Metody in vitro Test kokultury w celu oceny migracji transnabłonkowej neutrofili indukowanej patogenem

Powierzchnie błony śluzowej służą jako fizyczne i immunologiczne bariery, zapewniając ochronę przed zewnętrznymi zagrożeniami wszechobecnymi w środowisku^1,2. Ta ochronna bariera nabłonkowa może zostać naruszona, gdy organizmy chorobotwórcze zaatakują². W przypadku patogenu bakteryjnego, to spotkanie często inicjuje proces zapalny poprzez aktywację wrodzonego układu odpornościowego i wyzwalanie szybkiej mobilizacji granulocytów pierwszej pomocy, znanych jako Neutrofile^2-4. Czynniki chemotaktyczne ułatwiające rekrutację neutrofili są wytwarzane częściowo przez komórki nabłonka błony śluzowej, które starają się pozbyć gospodarza szkodliwego patogenu^2-4. Nadmierny lub nierozwiązany naciek neutrofili na powierzchni nabłonka błony śluzowej może powodować znaczną patologię^1,5. Jest to konsekwencja niespecyficznego uszkodzenia tkanek spowodowanego przez przeciwbakteryjny arsenał neutrofili^5-7. W takich przypadkach zdolność usuwania neutrofili przez bakterie jest przyćmiona przez zniszczenie tkanki gospodarza podczas zakażenia. Zakłócenie funkcji ochronnej bariery nabłonkowej może prowadzić do zwiększonego narażenia tkanki leżącej poniżej na mikroorganizmy i/lub toksyny, co jeszcze bardziej zaostrza patologię choroby^8,9. Konsekwencje te można zaobserwować w wielu układach narządowych, w tym w płucach i przewodzie pokarmowym1,5. Ponadto niezakaźne stany zapalne, takie jak ciężkie napady astmy, przewlekła obturacyjna choroba płuc (POChP), zespół ostrej niewydolności oddechowej (ARDS) i nieswoiste zapalenie jelit (IBD) charakteryzują się patologicznym naruszeniem bariery nabłonkowej błony śluzowej przez nadmierną odpowiedź neutrofilową^4,5,10-12.

Złożony proces rekrutacji neutrofili po infekcji błony śluzowej składa się z kilku etapów podzielonych na przedziały^1,5,13,14. Po pierwsze, neutrofile muszą opuścić krążenie poprzez szereg interakcji międzykomórkowych, które ułatwiają migrację międzybłonkową^1,13. Neutrofile następnie nawigują po istniejącej przestrzeni śródmiąższowej zawierającej macierz zewnątrzkomórkową^1,14. Aby dotrzeć do światła zakażonej błony śluzowej, neutrofile muszą następnie migrować przez barierę nabłonkową^1,4,5. To skomplikowane, wieloetapowe zjawisko jest często badane zbiorczo przy użyciu zwierzęcych modeli infekcji in vivo ¹⁵. Takie modele są przydatne do ustalenia konieczności istnienia określonych czynników, takich jak chemokiny, cząsteczki adhezyjne lub szlaki sygnałowe, które uczestniczą w całym procesie, ale są w dużej mierze nieodpowiednie do rozwiązywania molekularnych Wkłady krytyczne dla każdego odrębnego kroku z podziałem na przedziały¹⁶. Szczególnie przydatne w tym zakresie okazały się systemy kohodowlane in vitro modelujące transśródbłonkową, trans-macierzową lub trans-nabłonkową migrację neutrofili^1,14,16,17.

Solidny system testów kokulturowych został opracowany w celu rozszyfrowania mechanizmów odpowiedzialnych za migrację międzynabłonkową neutrofili w odpowiedzi na patogenną infekcję^18-22. Model ten polega na zainfekowaniu powierzchni wierzchołkowej spolaryzowanych warstw ludzkich komórek nabłonkowych patogenem bakteryjnym, a następnie zastosowaniu świeżo wyizolowanych ludzkich neutrofili na powierzchni podstawno-bocznej^18-22. Neutrofile migrują przez barierę nabłonkową w odpowiedzi na produkty chemotaktyczne pochodzenia nabłonkowego wydzielane po infekcji patogennej^18,21-23. Ten system modelowy został zastosowany przy użyciu kultur nabłonka jelit i płuc wystawionych na działanie odpowiednich patogenów bakteryjnych specyficznych dla tkanek i ujawnił nowe mechanizmy molekularne, które mogą być ważne dla procesu rekrutacji neutrofili podczas infekcji błony śluzowej^3,8,19,24-28. Siła tego Model kokultury in vitro polega na tym, że podejście redukcjonistyczne umożliwia badaczowi eksperymentalne manipulowanie patogenem, barierą nabłonkową i/lub neutrofilami w dobrze kontrolowanym, wysoce powtarzalnym i dość niedrogim systemie. Wgląd uzyskany dzięki temu podejściu można skutecznie wykorzystać do przeprowadzenia ukierunkowanej analizy zdarzeń przedziałowych podczas rekrutacji neutrofili przy użyciu modeli infekcji in vivo ^22,29,30.

Ten artykuł pokazuje wiele kroków niezbędnych do pomyślnego ustanowienia tego powtarzalnego modelu do badania migracji trans-nabłonkowej neutrofili indukowanej przez patogeny. Bariery nabłonkowe płuc zakażone patogenem Pseudomonas aeruginosa są opisane w tym artykule; jednak inne nabłonki tkankowe i patogeny mogą być zastąpione niewielkimi modyfikacjami. Wysiew i hodowla spolaryzowanych warstw komórek nabłonka płuc na odwróconym Pokryte kolagenem przepuszczalne filtry Transwell są szczegółowo opisane w niniejszym dokumencie, podobnie jak wzrost patogennego P. aeruginosa i izolacja neutrofili z krwi pełnej. Przedstawiono sposób łączenia tych składników w celu obserwacji migracji przeznabłonkowej neutrofili indukowanej przez patogen wraz z odpowiednimi kontrolami pozytywnymi i ujemnymi w celu ustalenia powtarzalnego testu. Wszechstronność tego podejścia do badania różnych aspektów migracji przeznabłonkowej neutrofili indukowanej patogenem jest omawiany w odniesieniu do konkretnych badań w literaturze.

Kroki (1-3) powinny być wykonywane w sterylnym środowisku pod okapem z przepływem laminarnym.

1. Powłoka kolagenowa Transwells

1. Przygotuj roztwór kolagenu o stężeniu 30 μg/ml. Rozcieńczyć 3 mg/ml kolagenu w stosunku 1:100 w 60% etanolu, który został przepuszczony przez jednostkę filtrującą 0,2 μm.
2. Roztwór rozcieńczony wirowo 30 μg/ml. Uwaga: Nie ma potrzeby wirowania roztworu podstawowego kolagenu o stężeniu 3 mg/ml, ponieważ roztwór ten jest dość lepki i mogą wprowadzać pęcherzyki powietrza, co może zmniejszyć dokładność pipetowania.
3. Wyjmij z opakowania zewnętrznego osłony o powierzchni 0,33 cm² i wielkości porów 3 μm i umieść 24-dołkową płytkę zawierającą 12 transwelli do góry nogami wewnątrz kaptura.
4. Podnieś dolną płytę i odłóż na bok. Uwaga: Transwelle będą teraz odwrócone do góry nogami i spoczywają na pokrywie płytki 24-dołkowej
5. Włącz palnik Bunsena. Podpal hemostat dla sterylności i ostudź.
6. W przypadku sterylnego hemostatu przenieś transwelle na szalkę Petriego o wymiarach 150 mm x 25 mm, utrzymując je w pozycji odwróconej. Uwaga: Należy pamiętać o zachowaniu sterylności pustej płytki 24-dołkowej wraz z pokrywką, która ma być używana do przechowywania transwelli po ich zasianiu komórkami nabłonkowymi.
7. Odpipetować 70 μl roztworu kolagenu o stężeniu 30 μg/ml na membranę filtracyjną każdego odwróconego transwella. Uwaga: Napięcie powierzchniowe powinno utrzymywać tę objętość roztworu na miejscu, ponieważ podczas uzyskiwania dostępu do powierzchni spodu wokół membrany filtra nie ma ścian. Należy uważać, aby roztwór kolagenu nie spływał po boku transwell i unikać przesuwania transwelli podczas procedury powlekania.
8. Pozostaw pokrywkę szalki Petriego zdjętą na co najmniej 4 godziny, aby umożliwić odparowanie roztworu etanolu. Aby zachować sterylność podczas tego procesu, należy włączyć wentylator okapu i światło ultrafioletowe.
9. Po wyschnięciu transwelle można je natychmiast zużyć lub przechowywać w temperaturze pokojowej przez okres do tygodnia, pod warunkiem, że pokrywa szalki Petriego jest na swoim miejscu i zachowana jest sterylność.

2. Kolba pasażowa komórek nabłonkowych do wysiewu transwelli

(Ten protokół szczegółowo opisuje sposób postępowania z linią komórek nabłonka płuc H292 do generowania barier nabłonkowych hodowanych na transwellach. Inne nabłonkowe linie komórkowe mogą być używane z niewielkimi modyfikacjami.)

1. Przygotować pożywkę hodowlaną, dodając 10% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej (HI-FBS) i 1x penicyliny/streptomycyny do RPMI 1640.
2. Ciepłe podłoże, trypsyna-EDTA (T-EDTA) i D-PBS w łaźni wodnej o temperaturze 37 ºC.
3. Wyjąć kolbę T-75 zawierającą komórki z inkubatora i ocenić zbieżność wizualnie za pomocą odwróconego mikroskopu. Uwaga: W przypadku korzystania z komórek H292 kolby powinny być bliskie lub całkowicie zlewne.
4. Odessać pożywkę z kolby. Skróć czas, w którym komórki są suche, umieszczając następny roztwór w kapturze z poluzowaną nasadką.
5. Dodać 5 ml D-PBS do kolby T-75 i zamieszać. Unikaj tworzenia bąbelków. Usuń PBS przez aspirację.
6. Dodać 3 ml T-EDTA do kolby T-75 i zamieszać do przykrycia dna.
7. Usunąć większość T-EDTA, pozostawiając około 0,3 ml w kolbie T-75.
8. Rozprowadzić niewielką pozostałą objętość T-EDTA na powierzchni komórek i umieścić w wilgotnym inkubatorze w standardowych warunkach hodowli (37 ºC, 5% CO₂ ).
9. Po pewnym czasie wyjąć kolbę z inkubatora. Uwaga: Komórki powinny łatwo odrywać się od powierzchni kolby poprzez delikatne stukanie kolby w bok. Komórki powinny być teraz zaokrąglone i unoszące się w powietrzu po wizualizacji pod mikroskopem. Średni czas potrzebny na ogniwa H292 to 5-10 minut.
10. Dodać 10 ml pożywki hodowlanej do kolby, aby zneutralizować T-EDTA i ponownie zawiesić komórki. Pobrać roztwór komórek do końcówki pipety i wysunąć na powierzchnię kolby zawierającej komórki około pięć razy, aby ponownie zawiesić wszystkie komórki.
11. Przenieść zawieszone komórki do probówki o pojemności 15 ml w celu wysiewu transwell. Uwaga: Stężenie tak zawieszonych komórek H292 powinno mieścić się w granicach około 1 x 10 6-1,8 x 10⁶ komórek/ml.

3. Siew Transwelli pokrytych kolagenem z komórkami nabłonkowymi

1. Dodać 70 μl zawieszonego roztworu komórkowego z probówki o pojemności 15 ml do każdego transwella pokrytego odwróconym kolagenem. Uwaga: Roztwory komórek H292 o zakresie stężeń między 1 x 10 6-1,8 x 10⁶ komórek/ml dadzą około 70 000-120 000 komórek/transwell.
2. Wymieszaj zawiesinę komórkową, delikatnie odwracając probówkę od czasu do czasu, aby zapobiec osadzaniu się komórek na dnie probówki o pojemności 15 ml podczas wysiewania transwells. Uwaga: Nie należy wirować komórek i należy uważać, aby końcówka pipety nie stykała się bezpośrednio z filtrem membranowym pokrytym kolagenem.
3. Gdy wszystkie odwrócone transwelle zostaną zasiane komórkami nabłonkowymi, załóż pokrywę szalki Petriego i ostrożnie umieść w inkubatorze do hodowli tkankowych, nawilżonym, w temperaturze 37 ºC, 5% CO₂ . Należy uważać, aby nie zakłócić zawiesiny komórkowej, która została dodana do membrany filtracyjnej pokrytej kolagenem.
4. Odwrócone transwelle należy utrzymywać w inkubatorze do hodowli tkankowych, nawilżonym, 37 ºC, 5% CO_{2 przez} noc. Uwaga: Pęcherzyk komórek zawierających ciecz powinien pozostać połączony z przepuszczalną membraną filtracyjną transwella przez cały okres inkubacji przez całą nocną inkubację. Jeśli membrana filtracyjna wyschnie z powodu odparowania cieczy lub dlatego, że ciecz spływa po boku transwells, warstwy nabłonka mogą nie rosnąć prawidłowo.
5. Następnego dnia dodać 1 ml pożywki do oryginalnej sterylnej 24-dołkowej płytki i odwrócić każdą odwróconą pożywkę za pomocą wysterylizowanego hemostatu do każdej studzienki zawierającej 1 ml pożywki.
6. Dodaj 0,2 ml pożywki do górnej komory każdej transwell i wróć do inkubatora do hodowli tkankowych, nawilżonego, 37 ºC, 5% CO₂.
7. Odwrócone transwelle H292 można stosować od 8 dni do 1 miesiąca po wysiewie. Uwaga: Sugerujemy odczekanie co najmniej 8 dni po wysiewie transwelli, aby upewnić się, że monowarstwy nabłonka są w pełni uformowane i wykazują funkcjonalną barierę. Można przetestować barierę nabłonkową H292, określając, czy monowarstwa jest zdolna do ograniczania przepływu transnabłonkowego białka peroksydazy chrzanowej (HRP) po dodaniu do powierzchni podstawno-bocznej¹⁸.

4. Przygotowanie bakterii do infekcji warstw nabłonka na transwellach

1. Na dzień przed eksperymentem wyekstrahować jedną kolonię P. aeruginosa PAO1 z płytki agaru izolacyjnego Pseudomonas i jedną kolonię K12 E. coli MC1000 z płytki agarowej Luria-Bertani (LB) i umieścić w oddzielnych probówkach zawierających 3 ml bulionu LB. UWAGA: P. aeruginosa jest ludzkim patogenem, podczas obchodzenia się z tym organizmem należy stosować standardowe środki bezpieczeństwa BSL2.
2. Wstrząsać przez noc z prędkością 225 obr./min w temperaturze 37 ºC.
3. Następnego dnia należy wyjąć 1 ml z gęstych kultur bakteryjnych i umieścić w probówkach Eppendorfa o pojemności 1,5 ml.
4. Wirować w mikrodrobince o gramaturze 15 800 x g przez 5 minut, a następnie usunąć supernatant.
5. Przygotuj wcześniej zbilansowany roztwór soli Hanksa z wapniem i magnezem (HBSS+). Dodaj 23,8 g HEPES i 97,5 g HBSS+ w proszku do 9,5 l wody destylowanej. Dodać niewielkie ilości 10 M NaOH do roztworu, monitorując pH, aż do osiągnięcia stabilnego pH 7,4. Zwiększyć objętość do 10 l i przechowywać w temperaturze 4 ºC.
6. Zawiesić każdy granulat bakteryjny w 1 ml HBSS+. Vortex, aby mieć pewność, że uzyskano równomierną zawiesinę bakteryjną.
7. Wirować ponownie przy 15 800 x g przez 5 minut i usunąć supernatant.
8. Zawiesić pastylkę PAO1 na 0,6 ml HBSS+, a pastylkę MC1000 na 0,5 ml HBSS+. Odwiruj zawiesiny bakteryjne.
9. Dalej rozcieńczyć zawieszone granulki PAO1 i MC1000 w stosunku 1:100 w HBSS+. Na przykład dodać 50 μl 0,6 ml zawieszonego osadu PAO1 do 5 ml HBSS+. Uwaga: Wykorzystując pomiary gęstości optycznej (OD) do określenia gęstości hodowli, a także metodologię rozcieńczania standardową jednostką tworzącą kolonię (CFU), roztwory PAO1 i MC1000 przygotowane w ten sposób konsekwentnie dają 3 x 10^7-6 x 10⁷ CFU/ml. Gęstość kultury bakteryjnej jest dodatnio skorelowana z pomiarem OD kultury przy 600 nm i ta korelacja może być wykorzystana do oszacowania stężenia komórek bakteryjnych. Aby potwierdzić stężenie komórek bakteryjnych, hodowlę można rozcieńczyć do bardzo niskiego szacowanego stężenia i posiać na płytce agarowej tak, aby można było oczekiwać, że na płytce będzie obecnych od 30 do 200 komórek bakteryjnych. Komórki rozprowadza się na płytce i inkubuje przez noc w temperaturze 37 °C, tak aby każda komórka tworzyła indywidualną kolonię komórek, która jest wystarczająco duża, aby była widoczna, a następnie można było policzyć kolonie.

5. Izolacja neutrofili z krwi pełnej

1. Kwaśny roztwór dekstrozy cytrynianu (ACD) jest stosowany jako antykoagulant i przygotowywany przez dodanie 6,9 g kwasu cytrynowego, 12,5 g cytrynianu sodu i 10 g dekstrozy do 500 ml wody destylowanej. Po rozpuszczeniu wszystkich składników roztwór ACD jest sterylizowany przez przepuszczenie przez jednostkę filtrującą 0,2 μm. Przechowywać roztwór ACD w temperaturze 4 °C.
2. Przed pobraniem krwi należy dodać 5 ml ACD do strzykawki o pojemności 50 ml i przymocować igłę motylkową 21 x 3/4 G z rurką 12 cali.
3. Załóż opaskę uciskową, przetrzyj żyłę alkoholem i włóż igłę. Uwaga: Każdy protokół badawczy z udziałem ludzi musi zostać zatwierdzony przez instytucjonalną komisję rewizyjną, a każdy dawca krwi musi uzyskać pisemną świadomą zgodę. Na przykład eksperymenty przeprowadzone przy użyciu tego protokołu zostały zatwierdzone przez Massachusetts General Hospital Institutional Review Board i przypisano im protokół #1999-P-007782.
4. Powoli pobrać 45 ml krwi, upewniając się, że krew miesza się z ACD raz w strzykawce.
5. Po pobraniu 45 ml (50 ml całkowitej objętości) należy rozwiązać opaskę uciskową przed wyjęciem igły. Po wyjęciu igły natychmiast przyłożyć ucisk do rany sterylną gazą.
6. Powoli przenosić krew po boku probówki o pojemności 50 ml przez około 5-10 sekund.
7. Wirować wirówkę przy 1 000 x g z wyłączonym hamulcem na 20 minut w temperaturze pokojowej. Uwaga: Dodatkowy etap polegający na rozcieńczeniu krwi pełnej w PBS i ostrożnym nałożeniu rozcieńczonej krwi na Ficoll-Paque przed wirowaniem może być zastosowany w celu osiągnięcia nieco wyższego poziomu czystości neutrofili poprzez skuteczniejsze oddzielenie kożuchy od granulocytów⁸. Pominięcie tego etapu służy zaoszczędzeniu czasu bez drastycznego wpływu na wydajność lub czystość dla celów tego testu, dlatego opowiadamy się za tym, aby nie włączać nakładki krwi do etapu Ficoll-Paque.
8. Podczas gdy krew wiruje, bardzo powoli dodaj 1 g żelatyny do 50 ml podgrzanego roztworu soli Hanksa bez wapnia i magnezu (HBSS(-)) w celu przygotowania 2% roztworu żelatyny. Roztwór należy utrzymywać w temperaturze 37 °C.
9. Odessać i usunąć osocze z probówki o pojemności 50 ml krwi za pomocą szklanej końcówki pipety, która została potraktowana produktem Sigmacote.
10. Kontynuuj bardzo ostrożne zasysanie, aby usunąć kożuchową powłokę, która zawiera białe krwinki, w tym limfocyty.
11. W miarę powolnego usuwania kożuchowego płaszcza, białawo-żółty, mętny materiał powyżej warstwy czerwonych krwinek (RBC) zniknie. Przerwij aspirację po usunięciu kożucha i wyraźnej wizualizacji warstwy RBC podczas oglądania znad rury.
12. Staraj się nie naruszać warstwy RBC, ponieważ granulocyty, głównie neutrofile, znajdują się blisko powierzchni warstwy RBC, ale nie są widoczne.
13. Do objętości 15 ml warstwy RBC dodać 30 ml ciepłego 2% roztworu żelatyny (2x objętość warstwy RBC).
14. Delikatnie odwróć probówkę, aby wymieszać, uważając, aby zminimalizować tworzenie się pęcherzyków.
15. Inkubacja w 37 ºC przez 25 min. Uwaga: RBC powinny się agregować i osiadać na dnie. Jako alternatywę dla żelatyny, dektrans o dużej masie cząsteczkowej może być stosowany do osadzania erytrocytów⁸.
16. Po inkubacji przenieść górną warstwę jasnoczerwonawego roztworu zawierającego granulocyty do nowej probówki o pojemności 50 ml z pipetą, uważając, aby nie naruszyć osiadłej ciemnej warstwy RBC podczas przenoszenia. Po oddzieleniu wyrzuć ciemną warstwę RBC.
17. Odwirować przeniesiony jasnoczerwonawy roztwór zawierający granulocyty i niektóre erytrocyty w wirówce przy 1,000 x g z włączonym hamulcem na 10 minut w temperaturze pokojowej w celu osadzania komórek.
18. Ostrożnie wylać lub odessać supernatant, ponieważ czerwonawe osady komórek, które utworzą się po odwirowaniu, są na ogół luźne.
19. Przygotować wcześniej bufor do lizy RBC i przechowywać w temperaturze 4 °C, dodając 8,29 g chlorku amonu (NH₄Cl), 1 g wodorowęglanu sodu (NaHCO₃) i 0,038 g EDTA do 1 l wody destylowanej w zlewce. Przechowywać bufor do lizy RBC w temperaturze 4 °C.
20. Ponownie zawiesić i rozbić czerwonawe osady komórkowe za pomocą niewielkiej objętości zimnego buforu do lizy RBC. Gdy osad komórkowy znajdzie się w roztworze, napełnij probówkę do 50 ml buforem do lizy RBC. Uwaga: W tym momencie i idąc dalej, utrzymuj komórki na lodzie lub w temperaturze 4 ºC.
21. Wirować wirówkę przy 300 x g przez 10 minut w 4 ºC, a następnie odlać lub odessać supernatant. Uwaga: Supernatant będzie nieco czerwonawy i będzie zawierał lizowane erytrocyty. W tym momencie granulka powinna być żółtawo-biała. Jeśli w osadzie pozostaną znaczne ilości erytrocytów, na co wskazuje czerwonawa osadka, krok 5.20-5.21 można powtórzyć. Znaczne ilości erytrocytów pozostają w osadzie komórkowym, jeśli czerwonawy osad z kroku 5.20 nie zostanie wystarczająco rozdrobniony.
22. Zawiesić i rozdrobnić białawe osady z niewielką objętością HBSS(-), a następnie napełnić probówkę do 50 ml HBSS(-). Uwaga: Do ponownego zawieszenia osadu komórek białawych należy użyć HBSS(-), a nie HBSS+. HBSS(-) nie zawiera wapnia i magnezu.
23. Ponownie zawirować w wirówce przy 300 x g przez 10 minut w 4 ºC.
24. Odlać supernatant i ponownie zawiesić osad do końcowej objętości 1 ml HBSS(-).
25. Dodać 5 μl zawiesiny 1 ml komórek do 250 μl HBSS(-) w probówce Eppendorfa o pojemności 1,5 ml i delikatnie mieszać pipetą w górę i w dół.
26. Dodać 25 μl rozcieńczonej zawiesiny komórek do 25 μl 0,4% błękitu trypanowego.
27. Dodać 12 μl mieszaniny z każdej strony wzorcowego hemocytometru.
28. Policz liczbę żywych komórek, które wykluczyły niebieski barwnik trypanowy i są obecne w środkowym kwadracie po obu stronach hemocytometru.
29. Aby obliczyć stężenie komórek, pomnóż średnią z 2 kwadratów przez 100 (współczynnik rozcieńczenia), a następnie pomnóż przez 10⁴, aby uzyskać liczbę komórek/ml.
30. Dostosuj końcowe stężenie do 5 x 10⁷ komórek/ml. Jeśli jest większa niż 5 x 10⁷ komórek/ml, dostosuj, dodając HBSS (-). Jeśli mniej, zagnieździć ogniwa i ponownie zawiesić do odpowiedniej objętości.
31. Utrzymuj komórki na lodzie, dopóki nie będą gotowe do testu migracji. Uwaga: Komórki te reprezentują populację granulocytów białych krwinek. Większość granulocytów wyizolowanych z pełnej krwi ludzkiej to neutrofile. Komórki są trzymane na lodzie zawieszonym w HBSS(-) do czasu dodania do testu migracji w celu utrzymania komórek w stanie spoczynku.

6. Przygotowanie warstw komórek nabłonkowych do testu migracji

(Te kroki nie muszą być wykonywane w sterylnym kapturze.)

1. Wyjąć z inkubatora 24-dołkową płytkę podtrzymującą warstwy nabłonka, które były hodowane na spodniej stronie membran filtracyjnych transwell przez co najmniej osiem dni.
2. Chwycić krawędź każdej transstu za pomocą hemostatu, wyjąć z płytki 24-dołkowej i odwrócić transwell nad wiadrem na odpady, aby wyrzucić pożywkę hodowlaną z wewnętrznej komory transwella. Zanurzyć każdą transwell w zlewce płuczącej zawierającej HBSS+, aby wypełnić wewnętrzną komorę transwella HBSS+. Wylej płyn z komory wewnętrznej do wiadra na odpady.
3. Powtórz krok 6.2 dla drugiego prania w HBSS+. Po dwóch płukaniach umieścić transwelle w nowej 24-dołkowej płytce zawierającej 1 ml HBSS+ w każdym dołku. Uwaga: Wszystkie prania należy wykonywać przy użyciu HBSS+ podgrzanego do 37 ºC.
4. Obserwuj górną komorę każdej transwell, aby ocenić integralność warstwy komórek nabłonka. Uwaga: HBSS+ nie powinien przeciekać i wypełniać górnej komory transwella po umieszczeniu w studzience 24-dołkowej płytki zawierającej 1 ml HBSS+.
5. Po dokładnym przyjrzeniu się każdemu transwellowi, dodać 0,2 ml HBSS+ do górnej komory.
6. Umieść w inkubatorze na 37 ºC, 5% CO₂ w wilgotnej komorze na 30-60 min, aby wyrównać warstwy komórek nabłonka.

7. Test migracji przeznabłonkowej neutrofili

1. Wyjąć z inkubatora 24-dołkową płytkę z przemytymi transwellami równoważącymi się w HBSS+.
2. Chwyć każdą transwell hemostatem i wylej płyn z góry do wiadra na odpady.
3. Umieść każdą transwell do góry nogami na szalce Petriego o wymiarach 150 mm x 25 mm.
4. Do sześciu odwróconych Transwelli dodaj 25 μl HBSS+. Do trzech odwróconych transwelli zainfekować 25 μl P. aeruginosa (PAO1) rozcieńczonego w HBSS+ przygotowanym zgodnie z opisem w kroku 4. Do ostatnich trzech odwróconych transwelli zainfekować 25 μl E. coli K12 (MC1000) rozcieńczonym w HBSS+ przygotowanym zgodnie z opisem w kroku 4. Jest to około 0,8 x 10 6-1,5 x 10⁶ CFU/warstwę nabłonkową dla każdego gatunku bakterii, ponieważ stężenie roztworów bakteryjnych przygotowanych w kroku 4 wynosi około 3 x 10^7-6 x 10⁷ CFU/ml.
5. Inkubacja w temperaturze 37 ºC, 5% CO₂ w wilgotnej komorze przez 60 min.
6. Przygotować fMLP jako kontrolę pozytywną migracji neutrofili, dodając 5 μl 10 mM zapasu fMLP do 5 ml HBSS+, dając roztwór 10 μM.
7. Przemyć transwelle, chwytając je hemostatem i przewracając z powrotem do 24-dołkowej płytki myjącej, która zawiera 1 ml HBSS+ w dolnych komorach. Dodać 0,2 ml HBSS+ do górnych komór.
8. Chwycić transwell hemostatem i wyjąć z pierwszej płytki myjącej. Przed umieszczeniem transwelli w drugiej 24-dołkowej płytce myjącej zawierającej 1 ml HBSS+, należy wylać płyn z górnej komory do wiadra na odpady. Dodać 0,2 ml HBSS+ do górnej komory.
9. Powtórz kroki 7.8 jeszcze raz, w sumie 3 prania. Uwaga: Wszystkie transwelle powinny być poddawane temu samemu reżimowi obchodzenia się i mycia, niezależnie od tego, czy zostały zakażone bakteriami, czy nie, w celu zapewnienia, że wszystkie transwelle poddawane testom zostały poddane manipulacji w ten sam sposób. 60-minutowe zakażenie PAO1 lub MC1000 nie zmniejsza żywotności ani nie zmienia właściwości barierowych monowarstwy H292, jak oceniono za pomocą testu toksykologicznego opartego na dehydrogenazie mleczanowym i testu strumienia HRP, odpowiednio:^18,22.
10. Przygotować 24-dołkową płytkę migracyjną, dodając 1 ml HBSS+ do 12 dołków 24-dołkowej płytki. Uwaga: Ta płyta może być przygotowana z wyprzedzeniem.
11. Po trzecim przemyciu wylać płyn z górnych komór transwelli do wiadra na odpady za pomocą hemostatu i umieścić trzy z niezainfekowanych transwelli w trzech dołkach 24-dołkowej płytki migracyjnej zawierającej 1 ml HBSS+, która reprezentuje kontrolę ujemną.
12. Pobrać pipetą 10 μl 10 μM roztworu fMLP do każdego z trzech dołków 24-dołkowej płytki migracyjnej zawierającej 1 ml HBSS+ (100 nM).
13. Umieścić trzy z niezakażonych transwelli w trzech dołkach 24-dołkowej płytki migracyjnej zawierającej 100 nM fMLP, która stanowi pozytywną kontrolę zdolności izolowanych neutrofili do migracji.
14. Umieścić trzy transwelle zakażone PAO1 i trzy transwell zakażone MC1000 w trzech dołkach odpowiednio z 24-dołkowej płytki migracyjnej zawierającej 1 ml HBSS+. Dodać 0,1 ml HBSS+ do górnej komory każdego transwella.
15. Na 0,1 ml HBSS+ w każdym transwellu, ostrożnie dodać 20 μl zawiesiny neutrofili (5 x 10⁷ komórek/ml) przygotowanej zgodnie z opisem w kroku 5. Uwaga: Odpowiada to w przybliżeniu 1 x 10⁶ neutrofili/transwell.
16. Inkubować w temperaturze 37 ºC, 5% CO₂ w wilgotnej komorze przez 2 godziny, aby umożliwić transnabłonkową migrację neutrofili.
17. Przygotować krzywą wzorcową do określenia liczby neutrofili, które migrowały po 2 godzinach. Dodać 40 μl zawiesiny neutrofili (5 x 10⁷ komórek/ml) do 2 ml HBSS(+) i przenieść 1 ml do 1 ml HBSS(+) i wykonać seryjne 2-krotne rozcieńczenia dodatkowe osiem razy, w sumie 10 wzorców w zakresie od około 2000 komórek/ml do 1 x 10⁶ komórek/ml. Dołączyć 1 ml HBSS(+) dla pustego.
18. Po 2 godzinach migracji podnieś transwelle, chwytając je hemostatem i delikatnie postukaj w wewnętrzne ścianki 24-dołkowej płytki migracyjnej. Wyrzuć transwelle.
19. Oceń migrację neutrofili w studzienkach w dużym stopniu, oglądając studzienki 24-dołkowej płytki migracyjnej pod mikroskopem odwróconym przy użyciu obiektywu 10X (patrz rysunek 1, aby zapoznać się z obrazami migrowanych neutrofili w każdym stanie).
20. Dodać 50 μl 10% trytonu X-100 do każdego dołka użytego w 24-dołkowej płytce migracyjnej, każdego wzorca i ślepej próby.
21. Obracaj 24-dołkową płytkę migracyjną, wzorce i ślepą próbę z niską prędkością przez 20 minut w 4 ºC.
22. Przygotować wcześniej 1 M bufor cytrynianu. Dodać 52,5 g kwasu cytrynowego i 73,5 g cytrynianu sodu do 400 ml wody destylowanej w zlewce. Doprowadzić pH do 4,2. Dodać wodę destylowaną do końcowego roztworu 500 ml. Przechowywać roztwór w temperaturze 4 °C.
23. Przygotuj świeży roztwór substratu ABTS tego dnia. Dodać 3 tabletki ABTS (po 10 mg każda) i 5 ml 1 M buforu cytrynianowego do 45 ml wody destylowanej. Poczekaj, aż tabletki całkowicie rozpuszczą się w roztworze. Wstrzymać się z dodawaniem 50 μl 30% nadtlenku wodoru do czasu, gdy potrzebny będzie roztwór substratu ABTS (patrz krok 7.27).
24. Dodać 50 μl buforu cytrynianowego do każdego dołka użytego w 24-dołkowej płytce migracyjnej, każdego wzorca i ślepej próby.
25. Przenieść 100 μl każdej studzienki na próbkę w dwóch egzemplarzach na płytkę 96-dołkową. Uwaga: Bardzo ważne jest, aby dokładnie wymieszać zawartość każdej próbki przed przeniesieniem do płytki 96-dołkowej. Przed przeniesieniem należy pipetować roztwór w górę i w dół co najmniej pięć razy.
26. Po wymieszaniu przenieść 100 μl każdego wzorca i ślepą próbę na płytkę 96-dołkową (ślepa próba w dwóch egzemplarzach).
27. Dodać 50 μl 30% nadtlenku wodoru do roztworu ABTS i wirować.
28. Dodać 100 μl roztworu substratu ABTS do każdej próbki na 96-dołkowej płytce.
29. Pozostaw płytkę do rozwinięcia się na 5-10 minut w ciemności. Uwaga: W niektórych studzienkach powinien rozwinąć się zielony kolor, korelujący z liczbą neutrofili obecnych w każdym dołku.
30. Odczyt na długości fali 405 nm za pomocą czytnika mikropłytek.
31. Obliczyć liczbę neutrofili, które migrowały przez warstwę nabłonkową, stosując wzorce, według których istnieje liniowa dodatnia korelacja między znaną liczbą neutrofili przygotowanych jako wzorce a wielkością aktywności peroksydazy mierzoną gęstością optyczną przy 405 nm (patrz rysunki 2 i 3 w celu uzyskania reprezentatywnych danych). Uwaga: Ta metoda oznaczania ilościowego neutrofili wykorzystuje dużą aktywność peroksydazy wykazywaną przez neutrofile w wyniku ekspresji mieloperoksydazy. Można rozważyć alternatywne podejścia do ilościowego oznaczania neutrofili, takie jak metody polegające na wstępnym znakowaniu neutrofili związkami radioaktywnymi lub fluorescencyjnymi.

Kilka badań wykazało, że warstwy nabłonkowe zakażone patogenami ułatwiają migrację międzynabłonkową neutrofili3,8,19,24-28,31,32. Dzieje się to poprzez specyficzną dla patogenu indukcję gradientu chemotaktycznego neutrofili pochodzącego z komórek nabłonkowych3,23. Na przykład patogenna P. aeruginosa oddziałująca z wierzchołkową powierzchnią komórek nabłonka płuc powoduje migrację znacznej liczby neutrofili przez warstwę nabłonkową18,22,25,26,33,34. Ten klinicznie istotny system testowy może być manipulowany na wiele sposobów, aby ujawnić kluczowe czynniki molekularne patogenu i gospodarza w połączeniu z odpowiednimi kontrolami.

Neutrofile dodane do spolaryzowanych warstw komórek nabłonkowych, które nie zostały wcześniej zainfekowane, nie migrują w znacznej liczbie. Jednak zastosowanie gradientu chemoatraktantu przez niezainfekowaną warstwę nabłonka spowoduje przerzucenie znacznej liczby neutrofili. Ważne jest, aby uwzględnić zarówno te kontrole negatywne, jak i dodatnie odpowiednio w każdym teście podczas badania migracji neutrofili przez warstwy nabłonka zakażone patogenem. Kontrola ujemna ustala liczbę tła neutrofili, które przenikają przez warstwę nabłonkową przy braku sygnału. Liczba ta powinna być bardzo niska, gdy hodowane komórki nabłonkowe utworzyły barierę funkcjonalną. Wysoka migracja tła komplikuje interpretację wyników uzyskanych w przypadku nabłonka zakażonego patogenem. Kontrola pozytywna polega na zastosowaniu gradientu chemoatraktantu neutrofili, takiego jak fMLP, w poprzek warstwy nabłonkowej i służy potwierdzeniu, że wyizolowane neutrofile są funkcjonalne. Ponadto, w przypadku, gdy warstwy nabłonka są wstępnie traktowane pewnymi odczynnikami w celu oceny ich wpływu na migrację transnabłonkową wywołaną patogenem, gradient fMLP służy do kontroli wszelkich wpływów, jakie odczynnik może mieć na zdolność neutrofili do poruszania się po warstwie nabłonka, niezależnie od skutków za pośrednictwem patogenu. Dodatkowa kontrola, często stosowana w tym systemie testów, polega na zakażeniu warstw nabłonka bakteriami niepatogennymi równolegle z patogenem. Kontrola ta może być wykorzystana do rozróżnienia istotnych odpowiedzi nabłonkowych po interakcji z bakteriami, a także do pomocy w identyfikacji czynników chorobotwórczych niezbędnych do stymulowania migracji przenabłonkowej neutrofili

Migrację międzynabłonkową neutrofili można ocenić zarówno jakościowo, jak i ilościowo. Po zakończeniu 2-godzinnej inkubacji po dodaniu neutrofili do powierzchni podstawno-bocznej, transwelle są usuwane, a neutrofile, które całkowicie migrowały przez warstwę nabłonkową do komory wierzchołkowej, można zobaczyć w dolnej studzience 24-dołkowej płytki migracyjnej. Reprezentatywny obraz każdego stanu jest przedstawiony na rysunku 1, wizualizowany za pomocą mikroskopu światła odwróconego. Zaobserwowano, że bardzo niewiele neutrofili migruje przez niezakażoną warstwę nabłonka bez narzuconego gradientu chemotaktycznego (HBSS +) i reprezentuje poziomy tła w teście (Figura 1A). W przeciwieństwie do tego, obfitość transmigrowanych neutrofili była widoczna, gdy dostarczony jest gradient fMLP (Figura 1B). Zakażenie nabłonka niepatogennym E. coli MC1000 spowodowało niewielką widoczną transmigrację neutrofili, podczas gdy wiele transmigrujących neutrofili można było zaobserwować, gdy warstwy nabłonka były zakażone patogennym dla płuc P. aeruginosa (PAO1) (ryc. 1C i 1D).

Neutrofile, które migrowały w eksperymencie, są oznaczane ilościowo poprzez pomiar ich aktywności mieloperoksydazy. Krzywa standardowa jest wykorzystywana do oszacowania liczby transmigrujących neutrofili. Liczba neutrofili dodatnio koreluje z wielkością aktywności peroksydazy mierzoną po lizie neutrofili o wartościach wykazujących liniową zależność w zakresie liczby neutrofili wybranych dla krzywej wzorcowej (2 x 103-1 x 106 komórek/ml) (ryc. 2). Znaczna liczba neutrofili migruje przez warstwy nabłonka w odpowiedzi na dostarczony gradient fMLP lub w odpowiedzi na warstwę nabłonkową zakażoną PAO1 (Figura 3). Liczba neutrofili, które migrują przy braku bodźców (HBSS +) lub po zakażeniu nabłonka wierzchołkowego niepatogennym E. coli MC1000 jest poniżej granicy wykrywalności dla testu (Figura 3). Dane przedstawione na rysunku 3 przedstawiają średnią liczbę transmigrujących neutrofili ze słupkami błędu reprezentującymi odchylenie standardowe trzech niezależnych odwiertów / stanu. Dane ilościowe przedstawione na rysunku 3 są zgodne z reprezentatywnymi obrazami studni przedstawionymi na rysunku 1.

Ryc. 1. Obraz neutrofili po migracji przeznabłonkowej. Obrazy oglądano za pomocą mikroskopu światła odwróconego w 10-krotnym powiększeniu dolnej studzienki (komory wierzchołkowej) 24-dołkowej płytki migracyjnej po 2-godzinnym okresie inkubacji z neutrofilami dodanymi do górnej studzienki (komory podstawno-bocznej). A) Kontrola ujemna HBSS+. (B) Kontrola pozytywna narzuciła gradient chemotaktyczny fMLP. (C) Warstwy komórek nabłonka zakażone niepatogenną E. coli K12 (MC1000). (D) Warstwy komórek nabłonka zakażone patogennym P. aeruginosa (PAO1). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większy obraz.

Rysunek 2. Neutrofile o początkowym stężeniu 1 x 106 poddano dziewięciu 2-krotnym rozcieńczeniom. Po lizie określono wielkość aktywności peroksydazy i przedstawiono liczbę neutrofili na wykresie na osi x z aktywnością peroksydazy na osi y. Przedstawione równanie można wykorzystać do określenia liczby neutrofili obecnych w każdym dołku po transmigracji na podstawie wielkości aktywności peroksydazy zmierzonej w każdym dołku. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większy obraz.

Rysunek 3. Kwantyfikacja transmigrujących neutrofili. Liczba transmigrujących neutrofili jest określana ilościowo przez względną aktywność mieloperoksydazy w stosunku do liniowej krzywej standardowej znanej liczby neutrofili. Znaczną liczbę transmigrujących neutrofili obserwowano po zakażeniu komórek nabłonka patogennym P. aeruginosa (PAO1) lub ustaleniu gradientu wierzchołkowego do podstawno-bocznego chemoatraktantu fMLP. Niewykrywalną liczbę transmigrowanych neutrofili obserwowano po zakażeniu komórek nabłonka niepatogennym E. coli K12 (MC1000) lub tylko buforem kontroli ujemnej (HBSS+). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większy obraz.

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.