Artykuł metodologiczny

Metoda hodowli Slice do śledzenia rozwoju zarodków zębów w hodowli eksplantatów

DOI:

10.3791/50824

⸱

13 listopada 2013

 , 
1Department of Craniofacial Development and Stem Cell Biology, and Department of Orthodontics, Dental Institute, Guy's Hospital, UK, King's College London, 2Department of Pediatric Dentistry and Orthodontics, College of Dentistry, King Saud University, Kingdom of Saudi Arabia

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj szczegółowo opisujemy metodę hodowli zarazków zębów w wycinkach żuchwy za pomocą rozdrabniacza tkanek. Metoda ta pozwala na unikalny dostęp do zęba podczas rozwoju, zapewniając doskonałą możliwość manipulacji i śledzenia linii, niedostępną przy użyciu bardziej tradycyjnych metod hodowli.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hodowla eksplantatów pozwala na manipulowanie rozwijającymi się organami w określonych punktach czasowych i dlatego jest ważną metodą dla biologa rozwojowego. W przypadku wielu narządów dostęp do rozwijającej się tkanki jest utrudniony, co umożliwia monitorowanie podczas hodowli ex vivo. Metoda hodowli warstwowej umożliwia dostęp do tkanki, dzięki czemu można śledzić ruchy morfogenetyczne, a określone populacje komórek mogą być celem manipulacji lub śledzenia linii.

W tym artykule opisujemy metodę hodowli plastrów, która okazała się bardzo skuteczna w hodowli zarazków zębów u wielu gatunków. Metoda zapewnia doskonały dostęp do zarodków zębów, które rozwijają się w tempie podobnym do obserwowanego in vivo, otoczone pozostałymi tkankami szczęki. Pozwala to na monitorowanie interakcji tkankowych między zębem a otaczającymi tkankami. Chociaż ten artykuł koncentruje się na zarodkach zębów, ten sam protokół można zastosować do śledzenia rozwoju wielu innych narządów, takich jak gruczoły ślinowe, chrząstka Meckela, gruczoły nosowe, język i ucho.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dla wielu eksperymentów ważne jest, aby móc hodować tkanki ex vivo, aby śledzić rozwój. Hodowla rozwijającej się tkanki zapewnia dostęp w określonych okresach rozwoju i umożliwia manipulowanie genami poprzez dodawanie czynników do pożywki hodowlanej lub na załadowanych kulkach oraz poprzez zastosowanie transfekcji i elektroporacji1. W przypadku wielu eksperymentów ważne jest, aby móc wizualizować tkankę w miarę jej wzrostu, na przykład, aby śledzić los komórek znakowanych rodowo, gdy tkanka przechodzi morfogenezę. Może to być szczególnie problematyczne w przypadku tkanek, które rozwijają się głęboko w zarodku, co nie jest oczywiste po wyhodowaniu bloku tkanki z zarodka. Dobrym tego przykładem są zęby, które rozwijają się w obrębie żuchwy, szczęki i przedniego wyrostka nosowego. Gdy cała żuchwa jest hodowana, można zobaczyć powierzchowne struktury zęba, ale zmiany w morfologii można analizować dopiero po przekroju utrwalonej tkanki2. Dostosowaliśmy technikę hodowli żywych plastrów, co pozwala nam śledzić rozwój zarodków zęba i zapewnia dostęp do różnych części zęba podczas rozwoju. Technika ta polega na hodowli wycinków zarodka zęba na granicy faz gaz-ciecz, przy użyciu zmodyfikowanej metody Trowella3. Te kultury warstwowe były bardzo przydatne w bezpośrednim śledzeniu morfogenezy zęba i umożliwieniu śledzenia linii różnych elementów, takich jak węzeł szkliwa oraz brodawka zębowa i mieszek włosowy1,4-7. Technika ta nie ogranicza się do zarodków myszy i została z powodzeniem zastosowana do hodowli żywych plastrów tkanki zębowej świni i węża8,9. Oprócz korzyści płynących z możliwości wizualizacji rozwoju zębów, metoda plasterkowa ma również tę zaletę, że cienkie plasterki tkanki mają zwiększony dostęp do składników odżywczych z pożywki i powietrza z inkubatora. Powoduje to lepszy wzrost zarodków zębów, które pasują do rozwoju in vivo i wykazują inwazję komórek śródbłonka do brodawki7. W przeciwieństwie do tego, zarodki zębów w całych kulturach żuchwy rozwijają się wolniej niż te in vivo, a centrum kultury jest często nekrotyczne w kulturach długotrwałych. W hodowli plastrowej ząb rozwija się w obrębie wycinka szczęki i można monitorować jego interakcję z otaczającą rozwijającą się kością i innymi tkankami. W naszej metodzie tkanka jest rozdrabniana bezpośrednio po rozwarstwieniu, bez konieczności zatapiania w podłożu10,11 i bez konieczności stosowania jakiegokolwiek systemu do mocowania tkanki do bloku tnącego. Metoda jest zatem nieinwazyjna i szybka, co pozwala na przecięcie wielu żuchw podczas jednej sesji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Konfiguracja

  1. Naostrzyć narzędzia preparacyjne (za pomocą kamienia do ostrzenia nasmarowanego olejem mineralnym) i wysterylizować przed użyciem do hodowli narządów, używając 70% etanolu w sprayu i sterylizacji na sucho. Naostrzyć igły do rozwarstwiania za pomocą elektrolizy w 2 M wodorotlenku sodu przy użyciu zasilania 12 V.
  2. Przygotować pożywkę stosowaną do sekcji i hodowli narządów zarodkowych, składającą się z Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium F12 (DMEM F12) uzupełnionego 1% GlutaMAX i 1% penicyliny-streptomycyny.

2. Sekcja zarodków

  1. Ubój ciężarnej samicy krytej w określonym czasie przy użyciu metody harmonogramu pierwszego, zatwierdzonej przez Ministerstwo Spraw Wewnętrznych lub inny organ zarządzający. Odetnij skórę wokół dolnej części brzucha i rozetnij brzuch nożyczkami. Zlokalizuj dwa rogi macicy, które łączą się ze sobą w dolnej linii środkowej.
  2. Wyciąć macicę i umieścić w probówce wypełnionej podłożem na lodzie. Na lodzie tkankę można pozostawić na kilka godzin.
  3. Usunąć macicę i umieścić na szalce Petriego w pożywce pod mikroskopem. Tam, gdzie to możliwe, sekcje zarodków powinny być przeprowadzane w kapturze z przepływem laminarnym, aby zminimalizować zanieczyszczenie.
  4. Wypreparuj zarodki z macicy i uwolnij je od tkanek pozazarodkowych.
  5. Odciąć głowy zarodkom za pomocą wolframowej igły i przenieść głowy do świeżego naczynia z podłożem.
  6. Odizoluj żuchwy od głów, umieszczając igłę w jamie ustnej i przecinając ją w kierunku tyłu głowy (ryc. 1A i 1B). Izolowane żuchwy mogą być tymczasowo przechowywane w podłożu na lodzie w oczekiwaniu na siekanie.
  7. W przypadku całych plastrów żuchwy etapy E11.5-E15.5 są idealne do hodowli zarodków zębów. Po E15,5 rozwijająca się kość w żuchwie jest zbyt twarda do siekania. Nadal można wytwarzać plastry zębów, ale kość (kość zębowa i tworząca się wyrostek zębodołowy) musi najpierw zostać usunięta przez preparację przed siekaniem9. Ostrożnie usuń kość za pomocą igieł wolframowych i kleszczy.

3. Krojenie zarodków

  1. Przygotuj plastry tkanki żuchwy za pomocą standardowego rozdrabniacza do tkanek stołowych (ryc. 1C). Użyj nowego ostrza po około 200 żuchwach i upewnij się, że leży równo z tarczą montażową, gdy upadnie.
  2. Przed użyciem wyczyść tarczę montażową i ostrze 70% etanolem. Należy zachować ostrożność podczas korzystania z maszyny, ponieważ ostrze jest bardzo ostre.
  3. Ustaw rozdrabniacz na odległość cięcia od 200 do 400 μm w zależności od wieku próbki i w zależności od tego, czy wymagany jest cały zarodek zęba. Ustaw siłę ostrza na maksimum.
  4. Przenieś żuchwę na plastikową tarczę montażową za pomocą pipety lub kleszczy. Ułóż żuchwę na dysku, upewniając się, że orientacja jest nadal jasna. Rozwijający się język może być używany jako przydatny punkt orientacyjny do określania orientacji. W przypadku zębów trzonowych należy zastosować orientację czołową/poprzeczną (patrz płaszczyzna siekania na rysunku 1B), natomiast w przypadku siekaczy należy użyć strzałkowego przekroju przez żuchwę, aby odzwierciedlić różną orientację tych zębów w miarę ich wzrostu (patrz płaszczyzna siekania na rysunku 2A).
  5. Usuń nadmiar pożywki z okolic tkanki za pomocą bibuły filtracyjnej, aby lekko wysuszyć żuchwę na tarczy montażowej.
  6. Natychmiast po wysuszeniu umieść tarczę na okrągłym stole ze stali nierdzewnej rozdrabniacza. Włącz maszynę i naciśnij start. Stół przesuwa się automatycznie od lewej do prawej, podczas gdy w tym samym czasie ramię tnące przenoszące ostrze jest podnoszone i opuszczane z prędkością do 200 uderzeń/min.
  7. Wyłącz maszynę, gdy chusteczka zostanie całkowicie pokrojona. Upewnij się, że ramię ostrza jest w pozycji podniesionej i wyjmij tarczę. Nie wkładaj palców pod ramię ostrza ani nie pozostawiaj maszyny bez nadzoru podczas siekania.
  8. Weź krążek montażowy i natychmiast dodaj podłoże do plastrów na krążku, aby zapobiec nadmiernemu wysuszeniu. Ostrożnie usunąć pokrojoną tkankę z dna dysku za pomocą wolframowej igły, a następnie pipetować do małej szalki Petriego z podłożem (Rysunek 2A).
  9. Oddziel plastry za pomocą igły, a następnie wybierz wycinki tkanki zawierające tkankę będącą przedmiotem zainteresowania pod mikroskopem stereoskopowym (ryc. 1D, 1E i 2B). Umieść wybrane plastry w świeżych naczyniach z kulturami z podłożem.

4. Kultura Slice

  1. Przygotować naczynia do hodowli narządów w studzience centralnej, gotowe do hodowli, dodając około 2 ml autoklawowanej wody do zewnętrznej studzienki, aby zapobiec odwodnieniu, oraz umieszczając metalową siatkę w poprzek środka naczynia (ryc. 3A i 3B).
  2. Przygotuj metalowe siatki, wycinając paski o wymiarach około 4 cm x 1,5 cm z arkuszy siatki ze stali nierdzewnej. Użyj dziurkacza, aby zrobić otwór w środku i zegnij boki, aby utworzyć naprzemienny koniec. Siatka powinna pasować płasko w poprzek środkowej studzienki, leżąc równolegle do dna naczynia (rysunki 3A i 3B). Autoklaw siatek w celu sterylizacji przed użyciem.
  3. Wytnij kawałek przezroczystej membrany z politereftalanu etylenu (PET) (wielkość porów 0,4 μm) wystarczająco duży, aby zakryć otwór w siatce. Umieść pociętą membranę w naczyniu z wybranym plasterkiem.
  4. Umieść plasterek na wierzchu membrany, a następnie ostrożnie wyjmij membranę z podłoża, tak aby plasterek był spłaszczony w środku.
  5. Umieść filtr na siatce nad okrągłym otworem pośrodku i dodaj około 1 ml pożywki hodowlanej do studzienki, aż do poziomu membrany.
  6. W celu manipulacji dodaj białka lub inhibitory małych cząsteczek do pożywki (na przykład8).
  7. Sfotografuj wycinek, aby uzyskać zapis morfologii w dniu 0 hodowli.
  8. Umieścić naczynia w wilgotnej atmosferze 5% CO2 w temperaturze 37 °C w inkubatorze.
  9. Fotografuj kultury w regularnych odstępach czasu przez średnio 7 dni. Zmieniaj pożywkę co 48-72 godziny. W przypadku fotografii obejrzyj plasterki ze źródłem światła od spodu (rysunki 2C-E).

5. Śledzenie pochodzenia

Jeśli wymagane jest śledzenie linii, barwniki lipofilowe, takie jak DiI lub DiO, mogą być wstrzyknięte do zarodka zęba przed krokiem 4, czyli pokrój hodowlę.

  1. Wyciągnij szklane igły kapilarne za pomocą ściągacza do igieł.
  2. Złamij końcówkę igły za pomocą kleszczy i umieść końcówkę w roztworze barwnika. Pozostaw na kilka minut, aż barwnik wypełni końcówkę metodą kapilarną.
  3. Umieść napełnioną igłę w uchwycie i przymocuj za pomocą rurki do wstrzykiwacza lub aspiratora doustnego.
  4. Umieścić końcówkę igły w pożywce hodowlanej dotykając obszaru plasterka, który ma być oznaczony. Zastosuj ciśnienie powietrza, aby wyprzeć niewielką ilość barwnika z igły na tkankę.
  5. Wyjąć igłę i sprawdzić, czy jest oznaczona pod wpływem fluorescencji.
  6. Pomyślnie oznakowane wycinki można przenieść do filtrów i hodować zgodnie z opisem w kroku 4.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby śledzić ruch pierwszego trzonowego pęcherzyka zębowego, przez żuchwę pobrano 250 μm przekrojów czołowych za pomocą metody opisanej powyżej. Mieszek zębowy to warstwa mezenchymy, która otacza zewnętrzny nabłonek szkliwa (OEE) rozwijającego się zęba i wcześniej wykazano, że bierze udział w tworzeniu tkanki przyzębia 6. Żuchwy zostały wypreparowane w E14,5, w stadium rozwoju zęba. W przekroju zarys nabłonka zębowego był wyraźny, a zagęszczającą się mezenchymę zębową można było zidentyfikować jako ciemniejszy ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta metoda hodowli zębów ma tę zaletę, że dostęp do zarodka zęba jest doskonały, co pozwala na dokładne śledzenie linii i umieszczanie koralików w nabłonku lub mezenchymie. Dzięki temu można precyzyjnie ukierunkować określone obszary rozwijającego się zarodka zęba. Podczas hodowli można śledzić zmieniającą się morfologię zarodka zęba i szybko ocenić efekt manipulacji.

Metoda ta jest jednak odpowiednia tylko w przypadku młodych zarodków zębów przed znacznym utworzeniem się tkanek twardych, takic...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sarah A. Alfaqeeh jest finansowana przez Kind Saud University College of Dentistry, Ministerstwo Szkolnictwa Wyższego, Królestwo Arabii Saudyjskiej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
EtanolVWR101077Y100% etanol rozcieńczono w destylowanym H2O do 70%.
DMEM F12Gibco12634-010Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium F12
GlutaMAXGibco35050-061
Penicylina-streptomycynaSigmaP0781
DiI (Sondy molekularne)VybrantV-22885Roztwór
InvitrogenCell tracker CM-DiI, C-7000
DiO ( Sondy molekularne)VybrantV22886
Geminator 500ThomasThomas No. 3885A20Sterylizacja na sucho
Rozdrabniacz tkanek McIlwainTed Pella, Inc.10180Stół standardowy
Naczynie do hodowli narządów (naczynie do hodowli narządów w studzience centralnej)Membrany Falcon353037
(wkładki do hodowli komórkowych, 0,4 μ m wielkość porów)BD Falcon353090Membrana PET z wytrawionymi ścieżkami, format 6-dołkowy
Siatki metalowe (stal nierdzewna - AISI 304 - siatka)GoodfellowFE228710(Fe/Cr18/Ni10)
AutoFlow Direct Heat CO2 InkubatorNuaireNU-5500
Picospritzer IIIIntracel Ltd051-0500-900 0-100 psiJednokanałowy picospritzer III
Kapilara szklana z żarnikiem 1 mmWPITW100F-4
Drut wolframowy 0,1 mmGoodfellowW005138
Drut wolframowy 0,38 mmRurkiW005155
SigmaA5177Używany do śledzenia linii aspiracji ust
do znakowania komórek aspiratora Goodfellow

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rothova, M., Peterkova, R., Tucker, A. S. Fate map of the dental mesenchyme: dynamic development of the dental papilla and follicle. Developmental biology. 366, 244-254 (2012).
  2. Ferguson, C. A., et al. Activin is an essential early mesenchymal signal in tooth development that is required for patterning of the murine dentition. Genes & development. 12, 2636-2649 (1998).
  3. Trowell, O. A. The culture of mature organs in a synthetic medium. Experimental cell research. 16, 118-147 (1959).
  4. Matalova, E., Antonarakis, G. S., Sharpe, P. T., Tucker, A. S. Cell lineage of primary and secondary enamel knots. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 233, 754-759 (2005).
  5. Mitsiadis, T. A., Tucker, A. S., De Bari, C., Cobourne, M. T., Rice, D. P. A regulatory relationship between Tbx1 and FGF signaling during tooth morphogenesis and ameloblast lineage determination. Developmental biology. 320, 39-48 (2008).
  6. Diep, L., Matalova, E., Mitsiadis, T. A., Tucker, A. S. Contribution of the tooth bud mesenchyme to alveolar bone. Journal of experimental zoology. Part B, Molecular. 312B, 510-517 (2009).
  7. Rothova, M., Feng, J., Sharpe, P. T., Peterkova, R., Tucker, A. S. Contribution of mesoderm to the developing dental papilla. The International journal of developmental biology. 55, 59-64 (2011).
  8. Buchtova, M., et al. Initiation and patterning of the snake dentition are dependent on Sonic hedgehog signaling. Developmental biology. 319, 132-145 (2008).
  9. Buchtova, M., Stembirek, J., Glocova, K., Matalova, E., Tucker, A. S. Early regression of the dental lamina underlies the development of diphyodont dentitions. Journal of dental research. 91, 491-498 (2012).
  10. Cho, S. W., et al. The primary enamel knot determines the position of the first buccal cusp in developing mice molars. Differentiation; research in biological diversity. 75, 441-451 (2007).
  11. Sakano, M., et al. Cell dynamics in cervical loop epithelium during transition from crown to root: implications for Hertwig's epithelial root sheath formation. Journal of periodontal research. , (2012).
  12. Fisher, A. R. Morphological development in vitro of the whole and halved lower molar tooth germ of the mouse. Archives of oral biology. 16, 1481-1496 (1971).
  13. Coin, R., Schmitt, R., Lesot, H., Vonesch, J. L., Ruch, J. V. Regeneration of halved embryonic lower first mouse molars: correlation with the distribution pattern of non dividing IDE cells, the putative organizers of morphogenetic units, the cusps. The International journal of developmental biology. 44, 289-295 (2000).
  14. Kavanagh, K. D., Evans, A. R., Jernvall, J. Predicting evolutionary patterns of mammalian teeth from development. Nature. 449, 427-432 (2007).
  15. Munne, P. M., Tummers, M., Jarvinen, E., Thesleff, I., Jernvall, J. Tinkering with the inductive mesenchyme: Sostdc1 uncovers the role of dental mesenchyme in limiting tooth induction. Development. 136, 393-402 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Rozw j zal ka z bakrojenie tkaneksekcja uchwyledzenie linii kom rkowychmikroskopia fluorescencyjnaprzygotowanie po ywki hodowlanejobs uga kroj cej maszyny do tkaneksystem filtracji membranowej

Powiązane artykuły