Luminometryczne badania elektrofizjologiczne oocytów drożdży i oocytów Xenopus molekularnej mechanowrażliwości TRPV4

Podsumowanie

Aby uzupełnić powszechnie stosowane metody badania TRPV4, opisano dwie metody: Jego mechanowrażliwość może być badana za pomocą luminometrii Ca²⁺-aequorin w transgenicznych drożdżach po prowokacji hypo-osmotycznej. Można go również badać w oocytach Xenopus z wstrzyknięciem TRPV4-RNA za pomocą dwuelektrodowego zacisku napięciowego całej komórki lub zacisku krosowego w trybie on-cell lub wyciętym.

Streszczenie

TRPV4 (Transient Receptor Potentials, rodzina waniloidów, typ 4) jest szeroko wyrażany w tkankach kręgowców i jest aktywowany przez kilka bodźców, w tym przez siły mechaniczne. Niektóre mutacje TRPV4 powodują złożone dziedziczne patologie kości lub neuronów u ludzi. Transgeny TRPV4 typu dzikiego lub zmutowanego są powszechnie ulegane ekspresji w hodowanych komórkach ssaków i badane za pomocą fluorometrii Fura-2 i elektrod. Jeśli chodzi o mechanizm mechanowrażliwości i molekularne podstawy chorób, obecna literatura jest zagmatwana i kontrowersyjna. Aby uzupełnić istniejące metody, opisujemy dwie dodatkowe metody badania właściwości molekularnych TRPV4. (1) Szczurzy TRPV4 i transgen aequoryny są przekształcane w pączkujące drożdże. Wstrząs hipoosmtyczny populacji transformantów daje sygnał luminometryczny dzięki połączeniu aequoryny z Ca²⁺, uwalnianej przez kanał TRPV4. Tutaj TRPV4 jest izolowany ze swoich zwykłych białek partnerskich ssaków i ujawnia swoją własną mechanowrażliwość. (2) cRNA TRPV4 wstrzykuje się do oocytów Xenopus. Po odpowiednim okresie inkubacji makroskopowy prąd TRPV4 jest badany za pomocą dwuelektrodowych cęgów napięciowych. Wzrost prądu po usunięciu obojętnego osmoticum z kąpieli oocytów wskazuje na mechanowrażliwość. Prądy mikroamperowe (^10-6 do ^10-4 A) z oocytów są znacznie większe niż prądy subnano- do nanoamperowe (^10-10 do ^10-9 A) z hodowanych komórek, co daje jaśniejsze dane ilościowe i bardziej wiarygodne oceny. Prądy mikroskopowe odzwierciedlające aktywność poszczególnych białek kanałowych mogą być również rejestrowane bezpośrednio pod klamrą krosową, w trybie on-cell lub po wycięciu. Ten sam oocyt dostarcza wiele próbek plastrów, co pozwala na lepszą replikację danych. Ssanie zastosowane do plastrów może aktywować TRPV4 w celu bezpośredniej oceny wrażliwości mechanologicznej. Metody te powinny być również przydatne w badaniu innych typów kanałów TRP.

Wprowadzenie

TRP (przejściowe potencjały receptorowe) składają się z siedmiu podrodzin kanałów kationowych, które pełnią funkcje sensoryczne^1,2. U ssaków TRPV, waniloidowa podrodzina TRP, ma sześć odmian. TRPV4 (typ 4)^3,4 reaguje na ciepło, niektóre chemikalia, pęcznienie osmotyczne lub naprężenia ścinające. Gen TRPV4 był wielokrotnie izolowany przez klonowanie genu kandydującego i/lub ekspresji^5-8. Ta ostatnia metoda była zgodna z reakcją produktu genu na hipoosmolarność. TRPV4 ulega ekspresji w prawie wszystkich narządach i funkcjach w rozwoju, fizjologii lub patologii wielu różnych typów komórek^3,4.

Protokół

1. Metody luminometrii drożdży

Użyj szczepu BYYT z Saccharomyces cerevisiae. Jest to pochodna yvc1-tok1- BY4741 (MATa, ura3D0, his3D1, leu2D0, lys2D0, yvc1::HIS3, tok1::kanMX4). Przekształć komórki za pomocą selektywnego przez leu plazmidu eksprymującego aequorynę pEVP1 / Aeq i selektywnego przez szczura plazmidu p416GPDV4 z ekspresją TRPV4 wybieranego przez URA, zgodnie z opisem w Batiza i wsp.²⁶ oraz Loukin i wsp.²⁴ Stosować standardowe metody budowy i transformacji plazmidu²⁷. Szczep drożdży i plazmidy są dostępne na życzenie.

1. Hodo....

Wyniki

W typowym eksperymencie luminometrycznym zakres hipotonicznych szoków w przedziale 400-1,200 mOsM uzyskuje się poprzez dodanie 200 μl roztworów szokowych o różnej niskiej osmolarności do 20 μl hodowli o stężeniu 1,400 mOsM. Aktywność TRPV4 jest widoczna, gdy RLU próbki doświadczalnej porównuje się z RLU dwóch kontroli negatywnych: komórek drożdży transformowanych pustym plazmidem p416GPDV4 lub plazmidem zawierającym gen TRPV4 z mutacją w filtrze jonowym (Rycina 1)²⁴.

Dyskusja

Jak stwierdzono we Wprowadzeniu, metody powszechnie stosowane do badania funkcji TRPV4 czasami prowadziły do niespójności i kontrowersji. Opisane tutaj dwa zestawy metod mają pewne zalety i mogą uzupełniać istniejące metody. Chociaż opisujemy tylko badania nad TRPV4, metody mogą zostać rozszerzone o badanie również innych kanałów jonowych.

1. Metody luminometrii drożdży

Pączkujące drożdże mają natywną odpowiedź napływu Ca^{2 +} na szok hipoosmotyczny, który je.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Oscylometr ciśnienia pary	Wescor	Wescor 5500	Logan, UT, USA
Luminometr jednorurkowy Sirius	Titertek-Berhold	Sirius	Huntsville, LA, Stany Zjednoczone
Luminometr mikropłytkowy	Titertek-Berthold	Mithras LB940	Huntsville, LA, Stany
Zjednoczone Oprogramowanie do luminometrii	Titertek-Berthold	MikroWin2000	Huntsville, LA, USA
Zacisk krosowy i oprogramowanie	Scena czołowa Axon Instrument	HS2A, wirtualny zacisk kąpielowy VG-2Ax100, wzmacniacz GeneClamp 500, digitizer digidata 1440, Oprogramowanie pClamp10	Union City, CA, Stany Zjednoczone
Manometr	Bio-Tec		Winooski, VT, Stany
Zjednoczone Ściągacz do pipet	Sutter Instrument Co	Model P-97	Novata, CA, USA
Mikrowstrzykiwacz	Drummond Scientific	Nanoinject II	Broomall, PA, Stany Zjednoczone
Lucyferyna coelenterazine	Invitrogen		Carlsbad, CA, USA
T7 Polimeraza RNA reakcja	Ambion	mMessage mMachine	Austin, TX, USA
Gentamycyna	Sigma
Ruten czerwony	Sigma
Mikropipety	Mikropipety Drummond	100 mikrolitrów	Broomall, PA, Stany Zjednoczone
Polimeraza PfuUtra o wysokiej wierności	Stratagene		La Jolla, Kalifornia, Stany Zjednoczone