Metoda przygotowania szkiełek w celu zachowania trójwymiarowej architektury chromatyny komórek rozrodczych jąder

Podsumowanie

Materiał tutaj opisuje metodę opracowaną w celu zachowania trójwymiarowej struktury chromatyny komórek rozrodczych jąder. Zostało to nazwane metodą slajdów trójwymiarowych (3D). Metoda ta poprawia czułość wykrywania struktur subjądrowych i ma zastosowanie do immunofluorescencji, fluorescencji DNA i fluorescencji RNA hybrydyzacji in situ (FISH).

Streszczenie

Podczas różnicowania komórek rozrodczych jąder, struktura chromatyny jądrowej zmienia się dynamicznie. Poniżej opisano metodę mającą na celu zachowanie trójwymiarowego układu chromatyny w komórkach rozrodczych jąder znajdujących się u myszy; metoda ta została określona jako metoda slajdów trójwymiarowych (3D). W tej metodzie kanaliki jądrowe są bezpośrednio traktowane etapem przepuszczalności, który usuwa materiał cytoplazmatyczny, a następnie etapem fiksacji, który utrwala materiały jądrowe. Kanaliki są następnie dysocjowane, zawiesina komórkowa jest cytospunowana, a komórki przylegają do szkiełek. Metoda ta poprawia czułość na wykrywanie struktur subjądrowych i ma zastosowanie do immunofluorescencji, fluorescencji DNA i RNA hybrydyzacji in situ (FISH) oraz kombinacji tych metod wykrywania. Jako przykład możliwego zastosowania metody slajdów 3D pokazano COT-1 RNA FISH do wykrywania powstających RNA. Metoda slajdów 3D ułatwi szczegółowe badanie relacji przestrzennych między strukturą chromatyny, DNA i RNA podczas różnicowania komórek rozrodczych jąder.

Wprowadzenie

W jądrach komórki rozrodcze różnicują się od plemników diploidalnych poprzez mejozę do dojrzałych, haploidalnych plemników. Podczas tego procesu struktura chromatyny jądrowej komórek rozrodczych ulega ciągłej i dynamicznej przebudowie. Rozprzestrzenianie się powierzchniowe jest powszechnie stosowane do badania cytologicznego pojedynczych komórek plemnikotwórczych. Dominującą metodą rozprzestrzeniania się powierzchniowego jest leczenie hipotoniczne, w którym poszczególne komórki plemnikowe są rozprowadzane i spłaszczane¹. Warunki te są optymalne do szczegółowej analizy chromosomów mejotycznych. Cechy chromosomalne, takie jak status synaptyczny i ogniska rekombinacji, można łatwo zaobserwować za pomocą tej metody. Jednak leczenie hipotoniczne zaburza subjądrową architekturę chromatyny, dlatego technika ta nie nadaje się do analizy strukturalnej jąder. W związku z tym opracowano ulepszoną metodę w celu zachowania trójwymiarowej struktury chromatyny komórek rozrodczych jąder. Metoda ta została określona jako metoda slajdów trójwymiarowych (3D) (rysunek 1). Metoda szkiełek 3D umożliwiła wykrycie powstającej lokalizacji RNA w jądrach, ponieważ początkowo została zoptymalizowana do badania ekspresji genów i stanów chromatyny podczas różnicowania komórek rozrodczych jąder za pomocą fluorescencji RNA hybrydyzacji in situ (FISH)^2,3. Ta metoda 3D ma również zastosowanie do kombinacji immunofluorescencji, DNA i RNA FISH. Ponadto metoda ta pomogła w odkryciu postmejotycznej chromatyny płciowej (PMSC), cichego przedziału chromosomów płciowych znajdujących się w postmejotycznych spermatydach².

Metoda slajdów 3D została pierwotnie zoptymalizowana poprzez połączenie dwóch podstawowych etapów przygotowania preparatów powszechnie stosowanych do barwienia jądrowego: etapu utrwalania przeznaczonego do utrwalania materiałów jądrowych oraz etapu przepuszczalności mającego na celu usunięcie materiałów cytoplazmatycznych w celu poprawy dostępności odczynników barwiących, takich jak przeciwciała i sondy FISH. Jak opisano wcześniej w innej publikacji³, ustalono, że etap permeabilizacji musi poprzedzać etap fiksacji, aby uzyskać optymalne wyniki przy niskim tle cytoplazmatycznym. W tej metodzie szkiełka 3D etap przepuszczalności i następujący po nim etap utrwalania są wykonywane bezpośrednio na kanalikach nasiennych, a następnie następuje mechaniczna dysocjacja komórek rozrodczych za pomocą kleszczy przed cytoprzędzeniem na szkiełkach. Alternatywna metoda oznaczania RNA FISH komórek plemnikotwórczych została opracowana w innym laboratorium⁴. W tej metodzie, zgodnej z metodą 3D, etap permeabilizacji musi poprzedzać etap utrwalania, aby uzyskać optymalne wyniki RNA FISH.

Poniższy protokół opisuje metodę slajdów 3D i podaje przykład możliwego zastosowania, Cot-1 RNA FISH do wykrywania powstających RNA. DNA Cot-1 składa się z powtarzających się elementów genomu. W tym przypadku sonda DNA Cot-1 jest hybrydyzowana z intronem i UTR powstających transkryptów, wykrywając w ten sposób aktywne transkrypcyjnie regiony w jądrze^5,6. Preparaty 3D są wszechstronne i mogą być stosowane do kombinacji technik immunofluorescencji, DNA i RNA FISH w celu uzyskania szczegółowych badań relacji przestrzennych między architekturą chromatyny.

Protokół

1. 3D Przygotowanie slajdów

1. Przygotuj następujące odczynniki:
   1. Bufor CSK: 100 mM NaCl, 300 mM sacharozy, 10 mM RURY, 3 mM MgCl₂. Doprowadzić pH do 6,8 za pomocą 1 M NaOH. Przechowywać bufor CSK w temperaturze 4 °C.
   2. Bufor CSK z 0,5% Triton X-100: Dodać 200 μl Triton X-100 do 40 ml buforu CSK. Mieszać roztwór za pomocą mieszadła magnetycznego aż do całkowitego rozpuszczenia Triton X-100. Przechowywać bufor CSK z 0,5% Triton X-100 w temperaturze 4 °C.
   3. 4% Paraformaldehyd (PFA)–PBS, pH 7,4: Rozpuść 4 g PFA w około 70-80 ml wody. W celu przyspieszenia procesu rozpuszczania dodać około 20 μl 4 N NaOH i utrzymywać roztwór w łaźni wodnej w temperaturze 60 °C do momentu całkowitego rozpuszczenia PFA i uzyskania przezroczystości. Ten proces trwa około 1 godziny. Po całkowitym rozpuszczeniu PFA dodać 10 ml 10x PBS. Uzupełnić końcową objętość do 100 ml wodą i schłodzić roztwór do temperatury pokojowej (25 °C). Używaj świeżo przygotowanego roztworu do każdego nowego eksperymentu.
      Uwaga: Uzyskaj pozwolenie instytucjonalne na wszystkie prace ze zwierzętami i przestrzegaj odpowiednich wytycznych dotyczących opieki nad zwierzętami.
2. Poddaj eutanazji samce myszy. Za pomocą kleszczy i nożyczek wytnij jądro od myszy. Umieść jądro w PBS (lub RPMI 1640). Po usunięciu jądra szybko wykonaj następujące kroki 1.3-1.4, aby zapobiec degradacji RNA.
3. Rozerwij jądro na małej szalce Petriego i usuń osłonkę białawą. Rozwikłać kanaliki nasienne w PBS na lodzie za pomocą kleszczy.
4. Za pomocą kleszczy przenieść kilka kanalików (kilka kawałków kanalików o długości około 5-10 mm) do jednego dołka 4-dołkowego naczynia zawierającego 500 ml buforu CSK + 0,5% Triton X-100 na lodzie i inkubować przez 6 minut. Nadmierna ekspozycja na bufor CSK może spowodować rozerwanie komórek.
5. Za pomocą kleszczy przenieś wszystkie kanaliki do jednego dołka 4-dołkowego naczynia zawierającego 4% roztworu PFA-PBS. Ten etap można wykonać bez mikroskopu stereoskopowego, ale opcjonalnie można go użyć. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Jednocześnie należy rozpocząć przygotowanie 12 komór cytospinowych w okresach inkubacji.
6. Za pomocą kleszczy przenieś wszystkie kanaliki do jednego dołka 4-dołkowego naczynia zawierającego PBS. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
7. Na odwrocie szkiełka przenieś wszystkie kanaliki do 30 μl PBS (należy unikać górnej części szkiełka ze względu na ładunek kationowy). Za pomocą końcówek dwóch kleszczy rozerwij kanaliki na kawałki. Posiekaj kanaliki w kierunku poziomym, wciskając kanaliki między końcówki dwóch kleszczy i ciągnąc kleszcze poziomo. Kontynuuj ten krok przez około 10-20 sekund.
8. Wymieszać zawiesinę, pipetując za pomocą pipety P20.
9. Przenieść zawiesinę do probówki do mikrowirówki, rozcieńczyć PBS do około 1,3 ml. Nałożyć 100 μl zawiesiny na każdą z 12 komór cytospinowych (łącznie 1,2 ml). Na tym etapie nie trzeba określać stężenia komórek.
10. Cytowirować próbki z prędkością 2 000 obr./min przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Po cytowirowaniu suszyć szkiełka na stole laboratoryjnym przez kilka minut w temperaturze pokojowej. Po pozostawieniu szkiełek do całkowitego wyschnięcia na kilka minut przejdź do następnego kroku.
11. Używając słoika Coplin zawierającego PBS, myj szkiełka przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
12. Przenieś szkiełka do słoika Coplin zawierającego 70% etanolu i odczekaj co najmniej 2 minuty przed inicjacją RNA FISH. Szkiełka są stabilne przez kilka tygodni w 70% etanolu w temperaturze 4 °C. W przypadku długotrwałego przechowywania należy odwodnić szkiełka za pomocą seryjnej obróbki 80% i 100% etanolem w słoikach Coplin przez 2 minuty każdy, a następnie całkowicie odwodnić szkiełka na powietrzu. Przechowywać w temperaturze -80 °C w pudełku na szkiełka.

2. Przygotowanie sondy DNA Cot-1 przez losowe gruntowanie

1. Przygotuj następujące odczynniki:
   1. Bufor do hybrydyzacji: Wymieszaj postępujące składniki, aby przygotować 900 ml zapasu buforowego do hybrydyzacji; roztwór ten zostanie użyty do przechowywania sond. Ten zapas buforowy do hybrydyzacji pozwala na dodanie 10% objętości roztworu inhibitora RNazy (kompleks rybonukleozydu wanadylu) przed hybrydyzacją. szt. szt. szt. szt.

      składnik	Ilość (μl)	Końcowe stężenie
      Formamid	500	50% (v/v)
      50% dekstranu	200	10% (w/v)
      20x SSC	100	2x
      1% powierzchni ciała	100	0,1 %

      Przed hybrydyzacją dodaj 1/10 obj. 200 mM kompleksu rybonukleozydu wanadylu lub wody do buforu hybrydyzacji, aby dopasować do końcowego stężenia. W temperaturze -20 °C mieszanina ta jest stabilna przez ponad rok.
   2. 20x SSC: Rozpuścić 88,2 g cytrynianu sodu i 175,3 g NaCl w około 800 ml wody. Dostosuj pH do 7,0 za pomocą kilku kropli 1 M HCl. Dodaj wodę, aby dostosować końcową objętość do 1 l. Sterylizuj w autoklawie. Po przygotowaniu 20x SSC można przechowywać w temperaturze pokojowej.
   3. 50% (w/v) Dekstranu: Wymieszaj wodę i powoli dodaj 50 g siarczanu dekstranu. Mieszaj przez noc w temperaturze pokojowej. Dodaj wodę, aby dostosować końcową objętość do 100 ml. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
2. Dodaj następujące składniki wymienione poniżej do probówki PCR. Za pomocą maszyny do PCR wymieszać i inkubować roztwór przez 5 minut w temperaturze 95 °C.

   składnik	Ilość na reakcję (μl)	Finał
   DNA Cot-1: 1 mg/ml	1	1 μg
   Losowy podkład 9mer (z zestawu)	10
   Woda	27

3. Krótko odwirować i umieścić na lodzie.
4. Dodaj następujące składniki. Mieszać i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C za pomocą maszyny do PCR. (Szczegółowe informacje na temat używanego zestawu znajdują się w tabeli odczynników i wyposażenia).

   składnik	Ilość na reakcję (μl)	Końcowe stężenie
   Mieszanina przygotowana z kroku 2.2	38
   5x bufor nukleotydowy (z zestawu)	9.2
   Cy3-dUTP (1 mM)	0.8	16 μM
   Klenow (z zestawu)	2

5. Dodać 2 μl buforu zatrzymującego (z zestawu), aby przerwać reakcję.
6. Oczyść zatrzymaną reakcję za pomocą kolumn mikrowirowych.
7. Do oczyszczonej frakcji dodać 50 μg (5 μl) DNA plemnika śledzia (50-krotny nadmiar matrycowego DNA Cot-1).
8. Zmierz całkowitą objętość za pomocą pipety. Dodać 0,7x objętość 100% etanolu i 0,1x objętość 3 M octanu sodu (pH 5,2), dobrze wymieszać i wirować przez 15 minut z maksymalną prędkością (17 000 x g) za pomocą mikrowirówki w temperaturze 4 °C.
9. Usunąć płyn i dodać 200 μl 70% etanolu, dobrze wymieszać i odwirować przez 5 minut z maksymalną prędkością w temperaturze 4 °C.
10. Usuń nadmiar płynu. Suszyć osad przez 10-30 minut w temperaturze pokojowej.
11. Rozpuścić osad w 20 μl buforu do hybrydyzacji. Ponieważ osad jest często trudny do rozpuszczenia, należy wielokrotnie pipetować. Alternatywną opcją może być również mieszalnik wirowy do wydajnego rozpuszczenia granulatu. Sondy można przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia.

3. Ryba RNA COT-1

1. Dodaj wymienione poniżej składniki do probówki do PCR. Za pomocą maszyny do PCR inkubować przez 10 minut w temperaturze 80 °C, a następnie etap wstępnego wyżarzania trwający około 10-30 minut w temperaturze 42 °C. Utrzymywać w temperaturze 42 °C do momentu hybrydyzacji. Kompleks rybonukleozydu wanadylu jest opcjonalny; Można go zastąpić wodą.

   składnik	Ilość na reakcję (μl)	Finał
   Sonda DNA Cot-1 (50 ng/μl)	2	100 ng
   Kompleks rybonukleozydu wanadylu (200 mM)	2	20 mM
   Bufor hybrydyzacyjny	dodano do 20

2. Odwodnić szkiełka w słoiku Coplin zawierającym 80% etanolu przez 2 minuty, a następnie w słoiku Coplin zawierającym 100% etanolu przez 2 minuty. Całkowicie wysuszyć szkiełka na stole laboratoryjnym w temperaturze pokojowej.
3. Wcześniej podgrzej komorę pojemnika na końcówki (wypełnioną 2-3 cm wody) w inkubatorze o temperaturze 42 °C. Umieść szkiełko w komorze pudełka na końcówki. Krótko odwirować wstępnie wyżarzone sondy i pipetować bezpośrednio na odwodnione szkiełka. Unikaj robienia bąbelków. Delikatnie przykryj szkiełko szkiełkiem nakrywkowym.
4. Hybrydyzować przez 6 godzin do nocy (14-15 godzin) w temperaturze 42 °C.
5. Przygotuj roztwory do mycia w słoikach Coplin (dwa słoiki z 2x SSC i 50% formamidu oraz dwa słoiki z 2x SSC). Rozgrzej w temperaturze 42 °C przez 30 minut w łaźni wodnej.
6. Użyj żyletki, aby usunąć szkiełko nakrywkowe z krawędzi szkiełka. Unikaj zarysowania próbek. Myj szkiełka w słoiku Coplin zawierającym 2x SSC i 50% formamidu przez 5 minut w temperaturze 45 °C. Powtórz ten krok raz.
7. Myć szkiełka w słoiku Coplin zawierającym 2x SSC przez 5 minut w temperaturze 45 °C. Powtórz ten krok raz.
8. Dodaj 20 μl nośnika do montażu DAPI na szkiełkach i przykryj szkiełkiem nakrywkowym. Delikatnie dociśnij szklaną pokrywę, aby usunąć dodatkowe nośniki montażowe. Wytrzyj dodatkowe media montażowe chusteczką czyszczącą. Preparaty są gotowe do oceny mikroskopowej.

Wyniki

Reprezentatywny wynik slajdu 3D jest pokazany na rysunku 2. W tym eksperymencie wykonano COT-1 RNA FISH w celu wykrycia powstającej transkrypcji wraz z barwieniem immunologicznym przy użyciu przeciwciał anty CBX1 i γH2AX. Aby połączyć RNA FISH i barwienie immunologiczne, najpierw przeprowadzono barwienie immunologiczne, a następnie RNA FISH, jak opisano w³. CBX1 jest białkiem heterochromatyny, które lokalizuje się w heterochromatynie pericentromerowej i cichych chromosomach płci w mejozie zwan...

Dyskusja

W przygotowaniu slajdów 3D etap przepuszczalności poprzedza etap utrwalania. Etapy te są wykonywane bezpośrednio na kanalikach nasiennych, zachowując w ten sposób trójwymiarową strukturę chromatyny. Alternatywną opcją zachowania struktury chromatyny dla RNA / DNA RYB jest jednoczesne wykonanie etapu przepuszczalności i etapu utrwalania. Ta alternatywna technika została przeprowadzona na komórkach rozrodczych torbacza i na mysich zarodkach przedimplantacyjnych^7,8. Jeśli jednak etap fiksacji poprzedza etap przep...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DNA łóżeczka COT-1	Invitrogen	18440-016
Stratagene Prime-It Fluor Zestaw do znakowania fluorescencyjnego	Agilent	300380
Roztwór DNA plemników śledzia	Invitrogen	15634-017
Etanol. 200 dowód (absolutny)	Pharmco-aaper	111000200
Octan sodu	Sigma-Aldrich	S2889
Formamid dejonizowany	American Bioanalytical	AB00600-00500
Cytrynian sodu trójzasadowy dwuwodny	Sigma-Aldrich	C8532
Albumina surowicy bydlęcej	Lifeblood Medical	77110-100
Sól sodowa siarczanu dekstranu z Leuconostoc spp.	Sigma-Aldrich	D6001
RPMI 1640	Invitrogen	A10491-01
Sacharoza	Sigma-Aldrich	S0389
RURY	Sigma-Aldrich	P6757
Sześciowodny chlorek magnezu	Sigma-Aldrich	M0250
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Paraformaldehyd	Sigma-Aldrich	76240
Wodorotlenek sodu	Sigma-Aldrich	221465
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami	Sigma-Aldrich	P4417
VECTASHIELD Podłoże montażowe z DAPI	Vector Laboratories	H1200
Kompleks rybonukleozydowo-wanadylowy	New England Biolabs	S1402S
Illustra MicroSpin G-50 Kolumny	GE Healthcare	27-5330-01
Mikrowirówka	Eppendorf	5424
Kleszcze	VWR	300-050
Probówki do mikrowirówek	Bioexpress	C-3262-1
Cytospin 3	Shandon
Coplin Jar	Fisher	08-815
Szkiełka mikroskopowe Superfrost / Plus	Fisher	12-550-15
Naczynie 4-dołkowe	Fisher	12-566-301
Szkło nakrywkowe	Inkubator powietrza Fisher	12-544-G
	Rewolucyjna nauka	RS-IF-203