Ta metoda opisuje użycie chemii kliknięć do pomiaru zmian w transkrypcji komórek gospodarza po zakażeniu wirusem gorączki doliny Rift (RVFV) szczepem MP-12. Wyniki można wizualizować jakościowo za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub uzyskiwać ilościowo za pomocą cytometrii przepływowej. Ta metoda można dostosować do użytku z innymi wirusami.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wykorzystanie chemii kliknięć do pomiaru wpływu infekcji wirusowej na syntezę RNA komórki gospodarza
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wiele wirusów RNA rozwinęło zdolność do hamowania transkrypcji komórek gospodarza jako sposób na obejście zabezpieczeń komórkowych. W celu zbadania tych wirusów ważne jest zatem, aby dysponować szybkim i wiarygodnym sposobem pomiaru aktywności transkrypcyjnej w zakażonych komórkach. Tradycyjnie, transkrypcję mierzono albo przez włączenie radioaktywnych nukleozydów, takich jak 3H-urydyna, a następnie wykrycie za pomocą autoradiografii lub zliczania scyntylacyjnego, albo włączenie fluorowcowanych analogów urydyny, takich jak 5-bromourydyna (BrU), a następnie wykrycie za pomocą barwienia immunologicznego. Stosowanie izotopów promieniotwórczych wymaga jednak specjalistycznego sprzętu i nie jest możliwe w wielu warunkach laboratoryjnych, a wykrywanie BrU może być kłopotliwe i może mieć niską czułość.
Niedawno opracowana chemia kliknięć, która obejmuje katalizowaną miedzią formację triazolu z azydku i alkinu, teraz stanowi szybką i bardzo czułą alternatywę dla tych dwóch metod. Chemia typu click to dwuetapowy proces, w którym powstające RNA jest najpierw znakowane przez włączenie analogu urydyny 5-etynylurydyny (EU), a następnie wykrywanie znacznika za pomocą fluorescencyjnego azydku. Azydki te są dostępne jako kilka różnych fluoroforów, co pozwala na szeroki zakres opcji wizualizacji.
Ten protokół opisuje metodę pomiaru supresji transkrypcji w komórkach zakażonych wirusem gorączki doliny Rift (RVFV) szczepem MP-12 za pomocą chemii kliknięć. Jednocześnie ekspresja białek wirusowych w tych komórkach jest determinowana przez klasyczne wewnątrzkomórkowe barwienie immunologiczne. Kroki od 1 do 4 szczegółowo opisują metodę wizualizacji supresji transkrypcji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, podczas gdy kroki od 5 do 8 szczegółowo opisują metodę ilościowego określania supresji transkrypcji za pomocą cytometrii przepływowej. Ten protokół można łatwo dostosować do użytku z innymi wirusami.
Wprowadzenie
Tradycyjnie, aktywność transkrypcyjna była mierzona poprzez włączenie radioaktywnych (3H-urydyna)1 lub halogenowanych (BrU)2 nukleozydów do powstającego RNA. Te analogi urydyny są wychwytywane przez komórki, przekształcane w trifosforan urydyny (UTP) przez szlak ratunkowy nukleozydów, a następnie włączane do nowo zsyntetyzowanego RNA. 3H-urydynę można wykryć za pomocą autoradiografii, która może być czasochłonna, lub zliczania scyntylacyjnego, które wymaga specjalistycznego sprzętu. Ponadto stosowanie izotopów promieniotwórczych może być niepraktyczne w wielu warunkach laboratoryjnych, w tym w laboratoriach o wysokim stopniu....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Analiza transkrypcji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej
1. Infekuj komórki MP-12 i oznaczaj powstające RNA za pomocą EU
- Umieścić okrągłe szkiełka nakrywkowe o średnicy 12 mm na 12-dołkowej płytce do hodowli tkankowej, po jednym szkiełku nakrywkowym na dołek.
Uwaga: Jeśli komórki mają problemy z przyleganiem do szkiełek nakrywkowych, pokryj je poli-L-lizyną (MW ≥ 70 000) przed umieszczeniem w studzienkach. W tym celu zanurzyć szkiełka nakrywkowe w sterylnym roztworze o stężeniu 0,1 mg/ml wH2Opoli-L-lizyny na 5 minut. Szkiełka nakrywkowe płukać sterylnymH2O....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Białko NSs wirusa RVFV (rodzina Bunyaviridae, rodzaj Phlebovirus) 11 hamuje ogólną transkrypcję komórek gospodarza poprzez dwa odrębne mechanizmy: (i) poprzez sekwestrację podjednostki p44 podstawowego czynnika transkrypcyjnego TFIIH11 oraz (ii) poprzez promowanie degradacji proteasomalnej podjednostki p62 TFIIH 6. Do eksperymentów opisanych w niniejszym protokole wykorzystano szczep szczepionkowy RVFV MP-12 13, ponieważ szczep MP-12 może być przetwarzany w la.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Dostarczony protokół opisuje metodę pomiaru wpływu infekcji wirusowej na transkrypcję komórek gospodarza poprzez włączenie analogu urydyny UE do powstającego RNA. Ta metoda ma kilka zalet w porównaniu z poprzednimi metodami: jest szybka, czuła i nie opiera się na użyciu izotopów promieniotwórczych. Ponadto metodę można dostosować do uzyskiwania danych jakościowych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub danych ilościowych za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu zasadniczo tych samych odczynników. W połączeniu z .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie stwierdzono konfliktu interesów.
Podziękowania
Dziękujemy R.B. Teshowi za dostarczenie mysiej poliklonalnej surowicy anty-RVFV oraz M. Griffinowi z UTMB Flow Cytometry Core Facility za pomoc w cytometrii przepływowej. Praca ta była wspierana przez 5 AI057156 U54 za pośrednictwem Western Regional Center of Excellence, grant NIH R01 AI08764301, a finansowanie z Sealy Center for Vaccine Development w UTMB.B.K. było wspierane przez James W. McLaughlin Fellowship Fund w UTMB.O.L. było wspierane przez Maurice R. Hilleman Early-Stage Career Investigator Award.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
e.g.
, pH 8,5 Trypsyna-EDTA Invitrogen 25200056 Cytometr przepływowy Olympus IX71 BD Biosciences LSRII Fortessa
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 5-etynylo-urydyna | Berry Associates | PY 7563 | rozpuszcza się w DMSO dla 100 mM zapasów |
| 12-milimetrowe okrągłe szkiełka nakrywkowe | Fisherbrand | 12-545-82 | |
| Probówki polistyrenowe 5 ml | BD Biosciences | 352058 | |
| Actinomycin D (ActD) | Sigma | 9415 | rozpuszcza się w DMSO dla 10 mM zapas |
| Alexa Fluor 488 kozia anty-mysia IgG | Invitrogen | A-11029 | |
| Albumina surowicy bydlęcej (BSA) | Santa Cruz | sc-2323 | |
| CuSO4 | Sigma | C-8027 | rozpuszczać w H2O dla 100 mM zapasu |
| DAPI | Sigma | D-9542 | rozpuszczać w H2O dla 5 mg/ml zapasu |
| DMEM | Invitrogen | 11965092 | |
| FBS | Invitrogen | 16000044 | |
| azydek fluorescencyjny (Alexa Fluor 594-sprzężony) | Invitrogen | A10270 | |
| azydek fluorescencyjny (Alexa Fluor 657-sprzężony) | Invitrogen | A10277 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Kwas L-askorbinowy | Sigma | A-5960 | rozpuszcza się w H2O przez 500 mM |
| filtr papierowy | VWRbrand | 28333-087 | |
| paraformaldehyd | Sigma | 158127 | |
| Penicylina-Streptomycyna | Invitrogen | 15140122 | |
| poli-L-lizyna (MW ≥ 70000) | Sigma | P1274 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| Baza Trizma | Sigma | T-1503 | rozpuścić w H2O dla 1,5 M bulionu |
| mikroskop fluorescencyjny | np. | ||
Bibliografia
- Fakan, S. Structural support for RNA synthesis in the cell nucleus. Methods Achiev. Exp. Pathol. 12, 105-140 (1986).
- Jensen, P. O., Larsen, J., Christiansen, J., Larsen, J. K. Flow cytometric measurement of RNA synthesis using bromouridine lab....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
