Migracja trans-nabłonkowa neutrofili w odpowiedzi na infekcję bakteryjną błony śluzowej przyczynia się do uszkodzenia nabłonka i choroby klinicznej. Opracowano model in vitro, który łączy patogen, ludzkie neutrofile i spolaryzowane warstwy ludzkich komórek nabłonkowych hodowanych na filtrach transwell, aby ułatwić badania nad rozwikłaniem mechanizmów molekularnych kierujących tym zjawiskiem.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Metody in vitro Test kokultury w celu oceny migracji transnabłonkowej neutrofili indukowanej patogenem
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Powierzchnie błony śluzowej służą jako bariery ochronne przed organizmami chorobotwórczymi. Wrodzone reakcje immunologiczne są aktywowane po wykryciu patogenu, co prowadzi do infiltracji tkanek migrującymi komórkami zapalnymi, głównie neutrofilami. Proces ten może być destrukcyjny dla tkanek, jeśli jest nadmierny lub utrzymywany w stanie nierozwiązanym. Hodowla in vitro Modele mogą być wykorzystywane do badania unikalnych mechanizmów molekularnych zaangażowanych w indukowaną przez patogeny migrację przebłonkową neutrofili. Ten typ modelu zapewnia wszechstronność w projektowaniu eksperymentalnym z możliwością kontrolowanej manipulacji patogenem, barierą nabłonkową lub neutrofilami. Chorobotwórcze zakażenie powierzchni wierzchołkowej spolaryzowanych monowarstw nabłonka wyhodowanych na przepuszczalnych filtrach transwell wywołuje fizjologicznie istotne transnabłonki podstawno-bocznego do wierzchołkowego migracja neutrofili zastosowana do powierzchni podstawno-bocznej. Opisany tutaj model in vitro demonstruje wiele etapów niezbędnych do wykazania migracji neutrofili przez spolaryzowaną monowarstwę nabłonka płuc, która została zakażona patogennym P. aeruginosa (PAO1). Opisano wysiew i hodowlę przepuszczalnych transwelli z ludzkimi komórkami nabłonka płuc, wraz z izolacją neutrofili z pełnej krwi ludzkiej i hodowlą PAO1 i niepatogenny K12 E. coli (MC1000). Proces emigracji i analiza ilościowa pomyślnie migrowanych neutrofili, które zostały zmobilizowane w odpowiedzi na zakażenie patogenne, przedstawiono za pomocą reprezentatywnych danych, w tym kontroli dodatnich i ujemnych. Ten system modelowy in vitro może być manipulowany i stosowany na innych powierzchniach błony śluzowej. Reakcje zapalne, które obejmują nadmierny naciek neutrofili, mogą być destrukcyjne dla tkanek gospodarza i mogą wystąpić przy braku zakażeń chorobotwórczych. Lepsze zrozumienie mechanizmów molekularnych, które sprzyjają migracji przebłonkowej neutrofili poprzez eksperymentalną manipulację opisanego w niniejszym dokumencie systemu testów kokultury in vitro, ma znaczący potencjał w zakresie identyfikacji nowych celów terapeutycznych dla szeregu chorób zakaźnych i zapalnych błony śluzowej.
Wprowadzenie
Powierzchnie błony śluzowej służą jako fizyczne i immunologiczne bariery, zapewniając ochronę przed zewnętrznymi zagrożeniami wszechobecnymi w środowisku1,2. Ta ochronna bariera nabłonkowa może zostać naruszona, gdy organizmy chorobotwórcze zaatakują2. W przypadku patogenu bakteryjnego, to spotkanie często inicjuje proces zapalny poprzez aktywację wrodzonego układu odpornościowego i wyzwalanie szybkiej mobilizacji granulocytów pierwszej pomocy, znanych jako Neutrofile2-4. Czynniki chemotaktyczne ułatwiające rekrutację neutrofili są wytwarzane częściowo przez komórki nabłonka błony śluzowej, które starają się pozbyć gospodarza szkodliwe....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Kroki (1-3) powinny być wykonywane w sterylnym środowisku pod okapem z przepływem laminarnym.
1. Powłoka kolagenowa Transwells
- Przygotuj roztwór kolagenu o stężeniu 30 μg/ml. Rozcieńczyć 3 mg/ml kolagenu w stosunku 1:100 w 60% etanolu, który został przepuszczony przez jednostkę filtrującą 0,2 μm.
- Roztwór rozcieńczony wirowo 30 μg/ml. Uwaga: Nie ma potrzeby wirowania roztworu podstawowego kolagenu o stężeniu 3 mg/ml, ponieważ roztwór ten jest dość lepki i mogą wprowadzać pęcherzyki powietrza, co może zmniejszyć dokładność pipetowania.
- Wyjmij z opakowania zewnętrznego osłony o powierzchni 0,33 cm....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wiele badań wykazało, że warstwy nabłonkowe zainfekowane patogenami ułatwiają transnabłonkową migrację neutrofili3,8,19,24-28,31,32. Dzieje się to poprzez specyficzne dla danego patogenu indukowanie gradientu chemotaktycznego neutrofili pochodzącego z komórek nabłonkowych3,23. Na przykład patogenny P. aeruginosa wchodzący w interakcję z powierzchnią apikalną komórek nabłonka płuc powoduje migrację znacznej liczby neutrofili przez warstwę nabłonkową18,22,25,26,33,34. Ten istotny k.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Migracja neutrofili przez powierzchnie nabłonka błony śluzowej jest powszechną cechą patologii choroby po zakażeniu patogenami bakteryjnymi3. Opisana w niniejszym dokumencie metodologia oferuje szybkie, proste podejście do eksperymentalnego wyizolowania tego dyskretnego zdarzenia przy użyciu systemu testów kokultury in vitro pochodzących z komórek ludzkich, który modeluje cechę procesu zapalnego wywołanego przez infekcje bakteryjne. System ten został pierwotnie opracowany przy użyciu spolaryzowanych k.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Ta praca była wspierana finansowo przez NIH (1 R01 AI095338-01A1).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Komórki NCl-H292 | ATCC | CRL-1848 | |
| RPMI-1640 podłoże | ATCC | 30-2001 | |
| Pseudomonas aeruginosa PAO1 | ATCC | #47085 | |
| Escherichia coli MC1000 | ATCC | #39531 | |
| D-PBS (1x) płyn | Invitrogen | 14190-144 | bez wapnia i magnezu |
| Inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęca | Invitrogen | 10082-147 | 10% dodana do pożywki hodowlanej |
| Penicylina-Streptomycyna | Invitrogen | 15140-122 | 100x: 10 000 jednostek penicyliny i 10 000 &mikro; g streptomycyny na ml. |
| Trypsyna-EDTA (0,05%) | Invitrogen | 25300-062 | 50 ml porcji są przechowywane w stanie zamrożonym w temperaturze -20 ºC. Używana porcja może być przechowywana w 4 º C krótkoterminowe. |
| Zbilansowany roztwór soli Hanka - HBSS(-) | Invitrogen | 14175-079 | Sterylny, bez wapnia i magnezu |
| Roztwór błękitu trypanowego | Invitrogen | 15250-061. | Zapas = 0,4% |
| Kolagen, ogon szczura | Invitrogen | A10483-01 | Można go również wyizolować w laboratorium bezpośrednio z ogonów szczurów przy użyciu standardowych protokołów |
| Kwas cytrynowy | Sigma-Aldrich | C1909-500G | Składnik 1 M buforu cytrynianowego i roztworu kwaśnej dekstrozy cytrynianu (ACD) |
| Cytrynian sodu | Sigma-Aldrich | S4641-500G | Składnik 1 M buforu cytrynianowego |
| Dekstroza bezwodna | Sigma-Aldrich | D8066-250G | Składnik roztworu kwaśnej dekstrozy cytrynianowej (ACD) |
| Chlorek amonu | Sigma-Aldrich | 213330-500G | Składnik buforu do lizy czerwonych krwinek (RBC) |
| Wodorowęglan sodu | Sigma-Aldrich | S6014-500G | Składnik buforu do lizy czerwonych krwinek (RBC) |
| EDTA | Sigma-Aldrich | ED-100G | Składnik buforu do lizy czerwonych krwinek (RBC) |
| HBSS(+) proszek | Sigma-Aldrich | H1387-10L | Kluczowy składnik HBSS+ |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-500G | Składnik HBSS+ |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-25ML | Postępuj zgodnie z instrukcjami dostawcy, aby pokryć szklane końcówki do pipet |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-9284 | |
| Kwas 2,2'-Azino-bis(3-etylobenzotiazolino-6-sulfonowy) Sól diamonowa (ABTS) | Sigma-Aldrich | A9941-50TAB | Kluczowy składnik roztworu substratu ABTS |
| 30% roztwór nadtlenku wodoru | Sigma-Aldrich | H1009-100ML | Składnik roztworu substratu ABTS |
| N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP lub fMLF) | Sigma-Aldrich | F-3506 | Należy przygotować roztwór podstawowy 10 mM w DMSO i przechowywać podwielokrotności w temperaturze -20 ‰C. |
| Żelatyna Typ B | Fisher Scientific | M-12026 | |
| Agar do izolacji Pseudomonas | Fisher Scientific | DF0927-17-1 | Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta s instrukcja wykonania płytek PIA |
| Ficoll-Paque PLUS | Fisher Scientific | 45-001-749 | Opcjonalnie, może poprawić czystość neutrofili |
| 24-dołkowa płytka migracyjna | Corning Incorporated | #3524 | |
| 24-dołkowa płytka myjąca | Falcon | 35-1147 | Może być ponownie użyta, jeśli zostanie namoczona w 70% etanolu i dokładnie umyta przed ponownym użyciem |
| Płytka 96-dołkowa | Fisher Scientific | #12565501 | |
| Przepuszczalne podpory Transwell | Corning Incorporated | #3415 | Poliwęglan; Średnica: 6,5 mm; Obszar wzrostu: 0,33 cm2; Rodzaj dania: talerz 24-dołkowy; Wielkość porów: 3,0 i mikro; m |
| szalka Petriego | Sokół | 35-1013 | Każda szalka Petriego zawiera 24 odwrócone 0,33 cm2 Transwells. |
| 500 ml 0,2 μ m filtr / kolba | Fisher Scientific | 09-740-25A | Do sterylizacji roztworu dekstrozy cytrynianu kwasu (ACD) |
| 5-3/4 w szklanym Pipeta Pasteura | Fisher Scientific | 13-678-20A | Pokryj końcówki Sigmacote przed użyciem |
| Hemostat | Fisher Scientific | 13-812-14 | Zakrzywiony, ząbkowany |
| mikroskop odwrócony z inwertoskopu | Zeiss | #342222 | |
| Versa-Max Czytnik mikropłytek | Urządzenia molekularne | #432789 |
Bibliografia
- Burns, A. R., Smith, C. W., Walker, D. C. Unique structural features that influence neutrophil emigration into the lung. Physiol. Rev. 83, 309-336 (2003).
- Hurley, B. P., McCormick, B. A. Intestinal epithelial defense systems protect against bacterial threat....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
