Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie chemii kliknięć do pomiaru wpływu infekcji wirusowej na syntezę RNA komórki gospodarza

11.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50809

⸱

9 sierpnia 2013

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, Sealy Center for Vaccine Development, Center for Biodefense and Emerging Infectious Diseases, University of Texas Medical Branch

W tym artykule

Podsumowanie

Ta metoda opisuje użycie chemii kliknięć do pomiaru zmian w transkrypcji komórek gospodarza po zakażeniu wirusem gorączki doliny Rift (RVFV) szczepem MP-12. Wyniki można wizualizować jakościowo za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub uzyskiwać ilościowo za pomocą cytometrii przepływowej. Ta metoda można dostosować do użytku z innymi wirusami.

Streszczenie

Wiele wirusów RNA rozwinęło zdolność do hamowania transkrypcji komórek gospodarza jako sposób na obejście zabezpieczeń komórkowych. W celu zbadania tych wirusów ważne jest zatem, aby dysponować szybkim i wiarygodnym sposobem pomiaru aktywności transkrypcyjnej w zakażonych komórkach. Tradycyjnie, transkrypcję mierzono albo przez włączenie radioaktywnych nukleozydów, takich jak 3H-urydyna, a następnie wykrycie za pomocą autoradiografii lub zliczania scyntylacyjnego, albo włączenie fluorowcowanych analogów urydyny, takich jak 5-bromourydyna (BrU), a następnie wykrycie za pomocą barwienia immunologicznego. Stosowanie izotopów promieniotwórczych wymaga jednak specjalistycznego sprzętu i nie jest możliwe w wielu warunkach laboratoryjnych, a wykrywanie BrU może być kłopotliwe i może mieć niską czułość.

Niedawno opracowana chemia kliknięć, która obejmuje katalizowaną miedzią formację triazolu z azydku i alkinu, teraz stanowi szybką i bardzo czułą alternatywę dla tych dwóch metod. Chemia typu click to dwuetapowy proces, w którym powstające RNA jest najpierw znakowane przez włączenie analogu urydyny 5-etynylurydyny (EU), a następnie wykrywanie znacznika za pomocą fluorescencyjnego azydku. Azydki te są dostępne jako kilka różnych fluoroforów, co pozwala na szeroki zakres opcji wizualizacji.

Ten protokół opisuje metodę pomiaru supresji transkrypcji w komórkach zakażonych wirusem gorączki doliny Rift (RVFV) szczepem MP-12 za pomocą chemii kliknięć. Jednocześnie ekspresja białek wirusowych w tych komórkach jest determinowana przez klasyczne wewnątrzkomórkowe barwienie immunologiczne. Kroki od 1 do 4 szczegółowo opisują metodę wizualizacji supresji transkrypcji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, podczas gdy kroki od 5 do 8 szczegółowo opisują metodę ilościowego określania supresji transkrypcji za pomocą cytometrii przepływowej. Ten protokół można łatwo dostosować do użytku z innymi wirusami.

Wprowadzenie

Tradycyjnie, aktywność transkrypcyjna była mierzona poprzez włączenie radioaktywnych (3H-urydyna)1 lub halogenowanych (BrU)2 nukleozydów do powstającego RNA. Te analogi urydyny są wychwytywane przez komórki, przekształcane w trifosforan urydyny (UTP) przez szlak ratunkowy nukleozydów, a następnie włączane do nowo zsyntetyzowanego RNA. 3H-urydynę można wykryć za pomocą autoradiografii, która może być czasochłonna, lub zliczania scyntylacyjnego, które wymaga specjalistycznego sprzętu. Ponadto stosowanie izotopów promieniotwórczych może być niepraktyczne w wielu warunkach laboratoryjnych, w tym w laboratoriach o wysokim stopniu hermetyczności. BrU można wykryć poprzez barwienie immunologiczne przeciwciałami anty-BrU, które mogą wymagać ostrej przepuszczalności w celu zapewnienia dostępu przeciwciała do jądra lub częściowej denaturacji RNA, ponieważ drugorzędowa struktura RNA może być steryczną przeszkodą w wiązaniu przeciwciał.

Opisany tutaj protokół wykorzystuje niedawno opracowaną chemię kliknięć3 do pomiaru aktywności transkrypcyjnej w komórkach zakażonych szczepem MP-12 RVFV. Chemia kliknięć opiera się na wysoce selektywnej i wydajnej reakcji cykloaddycji katalizowanej miedzią(I) między alkinem a ugrupowaniem azydkowym4,5. W tym protokole powstające RNA w zakażonych komórkach jest najpierw znakowane poprzez włączenie analogu urydyny EU. W drugim etapie włączone EU jest wykrywane w reakcji z fluorescencyjnym azydkiem. Główne zalety tej metody to (1) brak konieczności stosowania izotopów promieniotwórczych oraz (2) brak konieczności ostrej przepuszczalności lub denaturacji RNA. Przy masie cząsteczkowej mniejszej niż 50 Da dostęp azydku fluorescencyjnego nie jest utrudniony przez niewystarczającą przepuszczalność lub drugorzędową strukturę RNA. Co więcej, naukowcy nie są ograniczeni w wyborze przeciwciał pierwotnych, łącząc wykrywanie RNA z klasycznym barwieniem immunologicznym białek wirusowych.

W tym protokole opisane są dwie różne metody: jedna do wizualizacji transkrypcji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (kroki 1-4), a druga do ilościowego określania transkrypcji za pomocą cytometrii przepływowej (kroki 5-8). Obie te metody łączą znakowanie powstającego RNA z wewnątrzkomórkowym barwieniem immunologicznym białek wirusowych, co pozwala na korelację między aktywnością transkrypcyjną a infekcją wirusową na podstawie komórki po komórce.

Autorzy z powodzeniem wykorzystali opisany tutaj protokół do określenia aktywności transkrypcyjnej w komórkach zakażonych szczepem RVFV MP-126, komórkach zakażonych różnymi mutantami MP-127,8, 9 i komórkach zakażonych wirusem Toscana (TOSV)10. Opisany tutaj protokół może być łatwo dostosowany do stosowania z różnymi wirusami i może zostać zmodyfikowany w celu uwzględnienia barwienia immunofluorescencyjnego określonych białek wirusowych lub komórkowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Analiza transkrypcji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

1. Infekuj komórki MP-12 i oznaczaj powstające RNA za pomocą EU

  1. Umieścić okrągłe szkiełka nakrywkowe o średnicy 12 mm na 12-dołkowej płytce do hodowli tkankowej, po jednym szkiełku nakrywkowym na dołek.

Uwaga: Jeśli komórki mają problemy z przyleganiem do szkiełek nakrywkowych, pokryj je poli-L-lizyną (MW ≥ 70 000) przed umieszczeniem w studzienkach. W tym celu zanurzyć szkiełka nakrywkowe w sterylnym roztworze o stężeniu 0,1 mg/ml wH2Opoli-L-lizyny na 5 minut. Szkiełka nakrywkowe płukać sterylnymH2Oi suszyć na powietrzu przez co najmniej 2 godziny.

  1. Aby wysiać 293 komórki na szkiełka nakrywkowe, dodaj 5 x 104 komórki w 1 ml pożywki wzrostowej (DMEM zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej, 100 U/ml penicyliny i 100 mg/ml streptomycyny) na studzienkę. Inkubować w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 O/N.
  2. Zainfekuj komórki MP-12 przy wielokrotności infekcji (m.o.i.) wynoszącej 3. Uwzględnij co najmniej dwie niezakażone studzienki: jedna z dwóch studzienek będzie służyć jako niezakażona kontrola, druga będzie traktowana aktynomycyną D (ActD) na etapie 1.5 jako kontrola supresji transkrypcji. Usunąć pożywkę wzrostową i rozcieńczyć zapas wirusa tak, aby całkowita objętość dodana do każdej studzienki wynosiła 200 ml. Inkubować przez 1 godzinę w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .

Uwaga: Zamiast infekować komórki, komórki mogą być również transfekowane plazmidowym DNA lub syntetyzowanym in vitro RNA kodującym specyficzne białko wirusowe. W tym celu należy przetransfekować komórki odpowiednim odczynnikiem do transfekcji chemicznej zgodnie z instrukcjami producenta i przejść do kroku 1.5 po 16 godzinach od transfekcji. Wskazane jest zoptymalizowanie warunków transfekcji i czasu inkubacji przed znakowaniem i utrwalaniem RNA.

  1. Usuń inokulum i dodaj 1 ml świeżej pożywki do dołka. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 godzin.

Uwaga: Jeśli dostosowujesz ten protokół do użycia z innym wirusem, zaleca się przeprowadzenie eksperymentu z biegiem czasu, aby określić optymalny punkt czasowy dla znakowania i fiksacji RNA. Ustaw ten przebieg czasowy tak, aby czasy infekcji były rozłożone w czasie, a wszystkie próbki mogły być etykietowane, utrwalane i barwione w tym samym czasie.

  1. Po 15 godzinach od zakażenia (h.p.i.) zastąp pożywkę wzrostową pożywką zawierającą 1 mM EU. Do jednej z pozorowanych zainfekowanych studzienek dodać również 5 μg/ml ActD. Będzie to służyć jako kontrola supresji transkrypcji, ponieważ ActD hamuje syntezę RNA zależną od DNA. Zwróć komórki do inkubatora.
  2. W temperaturze 16 h.p.i. usunąć pożywkę i przemyć szkiełka nakrywkowe raz 1 ml PBS (KCl 0,20 g/L, KH2PO4 0,20 g/L, NaCl 8,00 g/L, Na2HPO4 1,15 g/L, pH 7,4) na studzienkę. Utrwalić komórki, dodając 1 ml 4% paraformaldehydu (PFA) na studzienkę i inkubując przez 30 minut w temperaturze pokojowej.

Uwaga: Aby przygotować 4% roztwór utrwalający PFA, rozpuść 10 g paraformaldehydu w 150 ml H2O podgrzanym do 60 °C mieszadle magnetycznym. Dodać 500 μl 1M NaOH i kontynuować mieszanie, aż roztwór stanie się klarowny. Przefiltrować roztwór PFA przez filtr papierowy w celu usunięcia cząstek stałych i dodać 62,5 ml buforu fosforanowego (77 mM NaH2PO4, 287 mM Na2HPO4, pH 7,4). DodaćH2Odo całkowitej objętości 250 ml. Zamrażać w temperaturze -20 °C w podwielokrotnościach jednorazowego użytku.

  1. Przemyć raz 1 ml PBS na studzienkę. Nie jest wymagany czas inkubacji dla tego i wszystkich kolejnych etapów mycia. Przejdź od razu do kroku 2.

Uwaga: Ważne jest, aby natychmiast przystąpić do reakcji kliknięcia, ponieważ RNA ulega degeneracji, jeśli jest przechowywane na tym etapie przez dłuższy czas; utratę sygnału fluorescencji RNA można już zaobserwować, jeśli komórki są przechowywane przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C. Podobnie, jeśli wykonujesz eksperyment z biegiem czasu, pamiętaj, aby oznaczyć, naprawić i wybarwić wszystkie próbki w tym samym czasie.

2. Kliknij Reakcja, aby wykryć oznaczone RNA

  1. Przepuszczalność komórek poprzez dodanie 1 ml 0,2% Triton X-100 do PBS. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.

Uwaga: Wszystkie roztwory użyte w krokach od 2.1 do 2.3 muszą być wolne od nukleaz.

  1. Przemyć trzy razy 1 ml PBS na studzienkę.
  2. Usunąć szkiełka nakrywkowe z płytki 12-dołkowej i przenieść do wilgotnej komory. Przykryj każde szkiełko nakrywkowe 50 - 100 μl roztworu barwiącego (100 mM Tris pH 8,5, 1 mM CuSO4, 20 μM azydek fluorescencyjny [maksimum wzbudzenia/emisji: 590/617 nm], 100 mM kwasu askorbinowego) każdy. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności.

Uwaga: Aby zmontować wilgotną komorę, wyłóż dno hodowli komórkowej lub szalki Petriego o średnicy 10 cm plastikową folią parafinową. Wyłóż wnętrze krawędzi naczynia wilgotnymi ręcznikami papierowymi. Umieść szkiełka nakrywkowe na plastikowej folii parafinowej.

Uwaga: Uważaj, aby nie dopuścić do wyschnięcia szkiełek nakrywkowych podczas tego lub innego kroku w protokole. Najlepiej jest dodawać roztwór barwiący do każdego szkiełka nakrywkowego bezpośrednio po umieszczeniu go w wilgotnej komorze.

Uwaga: Przygotuj świeżo roztwór do barwienia kliknięć bezpośrednio przed tym krokiem. Roztwory podstawowe 1,5 M Tris pH 8,5, 100 mMCuSO4 i 500 mM kwasu askorbinowego można przechowywać w temperaturze 4 °C. Należy jednak wyrzucić wszelki roztwór podstawowy kwasu askorbinowego, który zmienił kolor na żółty.

Uwaga: Upewnij się, że wybrałeś fluorofor, który pasuje do filtrów w Twoim mikroskopie fluorescencyjnym.

  1. Usunąć szkiełka nakrywkowe z wilgotnej komory i umieścić w świeżej 12-dołkowej płytce i przemyć trzykrotnie 1 ml PBS na studzienkę.

Uwaga: Jeśli nie jest pożądane wykrycie białek wirusowych, po tym kroku można zamontować i zobrazować szkiełka nakrywkowe (przejdź do kroku 3.3).

3. Immunofluorescencja do wykrywania ekspresji białek wirusowych

  1. Dodać 1 ml buforu blokującego (3% (w/v) albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w PBS) do każdego dołka i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
  2. Usunąć szkiełka nakrywkowe z płytki 12-dołkowej, przenieść do wilgotnej komory i przykryć 50 - 100 μl przeciwciała pierwszorzędowego (anty-RVFV, miły prezent od dr R.B. Tesh, UTMB) rozcieńczonego w buforze blokującym (1:500). Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności.

Uwaga: Dostosowując ten protokół do użycia z innym wirusem, najpierw określ optymalne rozcieńczenie dla swojego głównego przeciwciała.

Uwaga: Alternatywnie, ten krok można wykonać O/N przy 4 °C w ciemności.

  1. Wyjmij szkiełka nakrywkowe z wilgotnej komory i umieść je z powrotem na płytce 12-dołkowej i przemyj trzy razy 1 ml PBS na studzienkę.
  2. Wyjąć szkiełka nakrywkowe z 12-dołkowego miejsca, umieścić w wilgotnej komorze i przykryć 50 - 100 μl przeciwciała drugorzędowego (anty-mysie IgG sprzężonego z barwnikiem fluorescencyjnym [maksimum wzbudzenia/emisji: 495/519 nm]) rozcieńczonego w buforze blokującym (1:500). Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności.

Uwaga: Upewnij się, że wybrałeś przeciwciało drugorzędowe, które rozpozna twoje przeciwciało pierwszorzędowe i pasuje do filtrów w twoim mikroskopie fluorescencyjnym.

Uwaga: Jeśli jest to pożądane, 200 ng/ml DAPI można dodać do rozcieńczenia przeciwciał wtórnych, aby uwidocznić jądra.

  1. Wyjmij szkiełka nakrywkowe z wilgotnej komory i umieść je z powrotem na płytce 12-dołkowej i przemyj trzy razy 1 ml PBS na studzienkę.
  2. Zamontuj szkiełka nakrywkowe, umieszczając jedną kroplę (ok. 15 μl) Fluoromount-G na szkiełku mikroskopowym. Zanurz szkiełko nakrywkowe wH2O, usuń nadmiarH2O, dotykając stroną ręcznika papierowego, a następnie umieść stronę komórkową do dołu w kropli Fluoromount-G. Suszyć na powietrzu przez 5 min.

Uwaga: Jeśli obrazujesz na mikroskopie odwróconym, pozwól Fluoromount-G zastygnąć w temperaturze 4 °C O/N lub przymocuj szkiełka nakrywkowe do szkiełka mikroskopowego, uszczelniając krawędź przezroczystym lakierem do paznokci.

Uwaga: Slajdy mogą być natychmiast zobrazowane lub przechowywane w temperaturze 4 °C w ciemności przez okres do tygodnia.

4. Pozyskiwanie danych

  1. Obraz za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

Uwaga: Upewnij się, że wybrałeś odpowiednie fluorofory, które można zobrazować za pomocą mikroskopu. Dla porównania, poniżej przedstawiono fluorofory i zestawy filtrów używane do pozyskiwania obrazów przedstawionych w tej publikacji.

DAPI :
Filtr wzbudzenia: BP 330 - 385
Lustro dwuchromatyczne: DM 400
Filtr spalinowy: LP 420

Fluorofor o maksymalnej wartości wzbudzenia/emisji 495/519:
Filtr wzbudzenia: BP 460 - 490
Lustro dwuchromatyczne: DM 505
Filtr emisyjny: LP 510

Fluorofor o maksymalnej wartości wzbudzenia/emisji 590/617:
Filtr wzbudzenia: BP 545 - 580
Lustro dichromatyczne: DM 600
Filtr spalinowy: LP 610

Analiza transkrypcji za pomocą cytometrii przepływowej

5. Zainfekuj komórki MP-12 i oznacz powstające RNA za pomocą EU

  1. Wysiewaj 293 komórki na 6-dołkową płytkę do hodowli tkankowej w pożywce wzrostowej (DMEM zawierający 10% płodowej surowicy bydlęcej, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny). Inkubować w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 , aż komórki osiągną zlewność 80 - 100%.
  2. Zainfekuj komórki MP-12 przy m.o.i. wynoszącym 3. Uwzględnij co najmniej dwie niezainfekowane studzienki: jedna z dwóch studzienek będzie służyć jako niezainfekowana kontrola, druga zostanie potraktowana ActD w kroku 5.4. Usunąć pożywkę wzrostową i rozcieńczyć zapas wirusa tak, aby całkowita objętość dodana do każdej studzienki wynosiła 400 μl. Inkubować przez 1 godzinę w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  3. Usuń inokulum i dodaj 2 ml świeżej pożywki do dołka. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 12 godzin.

Uwaga: Jeśli dostosowujesz ten protokół do użycia z innym wirusem, zaleca się przeprowadzenie eksperymentu z biegiem czasu, aby określić optymalny punkt czasowy do etykietowania i zbierania. Ustaw ten przebieg czasowy tak, aby czasy infekcji były rozłożone w czasie, a wszystkie próbki mogły być etykietowane, zbierane i barwione w tym samym czasie.

  1. Przy 12 h.p.i. zastąp pożywkę wzrostową pożywką zawierającą 0,5 mM EU. Do jednej z pozorowanych zainfekowanych studzienek dodać również 5 μg/ml ActD. Będzie to służyć jako kontrola supresji transkrypcji, ponieważ ActD hamuje syntezę RNA zależną od DNA. Zwróć komórki do inkubatora.
  2. Przy 13 h.p.i. umyj komórki raz PBS i zbierz przez trypsynizację komórek. Zebrane komórki przemyć trzykrotnie PBS zawierającym 1 mM EDTA (PBS-EDTA).

Uwaga: Podczas tego i następnych kroków, nie wiruj komórek szybciej niż 500 - 1,000 x g, aby zapobiec ich rozpadowi. Odwirować komórki przez 1 - 2 minuty do osadu.

Uwaga: Jeśli planowane jest immunologiczne barwienie powierzchni po reakcji kliknięcia, zbierz za pomocą gumowego policjanta lub jednorazowego skrobaczki do komórek.

  1. Utrwalić komórki poprzez ponowne zawieszenie ich w 1 ml 4% PFA i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Patrz krok 1.6, aby uzyskać instrukcje dotyczące przygotowania 4% PFA.
  2. Przemyć raz 1 ml PBS-EDTA na studzienkę. Przejdź od razu do kroku 6.

Uwaga: Ważne jest, aby natychmiast przystąpić do reakcji kliknięcia, ponieważ RNA ulega degeneracji, jeśli jest przechowywane na tym etapie przez dłuższy czas. Podobnie, jeśli wykonujesz eksperyment w czasie, pamiętaj, aby oznaczyć, naprawić i zabarwić wszystkie próbki w tym samym czasie.

6. Kliknij Reakcję, aby wykryć oznakowane RNA

  1. Przepuszczalność komórek poprzez ponowne zawieszenie w 0,5 ml 0,2% Triton X-100 w PBS. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.

Uwaga: Wszystkie roztwory użyte w krokach od 6.1 do 6.3 muszą być wolne od nukleaz.

Uwaga: Jeśli komórki nie osadzają się prawidłowo podczas tego kroku, zwiększ czas wirowania do 5 minut. Zachowanie sedymentacji poprawi się, gdy komórki zostaną zawieszone w buforze FACS (krok 6.4).

  1. Przemyć raz 1 ml PBS.

Uwaga: Nie używaj EDTA w tym kroku, ponieważ spowoduje to chelatowanie jonów Cu2+ niezbędnych do reakcji kliknięcia.

  1. Zawieś komórki w 200 μl roztworu barwiącego (100 mM Tris pH 8,5, 1 mM CuSO4, 200nM azydek znakowany barwnikiem fluorescencyjnym [maksimum wzbudzenia/emisji: 650/665 nm], 100 mM kwasu askorbinowego). Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności.

Uwaga: Przygotuj świeżo roztwór do barwienia kliknięć bezpośrednio przed tym krokiem. Roztwory podstawowe 1,5 M Tris pH 8,5, 100 mMCuSO4 i 500 mM kwasu askorbinowego można przechowywać w temperaturze 4 °C. Należy jednak wyrzucić wszelki roztwór podstawowy kwasu askorbinowego, który zmienił kolor na żółty.

Uwaga: Jeśli komórki zlepią się ze sobą podczas tego kroku, ponownie zawieś przez kilka razy pipetowanie w górę i w dół.

Uwaga: Upewnij się, że wybrałeś fluorofor, który może być wykryty przez twój cytometr przepływowy.

Uwaga: Przygotuj również jedną próbkę zainfekowanych komórek, które nie są poddawane procedurze barwienia za pomocą kliknięcia; będą one potrzebne do kalibracji cytometru przepływowego. Użyj połowy zainfekowanych komórek lub dołącz dodatkową zainfekowaną studzienkę w kroku 5.2. Te komórki kontrolne zostaną wybarwione immunologicznie w kroku 7.1.

  1. Przemyć dwukrotnie buforem FACS (PBS zawierający 1 mM EDTA i 0,5% (w/v) BSA).

Uwaga: Jeśli nie jest pożądane barwienie immunologiczne białek wirusa, komórki mogą być natychmiast analizowane (przejdź do kroku 8).

7. Immunofluorescencja do wykrywania ekspresji białek wirusowych

  1. Zawiesić komórki w 200 μl przeciwciała pierwszorzędowego (anty-RVFV) rozcieńczonego w buforze FACS (1:10 000) i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności.

Uwaga: Alternatywnie, ten krok można wykonać O/N przy 4 °C w ciemności.

Uwaga: Przygotuj również jedną próbkę niezainfekowanych komórek, które zostały poddane procedurze barwienia za pomocą kliknięcia, ale nie będą wybarwione immunologicznie, będą one potrzebne do kalibracji cytometru przepływowego. Użyj połowy pozorowanych zainfekowanych komórek lub dołącz dodatkową niezainfekowaną studzienkę w kroku 5.2.

Uwaga: Dostosowując ten protokół do użycia z innym wirusem, najpierw określ optymalne rozcieńczenie dla swojego głównego przeciwciała.

  1. Umyj komórki dwukrotnie w buforze FACS.
  2. Zawiesić komórki w 200 μl przeciwciała drugorzędowego (anty-mysie IgG sprzężone z barwnikiem fluorescencyjnym [maksimum wzbudzenia/emisji: 495/519 nm]) rozcieńczonego w buforze FACS (1:1,000) i inkubować przez 1 godzinę w RT w ciemności.
  3. Umyj komórki raz w buforze FACS.

Uwaga: W tym momencie komórki mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C w ciemności.

8. Pozyskiwanie danych

  1. Ponownie zawiesić komórki w buforze FACS o pojemności 500 μl, przenieść do probówek polistyrenowych o pojemności 5 ml i przeanalizować za pomocą cytometru przepływowego. Użyj komórek zainfekowanych MP-12 (brak reakcji kliknięcia, tylko barwienie anty-RVFV) i pozorowanych zainfekowanych komórek (tylko reakcja kliknięcia), aby skalibrować instrument.

Uwaga: Upewnij się, że wybrałeś odpowiednie fluorofory, które mogą być wykryte przez twój instrument. Dla porównania, poniżej przedstawiono linie laserowe i zestawy filtrów używane do pozyskiwania danych przedstawionych w tej publikacji.

Fluorofor o widmie wzbudzenia/emisji 495/519:
Laser: 488 nm
Filtr: 530/30

Fluorofor o widmie wzbudzenia/emisji 650/665:
Laser: 640 nm
Filtr: 670/20

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Białko NSs wirusa RVFV (rodzina Bunyaviridae, rodzaj Phlebovirus) 11 hamuje ogólną transkrypcję komórek gospodarza poprzez dwa odrębne mechanizmy: (i) poprzez sekwestrację podjednostki p44 podstawowego czynnika transkrypcyjnego TFIIH11 oraz (ii) poprzez promowanie degradacji proteasomalnej podjednostki p62 TFIIH 6. Do eksperymentów opisanych w niniejszym protokole wykorzystano szczep szczepionkowy RVFV MP-12 13, ponieważ szczep MP-12 może być przetwarzany w la...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Dostarczony protokół opisuje metodę pomiaru wpływu infekcji wirusowej na transkrypcję komórek gospodarza poprzez włączenie analogu urydyny UE do powstającego RNA. Ta metoda ma kilka zalet w porównaniu z poprzednimi metodami: jest szybka, czuła i nie opiera się na użyciu izotopów promieniotwórczych. Ponadto metodę można dostosować do uzyskiwania danych jakościowych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub danych ilościowych za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu zasadniczo tych samych odczynników. W połączeniu z ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

Dziękujemy R.B. Teshowi za dostarczenie mysiej poliklonalnej surowicy anty-RVFV oraz M. Griffinowi z UTMB Flow Cytometry Core Facility za pomoc w cytometrii przepływowej. Praca ta była wspierana przez 5 AI057156 U54 za pośrednictwem Western Regional Center of Excellence, grant NIH R01 AI08764301, a finansowanie z Sealy Center for Vaccine Development w UTMB.B.K. było wspierane przez James W. McLaughlin Fellowship Fund w UTMB.O.L. było wspierane przez Maurice R. Hilleman Early-Stage Career Investigator Award.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

e.g.
Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
5-etynylo-urydynaBerry AssociatesPY 7563rozpuszcza się w DMSO dla 100 mM zapasów
12-milimetrowe okrągłe szkiełka nakrywkoweFisherbrand12-545-82
Probówki polistyrenowe 5 mlBD Biosciences352058
Actinomycin D (ActD)Sigma9415rozpuszcza się w DMSO dla 10 mM zapas
Alexa Fluor 488 kozia anty-mysia IgGInvitrogenA-11029
Albumina surowicy bydlęcej (BSA) Santa Cruzsc-2323
CuSO4SigmaC-8027rozpuszczać w H2O dla 100 mM zapasu
DAPI SigmaD-9542rozpuszczać w H2O dla 5 mg/ml zapasu
DMEM Invitrogen11965092
FBSInvitrogen16000044
azydek fluorescencyjny (Alexa Fluor 594-sprzężony)InvitrogenA10270
azydek fluorescencyjny (Alexa Fluor 657-sprzężony)InvitrogenA10277
Fluoromount-GSouthern Biotech0100-01
Kwas L-askorbinowySigmaA-5960rozpuszcza się w H2O przez 500 mM
filtr papierowyVWRbrand28333-087
paraformaldehyd Sigma158127
Penicylina-StreptomycynaInvitrogen15140122
poli-L-lizyna (MW ≥ 70000)SigmaP1274
Triton X-100SigmaT-8787
Baza TrizmaSigmaT-1503rozpuścić w H2O dla 1,5 M bulionu
mikroskop fluorescencyjnynp.
, pH 8,5 Trypsyna-EDTA Invitrogen 25200056 Cytometr przepływowy Olympus IX71 BD Biosciences LSRII Fortessa

Bibliografia

  1. Fakan, S. Structural support for RNA synthesis in the cell nucleus. Methods Achiev. Exp. Pathol. 12, 105-140 (1986).
  2. Jensen, P. O., Larsen, J., Christiansen, J., Larsen, J. K. Flow cytometric measurement of RNA synthesis using bromouridine labelling and bromodeoxyuridine antibodies. Cytometry. 14, 455-458 (1993).
  3. Jao, C. Y., Salic, A. Exploring RNA transcription and turnover in vivo by using click chemistry. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 15779-15784 (2008).
  4. Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes. Angew Chem. Int. Ed. Engl. 41, 2596-2599 (2002).
  5. Tornoe, C. W., Christensen, C., Meldal, M. Peptidotriazoles on solid phase: [1,2,3]-triazoles by regiospecific copper(i)-catalyzed 1,3-dipolar cycloadditions of terminal alkynes to azides. J. Org. Chem. 67, 3057-3064 (2002).
  6. Kalveram, B., Lihoradova, O., Ikegami, T. NSs protein of rift valley fever virus promotes posttranslational downregulation of the TFIIH subunit p62. J. Virol. 85, 6234-6243 (2011).
  7. Kalveram, B., et al. Rift Valley fever virus NSs inhibits host transcription independently of the degradation of dsRNA-dependent protein kinase PKR. Virology. , (2012).
  8. Head, J. A., Kalveram, B., Ikegami, T. Functional analysis of Rift Valley fever virus NSs encoding a partial truncation. PLoS One. 7, e45730(2012).
  9. Lihoradova, O. A., et al. Characterization of Rift Valley Fever Virus MP-12 Strain Encoding NSs of Punta Toro Virus or Sandfly Fever Sicilian Virus. PLoS Negl Trop Dis. 7, e2181(2013).
  10. Kalveram, B., Ikegami, T. Toscana Virus NSs Protein Promotes Degradation of Double-Stranded RNA-Dependent Protein Kinase. J. Virol. , (2013).
  11. Schmaljohn, C., Nichol, S. In Fields Virology. Knipe, D. M., et al. , Lippincott Williams and Wilkins. 1741-1789 (2007).
  12. Le May, N., et al. TFIIH transcription factor, a target for the Rift Valley hemorrhagic fever virus. Cell. 116, 541-550 (2004).
  13. Caplen, H., Peters, C. J., Bishop, D. H. Mutagen-directed attenuation of Rift Valley fever virus as a method for vaccine development. J. Gen. Virol. 66, 2271-2277 (1985).
  14. Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. Rescue of infectious Rift Valley fever virus entirely from cDNA, analysis of virus lacking the NSs gene, and expression of a foreign gene. J. Virol. 80, 2933-2940 (2006).
  15. Vyboh, K., Ajamian, L., Mouland, A. J. Detection of viral RNA by fluorescence in situ hybridization (FISH). J. Vis. Exp. , e4002(2012).
  16. Reich, E., Goldberg, I. H. Actinomycin and nucleic acid function. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 3, 183-234 (1964).
  17. Holmes, K. L., Lantz, L. M., Russ, W. Conjugation of fluorochromes to monoclonal antibodies. Curr. Protoc. Cytom. Chapter 4 (Unit 4 2), (2001).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

aktywność transkrypcyjnawirus gorączki doliny Riftznakowanie EUazydki fluorescencyjnemikroskopia fluorescencyjnacytometria przepływowanowo powstałe RNAsupresja transkrypcji
Wykorzystanie chemii kliknięć do pomiaru wpływu infekcji wirusowej na syntezę RNA komórki gospodarza
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.