Badanie oddziaływań Staphylococcus aureus z neutrofilami za pomocą cytometrii przepływowej i mikroskopii poklatkowej

Podsumowanie

Prezentujemy metody badania wpływu PSM i innych toksyn wydzielanych przez Staphylococcus aureus na neutrofile za pomocą cytometrii przepływowej i mikroskopii fluorescencyjnej.

Streszczenie

Prezentujemy metody badania wpływu modulin rozpuszczalnych w fenolu (PSM) i innych toksyn wytwarzanych i wydzielanych przez Staphylococcus aureus na neutrofile. Aby zbadać wpływ PSM na neutrofile, izolujemy świeże neutrofile za pomocą wirowania w gradiacji gęstości. Te neutrofile są naładowane barwnikiem, który fluoryzuje po mobilizacji wapnia. Aktywacja neutrofili przez PSM inicjuje szybki i przejściowy wzrost stężenia wolnego wewnątrzkomórkowego wapnia. W eksperymencie cytometrii przepływowej tę szybką mobilizację można zmierzyć, monitorując fluorescencję wstępnie załadowanego barwnika, który reaguje na zwiększone stężenie wolnego Ca²⁺. Za pomocą tej metody możemy określić stężenie PSM niezbędne do aktywacji neutrofili oraz zmierzyć działanie specyficznych i ogólnych inhibitorów aktywacji neutrofili.

Aby zbadać ekspresję PSM w przestrzeni wewnątrzkomórkowej, skonstruowaliśmy fuzje reporterowe promotora operonu PSMα do GFP. Kiedy te reporterowe szczepy S. aureus są fagocytozowane przez neutrofile, indukcję ekspresji można zaobserwować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Wprowadzenie

Neutrofile (PMN) to profesjonalne fagocyty, które odgrywają kluczową rolę we wrodzonej odpowiedzi immunologicznej przeciwko Staphylococcus aureus ¹. Ciągła walka między gospodarzem a mikrobem doprowadziła do wyścigu zbrojeń obu stron. Ostatnio pojawiły się szczepy S. aureus opornego na metycylinę (MRSA) związane ze społecznością (CA), które wydają się być bardzo skuteczne w obchodzeniu zabijania neutrofili ^2,3. Nadmierna produkcja moduliny rozpuszczalnej w fenolu (PSM) CA-MRSA wiąże się z wyższą zjadliwością ^4,5. Ludzkie neutrofile mogą rozpoznać te PSM za pomocą FPR2, co prowadzi do aktywacji tego receptora sprzężonego z białkiem G ⁶. Jednym z najwcześniejszych zdarzeń jest mobilizacja wewnątrzkomórkowych zapasów wapnia (^Ca2+). Ca²⁺ działa jako wtórny przekaźnik dla różnych funkcji efektorowych PMN, w tym degranulacji i fagocytozy ⁷. Dlatego Ca²⁺ jest bardzo czułym wskaźnikiem funkcjonalnej zdolności PSM do aktywacji PMN. Aby zbadać wpływ PSM na neutrofile, świeże neutrofile są izolowane i ładowane barwnikiem, który fluoryzuje po mobilizacji wapnia. W eksperymencie cytometrii przepływowej można zmierzyć tę szybką mobilizację. Za pomocą tej metody można zbadać bezpośredni wpływ składników toksycznych i innych na neutrofile oraz określić najniższe stężenie, w którym są one aktywne. Dla nas jest to bardzo przydatne narzędzie do badania wpływu wielu białek wytwarzanych przez S. aureus zaangażowanych w unikanie odporności, takich jak białko hamujące FPR2 (FLIPr) ⁸, FLIPr-podobne ⁷ i białko hamujące chemotaksję Staphylococcus aureus (CHIPS) ⁹. Wykazano, że wszystkie te białka hamują mobilizację wapnia w neutrofilach poprzez wiązanie się z receptorem rozpoznającym agonistę.

Ostatnio nasza grupa opisała, że PSM są funkcjonalnie hamowane przez lipoproteiny w surowicy ¹⁰ . Te lipoproteiny są obficie obecne we krwi i tkance ludzkiej, co wskazuje, że PSM pełnią swoją funkcję przede wszystkim w środowisku wewnątrzkomórkowym. Dostępność testu mobilizacji wapnia pozwoliła nam na precyzyjny pomiar wpływu lipoprotein w surowicy na aktywację neutrofili przez PSM, na co wskazuje znaczne hamowanie przez bardzo niskie stężenia surowicy.

Ponieważ PSM są funkcjonalnie hamowane przez surowicę, postawiliśmy hipotezę, że istnieje ważna funkcja dla PSM jako toksyn wewnątrzkomórkowych. W związku z tym staraliśmy się określić rolę PSM po fagocytozie. Aby zbadać ekspresję PSM w przestrzeni międzykomórkowej, skonstruowaliśmy fuzje reporterowe promotora operonu psmα do GFP. Kiedy te reporterowe szczepy S. aureus były fagocytozowane przez neutrofile, indukcję ekspresji można było zaobserwować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej ¹⁰. Oczywiście technika ta pozwala na badanie ekspresji dużej liczby genów w S. aureus lub innych patogenach po fagocytozie. Ponieważ dla S. aureus przetrwanie w niszy międzykomórkowej jest bardzo ważne dla pokonania wrodzonego układu odpornościowego^{11 10 12}, badanie roli genów aktywowanych w tej niszy jest bardzo istotne dla zrozumienia jego zjadliwości.

Protokół

1. Izolacja PMN z ludzkiej krwi przez wirowanie gęstości

1. Pobierz 5 probówek po 9 ml heparynizowanej krwi żylnej.
2. Przygotować dwuwarstwowe gradienty Ficoll (4 gradienty na 5 probówek krwi) w następujący sposób: Wlać 12 ml roztworu fikolu o gęstości 1,119 g/ml do probówki o pojemności 50 ml i ostrożnie nałożyć na wierzch 10 ml roztworu fikolu o gęstości 1,077 g/ml.
3. Rozcieńczyć krew równą objętością PBS.
4. Rozcieńczoną krew należy ostrożnie nałożyć na dwuwarstwowy gradient Ficoll; 20-25 ml na gradient.
5. Wirować 20 min przy 396 x g w obracającym się wirniku kubełkowym, 22 °C bez hamowania.
6. Przygotuj zimny RPMI zawierający 0,05% albuminy ludzkiej surowicy (RPMI-HSA). Przygotuj również 9 ml sterylnego dejonizowanego_H2O. Wstępnie schłodzić zarówno RPMI, jak i_H2Ona lodzie.
7. Za pomocą pompy próżniowej odessać górną warstwę Ficollu zawierającą osocze (o barwie żółtej) i PBMC oraz drugą warstwę Ficollu (o barwie białej) (na pipetę nałożyć sterylną końcówkę pipety).
8. Zebrać PMN do probówek o pojemności 50 ml za pomocą małej plastikowej pipety (1 probówka na frakcje PMN na każde 2 gradienty) i umieścić je na lodzie.
9. Dodać zimny RPMI-HSA do całkowitej objętości 50 ml i wirować przez 10 minut w temperaturze 249 x g w temperaturze 4 °C.
10. Zdjąć supernatant za pomocą pompy próżniowej i delikatnie wymieszać osad (erytrocyty i PMN).
11. Dodaj 9 ml sterylnego dejonizowanego_H2Oi uruchom stoper. Zatrzymaj wstrząs hiperosmotyczny dokładnie po 30 sekundach, dodając 1 ml 10-krotnie stężonego PBS. Uwaga: 30 sekund jest bardzo krytyczne.
12. Dodać zimny RPMI-HSA do całkowitej objętości 50 ml i wirować przez 10 minut w temperaturze 249 x g w temperaturze 4 °C.
13. Zdjąć supernatant za pomocą pompy próżniowej i zebrać granulat PMN do 1 probówki o określonej objętości (1-2 ml) RPMI-HSA.
14. Określ ilość komórek i dostosuj stężenie do 1,10⁷ komórek/ml. W zależności od dawcy, wydajność izolowanych PMN będzie wynosić od 5 x 10 6 do 3 x 10⁷ PMN z każdej probówki krwi o pojemności 9 ml

2. Test cytometrii przepływowej do oceny mobilizacji wapnia w ludzkich PMN

1. Załaduj ogniwa (5 x 10⁶ komórek/ml) 2 μM Fluo-3-AM w RPMI-HSA i inkubuj przez 20 minut w temperaturze pokojowej, kołysząc się powoli, używając na przykład wytrząsarki z platformą kołyszącą, chronioną przed światłem.
2. W międzyczasie należy przygotować seryjne rozcieńczenie (np. 3-krotne) bodźca o stężeniu 10-krotnym od końcowego. W tym protokole używany jest PSMα3; jednak każdy bodziec GPCR, który działa na neutrofile, jest odpowiedni.
3. Przygotuj 10x skoncentrowany inhibitor receptora w RPMI-HSA. Gdy inhibitor działa na bodziec (np. HDL na PSMα3), należy wstępnie inkubować 25 μl bodźca z równą objętością inhibitora przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
4. Umyj komórki, dodając 10 ml RPMI-HSA i odwiruj przez 249 x g w temperaturze pokojowej. Ponownie zawieś komórki na 5 x 10⁶ komórek/ml.
5. Tuż przed eksperymentem rozcieńczyć komórki do 2x10⁶ komórek/ml w RPMI-HSA i dodać 200 μl komórek na probówkę FACS. Rozcieńczone PMN są bardzo delikatne. Utrzymywanie ich zbyt długo w tym stężeniu doprowadzi do automatycznej aktywacji; To samo dotyczy energicznego potrząsania lub pipetowania.
6. Podłącz rurkę do cytometru przepływowego, odczekaj 3 sekundy i rozpocznij akwizycję. Po upływie określonego czasu (np. 8 sekund) zdjąć probówkę i szybko dodać do próbki 50 μl bodźca. Natychmiast ponownie przymocuj probówkę do uchwytu próbki i kontynuuj akwizycję.
7. Zacznij od najniższego i skończ na najwyższym stężeniu bodźca. Regularnie myj igłę cytometru przepływowego po każdym uruchomieniu za pomocą RPMI-HSA.
8. Analizuj dane za pomocą oprogramowania do analizy cytometrii przepływowej. Porównać średni sygnał fluorescencji przed dodaniem bodźca z sygnałem po dodaniu bodźca i użyć odpowiednich kontroli dodatnich i ujemnych do obliczenia siły aktywacji dla każdego mierzonego rozcieńczenia.

Alternatywnie, gdy inhibitor działa na receptor, wstępnie inkubuj komórki z inhibitorem.

3. Analiza mikroskopii fluorescencyjnej ekspresji GFP bakterii po fagocytozie za pomocą PMN

1. Hoduj szczepy S. aureus zawierające interesujący konstrukt reporterowy przez noc w bulionie (z antybiotykami, jeśli jest to wymagane do utrzymania plazmidu reporterowego). W tym przypadku stosuje się szczep MW2 zawierający konstrukt reporterowy PSMα GFP ¹⁰, wyhodowany w 50 ml plastikowej probówce z 5 ml pożywki hodowlanej LB.
2. Aby usunąć całą GFP z ekspresji O/N, rozcieńczyć kultury do OD₆₆₀ 0,01 i wyhodować do OD₆₆₀ 0,1. Ponownie rozcieńcz tę kulturę 1:30 i monitoruj wzrost, aż kultura osiągnie OD₆₆₀ 0,1. Zebrać bakterie przez odwirowanie i umyć raz w DPBS. Zawiesić ponownie w stosunku 1:10 pierwotnej objętości, aby uzyskać OD₆₆₀ 1,0 lub około 5,10⁸ jtk/ml.
3. Wymieszać bakterie (1,10⁷/ml) ze świeżo wyizolowanymi PMN (1,10⁶/ml) w RPMI-HSA (stosunek 10:1) w mikroprobówce o pojemności 1,5 ml i dodać zbiorczą surowicę ludzką do końcowego stężenia 10%. Wstrząsać na platformie wstrząsającej przez 10 minut w temperaturze 37 °C w celu pobudzenia fagocytozy. Rozcieńczyć PMN wypełnione bakteriami do 5,10⁵ PMN/ml i odpipetować 250 μl do studzienki z 8-komorowym szkiełkiem nakrywkowym.
4. Zobrazuj PMN z bakteriami pod mikroskopem. Mikroskop odwrócony wyposażony w obiektyw 40X/0,85 NA działa dobrze i powinien być zamknięty w komorze ciemnego środowiska, aby utrzymać środowisko stabilnie na poziomie 37 °C. Uzyskuj obrazy dla kilku wstępnie ustawionych pozycji za pomocą kamery co 5-10 minut zarówno w jasnym polu, jak i w kanale GFP, aby śledzić produkcję GFP w czasie.

Wyniki

Test cytometryczny przepływu do oceny mobilizacji wapnia w ludzkich PMN

Inkubacja neutrofili z serią koncentracji syntetycznego PSMα3 skutkująca szybką aktywacją mierzoną strumieniem wapnia, co jest pokazane przez wzrost sygnału w FL-1. Wstępna inkubacja syntetycznego PSMα3 z 0,01%, 0,1% lub 1% ludzką surowicą znacznie hamowała zdolność do wywoływania strumieni wapnia (ryc. 1).

Analiza ekspresji GFP u bakterii po fagocytozie za pomocą PMN przy użyciu mikr...

Dyskusja

W opisanych tutaj metodach niektóre kroki są bardzo krytyczne. Podkreślimy je tutaj.

W przypadku izolacji neutrofili przez wirowanie w gradiacji gęstości ważne jest, aby nie naruszać warstw w trakcie lub po etapach wirowania. Podczas zasysania neutrofili za pomocą plastikowej pipety należy uważać, aby nie ściskać balonu w warstwie komórek, ponieważ wyrzucenie cieczy naruszy warstwy. Sprawdź również wzrokowo osady neutrofili po etapie szoku osmotycznego i wirowania. Jeśli osad jest nadal czerw...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Fluo-3, AM	Sondy molekularne / Life Technologies	F-1241
Ficoll-Paque	GE Healthcare	17-5442-03	gęstość 1.077 g/ml
Histopaque	Sigma	11191	gęstość 1.119 g/ml
RPMI 1640	Gibco, Life Technologies	52400-025	zawiera 25 mM HEPES i L-glutaminę
Mikroskop Leica TCS SP5	Leica Microsystems, Holandia	TCS SP5	obiektyw: HCX PL APO 40x/0.85
FACSCalibur	BD Biosciences	FACSCalibur	Bardzo ważne jest, aby rurkę można było wyjąć i wymienić podczas procesu pomiaru