Model eksperymentalny do badania koinfekcji gruźlicą i malarią po naturalnym przenoszeniu Mycobacterium tuberculosis i Plasmodium berghei

Podsumowanie

Gruźlica i malaria to dwie z najbardziej rozpowszechnionych infekcji u ludzi oraz główne przyczyny zachorowalności i śmiertelności w zubożałych populacjach w tropikach. Stworzyliśmy eksperymentalny system modelowy do badania wyników koinfekcji malarią i gruźlicą u myszy po prowokacji obydwoma patogenami za pośrednictwem ich naturalnej drogi zakażenia.

Streszczenie

Koinfekcje występują naturalnie z powodu geograficznego nakładania się różnych typów organizmów chorobotwórczych. Równoczesne infekcje najprawdopodobniej modulują odpowiednią odpowiedź immunologiczną na każdy pojedynczy patogen, a tym samym mogą wpływać na patogenezę i wynik choroby. Pacjenci zakażeni mogą również różnie reagować na interwencje przeciwinfekcyjne. Koinfekcja między gruźlicą wywoływaną przez prątki a pasożytem malarii Plasmodium, które są endemiczne w wielu częściach Afryki Subsaharyjskiej, nie została szczegółowo zbadana. Aby zmierzyć się z trudnym, ale naukowo i klinicznie bardzo istotnym pytaniem, w jaki sposób koinfekcja malarią i gruźlicą moduluje odporność gospodarza i przebieg każdej choroby, stworzyliśmy eksperymentalny model myszy, który pozwala nam przeanalizować wywołane odpowiedzi immunologiczne na oba patogeny w zakażonym gospodarzu. Warto zauważyć, że w celu jak najdokładniejszego naśladowania naturalnie nabytych infekcji u ludzi, przeprowadzamy eksperymentalne infekcje myszy obydwoma patogenami za pomocą ich naturalnych dróg infekcji, tj. odpowiednio aerozolu i ukąszenia komara.

Wprowadzenie

Populacje ludzkie rzadko są narażone na działanie tylko jednego patogenu. Szczególnie w regionach o wysokiej częstości występowania zakażeń, takich jak Afryka Subsaharyjska, koinfekcje stanowią główny, ale bardzo niedoceniany problem zdrowia publicznego. Gruźlica i malaria są najczęstszymi infekcjami bakteryjnymi i pasożytniczymi u ludzi i nadal są głównymi przyczynami zachorowalności i śmiertelności w zubożałych populacjach w tropikach. Pomimo szerokiego pokrywania się geograficznego gruźlicy i malarii oraz dużej liczby osób zagrożonych kozakażeniem, bardzo niewiele wiadomo na temat interakcji między różnymi i często przeciwdziałającymi regulatorami immunologicznymi i efektorami jednocześnie wywoływanymi przeciwko pasożytom malarii i prątkom gruźlicy u osób zakażonych.

Modele mieszanych infekcji gryzoni pozwalają na scharakteryzowanie zróżnicowanych reakcji immunologicznych przeciwko różnym patogenom u jednego gospodarza, rzucając tym samym światło na wzajemne wpływy modulujące patologię i wynik kliniczny danej choroby, co również pomoże zidentyfikować nowe zalecenia dotyczące terapii i profilaktyki. Ustaliliśmy eksperymentalny model myszy, który umożliwia nam zbadanie konsekwencji spowodowanych jednoczesnym zakażeniem Mycobacterium tuberculosis (Mtb) i gatunkami gryzoni Plasmodium w obrębie tego samego gospodarza¹. Co ważne, aby jak najwierniej naśladować naturalnie nabyte infekcje u ludzi, nasz model implementuje naturalne drogi infekcji wykorzystywane przez oba patogeny. Gruźlica jest infekcją przenoszoną drogą powietrzną, która objawia się przede wszystkim w płucach. Czynnik sprawczy, Mtb, jest przenoszony przez osoby z aktywną chorobą drogą aerozolową, gdy wydalają zakaźne kropelki aerozolu podczas kaszlu lub kichania. Tak więc infekcja aerozolowa jest metodą z wyboru naśladującą naturalną infekcję. Wytwarzanie unoszących się w powietrzu cząstek zawierających Mtb można osiągnąć za pomocą systemu narażenia inhalacyjnego. Ta komora ekspozycyjna całego ciała pozwala na wystawienie zwierząt doświadczalnych na zakaźne kropelki aerozolu zawierające Mtb (ryc. 1), które są wdychane do pęcherzyków płucnych, w których inicjuje się infekcja².

Malaria z drugiej strony jest chorobą przenoszoną przez wektory wywoływaną przez pierwotniaka, pasożyta apicomplexan Plasmodium, który jest naturalnie przenoszony przez ukąszenie samicy komara Anopheline. Podczas posiłku z krwi zakaźne sporozoity odkładają się pod skórą gospodarza, a następnie docierają do wątroby przez krwioobieg. W obrębie hepatocytów rozwijają się i szybko namnażają w schizonty w fazie wątrobowej. W końcu dojrzałe schizonty pękają i uwalniają tysiące chorobotwórczych merozoitów pierwszej generacji do krwiobiegu, gdzie inicjują postępujący cykl inwazji krwinek czerwonych, replikacji, pękania krwinek czerwonych i reinwazji³. Cykl życiowy Plasmodium trwa nadal, gdy niektóre merozoity przekształcają się w stadia pasożyta płciowego, męskie i żeńskie gametocyty, które mogą być wchłaniane przez komary podczas posiłków z krwi. U komara sporozoity Plasmodium rozwijają się w oocystach znajdujących się w jelicie środkowym komara i ostatecznie migrują do gruczołów ślinowych w celu dalszego przeniesienia do innego żywiciela^3,4.

Podczas gdy w eksperymentalnych modelach zwierzęcych dostarczanie Mtb przez aerozol, a więc najbardziej odpowiednią drogę, jest bardzo powszechne, wiele eksperymentalnych badań nad zakażeniem gryzoni Plasmodium, w tym badania nad koinfekcją malarii i gruźlicy^5-7, zostało przeprowadzonych przez zakażenie myszy pasożytniczymi erytrocytami, powodując zakażenie malarią w stadium krwi, wykluczając klinicznie cichą fazę wątroby. Jednak stadium wątrobowe jest obowiązkowym etapem podczas infekcji i ma znaczenie dla odporności przeciwplazmodialnej^8-11. W związku z tym uważamy, że ważne jest, aby uwzględnić wątrobową fazę przenoszenia i utrzymywania się malarii w badaniach dotyczących odpowiednio malarii i koinfekcji malarii i gruźlicy. Ponadto wykazano, że naturalnie przenoszone sporozoity są bardziej zakaźne niż te przenoszone przez infekcje igłowe¹², co skłoniło nas do ustalenia zakażenia malarią przez ukąszenie komara zamiast wstrzykiwania izolowanych sporozoitów pochodzących z gruczołów ślinowych. Jedynym sposobem na uzyskanie zakaźnych komarów do naturalnego przenoszenia pasożytów malarii jest utrzymanie całego cyklu życiowego pasożyta zarówno u żywiciela kręgowców (w tym przypadku myszy), jak i wektora komarów. W związku z tym dostęp do owada w celu utrzymania pasożyta jest nieunikniony, aby przeprowadzić naturalne przenoszenie przez ugryzienie.

Nasz protokół opisany tutaj został opracowany w celu zbadania, jak koinfekcja sporozoitami Plasmodium wpływa na przewlekłą gruźlicę¹. W tym celu myszy są zarażane M. tuberculosis w aerozolu, a 40 dni później, gdy zakażenie M. tuberculosis osiąga fazę przewlekłą, myszy są narażone na komary zakaźne malarii. Wyniki zarówno malarii, jak i gruźlicy u zakażonych zwierząt można śledzić, monitorując odpowiednio pasożytnictwo krwi i obciążenie bakteryjne w tkankach. W naszym protokole opiszemy szczegółowo, jak zarazić myszy obydwoma patogenami ich naturalną drogą infekcji i jak potwierdzić udaną transmisję patogenu. W naszych rękach powszechnie osiągany wskaźnik zakażeń dla obu eksperymentalnych infekcji wynosi 100%. Protokoły te mogą być stosowane do badania obu infekcji oddzielnie lub, tak jak my to robimy, do modelowania i badania koinfekcji między dwiema najtrudniejszymi chorobami zakaźnymi u ludzi. Model ten ma zastosowanie do innych gatunków Mycobacterium i gryzoni Plasmodium poza opisanymi w niniejszym protokole.

Protokół

Oświadczenie o środkach bezpieczeństwa i etyce

Badania przedstawione tutaj obejmują pracę z ludzkim patogenem Mtb i pasożytem malarii gryzoni Plasmodium berghei (P. berghei). Doświadczenia z Mtb (szczepem H37Rv) i P. berghei muszą być przeprowadzane w odpowiednich warunkach bezpieczeństwa biologicznego. Laboratoria poziomu bezpieczeństwa biologicznego (BSL) 2 są wymagane dla pasożytów malarii gryzoni, takich jak P. berghei i BSL 3 dla Mtb, a tym samym dla wszystkich badań koinfekcji opisanych w niniejszym dokumencie. UWAGA: Myszy zakażone Mtb nie przenoszą infekcji na inne myszy w bezpośrednim sąsiedztwie (nasza własna obserwacja). W związku z tym można wykluczyć rozprzestrzenianie się na eksperymentatora; jednak w laboratorium BSL 3 należy przez cały czas nosić odpowiednią odzież ochronną. Zgodnie z naszymi zasadami, eksperymentatorzy noszą fartuchy chirurgiczne, siatki na włosy, jednorazowe respiratory i dwie pary rękawiczek, z których zewnętrzna jest wyrzucana za każdym razem, gdy broń jest wyjmowana z szafki. Nowe są zakładane przed ponownym wejściem do szafki. Dwa pojemniki, jeden z 2% Buratonem (UWAGA: inne środki dezynfekujące zatwierdzone do inaktywacji Mtb mogą być stosowane w zatwierdzonym stężeniu) na odpady płynne i zakaźne oraz jeden do odkażania powierzchni, są przygotowywane przed eksperymentem i umieszczane w szafie. Ponadto worki foliowe będą używane do stałych odpadów niezakaźnych. Zgodnie z niemieckimi przepisami wszystkie prace związane z obchodzeniem się i przetwarzaniem kultur Mtb lub tkanek pochodzących od myszy zakażonych Mtb muszą być wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy 2 w laboratorium BSL3. Podczas obchodzenia się z prątkami należy podjąć środki, aby przez cały czas unikać wytwarzania aerozoli.

Samice myszy C57BL/6 (Charles River) w wieku od 6 do 8 tygodni były wykorzystywane do wszystkich eksperymentów z koinfekcją i utrzymywane w określonych warunkach barierowych w obiektach BSL 3. Opieka nad zwierzętami i doświadczenia prowadzone były zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Komisję Etyki ds. Doświadczeń na Zwierzętach Ministerstwa Rolnictwa, Środowiska i Obszarów Wiejskich kraju związkowego Szlezwik-Holsztyn

W celu uzyskania stadiów malarii komarów, myszy NMRI zostały zakupione z Charles River Laboratory, Sulzfeld, Niemcy i trzymane w specyficznych warunkach wolnych od patogenów w ośrodku dla zwierząt Uniwersytetu w Heidelbergu (IBF). Wszystkie doświadczenia na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z przepisami europejskimi i zatwierdzone przez władze kraju związkowego Badenia-Wirtembergia (Regierungspräsidium Karlsruhe).

1. Zakażenie aerozolem myszy Mtb za pomocą komory aerozolowej Glas-Col

Najlepszym sposobem na standaryzację infekcji aerozolowych zwierząt doświadczalnych za pomocą Mtb jest użycie prątków z zamrożonych zapasów o znanym mianie CFU. Aby przygotować kultury podstawowe, należy wyhodować Mtb w bulionie Middlebrook 7H9 uzupełnionym pożywką wzbogacającą OADC (kwas oleinowy, albumina, dekstroza, katalaza) i 0,05% Tween 80, źródło węgla dla prątków i jednocześnie zmierzyć, aby uniknąć zbrylania się bakterii. Kultury powinny mieć OD ≤ 1 w momencie zbioru. Przy wyższym OD zwiększa się zlepianie bakterii i zmniejsza się żywotność. Przechowywać 1 ml podwielokrotności w temperaturze -80 °C. Określić liczbę żywotnych jednostek tworzących kolonie (CFU) w zamrożonych wywarach, posiewając serię 10-krotnych rozcieńczeń trzech niezależnych fiolek na płytkach agarowych 7H11 uzupełnionych 0,5% glicerolem, 1 g/l asparaginy i OADC i policzyć kolonie po 4 tygodniach inkubacji w temperaturze 37 °C. Przeprowadzić infekcję aerozolową zgodnie z opisem poniżej.

1. Rozmrozić zapasy Mtb o znanym mianie CFU i ostrożnie wymieszać zawiesinę pięć razy w celu rozproszenia grudek bakteryjnych za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml wyposażonej w igłę 27 G. Unikaj produkcji aerozoli.
2. W zależności od pożądanej dawki infekcji, przenieść wymaganą objętość wywaru prątków do 50 ml probówki zawierającej sterylny PBS. Ostateczna objętość wynosi 6 ml. UWAGA: Zmieniając liczbę mikroorganizmów w tej zawiesinie, zmienia się proporcja bakterii przenoszących kropelki aerozolu. Zwykle dążymy do wychwytu 100 żywotnych pałeczek na płuco (infekcja niskodawkowa). Z naszego doświadczenia wynika, że wymaga to około 1-2 x 10⁶ Mtb/ml w całkowitej objętości 6 ml, z czego 5,5 ml jest nebulizowane (patrz poniżej). Zaleca się wykonanie serii eksperymentalnych wyzwań aerozolowych z różnymi stężeniami bakterii, aby znaleźć idealne warunki dla infekcji. Podczas gdy infekcje wysokodawkowe z użyciem do 5000 prątków można przeprowadzić w celu przyspieszenia procesu zakaźnego, do skutecznego zakażenia myszy za pomocą aerozolu można użyć zaledwie 5 bakterii. Wskaźnik infekcji wynosi zwykle 100%.
3. Usunąć wystarczającą objętość (przygotowaną ponad wymaganą objętość końcową) do posiewu w celu określenia miana inokulum; zwykle usuwamy 500 μl do trzech egzemplarzy technicznych.
4. Umieść zwierzęta w koszu siatkowym z przedziałami (jedna mysz na kosz) w okrągłej komorze aerozolowej i zamknij pokrywę komory aerozolowej. UWAGA: Inne modele są wyposażone w kosz w kształcie ciasta składający się z pięciu pojedynczych przegródek, z których każda może pomieścić 20 myszy.
5. Przymocuj nebulizator Venturiego do trzech złączy kielichowych ze stali nierdzewnej.
6. Wyjąć zawiesinę prątków z probówki o pojemności 50 ml za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml wyposażonej w igłę o masie 18 G i przenieść strzykawkę do komory aerozolowej w zamkniętym pudełku transportowym.
7. Zdejmij nakrętkę z nebulizatora i ostrożnie wstrzyknij zawiesinę prątków do nebulizatora. Unikaj wytwarzania aerozoli. Wyrzucić strzykawkę do pojemnika na ostre przedmioty zawierającego 2% Buraton. Uszczelnij nebulizator zakrętką.
8. Włącz główny wyłącznik zasilania i UV lamp. Na wyświetlaczu na klawiaturze sterującej pojawia się "Glas-Col Apparatus Co".
9. Włącz przełącznik programu. Na wyświetlaczu pojawi się "Czy nebulizator jest gotowy?" "Czy kosz jest załadowany?" Naciśnij enter, gdy będzie gotowy". Naciśnij Enter.
10. Na wyświetlaczu pojawi się komunikat "Enter Preheating Time 900", co oznacza, że czas wstępnego nagrzewania dla spalarni (która odkaża powietrze wywiewane) wynosi 900 sek. Naciśnij enter.
11. Na wyświetlaczu pojawi się komunikat "Wprowadź czas nebulizacji 1,800", co oznacza, że czas nebulizacji jest domyślnie ustawiony na 1,800 sekund. Aby przedłużyć czas nebulizacji, wpisz "2,400" i naciśnij enter. UWAGA: Podczas cyklu nebulizacji powietrze pod ciśnieniem rozpyla zawiesinę, wytwarzając w ten sposób małe kropelki aerozolu zawierające prątki. Przy głównym strumieniu powietrza kropelki te (o wielkości około 2-5 μm) są przenoszone do komory aerozolowej.
12. Na wyświetlaczu pojawi się "Enter C.D. Time 1,800"; oznacza to, że cykl zaniku trwa 1,800 sek. Ustaw na "2,400" i naciśnij enter. UWAGA: Podczas tego cyklu chmura, która nagromadziła się w komorze aerozolowej podczas cyklu nebulizacji, może ulec rozpadowi. Małe kropelki są wdychane przez zwierzęta doświadczalne.
13. Na wyświetlaczu pojawi się komunikat "Enter Dec Time 900", co oznacza, że cykl odkażania światłem UV potrwa 900 sekund. Naciśnij enter. Maszyna zacznie cyklicznie przechodzić przez podgrzewanie, nebulizację, zanikanie chmur i odkażanie UV.
    UWAGA: Przepływomierz podciśnienia powinien wskazywać 60 stóp sześciennych / godzinę (sprawdź, kiedy rozpoczyna się cykl podgrzewania; w razie potrzeby wyreguluj zawór sterujący podciśnieniem), a przepływomierz sprężonego powietrza 10 stóp sześciennych / godzinę (sprawdź, kiedy rozpoczyna się cykl nebulizacji; odpowiednio wyreguluj zawór sterujący powietrzem).
14. Po zakończeniu cyklu na klawiaturze pojawi się komunikat "Proces zakończony – Usuń próbkę". Wyłącz program, UV i główny wyłącznik zasilania.
15. Sprawdzić, czy zawiesina prątków została całkowicie poddana nebulizacji, a jeśli nie, zanotować pozostałą objętość, ostrożnie usuwając zawiesinę odpowiednią strzykawką wyposażoną w igłę o sile 18 G. Pozostała objętość nie powinna przekraczać 1 ml.
16. Wyjmij nebulizator z jointów i umieść go w garnku zawierającym 2% Buraton na minimum 2 godziny, zwykle dezynfekcja odbywa się O/N. Następnie przenieś nebulizator na świeżą patelnię i dokładnie spłucz wodą. Pozostaw nebulizator do wyschnięcia na powietrzu.
17. Otwórz komorę aerozolową i włóż zwierzęta z powrotem do klatek. Zapakuj kosze w worki autoklawu i autoklawy. Wytrzyj powierzchnie wnętrza komory aerozolowej 2% Buratonem. UWAGA: Ze względów bezpieczeństwa podczas tej procedury należy nosić respirator oczyszczający powietrze z wymuszonym przepływem powietrza.
18. Używając pozostałych 500 μl zawiesiny prątków (patrz krok 1.3), naniec 10-krotne rozcieńczenia technicznego triplikatau (3 x 100 μl) na płytkach agarowych 7H11.

2. Sprawdź wychwyt pożądanego CFU w płucach

Dzień po zakażeniu aerozolowym zwierząt doświadczalnych określ ładunek bakteryjny w płucach wyznaczonych zwierząt kontrolnych, aby sprawdzić absorpcję pożądanego CFU. UWAGA: Zwykle wyznaczamy dodatkową grupę 3-5 myszy do oznaczania CFU dnia 1.

Aby monitorować przebieg infekcji Mtb w czasie, obciążenie tkankami prątków może być badane poprzez sianie seryjnych rozcieńczeń homogenatów całego narządu do określenia CFU. Płuca są głównym miejscem manifestacji choroby w gruźlicy, jednak śledziona, wątroba i węzły chłonne są zwykle odpowiednio analizowane. Rozcieńczenia, które należy posiać, zależą od oczekiwanego obciążenia prątkami w narządach, które zależy od początkowego inokulum (niska dawka vs. wysoka dawka), co powoduje różne obciążenia bakteryjne w tkance, a także od narządu i punktu czasowego, który ma być analizowany. Po zakażeniu niską dawką ładunek bakteryjny Mtb H37Rv w płucach zwykle osiąga plateau między 25 a 30 dniem.

1. Umieścić zwierzęta poddane eutanazji (eutanazja: uduszenie CO₂ lub znieczulenie końcowe) na papierze chłonnym na desce sekcyjnej w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II i zdezynfekować myszy 70% etanolem. UWAGA: 70% alkohol służy wyłącznie do odkażania powierzchni i nie zabija Mtb.
2. Wykonaj małe nacięcie na środku brzucha i schuj skórę myszy nad głową.
3. Otwórz jamę brzuszną i klatkę piersiową nożyczkami chirurgicznymi i usuń ścianę klatki piersiowej, aby płuca były dostępne.
4. Usunąć płuca i przenieść do probówki o pojemności 15 ml z buforem homogenizacyjnym (sterylna woda/1% v/v Tween 80/1% w/v albumina).
5. Za pomocą tłoka strzykawki o pojemności 5 ml przecisnąć płuca przez sitka o średnicy 100 μm do małej szalki Petriego.
6. Przepłukać sita kilkakrotnie za pomocą pipety o pojemności 1 ml wyposażonej w końcówkę barierową i rozprowadzić homogenat płucny na 8 płytkach agarowych (ok. 250 μl/płytkę; upewnić się, że mają dobrze wysuszoną powierzchnię).
7. Ostrożnie pokryć próbki za pomocą jednorazowych rozsiewaczy, które są wyrzucane do 2% Buraton.
8. Pozostaw płytki agarowe do wyschnięcia wewnątrz szafki. Uszczelnić każdą pojedynczą płytkę parafilmem, zawinąć w folię aluminiową i inkubować w pozycji pionowej w temperaturze 37 °C przez co najmniej 4 tygodnie.

3. Budowa klatek na komary zabezpieczonych przed ucieczką

Szczepy gryzoni Plasmodium nie są szkodliwe dla ludzi. Ponieważ jednak myszy zakażone Mtb są odbiorcami pasożyta, a praca jest wykonywana w warunkach BSL 3, konieczne są środki ostrożności, aby zapobiec ucieczce komarów z klatek. W zależności od planowanego schematu infekcji można stosować klatki z metalową ramą do sterylizacji w autoklawie i wielokrotnego użytku lub samodzielnie wykonane klatki jednorazowe. Te ostatnie są zalecane, jeśli zakażenie przez ugryzienie zwierząt doświadczalnych musi być przeprowadzone przez określoną liczbę komarów na mysz. Jeśli wymagane są klatki wykonane samodzielnie, należy przygotować klatki zgodnie z dokładnymi specyfikacjami, ponieważ zdrowie komarów i bezpieczeństwo laboratorium zależy od ich solidnej konstrukcji (rysunek 2).

1. Weź karton, taki jak półlitrowy karton po lodach lub papierowy kubek do kawy (Rysunek 2).
2. Wytnij mały otwór z boku kartonu i przykryj podwójną warstwą lateksu ze szczeliną wyciętą w każdym kawałku, aby stworzyć bezpieczne wejście dla komarów. UWAGA: Otwór ma całkowity wymiar 2 cm x 2 cm, rurka (urządzenie aspirujące), której używamy do wnoszenia i/lub wyjmowania komarów, to zmodyfikowana rurka Falcon o pojemności 15 ml podłączona do pompy próżniowej, a zatem służy jako aspirator o średnicy 1,5 cm.
3. Przyklej kawałek bibuły filtracyjnej do wewnętrznej strony kartonu, aby wchłonąć krople.
4. Kubki do lodów zamknij siatką (podwójna warstwa siatki nylonowej o wymiarach 1 mm x 1 mm) i przymocuj do kartonu za pomocą taśmy i gumki.
5. Do eksperymentów z infekcjami, w których wymagana jest określona liczba komarów na mysz, przygotuj klatki z 10-15 zainfekowanymi komarami, z których każda idealnie zawiera średnio 10 000 sporozoitów gruczołów ślinowych typu dzikiego P. berghei.
6. Najlepiej głodzić komary przez 24 godziny przed wykonaniem posiłku z krwi.

4. Malaria Zakażenie myszy przez ukąszenie komara

Pasożytem malarii gryzoni używanym tutaj jest P. berghei, jednak można użyć dowolnego innego szczepu Plasmodium gryzonia, który jest interesujący. Aby uzyskać zakaźne komary do przenoszenia sporozoitu, cały cykl życiowy pasożyta jest utrzymywany zarówno w żywicielu kręgowców (myszy), jak i w wektorze komarów. Utrzymanie pasożytów odbywa się w insekcie. W przypadku eksperymentów z naturalną transmisją, minimalna liczba sporozoitów na gruczoł ślinowy nie powinna być mniejsza niż 10 000. Szczegółowe protokoły dotyczące opieki nad pasożytami można znaleźć w Methods in Malaria Research autorstwa Moll et al., 2013.

1. Znieczulenie nieleczonych myszy lub zwierząt należy wstępnie zakażone przez 40 dni roztworem Mtb z ketaminą (100 mg/kg) i ksylazyną (7 mg/kg) we wstrzyknięciu dootrzewnowym (200 μl/mysz). UWAGA: Czas między zakażeniem Mtb a Plasmodium można dostosować w zależności od podstawowego pytania badawczego. Podobnie, kolejność wyzwań związanych z patogenami może zostać odwrócona, tj. myszy mogą być narażone na zakaźne ukąszenie komara przed zakażeniem Mtb.
2. Umieść znieczulone myszy na siatce klatek na komary (jedna mysz na klatkę dla komarów dla określonego stosunku komarów do myszy) i pozwól komarom żerować przez membranę przez 10-15 minut. UWAGA: Obecność krwi w jelitach komarów oznacza karmienie, a tym samym przenoszenie sporozoitów.
3. Przenieś myszy z powrotem do ich klatek i stale nadzoruj, aż obudzą się ze znieczulenia. UWAGA: Umieść myszy na ręczniku papierowym, a nie na pościeli (ryzyko uduszenia) i trzymaj w cieple (umieść blisko siebie i przykryj ciała ręcznikiem papierowym).
4. Zabij komary, spryskując je 70% etanolem lub innymi środkami dezynfekującymi przez siatkę klatki. Klatki do autoklawu i wyrzuć, jeśli użyto jednorazowych.

5. Monitorowanie parazytemii

1. Nakłuj żyły ogonowe na samym końcu igłą i zbierz po jednej kropli krwi na każdym końcu szkiełka.
2. Użyj innego slajdu, aby wyciągnąć jedną kroplę krwi na połowie długości szkiełka. Odwróć rozsiewacz, aby użyć drugiej krawędzi do drugiego rozmazu. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na powietrzu.
3. Bejca Giemsa
   1. Umieścić szkiełka w uchwytach na szkiełka i utrwalić rozmazy krwi przez krótkie zanurzenie w absolutnym metanolu. UWAGA: Ponieważ w BSL 3 należy ograniczyć użycie wyrobów szklanych do minimum, do wszystkich roztworów używamy kuwet polipropylenowych.
   2. Zanurz rozmazy w Giemsie (1:10 w wodzie dejonizowanej). Po 10 minutach zanurz i wyjmij szkiełka z kuwet barwiących wypełnionych wodą dejonizowaną, aby spłukać nadmiar plamy.
   3. Na koniec suszenie na powietrzu przesuwa się w pozycji pionowej.
4. ALTERNATYWNA PLAMA: Plama Wrighta
   1. Rozpuść plamę Wrighta w stężeniu 1 mg/ml w metanolu.
   2. Przefiltruj przez złożony filtr przed użyciem.
   3. Zanurz rozmazy krwi w roztworze barwiącym i inkubuj przez 4 minuty (UWAGA: utrwalanie rozmazów metanolem nie jest konieczne, ponieważ roztwór barwiący jest na bazie metanolu).
   4. Umyć szkiełka, płucząc je w wodzie dejonizowanej, jak opisano powyżej, i pozostawić szkiełka do wyschnięcia na powietrzu.
   5. Gdy plama Giemsy/Wrighta będzie gotowa, delikatnie przenieś wszystkie użyte odczynniki do pojemnika zawierającego Buraton.
5. Analiza rozmazu krwi
   1. Analizuj poplamione rozmazy krwi za pomocą mikroskopii świetlnej przy 100-krotnym powiększeniu z zanurzeniem w oleju.
   2. Policz niezakażone i zakażone erytrocyty w obszarze rozmazu krwi, w którym erytrocyty są ułożone w monowarstwie.
   3. Aby uzyskać dobrze zdefiniowaną parazytemię, należy policzyć co najmniej 10 różnych pól widzenia, w których występuje monowarstwa erytrocytów.
   4. Oblicz względną parazytemię (w %), dzieląc liczbę spasożytowanych erytrocytów przez liczbę erytrocytów i mnożąc przez 100.

Wyniki

Zakażenie myszy Mtb i P. berghei drogą naturalną, tj. odpowiednio aerozolem i ukąszeniem komara, prowadzi do spójnego i powtarzalnego zakażenia wszystkich zwierząt (Tabela 1)¹. Możemy monitorować pomyślne zakażenie oraz przebieg zarówno malarii, jak i gruźlicy, określając odpowiednio moment pierwszego pojawienia się (okres prepatentny) i liczbę pasożytów we krwi (parasitemia P. berghei) oraz obciążenie Mtb w różnych narządach. Przykład pomyślnej transmisji pasożyta malarii poprzez ukąszenie zakażonego komara przedstawiono w Tabeli 1 oraz na Rysunku 3. Karmienie każdego myszy 10 komarami zakażonymi sporozoitami skutkowało 100% stopniem zakażenia, co potwierdzono obecnością pasożytów w stadium krwi 4-5 dni później (Tabela 1 i Rysunek 3A). Co istotne, obserwujemy podobną liczbę pasożytów we krwi poszczególnych myszy z tej samej grupy eksperymentalnej, co wskazuje, że transmisja sporozoitów przez ukąszenie komara prowadzi do spójnego i powtarzalnego zakażenia. Porównując okres prepatentny u naiwnych myszy kontrolnych z okresem u zwierząt współzakażonych Mtb, można zauważyć, że okres prepatentny jest nieco opóźniony u myszy, które zostały wcześniej zakażone Mtb (Tabela 1, Rysunek 3B)¹. Jak zgłaszaliśmy wcześniej¹, wpływ współzakażenia Mtb na przebieg malarii możemy określić poprzez codzienne monitorowanie parasitemii w rozmazach krwi barwionych metodą Giemsy, jak pokazano na Rysunku 3B.

Zakażenie myszy Mtb z wykorzystaniem systemu ekspozycji inhalacyjnej skutkuje skutecznym osadzeniem bakterii w płucach przy stosunkowo niskiej zmienności między poszczególnymi osobnikami (Rysunek 4A). Możemy śledzić liczbę prątków w płucach i innych interesujących nas organach w czasie poprzez oznaczenie CFU. Przykład obciążenia prątkami w płucach zakażonych Mtb myszy C57BL/6 w obecności lub przy braku P. berghei przedstawiono na Rysunku 4B.

Tabela 1. Okres prepatencyjny po transmisji sporozoitów poprzez ukąszenie komara. Wszystkie myszy rozwinęły infekcje na etapie krwi po naturalnej transmisji sporozoitów P. berghei poprzez ukąszenie komara. Dostosowano z¹ PLoS ONE, 7(10), e48110 za zgodą wydawcy.

Experimentalna grupa myszy (C57BL/6)	Ekspozycja na 10 infekcyjnych ukłuć komarów	Liczba zwierząt z wynikiem dodatnim w stadium krwi / Liczba zwierząt w grupie	Średni czas do utraty drożności [d]
naiwne	P. berghei	7/7	4,4
Mtb zakażony	P. berghei	7/7	5,5

Rycina 1. Ogólny schemat procedury eksperymentalnej. Myszy C57BL/6 są poddawane działaniu kropelek aerozolu zawierającego Mtb w komorze aerozolowej Glas-Col. Jeden dzień po infekcji aerozolowej weryfikuje się pobranie Mtb poprzez analizę CFU w płucach. 40 dni po ekspozycji na Mtb (gdy gruźlica w zakażonych myszach przechodzi w stan przewlekły), zwierzęta są eksponowane na komary zakażone P. berghei. Aby potwierdzić pomyślny transfer sporozoitów i śledzić przebieg infekcji Plasmodium, poziom parasitemii jest monitorowany codziennie w rozmazach krwi barwionych metodą Giemsy, zaczynając od 3. dnia po ukąszeniu komara.

Rycina 2. Schemat klatki dla komarów. Zakażone komary są przetrzymywane w pojemniku, takim jak pudełko po lodach o pojemności pół pinta. W bocznej ściance pojemnika wycina się mały otwór i zakrywa go podwójną warstwą lateksu, w której każdy element ma nacięcie, tworzące bezpieczne wejście dla komarów. Na wewnętrznej dolnej ściance pojemnika przykleja się taśmą kawałek papieru filtrującego, aby wchłaniał kapiące ciecze. Kubki po lodach są zamknięte siatką (siatka nylonowa), która jest przymocowana do pojemnika za pomocą taśmy i gumki recepturki.

Rycina 3. Parasitemia krwi. A) Przykład rozmazu krwi barwionego metodą Wrighta, przedstawiający zarażone erytrocyty (Pasek skali, 20 µm). B) Parasitemię we krwi myszy monitorowano poprzez codzienną analizę rozmazów krwi barwionych metodą Giemsy. Myszy z coinfekcją wykazują obniżoną parasitemię w porównaniu do myszy zainfekowanych pojedynczo Plasmodium (n=10); wyniki przedstawiono jako średnie ± SD; ***p<0,001. Przedrukowano z ¹ PLoS ONE, 7(10), e48110 za zgodą autora.

Rycina 4. Wykrywanie Mtb w płucach. Myszy C57BL/6 poddano wyzwaniu aerozolowemu 100 CFU Mtb, a 40 dni później zainfekowano współbieżnie P. berghei poprzez ukąszenie komara. A) Jeden dzień po infekcji aerozolowej pobranie pożądanej liczby Mtb zweryfikowano poprzez wysiew homogenatów całych płuc w celu oznaczenia CFU. B) Obciążenie bakteryjne w momencie koinfekcji określono w lizatach płuc 3 myszy za pomocą analizy CFU (Mtb d40/d0). 12 dni po koinfekcji lizaty płuc wysiano do analizy CFU, aby określić wpływ koinfekcji Plasmodium na kontrolę Mtb. Należy zauważyć, że liczba Mtb w płucach wzrosła podczas koinfekcji z P. berghei NK65. Opisy osi X: czas po infekcji Mtb/czas po koinfekcji. Adaptowano z¹ PLoS ONE, 7(10), e48110 za zgodą wydawcy.

Dyskusja

Opisaliśmy, w jaki sposób myszy mogą być produktywnie zarażone Mtb i P. berghei poprzez ich naturalne drogi infekcji. Stosujemy ustalone protokoły infekcji do badania eksperymentalnej gruźlicy¹³ lub malarii¹² , a ostatnio przyjęliśmy je do badania koinfekcji między Mtb i Plasmodium w modelu mysim¹.

Najbardziej krytycznymi etapami udanych infekcji jest przenoszenie obu patogenów w pożądanej liczbie. Stada prątków nie powinny być starsze niż 2 lata, ponieważ z czasem stracą żywotność, a pierwotnie określone miano stad najprawdopodobniej nie będzie już dokładne. W rezultacie dawki infekcji byłyby znacznie niższe niż oczekiwano. W związku z tym miana CFU w kulturach podstawowych należy oznaczać co kilka miesięcy. Równie ważna jest przede wszystkim standaryzacja uprawy i generowania zapasów MTB . Warunki hodowli, takie jak pożywka, suplementy, czas i objętość, powinny być ustandaryzowane, aby móc porównać dane z eksperymentów z użyciem różnych zapasów Mtb. Prątki mają tendencję do zbrylania się podczas hodowli, dlatego ważne jest, aby utrzymywać ustandaryzowane warunki hodowli, zbierać bakterie w tej samej fazie wzrostu i często zawieszać podczas porcjowania. W przeciwnym razie mogą wystąpić duże różnice w mianach CFU i wynikach infekcji.

Kolejnym krytycznym krokiem jest generowanie jednorodnie zakażonych partii komarów. Ponieważ różne komary będą żywić się każdą pojedynczą myszą, ważne jest, aby wszystkie komary użyte w jednym eksperymencie infekcyjnym pochodziły z tej samej partii i aby używano tylko tych partii, w których zakażonych jest ponad 90% komarów.

Obecny model można wykorzystać do analizy odpowiedzi immunologicznych i modulacji immunologicznych u współzakażonego gospodarza poprzez porównanie go z odpowiedziami immunologicznymi u pojedynczych zakażonych gospodarzy. Możemy zastosować różne dobrze ugruntowane metodologie, takie jak histologia, immunohistochemia, analiza cytometryczna populacji komórek odpornościowych lub PCR i ELISA do wykrywania cytokin i chemokiny w tkankach lub płynach ustrojowych będących przedmiotem zainteresowania. Należy zauważyć, że takie modele myszy mają pewne ograniczenia. Podczas gdy u większości osób zakażonych Mtb rozwija się utajona infekcja bez oznak objawów klinicznych, u myszy rozwija się choroba przewlekła z postępującą patologią płuc. Mimo to myszy C57BL / 6 są stosunkowo odporne na zakażenie Mtb i nie rozwijają klasycznych ziarniniaków, jak obserwowano u pacjentów z gruźlicą. W rezultacie, reakcje immunopatologiczne u myszy nie odzwierciedlają odpowiednio ani utajonej, ani aktywnej gruźlicy u ludzi. Pomimo rozbieżności między utajoną a przewlekłą chorobą u ludzi i myszy, myszy są szeroko wykorzystywane do identyfikacji i badania czynników gospodarza, które kontrolują infekcję Mtb i są cennymi i niezbędnymi narzędziami do badania odpowiedzi immunologicznych w chorobach zakaźnych. Co ważne, podatność na zakażenie Mtb różni się znacznie między powszechnie stosowanymi szczepami myszy wsobnych, a bardziej wrażliwe szczepy, takie jak DBA lub C3H, mogą być włączone do badań nad współinfekcjami i pojedynczymi infekcjami. Ponadto, oprócz opisanych w niniejszym dokumencie gatunków patogenów, można stosować wszelkie inne gatunki prątków będące przedmiotem zainteresowania (np. izolaty kliniczne). Podobnie, podczas gdy żaden pojedynczy model malarii nie powiela wszystkich aspektów choroby u ludzi, różne modele mysie bardzo przypominają różne aspekty naturalnie nabytego zakażenia malarią u ludzi. Na przykład P. berghei ANKA i P. yoelii YM/17XL są szeroko przebadanymi modelami ciężkiej malarii u ludzi (wywołanej przez P. falciparum), przy czym P. berghei ANKA jest uważana za doskonały model ludzkiej malarii mózgowej^14,15. P. berghei NK65 jest doskonałym modelem hiperparazytemii i ostrej niedokrwistości malarycznej, a ostatnio została opisana jako eksperymentalny model zespołu ostrej niewydolności oddechowej związanej z malarią (MA-ARDS¹⁶). Korzystając z opisanego modelu koinfekcji, udało nam się niedawno wykazać, że jednoczesne zakażenie P. berghei NK65 zaostrza przewlekłą gruźlicę¹.

Oprócz wykorzystywania różnych pasożytów malarii u gryzoni, kolejność i czas infekcji mogą być dostosowywane w zależności od podstawowego pytania badawczego. W terenie współistniejące zakażenia Plasmodium mogą być obecne w momencie zakażenia Mtb lub nabyte później. W obu scenariuszach odpowiedź immunologiczna na Mtb i Plasmodium może być różnie zaburzona. Dlatego myszy mogą być zarażone sporozoitami Plasmodium przed lub po zakażeniu Mtb . Co więcej, myszy mogą być prowokowane w różnych momentach po zakażeniu Mtb , aby ocenić wpływ odpowiedzi immunologicznej wywołanej przez Plasmodium na ostrą i przewlekłą gruźlicę. Co ważne, wybierając pasożyta malarii do badania koinfekcji malarii i gruźlicy, należy mieć świadomość, że niektóre szczepy gryzoni Plasmodium powodują ostrą chorobę u niektórych szczepów myszy i ulegają infekcji w ciągu zaledwie kilku dni lub tygodni, podczas gdy Mtb powoduje przewlekłe i długotrwałe infekcje u myszy immunokompetentnych. W związku z tym czas koinfekcji ma kluczowe znaczenie, aby uniknąć przedwczesnej śmierci zwierząt doświadczalnych.

Modulacja odporności gospodarza poprzez jednoczesne zakażenie wieloma gatunkami patogenów pozostaje słabo poznana. Nasz eksperymentalny model koinfekcji stanowi potężne narzędzie do badania interakcji Mycobacterium-Plasmodium z układem odpornościowym współzakażonego gospodarza i przyczyni się do zrozumienia, w jaki sposób koinfekcje mogą wpływać na patogenezę, wynik choroby, szczepienia, immunodiagnostykę i terapię.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Buraton	Schü		Składniki aktywne: aldehydy (formaldehyd, aldehyd glutarowy, aldehyd szczawiowy, heksanal etylu)
Middlebrook 7H9	Sigma	M0178	Do kultur bulionowych Mtb
Middlebrook 7H11	BD Biosciences	283810	Pożywka agarowa do hodowli Mtb
Pożywka wzbogacająca Middlebrook OADC	BD Biosciences	212240	Dodaj do 7H9 i 7H11 do hodowli Mtb
Staining Dish	Science Services	E62542-12
24-suwakowy uchwyt z uchwytem	Science Services	E62543-06
Giemsas Roztwór błękitu azur-eozyno-metylenowego	Merck Millipore
Wright´ s stain	Sigma	W0625
System ekspozycji inhalacyjnej	Glas-Col
Nebulizator-Venturi	Glas-Col
Kubki do lodów	Hä agen-Dazs		Używane jako klatki na komary
Klatki na komary z metalową ramą	Produkty BioQuip	1450A