztlenowo przez 48 godzin w temperaturze 37 °C. Możliwe jest wykrycie i zidentyfikowanie kolonii C. difficile w ciągu 24 godzin na podstawie płaskiego, nieregularnego, zmielonego wyglądu kolonii15, chociaż dokładniejszą identyfikację i liczenie uzyskuje się po 48 godzinach.
  6. Używając sterylnych pętli zaszczepiających, posadź wszystkie kolonie, które wydają się być C. difficile, na wstępnie zredukowanych płytkach agarowych BHIS, uzupełnionych 0,03% L-cysteiną20. Wybierz pojedynczą kolonię i rozprowadź smugi na płytce w ćwiartkach, używając nowej sterylnej pętli zaszczepiającej dla każdej ćwiartki, aby uzyskać izolowane kolonie. Alternatywnie, należy policzyć kolonie C. difficile w każdym rozcieńczeniu (można to przeprowadzić w warunkach tlenowych) i obliczyć liczbę jednostek tworzących kolonie na gram próbki kału.
  7. Potwierdzić identyfikację C. difficile za pomocą barwienia metodą Grama. Po barwieniu metodą Grama C. difficile pojawi się jako fioletowe pręciki, a niektóre komórki mogą zawierać końcowe przetrwalniki. Identyfikacja genów kodujących toksynę B za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) może dostarczyć dalszego potwierdzenia toksycznych szczepów C. difficile21, podczas gdy typowanie sekwencji wielolocus (MLST) jest skuteczne w identyfikacji i dokładnym typowaniu nieznanych i nietoksycznych szczepów C. difficile22.
  8. Aby utrzymać zapas C. difficile w temperaturze -80 °C, należy pobrać indywidualną, wyizolowaną kolonię z płytki agarowej BHIS za pomocą sterylnej pętli zaszczepiającej i ponownie zawiesić kolonię w 10 ml wstępnie zredukowanej płynnej pożywki BHIS uzupełnionej 0,03% L-cysteiną.*
  9. Inkubować przez noc w stanie beztlenowym w temperaturze 37 °C lub do momentu, gdy kultura stanie się mętna.
  10. Dodać 333 μl 50% glicerolu i 666 μl kultury C. difficile do 1,8 ml probówki kriogenicznej, aby utworzyć 15% zapas glicerolu w izolowanym szczepie.
  11. Szczelnie zakryj probówkę kriogeniczną, dobrze wymieszaj i natychmiast wyjmij bulion z komory beztlenowej i umieść w zamrażarce o temperaturze -80 °C do długotrwałego przechowywania.

3. Hodowla C. difficile z mrożonych zapasów glicerolu

Procedura ta przewiduje odzysk C. difficile z zapasów glicerolu przechowywanych w temperaturze -80 °C. Ponieważ powtarzające się cykle zamrażania i rozmrażania mogą zabijać komórki wegetatywne, ważne jest, aby zapasy glicerolu były zawsze zamrożone. Nie zalecamy używania suchego lodu do przenoszenia szczepów do i z komory, ponieważ odparowanie suchego lodu może zmienić środowisko w komorze. Zamiast tego zalecamy używanie zamrożonych stojaków chłodzących, aby zapasy glicerolu były zamrożone podczas transportu. Do różnych celów selektywnych i różnicowych do hodowli C. difficile powszechnie stosuje się trzy podłoża. TCCFA, jak omówiono powyżej, jest selektywny dla C. difficile i zawiera taurocholan sodu, substancję kiełkującą. Napar z mózgu i serca uzupełniony ekstraktem drożdżowym (BHIS) jest powszechnie stosowaną, wzbogaconą, nieselektywną pożywką, która pozwala na wzrost szerokiej gamy organizmów (ryc. 2A)24. Często L-cysteina jest dodawana do BHIS jako środek redukujący20. Wreszcie, dodanie krwi do pożywki (ryc. 2B) pozwala na bardziej efektywne zarodnikowanie niż w przypadku TCCFA i zapewnia wykrycie unikalnej zielonkawej lub chartreuse fluorescencji wykazywanej przez C. difficile w długofalowym świetle ultrafioletowym (UV)15 (ryc. 2C). Podczas hodowli C. difficile z zarodników należy pamiętać, że taurocholan sodu musi być dodany do pożywki, aby zapewnić kiełkowanie.

Przed rozpoczęciem należy umieścić w komorze beztlenowej następujące przedmioty:

  • Zamrożony bulion glicerolowy (w stojaku chłodzącym)
  • Sterylne pętle inokulacyjne
  • Tabliczki TCCFA lub BHIS (patrz Materiały)
  • Rosół BHIS (patrz Materiały)
  • 50% glicerol (sterylizowany)
  • Fiolki do przechowywania kriogenicznego
  1. Zamrożony zapas glicerolu C. difficile umieścić w stojaku chłodzącym, który był przechowywany w temperaturze -80 °C przed użyciem, aby zapobiec rozmrożeniu.
  2. Wprowadzić zamrożony bulion glicerolowy na suchym lodzie do komory beztlenowej.
  3. Stosując technikę aseptyczną i sterylną pętlę zaszczepiającą, umieść niewielką ilość bulionu na płytce i rozprowadź smugę w poprzek jednej ćwiartki płytki.
  4. Obrócić płytkę o 90° i, używając nowej sterylnej pętli do zaszczepiania, kontynuować przesuwanie smugi w poprzek drugiego kwadrantu.
  5. Powtórz dla trzeciej i czwartej ćwiartki, aby zapewnić izolację poszczególnych kolonii.
  6. Natychmiast usunąć zamrożony zapas glicerolu z komory beztlenowej i powrócić do temperatury -80 °C.
  7. Inkubować płytkę beztlenowo przez noc w temperaturze 37 °C. Poszczególne izolowane kolonie należy obserwować po nocnym wzroście.

4. Oczyszczanie zarodników z C. difficile

Ponieważ zarodnikowanie jest niezbędne do przetrwania w środowiskach bogatych w tlen i do skutecznego przenoszenia chorób8, przygotowanie zapasów przetrwalników jest często konieczne do dalszych zastosowań, nie ograniczając się do mikroskopii i badań na zwierzętach. Ważne jest, aby pamiętać, że liczenie zarodników wymaga powtórzenia, aby zapewnić odtwarzalność liczenia. Wielokrotne pipetowanie w górę i w dół między rozcieńczeniami również zmniejsza straty, ponieważ zarodniki dobrze przylegają do plastiku.

Zarodnikowanie C. difficile nie jest tak szybkie ani jednorodne jak w przypadku innych gatunków sporogennych. Aby zoptymalizować produkcję i regenerację zarodników, zaleca się stosowanie pożywki zarodnikowej (SMC)17,25 lub pożywki 70:3026. Inne powszechnie stosowane pożywki to BHIS, który wymaga 4-5 dni wzrostu, zanim zaobserwuje się skuteczne zarodnikowanie27, oraz Clospore, płynne podłoże, które wytwarza wysokie miana zarodników (107 - 108 zarodników na mililitr) po 72 godzinach wzrostu. Inne protokoły używają lodowatej wody zamiast 1x PBS20; Jednak zastosowanie roztworu izotonicznego może zmniejszyć przywieranie zarodników do siebie i plastikowych powierzchni. Alternatywnie, niektórzy badacze dodatkowo oczyszczają swoje zarodniki za pomocą gradientu sacharozy, aby całkowicie usunąć komórki wegetatywne i szczątki29.

Przed rozpoczęciem należy umieścić w komorze beztlenowej następujące przedmioty:

  • Sterylne pętle inokulacyjne
  • Płyty BHIS, SMC i/lub 70:30 (patrz Materiały)
  • Rosół BHIS (patrz Materiały)
  • 1x PBS, sterylizowany filtrem (patrz Materiały)
  1. Wyhodować szczepy z zamrożonego glicerolu na wstępnie zredukowanych płytkach BHIS i inkubować beztlenowo przez noc w temperaturze 37 °C.
  2. Ponownie nałożyć smugi na kilka wstępnie zredukowanych płytek SMC lub 70:30 i inkubować beztlenowo w temperaturze 37 °C przez 24-48 godzin. Powstawanie przetrwalników można śledzić za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym. Zarodniki będą wyświetlane w fazie jasnej, podczas gdy komórki wegetatywne i macierzyste będą w ciemnej fazie. *Alternatywnie, zarodniki można oczyścić z płynnego podłoża 70:30 po 24-48 godzinach, co daje 105-10 6 zarodników na mililitr, w zależności od użytego szczepu.
  3. Używając sterylnej pętli do zaszczepiania, zeskrobać płytki i ponownie zawiesić komórki w 10 ml sterylnego 1x PBS.
  4. Wyrzucić płytki i usunąć zawiesinę zarodników z komory beztlenowej. Granulować komórki w temperaturze 3,000 x g przez 15 minut. Umyj komórki dwukrotnie w 1x PBS, za każdym razem całkowicie zawieszając osad komórkowy.
  5. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C, aby wspomóc lizę komórek wegetatywnych i macierzystych.
  6. Inkubować w temperaturze 70 °C przez 20 minut w celu zabicia wszelkich pozostałych komórek wegetatywnych.
  7. Aby określić jednostki tworzące kolonie (CFU) na mililitr, należy seryjnie rozcieńczyć każdy preparat przetrwalnikowy w 1x PBS i płytce na BHIS + 0,1% taurocholanu sodu. Inkubować płytki przez co najmniej 24 godziny przed zliczeniem kolonii.
  8. Zarodniki mogą być przechowywane w 1x PBS w temperaturze pokojowej lub 4°C do długotrwałego przechowywania. W przypadku przechowywania w temperaturze 4 °C przydatne może być ponowne podgrzanie preparatu z zarodnikami w temperaturze 55 °C przez 15 minut, aby przywrócić skuteczne kiełkowanie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przykład C. difficile wyhodowanego na podłożach BHIS oraz beztlenowym agarze Columbia z krwią owczą przedstawiono na Rysunku 2. C. difficile tworzy nieregularne, płaskie kolonie o wyglądzie przypominającym szkło matowe, co jest widoczne na obu podłożach. Tutaj wrażliwy na erytromycynę izolat kliniczny C. difficile, 630E30, został wyhodowany na agarze BHIS, wzbogaconą pożywce nie selektywnej, przez 24 hr w 37 °C (Rysunek 2A). Kolonie na beztlenowym ag...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisane tutaj metody pozwalają na proste i szybkie odzyskanie C. difficile z różnych próbek kału, w tym ludzi, myszy i chomików, a także na długotrwałe przechowywanie C. difficile w postaci glicerolu lub zapasów zarodników. C. difficile może być organizmem trudnym w uprawie, ale staranne utrzymanie środowiska beztlenowego i stosowanie technik aseptycznych może zapewnić silny wzrost i zmniejszenie zanieczyszczenia.

Komory beztlenowe: uwagi i konserwacja

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Coy Laboratories za uprzejme udostępnienie zdjęć komory beztlenowej. Praca ta była wspierana przez National Institutes of Health grant DK087763 (S.M. M.) oraz stypendium STEP/HHMI Curriculum Development Fellowship (A.N.E.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pepton proteozy nr 2BD212120
Na2HPO4FisherS373
KH2PO4FisherBP362
NaClFisherS27
MgSO4 (bezwodny)FisherM65
á'...-FruktozaFisherL96
Taulocholan soduSigmaT4009
á'...-cykloserynaSigmaC6880
CefoksytynaFlukaC4786
Pożywka do naparu serca mózguBD237300
Peptonproteozy BD211684
(NH4)2SO4SigmaA5132
Tris baseFisherBP152
AgarBD214010
L-cysteinaSigmaC7755
BactoPeptoneBD211684
Agar z krwią owiec kolumbijskichFisherL21928
NaClFisherS27
KClFisherP217
GlicerolFisherBP2291
Sterylne pętle inokulacyjneFisher22363596
Sterylne wacikiFisher1495990
Coy Vinyl Anaerob Chamber i akcesoriaCoy Laboratory Products, IncOkreślony przez klientaTe elementy są zamawiane na zamówienie według potrzeb
Materials
TCCFA agar

Pepton proteozy nr 2 (Difco) 40 g
Na2HPO4 5 g
KH2PO4 1 g
NaCl 2 g
MgSO4 (bezwodny) 0,1 g
Fruktoza 6 g
Agar 20 g

Doprowadzić do 1 l wodą dejonizowaną i autoklawować w temperaturze 121 stopni; C przez 20 minut do sterylizacji.

Po autoklawowaniu dodaj:
10 ml 10% (w/v) taurocholanu sodu, sterylizowanego filtrem (rozpuścić w wodzie; stężenie końcowe 0,1%)
25 ml 10 mg/ml á'...-cykloseryny, sterylizowanej filtrem (rozpuścić w wodzie; stężenie końcowe, 250 μ g/ml)
1,6 ml 10 mg/ml cefoksytyny, sterylizowanej filtrem (rozpuścić w wodzie; stężenie końcowe, 16 μ g/ml)

BHIS Medium

Napar z mózgu serca 37 g
Ekstrakt drożdżowy 5 g

Na talerze dodaj 15 g agaru. Doprowadzić do 1 l wodą dejonizowaną i przelać do autoklawu w temperaturze 121 °; C przez 20 minut do sterylizacji.

Opcjonalnie (dodać po autoklawowaniu):

3 ml 10% (w/v) L-cysteiny (rozpuścić w wodzie; stężenie końcowe, 0,03%)
10 ml 10% (w/v) taurocholanu sodu (rozpuścić w wodzie; stężenie końcowe, 0,1%)

SMC Pożywka zarodnikowa

Bactopeptone 90 g
Pepton proteazy 5 g
(NH4)2SO4 1 g
Tris base 1,5 g
Agar 15 g

Doprowadzić do 1 l wodą dejonizowaną i autoklawować w temperaturze 121 ° C przez 20 minut do sterylizacji.

Opcjonalnie (dodać po autoklawowaniu):
3 ml 10% (w/v) L-cysteiny (rozpuścić w wodzie; stężenie końcowe, 0,03%)

70:30 Medium

Bactopeptone 63 g
Pepton proteazy 3,5 g
Napar z mózgu serca 11,1 g
Ekstrakt drożdżowy 1,5 g
(NH4)2SO4 0,7 g
Tris base 1,06 g

Na talerze dodaj 15 g agaru. Doprowadzić do 1 l wodą dejonizowaną i przelać do autoklawu w temperaturze 121 °; C przez 20 minut do sterylizacji. Po autoklawowaniu dodać 3 ml 10% (w/v) L-cysteiny (stężenie końcowe, 0,03%).

Blood agar

Zaleca się stosowanie gotowych beztlenowych płytek agarowych z krwią owczą Columbia (Fisher Scientific, L21928)35.

1X Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)

NaCl 8,01 g
KCl 0,2 g
Na2HPO4 1,44 g
KH2PO4 0,27 g

Doprowadzić do 1 l wodą dejonizowaną i dostosować pH do 7,4 za pomocą HCl. Filtr Sterylizować przed użyciem.
laboratorium

Bibliografia

  1. Hall, I. C., O'Toole, E. Intestinal flora in new-borin infants - With a description of a new pathogenic anaerobe, Bacillus difficilis. Am. J. Dis. Child. 49, 390-402 (1935).
  2. Tedesco, F. J., Barton, R. W., Alpers, D. H. Clindamycin-Associated Colitis - Prospective Study. Ann. Intern. Med. 81, 429-433 (1974).
  3. Gerding, D. N. Clostridium difficile 30 years on: what has, or has not, changed and why. Int. J. Antimicrob. Agents. 33, 2-8 (2009).
  4. Gerding, D. N., Muto, C. A., Owens, R. C. Treatment of Clostridium difficile infection. Clin. Infect. Dis. 46, Suppl 1. 32-42 (2008).
  5. Dubberke, E. R., Olsen, M. A. Burden of Clostridium difficile on the healthcare system. Clin. Infect. Dis. 55, 88-92 (2012).
  6. Bouza, E. Consequences of Clostridium difficile infection: understanding the healthcare burden. Clin. Microbiol. Infect. 18, 5-12 (2012).
  7. Peery, A. F., et al. Burden of gastrointestinal disease in the United States: 2012 update. Gastroenterology. 143, 1171-1173 (2012).
  8. Deakin, L. J., et al. The Clostridium difficile spo0A gene is a persistence and transmission factor. Infect. Immun. 80, 2704-2711 (2012).
  9. Drasar, B. S. Cultivation of anaerobic intestinal bacteria. J. Pathol. Bacteriol. 94, 417-427 (1967).
  10. Leach, P. A., Bullen, J. J., Grant, I. D. Anaerobic CO 2 cabinet for the cultivation of strict anerobes. Appl. Microbiol. 22, 824-827 (1971).
  11. Killgore, G. E., Starr, S. E., Del Bene,, Whaley, V. E., N, D., Dowell, V. R. Comparison of three anaerobic systems for the isolation of anaerobic bacteria from clinical specimens. Am. J. Clin. Pathol. 59, 552-559 (1973).
  12. Bacic, M. K., Smith, C. J. Laboratory maintenance and cultivation of bacteroides species. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 13, Unit 13C 11(2008).
  13. Doan, N., Contreras, A., Flynn, J., Morrison, J., Slots, J. Proficiencies of three anaerobic culture systems for recovering periodontal pathogenic bacteria. J. Clin. Microbiol. 37, 171-174 (1999).
  14. Socransky, S., Macdonald, J. B., Sawyer, S. The cultivation of Treponema microdentium as surface colonies. Arch. Oral. Biol. 1, 171-172 (1959).
  15. George, W. L., Sutter, V. L., Citron, D., Finegold, S. M. Selective and differential medium for isolation of Clostridium difficile. J. Clin. Microbiol. 9, 214-219 (1979).
  16. Wilson, K. H., Silva, J., Fekety, F. R. Suppression of Clostridium difficile by normal hamster cecal flora and prevention of antibiotic-associated cecitis. Infect. Immun. 34, 626-628 (1981).
  17. Wilson, K. H., Kennedy, M. J., Fekety, F. R. Use of sodium taurocholate to enhance spore recovery on a medium selective for Clostridium difficile. J. Clin. Microbiol. 15, 443-446 (1982).
  18. Bliss, D. Z., Johnson, S., Clabots, C. R., Savik, K., Gerding, D. N. Comparison of cycloserine-cefoxitin-fructose agar (CCFA) and taurocholate-CCFA for recovery of Clostridium difficile during surveillance of hospitalized patients. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 29, 1-4 (1997).
  19. Marler, L. M., et al. Comparison of five cultural procedures for isolation of Clostridium difficile from stools. J. Clin. Microbiol. 30, 514-516 (1992).
  20. Sorg, J. A., Dineen, S. S. Laboratory maintenance of Clostridium difficile. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 9, Unit 9A 1(2009).
  21. Bouillaut, L., McBride, S. M., Sorg, J. A. Genetic manipulation of Clostridium difficile. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 9, Unit 9A 2(2011).
  22. Lemee, L., Pons, J. L. Multilocus sequence typing for Clostridium difficile. Methods. Mol. Biol. 646, 77-90 (2010).
  23. Shanholtzer, C. J., Peterson, L. R., Olson, M. N., Gerding, D. N. Prospective study of gram-stained stool smears in diagnosis of Clostridium difficile colitis. J. Clin. Microbiol. 17, 906-908 (1983).
  24. Smith, C. J., Markowitz, S. M., Macrina, F. L. Transferable tetracycline resistance in Clostridium difficile. Antimicrob. Agents Chemother. 19, 997-1003 (1981).
  25. Permpoonpattana, P., et al. Surface layers of Clostridium difficile endospores. J. Bacteriol. 193, 6461-6470 (2011).
  26. Putnam, E. E., Nock, A. M., Lawley, T. D., Shen, A. SpoIVA and SipL are Clostridium difficile spore morphogenetic proteins. J. Bacteriol. , (2013).
  27. Burns, D. A., Minton, N. P. Sporulation studies in Clostridium difficile. J. Microbiol. Methods. 87, 133-138 (2011).
  28. Perez, J., Springthorpe, V. S., Sattar, S. A. Clospore: a liquid medium for producing high titers of semi-purified spores of Clostridium difficile. J. AOAC Int. 94, 618-626 (2011).
  29. Sorg, J. A., Sonenshein, A. L. Inhibiting the initiation of Clostridium difficile spore germination using analogs of chenodeoxycholic acid, a bile acid. J. Bacteriol. 192, 4983-4990 (2010).
  30. O'Connor, J. R., et al. Construction and analysis of chromosomal Clostridium difficile mutants. Mol. Microbiol. 61, 1335-1351 (2006).
  31. Buggy, B. P., Wilson, K. H., Fekety, R. Comparison of methods for recovery of Clostridium difficile from an environmental surface. J. Clin. Microbiol. 18, 348-352 (1983).
  32. Koch, C. J., Kruuv, J. The release of oxygen from polystyrene Petri dishes. Br. J. Radiol. 45, 787-788 (1972).
  33. Ethapa, T., et al. Multiple factors modulate biofilm formation by the anaerobic pathogen Clostridium difficile. J. Bacteriol. , (2012).
  34. Speers, A. M., Cologgi, D. L., Reguera, G. Anaerobic cell culture. Curr. Protoc. Microbiol. Appendix 4, Appendix 4F(2009).
  35. Lyras, D., et al. Toxin B is essential for virulence of Clostridium difficile. Nature. 458, 1176-1179 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Komora beztlenowaizolacja pr bek ka uprzygotowanie banku w gliceroluliczenie przetrwalnik wwysiew na pod o a selektywneinkubacja beztlenowaobliczanie CFUpoziom bezpiecze stwa biologicznego 2hodowla kom rek wegetatywnych

Powiązane artykuły