Method Article

Decelularyzacja i recelularyzacja płuc naczelnych przy użyciu specjalistycznego bioreaktora wielkonarządowego

DOI:

10.3791/50825

⸱

December 15th, 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Stem Cell Research and Regenerative Medicine, Tulane University School of Medicine, 2Division of Regenerative Medicine, Tulane National Primate Research Center, 3Department of Microbiology and Immunology, Tulane University School of Medicine, 4Department of Pharmacology, Tulane University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Decelularyzacja całego narządu tworzy naturalne biologiczne rusztowania, które mogą być wykorzystane w medycynie regeneracyjnej. Przedstawiono opis modelu regeneracji płuc u naczelnych u zwierząt innych niż człowiek, w którym całe płuca są decelularyzowane, a następnie wysiewane dorosłymi komórkami macierzystymi i komórkami śródbłonka w bioreaktorze ułatwiającym krążenie naczyniowe i wentylację płynnych mediów.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie ma wystarczającej liczby dostępnych płuc, aby zaspokoić obecne i przyszłe potrzeby w zakresie transplantacji narządów. Biosztuczna regeneracja tkanek jest atrakcyjną alternatywą dla klasycznego przeszczepu narządów. Technologia ta wykorzystuje naturalną biologiczną macierz zewnątrzkomórkową (ECM) narządu jako rusztowanie, na którym można wysiewać i hodować komórki autologiczne lub macierzyste/progenitorowe w sposób ułatwiający regenerację oryginalnej tkanki. Naturalny ECM jest izolowany w procesie zwanym decelularyzacją. Decelularyzacja odbywa się poprzez traktowanie tkanek szeregiem detergentów, soli i enzymów w celu skutecznego usunięcia materiału komórkowego przy jednoczesnym pozostawieniu ECM w stanie nienaruszonym. Badania przeprowadzone z wykorzystaniem decelularyzacji, a następnie recelularyzacji płuc gryzoni wykazały marginalny sukces w generowaniu tkanki płucnej, która jest zdolna do wymiany gazowej in vivo. Chociaż modele gryzoni stanowią niezbędny dowód słuszności koncepcji, nie można ich bezpośrednio przełożyć na użytkowanie przez ludzi. Zwierzęta naczelne (NHP) stanowią bardziej odpowiedni model do zbadania wykorzystania produkcji narządów biosztucznej do ewentualnego zastosowania klinicznego.

Przedstawiono protokoły osiągnięcia całkowitej decelularyzacji płuc pobranych od makaka rezusa NHP. Powstałe w ten sposób bezkomórkowe płuca mogą być obsiane różnymi komórkami, w tym mezenchymalnymi komórkami macierzystymi i komórkami śródbłonka. Manuskrypt opisuje również rozwój systemu bioreaktorów, w którym płuca makaków z nasionami komórek mogą być hodowane w warunkach mechanicznego rozciągania i naprężenia zapewnianego przez wentylację podciśnieniową, a także pulsacyjną perfuzję przez naczynia krwionośne; Wiadomo, że siły te kierują różnicowaniem odpowiednio wzdłuż linii płucnej i śródbłonka. Przedstawiono reprezentatywne wyniki decelularyzacji i wysiewu komórek.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bioinżynieria tkanek i organów jest atrakcyjnym dodatkiem do dziedziny medycyny regeneracyjnej. Tworzenie "laboratoryjnych" narządów, które nadają się do przeszczepienia pacjentom w celu zastąpienia funkcjonalności chorych narządów, jest wysoce pożądane w celu zaspokojenia obecnego i przyszłego zapotrzebowania na przeszczepy. Zasady inżynierii tkankowej koncentrują się na wysiewaniu pożądanych typów komórek lub ich progenitorów do rusztowania, które podtrzymuje kształt zmodyfikowanej tkanki, dostarczając jednocześnie odpowiednich czynników wzrostu i warunków hodowli niezbędnych do naśladowania procesów rozwojowych lub regeneracyjnych. Podczas gdy syntetyczne rusztowan....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Decelularyzacja płuc makaków całoorganowych

  1. Przygotowanie roztworów
    1. Autoklaw 10-15 L wody dejonizowanej (dH2O) w butelkach o pojemności 1-2 L.
    2. Przygotować "roztwór Triton" (0,1% Triton X-100 w dH2O), mieszając 1 ml Triton X-100 w 999 mldH2O, mieszając na mieszadle magnetycznym. Przefiltrować roztwór przez aparat filtrujący 0,22 μm. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
    3. Przygotować "roztwór SDC" (2% SDC w dH2O), powoli dodając 20 g deoksycholanu sodu (SDC) do ~900 mldH 2O, mieszając. Po rozpuszczeniu SDC przenieść roztwór do cylindra miarowego i doprowadzić....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wyniki pokazane poniżej reprezentują oddzielne eksperymenty, w których przedziały dróg oddechowych lub naczyń krwionośnych zostały obsiane mezenchymalnymi komórkami macierzystymi pochodzącymi ze szpiku kostnego makaka rezusa lub mikronaczyniowymi komórkami śródbłonka pochodzącymi z płuc rezus, które zostały wyizolowane i scharakteryzowane jako wcześniej opisane16-18.

Przez cały proces decelularyzacji, płuca makaków wykazywały postępujące wybielanie, którego kulminacją był półprzezro.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tkanki mogą być sprawnie i skutecznie decellular ized za pomocą wielu metod wykorzystujących czynniki fizyczne, chemiczne i enzymatyczne12,20. Wyzwania związane z produkcją matryc biologicznych 3D z dużych narządów obejmują wymóg stosowania dużych ilości roztworów decelularyzacyjnych, drogi sprzęt komercyjny (tj. bioreaktory) oraz zawrotną liczbę perturbacji metodologicznych wymaganych do uzyskania końcowego produktu pochodzącego z tkanki. Nasza metoda zapewnia proste podejście, które minimalizuje man.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie mamy nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy pragną podziękować redakcji Tissue Engineering za zgodę na wykorzystanie zdjęć z poprzedniej publikacji w tym raporcie.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Nitrofrozyd soduSigma-Aldrich71778-25G
Sól sodowa heparynyFisherBP2425
Triton X-100FisherBP151-100
Deoksycholan soduFisherBP349-100
Chlorek soduFisher7647-14-5
DNaza trzustki bydlęcaSigma-AldrichDN25Przygotować bulion, porcję i zamrozić
Siarczan magnezuFisher10034-99-8
Chlorek wapniaFisherC614-500
PBS (bez Ca/Mg)Gibco, Life Technologies10010-031
Antybiotykowo-PrzeciwgrzybiczyGibco Life Technologies15240062
Pożywka
Alpha MEMGibco Life Technologies12561-072
Medium 199Gibco Life Technologies11150067
Premium Płodowa surowica bydlęcaAtlanta BiologicalsS11150
L-glutamina 100xGibco Life Technologies25030-081
Suplement na wzrost komórek śródbłonka (EKGS)ScienCell1052
Antybiotykowo-przeciwgrzybiczyGibco Life Technologies15240062
Zawory zwrotne do wysiewu komórek i hodowli w bioreaktorze
Cole-ParmerEW-98553-20
Łączniki YCole-ParmerED-30614-08
Kran 3-drogowyAparatura Harvarda721664
Rurka MasterFlex L/S 14Cole-Parmer96420-14
Wąż MasterFlex L/S 16Cole-Parmer96420-16
Zamek męski Luer 1/8 calaCole-ParmerEW-45505-04
Żeński Luer 1/8 calaCole-ParmerSI-45502-04
Męski wtyk Luer lockCole-ParmerEW-45505-56
Porty iniekcyjneMedi-Dose EPSIV2004
Rurka lateksowaSt. Louis Medical SuppyHN10910
Zacisk wężaCole-ParmerEW-06832-02
2 L Słoik z szerokim otworemFisher05-719-276
Strzykawki 60 mlFisherNC9035364
do hodowli komórkowych

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat. Med. 14, 213-221 (2008).
  2. Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Nonhuman Primate LungLung DecellularizationBioreactor SystemExtracellular MatrixStem Cell SeedingEndothelial Cell CultureMechanical StretchPulsatile PerfusionTissue EngineeringOrgan Regeneration

Related Articles