Produkcja i oczyszczanie niereplikacyjnych wektorów pochodnych adenowirusa psów typu 2

Podsumowanie

W ciągu ostatnich 15 lat, wektory pochodzące od psiego adenowirusa typu 2 (CAV2) udowodniły swoją skuteczność w transdukcji komórek in vitro i in vivo i są szeroko stosowane w szczepieniach i terapii genowej. W tym miejscu opisujemy procedurę konstruowania, wytwarzania i oczyszczania wektorów CAV2, w wyniku której powstają zawiesiny wirusa o wysokim mianie.

Streszczenie

Wektory pochodzące z adenowirusa (Ad) były szeroko stosowane do krótko- lub długoterminowego transferu genów, zarówno do terapii genowej, jak i do zastosowań szczepionkowych. Ze względu na częstą wcześniejszą odporność przeciwko klasycznie stosowanemu ludzkiemu adenowirusowi typu 5, adenowirus psów typu 2 (CAV2) został zaproponowany jako alternatywny wektor transferu genów u ludzi. Dobrze scharakteryzowana biologia CAV2, wraz z łatwością manipulacji genetycznej, oferuje duże korzyści, zwłaszcza w zakresie transferu genów do ośrodkowego układu nerwowego lub indukowania szerokiego zakresu ochronnych odpowiedzi immunologicznych, od odporności humoralnej do komórkowej. Obecnie CAV2 stanowi jeden z najbardziej atrakcyjnych adenowirusów innych niż człowiek do stosowania jako wektor szczepionkowy. Protokół ten opisuje prostą metodę konstruowania, wytwarzania i mianowania rekombinowanych wektorów CAV2. Po sklonowaniu kasety ekspresyjnej genu będącego przedmiotem zainteresowania do plazmidu wahadłowego, rekombinowany plazmid genomowy otrzymuje się w drodze rekombinacji homologicznej w szczepie bakteryjnym E. coli BJ5183. Powstały plazmid genomowy jest następnie transfekowany do komórek nerki psów wykazujących ekspresję komplementarnych genów CAV2-E1 (DK-E1). Amplifikacja wirusa umożliwia wytworzenie dużego zapasu wirusa, który jest oczyszczany przez ultrawirowanie przez gradienty chlorku cezu i odsalany przez dializę. Powstała zawiesina wirusowa rutynowo ma miano ponad 10¹⁰ zakaźnych cząstek na ml i może być bezpośrednio podawana in vivo.

Wprowadzenie

W ciągu ostatnich dziesięcioleci, wektory pochodzące z adenowirusów (reklam) udowodniły swoją skuteczność w terapii genowej i szczepieniach, a także w wirusoterapii onkolitycznej ¹. Ads to bezotoczkowe wirusy dwudziestościenne z rodziny Adenoviridae, które zostały wyizolowane ze ssaków, ptaków,, i ryb. Od czasu ich odkrycia w 1953 roku, ADS były intensywnie badane jako modele do badania interakcji wirus/komórka, a ostatnio jako systemy dostarczania genów oparte na wektorach ². Rzeczywiście, wektory oparte na reklamach oferują wiele zalet, takich jak szeroki zakres gospodarzy i dobrze scharakteryzowana biologia, a także łatwość, z jaką można je genetycznie manipulować i amplifikować do produkcji na dużą skalę.

Aby przezwyciężyć kliniczne trudności związane z istniejącymi wcześniej odpornościami w populacjach ludzkich na wektory pochodzące od ludzkich Ads ³, my i inni zaczęliśmy wyprowadzać wektory z nieludzkich Ads ⁴. Ponadto wydaje się, że wektory adenowirusowe inne niż ludzkie są lepiej przystosowane do masowych szczepień w medycynie weterynaryjnej niż klasycznie stosowany adenowirus typu 5 (Ad5), ponieważ powinny być bardziej zgodne z wymogami bezpieczeństwa i ochrony podczas oceny ryzyka przez krajowe organy regulacyjne. Pod koniec lat dziewięćdziesiątych opisaliśmy pierwszy rekombinowany CAV2 jako nieludzką alternatywę dla wektorów pochodzących z Ad5 ⁵. Od tego czasu liczne badania potwierdziły potencjał wektorów CAV2 do terapeutycznego lub antygenowego transferu genów (dla recenzji ^6,7). Podobnie jak inne ADS, wektory pochodzące z CAV2 są stabilne i mogą być wytwarzane przy wysokich mianach, co ułatwia ich stosowanie in vivo. Są one również bezpieczne, ponieważ nie mają charakteru integracyjnego, chociaż umożliwiają długotrwałą ekspresję transgenu in vivo (>1 rok) ⁸. Co ciekawe, wykazano, że lepsze niż ludzkie serotypy ADS, wektory CAV2 są wysoce neurotropowe, z bardzo wydajnym transportem wstecznym w aksonach ^9,10. Ta wewnętrzna właściwość przyniosła pomysł wykorzystania rekombinowanych wektorów CAV2 do transdukcji neuronów określonych obszarów mózgu, które są trudno dostępne dla wektorów lentiwirusowych, do tej pory powszechnie stosowanych do transferu genów do ośrodkowego układu nerwowego ¹¹.

Tutaj opisujemy prosty i klasyczny protokół do konstruowania, produkcji i oczyszczania niereplikowalnych wektorów CAV2 pochodzących ze szczepu Manhattan. Rekombinowane genomy CAV2 są konstruowane przez klonowanie pożądanego genu zainteresowania (GOI) w kasecie poniżej wczesnego promotora wirusa cytomegalii (CMV), który zapewnia wszechobecną ekspresję. Wektory CAV2 mają zdolność klonowania na poziomie ~4,2 kbp, co pozwala na ekspresję dużego cDNA. W drugim etapie ta kaseta ekspresyjna jest wprowadzana przez rekombinację homologiczną w miejsce regionu E1 genomu CAV2, co prowadzi do niereplikacyjnego wirusa (dlE1), jak opisano początkowo przez Chartiera i wsp. ¹² Wreszcie, cząsteczki wirusa są wytwarzane po transfekcji plazmidu genomowego do linii komórek nerki psów z ekspresją CAV2-E1 (DK-E1) i są seryjnie amplifikowane przed zagęszczeniem i oczyszczeniem zapasów wirusa. Opisana tutaj metoda wykorzystuje dwuetapowe ultrawirowanie w gradientach chlorku cezu (CsCl), co umożliwia wzbogacenie cząstek zakaźnych o wysokie miano końcowe (zwykle ponad 10¹⁰ cząstek zakaźnych na ml). Zawiesina wirusa jest następnie odsalana za pomocą chromatografii przez jednorazowe kolumny Sephadex G-25, tak aby była ostatecznie wystarczająco czysta, aby można ją było bezpośrednio zastosować in vivo.

Protokół

1. Budowa niereplikacyjnego plazmidu genomu CAV2

Uwaga: wszystkie plazmidy opisane w tym protokole zostały opisane wcześniej⁷ i są dostępne na żądanie.

1. Sklonuj GOI do plazmidu pShuttle, używając odpowiednich enzymów restrykcyjnych, aby wygenerować pShuttle-GOI (Figura 1A).
2. Trawić 2 μg pShuttle-GOI przez AscI/PacI. Trawienie uwalnia fragment Shuttle-GOI (~2,9 kbp + sekwencja GOI ORF) ze szkieletu plazmidu (2,8 kbp).
3. Oczyść fragment Shuttle-GOI po elektroforezie w żelu agarozowym, używając żelu NucleoSpin i zestawu do czyszczenia PCR.
4. Równolegle trawić 1 μg plazmidu genomowego pCAV2 przez SwaI. Plazmid pCAV2 zawiera unikalne miejsce SwaI zlokalizowane w regionie E1 (Figura 1B). Inaktywuj termicznie ten enzym restrykcyjny w temperaturze 65 °C przez 20 minut.
5. Przekształć kompetentne bakterie E. coli BJ5183 za pomocą 500 ng oczyszczonego fragmentu Shuttle-GOI i 100 ng zlinearyzowanego plazmidu pCAV2 w celu rekombinacji homologicznej (Figure 1B). Rozprowadzić na płytkach LB-Amp. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez co najmniej 20 godzin.
6. Przeprowadzić analizę PCR bezpośrednio na koloniach bakteryjnych przy użyciu głównej mieszanki EmeraldAmp ze starterami do przodu (5'-CACGAGGCCCTCTCGTCTTCAA-3') i wstecznie (5'-GCGGTAGTTTATCAGTTAAATTGC-3') w następujących warunkach cyklicznych: 10 min w temperaturze 95 °C (dla jednego cyklu), 95 °C dla 1 min; 58 °C dla 1 min; 72 °C dla 1 min/kbp (dla 39 cykli), i wreszcie 5 min w temperaturze 72 °C. Produkt o wartości 1 kbp + sekwencja GOI ORF jest amplifikowany z klonów pCAV-GOI dodatnich, podczas gdy żaden produkt PCR nie może być wykryty z klonami ujemnymi.
7. Zaszczepić co najmniej dwie dodatnie kolonie przez noc, każda w 5 ml pożywki LB-amp w temperaturze 37 °C w wytrząsarce (220 obr./min).
8. Ekstrakcja plazmidowego DNA za pomocą zestawu plazmidów nukleospinowych. Przekształć kompetentne bakterie E. coli DH5α za pomocą podwielokrotności każdego preparatu DNA. Rozprowadzić zawiesinę bakteryjną na płytkach LB-Amp i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
9. Zaszczepić dwie kolonie każdego dodatniego klonu przez noc w 3 ml pożywki LB-amp w temperaturze 37 °C w wytrząsarce (220 obr./min). Ekstrakcja plazmidowego DNA za pomocą zestawu plazmidów nukleospinowych.
10. Strawić powstałe DNA i macierzysty plazmid pCAV2 (jako kontrolę) za pomocą NdeI. Wzorzec ograniczeń rodzicielskiego pCAV2 wynosi 14,8 kbp, 9 kbp, 7,9 kbp i 1,6 kbp. Kaseta z wyrażeniami rządu Indii jest umieszczana we fragmencie o rozmiarze 7,9 kbp i zawiera co najmniej jedno miejsce NdeI, tj. jedno miejsce w kasecie oraz potencjalne miejsca obecne w IWP.
11. Wybierz pozytywne konstrukcje i przejdź do kroku 2 z co najmniej 2 niezależnymi klonami.

2. Transfekcja rekombinowanego plazmidu genomu CAV2 do komórek DK-E1

Uwaga: Wektory niereplikacyjne pochodzące z CAV2 to organizmy modyfikowane genetycznie sklasyfikowane jako poziom bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2), podczas gdy ich stosowanie na modelach zwierzęcych jest klasyfikowane jako BSL-1. Należy stosować odpowiednie środki ograniczające rozprzestrzenianie się odpadów i utylizację odpadów, w tym środki ochrony osobistej, oraz pracować pod okapami z przepływem laminarnym BSL-2.

1. Dzień przed transfekcją wysiewaj komórki DK-E1 na płytce 6-dołkowej. Hoduj komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ w zmodyfikowanym pożywce Eagle (DMEM) firmy Dulbecco o wysokiej zawartości glukozy, zawierającej 7% inaktywowanej termicznie surowicy cielęcej płodu (FCS), 1 mM pirogronianu sodu i 100 U/ml penicyliny/100 μg/ml streptomycyny. Komórki powinny być w 70-80% zlewające się do transfekcji.
2. Trawić 2 μg plazmidu pCAV-GOI za pomocą AscI, aby uwolnić niewirusową sekwencję plazmidu. Sprawdź wynikowy wzór oporu za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym o stężeniu 0,8%. Trawienie powinno dać fragment o wielkości ~31 kpz zawierający rekombinowany genom i fragment o wielkości 2 kpz odpowiadający szkieletowi plazmidu.
3. Wymieszaj strawione DNA z 200 μl buforu Jet Prime, wirując przez 10 sekund. Dodać 4 μl Jet Prime i mieszać przez wirowanie przez 10 sekund. Krótko wirować, aby usunąć kropelki i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
4. Dodaj mieszankę transfekcyjną kroplami na komórki. Delikatnie wstrząsnąć płytkami, aby równomiernie rozprowadzić mieszankę i inkubować w temperaturze 37 °C.

3. Propagacja rekombinowanego CAV2

1. Tydzień po transfekcji zebrać komórki i pożywkę hodowlaną w probówce polipropylenowej o pojemności 15 ml. Rozbić komórki w trzech cyklach zamrażania i rozmrażania (-80 °C/37 °C) i oczyścić lizat przez wirowanie przez 10 minut przy 1 800 x g.
2. Zebrać supernatant i przechowywać w temperaturze -20 °C w celu późniejszego namnażania wirusa.
3. Zainfekuj 80-90% zlewającą się monowarstwę komórek DK-E1 wyhodowanych w jednym dołku na płytce 6-dołkowej 0,5 ml supernatantu zawierającego wirusa. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, przy łagodnym mieszaniu. Usunąć inokulum i zastąpić je 1,5 ml kompletnego DMEM zawierającego 5% inaktywowanego termicznie FCS.
4. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 3-4 dni. Komórki powinny być codziennie monitorowane pod kątem pojawienia się efektu cytopatycznego (CPE, ryc. 2A-B). Jeśli nie widać wyraźnego CPE, należy pobrać komórki po 4 dniach hodowli i powtórzyć kroki 3.1-3.4.
5. Gdy wyraźny CPE zaatakuje większość komórek, zwykle po 2-4 rundach amplifikacji wirusa, należy zebrać komórki za pomocą pożywki hodowlanej i zamrozić i rozmrozić 3x, jak opisano powyżej. Zainfekować 80-90% zlewających się komórek DK-E1 wyhodowanych w trzech szalkach do hodowli tkankowych o średnicy 10 cm, używając za każdym razem 0,5 ml supernatantu zawierającego wirusa.
6. Po 3-4 dniach (gdy CPE jest kompletny) należy pobrać komórki z tych 10-centymetrowych szalek, ponownie rozbić je w trzech cyklach zamrażania i rozmrażania, oczyścić lizat przez odwirowanie przez 10 minut przy 1,800 x g, zebrać supernatant i przechowywać w temperaturze -20 °C w celu amplifikacji CAV2 na dużą skalę.

4. Oczyszczanie CAV2 na dużą skalę

1. Zainfekuj 80-90% zlewających się monowarstw komórek DK-E1 wyhodowanych w czterdziestu szalkach do hodowli tkankowych o średnicy 10 cm. Do każdej potrawy należy użyć 0,1 ml supernatantu zawierającego wirusa, rozcieńczonego w 1 ml kompletnego DMEM bez FCS. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 3-4 godziny przy łagodnym mieszaniu. Dodać 5 ml kompletnego DMEM uzupełnionego 5% FCS.
2. Inkubować przez 3 dni. Zbierz zainfekowane komórki z czterdziestu 10-centymetrowych naczyń w probówkach polipropylenowych o pojemności 50 ml. Komórki osadu w temperaturze 1 200 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić w 15 ml pożywki DMEM.
3. Rozbij komórki w trzech cyklach zamrażania i rozmrażania (-80 °C/37 °C). Usunąć resztki komórek przez odwirowanie w temperaturze 1 800 x g przez 10 minut i przechowywać supernatant w temperaturze -20 °C przed oczyszczeniem z cząstek wirusa.
4. Przygotuj nieciągły gradient CsCl w 14 ml probówce Ultra-Clear. Najpierw wlać 2 ml roztworu CsCl (1,40 g/ml w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem) na dno probówki. Następnie powoli dodawać 2 ml roztworu CsCl (1,25 g/ml w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem) na wierzch pierwszego roztworu.
5. Ostrożnie załadować supernatant wirusa na wierzch gradientu CsCl. Napełnij rurkę olejem mineralnym do 2-3 mm od góry. Wirować przez 1,5 godziny przy 130 000 x g i temperaturze 18 °C w wahadłowym wirniku SW40.
6. Po odwirowaniu wyraźnie widoczne są dwa białe paski na granicy faz między 2 warstwami roztworu CsCl (rysunek 2C). Za pomocą igły 21 G i strzykawki pobrać boczne nakłucie dolnego pasma zawierającego dojrzałe cząstki CAV2. Staraj się w miarę możliwości unikać gromadzenia się górnego pasma, które odpowiada pustym cząsteczkom wirusa.
7. Przygotować ciągły gradient CsCl w przezroczystej probówce o pojemności 14 ml, mieszając zebrane cząstki wirusa z roztworem CsCl (1,34 g/ml w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami). Napełnij rurkę olejem mineralnym do 2-3 mm od góry. Wirować przez 18 godzin przy 130 000 x g i temperaturze 18 °C w obracającym się wirniku SW40.
8. Po odwirowaniu zebrać białą opaskę zawierającą CAV2 przez boczne nakłucie strzykawką, jak opisano powyżej. Ponownie staraj się unikać zbierania pozostałego górnego pasma. Powinno to być łatwiejsze w tym ciągłym gradiencie, który lepiej oddziela te dwa pasma. Całkowita objętość pobranej zawiesiny nie powinna przekraczać 2 ml.
9. Zrównoważyć kolumnę Sephadex G-25 PD-10 z 30 ml PBS.
10. Załadować zawiesinę wirusa i wyrzucić przepływ.
11. Eluować frakcjami 500 μl PBS. Zbierz frakcje 5-7, które zwykle zawierają odsolone cząstki CAV2. Frakcje zawierające wirusa można łatwo zidentyfikować, ponieważ są opalizujące. Dodać 150 μl glicerolu do 1,5 ml zawiesiny CAV2 i przechowywać w porcjach w temperaturze -80 °C.

5. Miareczkowanie CAV2 przez rozcieńczenie punktu końcowego

1. Rozmrozić podwielokrotność oczyszczonego wirusa na lodzie i wykonać 10-krotne seryjne rozcieńczenia (w zakresie od 10-2-10-12) w DMEM bez surowicy.
2. Dodać 50 μl każdego rozcieńczenia wirusa do 5 dołków na 96-dołkowej płytce. Dodaj 1,5 x 10⁴ komórki DK-E1 do każdej studzienki. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ przez 5 dni.
3. W 5 dniu po zakażeniu należy monitorować wygląd CPE za pomocą obserwacji mikroskopowej (ryc. 2A-B). Miana zakaźne określa się jako medianę dawek zakaźnych w hodowli tkankowej (TCID₅₀), przy użyciu metody statystycznej Reeda i Muencha¹³.

Wyniki

Produkcja rekombinowanych wektorów CAV2 opiera się na podstawowych, lecz istotnych technikach biologii molekularnej. Przed wytworzeniem wektorów wirusowych konieczne jest skonstruowanie rekombinowanego genomu CAV2 zawierającego kasetę ekspresyjną dla transgenu. Konstrukcja ta obejmuje dwa etapy: najpierw geny zainteresowania (GOI) są klonowane w plazmidzie transportowym jako kaseta ekspresyjna (t.j. z promotorem i sygnałem poliadenylacji). Ten element funkcjonalny jest flankowany przez dwie sekwencje genomowe po...

Dyskusja

Opisana tutaj prosta metoda, zaadaptowana z dobrze udokumentowanej technologii Ad5, pozwala na wydajną produkcję niereplikacyjnych wektorów CAV2 o typowej zdolności klonowania ~4,2 kbp. Jeśli chodzi o względy czasowe, rekombinowany genom CAV2 jest zwykle generowany w ciągu dwóch tygodni, podczas gdy amplifikacja, oczyszczenie i mianowanie zawiesin wirusa zajmie dodatkowe 5 tygodni.

Chociaż produkcja pierwszej partii wektorów pochodzących z CAV2 może wydawać się czasochłonna, należy przypomnieć...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Enzymy restrykcyjne	New England Biolabs	Różne
zestawy do transfekcji Jet Prime	Polyplus	114-01
DMEM	Gibco (Life Technologies)	10567014
E. coli Bakterie BJ5183	Agilent	200154
PD-10 Kolumna odsalająca	GE Healthcare	17-0851-01
EmeraldAmp polimeraza	Takara	RR320A Zestaw plazmidów
nukleospinowych	Macherey-Nagel	740558.250
NucleoSpin Żel i PCR Clean-up	Probówki Macherey-Nagel	740609.50
Ultra Clear	Beckman	344060