Artykuł metodologiczny

In vivo (in vivo) Przeprogramowanie dorosłych komórek somatycznych na pluripotencję przez nadekspresję czynników Yamanaka

15K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50837

⸱

17 grudnia 2013

 ,  ,  , 
1Nanomedicine Lab, UCL School of Pharmacy, University College London, 2Nanomedicine Lab, Faculty of Medical & Human Sciences, University of Manchester

W tym artykule

Podsumowanie

To badanie pokazuje przeprogramowanie komórek somatycznych w kierunku pluripotencji in vivo bez generowania potworniaków. Zastosowaliśmy hydrodynamiczne wstrzyknięcie do żyły ogonowej plazmidowego DNA kodującego czynniki Yamanka, aby indukować przeprogramowanie in vivo dorosłych hepatocytów na komórki o zwiększonej pluripotencji.

Streszczenie

Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPS), które powstają w wyniku przeprogramowania komórek somatycznych do stanu pluripotencjalnego poprzez wymuszoną ekspresję określonych czynników, oferują nowe możliwości dla medycyny regeneracyjnej. Takie kliniczne zastosowania komórek iPS były do tej pory ograniczone, głównie ze względu na słabą skuteczność istniejących metodologii przeprogramowania oraz ryzyko, że wygenerowane komórki iPS utworzą guzy po implantacji.

Postawiliśmy hipotezę, że przeprogramowanie komórek somatycznych w kierunku pluripotencji może być osiągnięte in vivo poprzez transfer genów czynników przeprogramowujących. Aby skutecznie przeprogramować komórki in vivo, w tkance docelowej muszą zostać wyrażone wysokie poziomy czynników transkrypcyjnych Yamanaka (OKSM). Można to osiągnąć poprzez zastosowanie różnych wirusowych lub niewirusowych wektorów genowych w zależności od tkanki docelowej. W tym konkretnym badaniu zastosowano hydrodynamiczne wstrzyknięcie plazmidowego DNA do żyły ogonowej (HTV) w celu dostarczenia czynników OKSM do hepatocytów myszy. Dostarczyło to dowodów na przeprogramowanie in vivo dorosłych komórek somatycznych w kierunku stanu pluripotencjalnego o wysokiej wydajności i szybkiej kinetyce. Ponadto nie zaobserwowano powstawania guza ani potworniaka in situ.

Można wywnioskować, że przeprogramowanie komórek somatycznych in vivo może stanowić potencjalne podejście do wywołania zwiększonej pluripotencji szybko, efektywnie i bezpiecznie w porównaniu z protokołami wykonywanymi in vitro i może być stosowane do różnych typów tkanek w przyszłości.

Wprowadzenie

Obawy etyczne dotyczące wykorzystania embrionalnych komórek macierzystych były jednym z ograniczeń w rozwoju badań nad komórkami macierzystymi. Jednak odkrycie Yamanaki i współpracowników, że wymuszona ekspresja czterech czynników transkrypcyjnych (a mianowicie: Oct3/4, Klf4, Sox2, c-Myc (OKSM)) może prowadzić do przeprogramowania in vitro komórek somatycznych w komórki pluripotencjalne, zwane indukowanymi pluripotencjalnymi komórkami macierzystymi (iPS), otworzyło nowe możliwości. Wirusowy transfer genów1-5 i niewirusowych6-10, translokacja cytoplazmatyczna białek11,12 i transfekcja miRNA13-16 to jedne z różnych metod stosowanych obecnie do generowania komórek iPS. Jednak takie metodologie przeprogramowania cierpią z powodu różnych problemów, które ograniczają ich zastosowanie w praktyce klinicznej, takich jak: a) poważne ograniczenia w wydajności przeprogramowania komórek; b) dominujące wykorzystanie wektorów wirusowych; c) długie i wieloetapowe protokoły warunków hodowli; oraz d) ryzyko rakotwórczości przez implantację komórek iPS wytworzonych in vitro 17-20.

Transfer genów zdefiniowanych czynników transkrypcyjnych3-5 przez retrowirusy jest najczęściej stosowaną metodą przeprogramowania komórek somatycznych. Wiąże się to jednak z ryzykiem związanym z możliwością mutagenezy insercyjnej, stabilnej transdukcji i długotrwałej ekspresji protoonkogenu21,22. Zbadano również niewirusowe wektory transferu genów, takie jak dostarczanie plazmidowego DNA6,7,23 lub RNA10 za pomocą liposomów lub elektroporacji. Chociaż wektory te są bezpieczniejsze w porównaniu z wirusami, oferują znacznie ograniczoną wydajność transdukcji i przeprogramowania24,25 .

Jednym z głównych dogmatów tej rozwijającej się dziedziny jest to, że implantacja in vivo komórek iPS doprowadzi do ich niekontrolowanego różnicowania i powstania masy podobnej do guza (potworniaka), składającej się z różnych tkanek z trzech różnych listków zarodkowych. W związku z tym koncepcja przeprogramowania do pluripotencji skupia się przede wszystkim na manipulacjach in vitro pierwotnie wyekstrahowanych komórek somatycznych (najczęściej fibroblastów). Jednak, jak opisano powyżej, zasada ta cierpi z powodu długich i złożonych protokołów hodowli komórkowych, w tym wielu rund leczenia (transfer genów, czynniki wzrostu, antybiotyki, przeciwutleniacze), które same w sobie mogą zwiększać ryzyko powstania potworniaka lub innych form nowotworzenia po implantacji komórek24-28.

Proponujemy, że przeprogramowanie dorosłych komórek somatycznych in vivo przez przejściową nadekspresję czynników transkrypcyjnych OKSM nie prowadzi do późniejszego powstawania potworniaków29. Metoda, która pozwoli to osiągnąć, będzie zależała od osiągnięcia wysokiego poziomu ekspresji czynnika transkrypcyjnego w tkance docelowej w możliwie najbezpieczniejszy sposób. W tym badaniu wybraliśmy uznaną technologię transferu genów wolną od wirusów, która, jak wykazano, skutecznie celuje w wątrobę w celu przeprogramowania komórek na pluripotencję in vivo. Technologia ta polega na szybkim wstrzyknięciu plazmidowego DNAdo plazmidowej żyły ogonowej (HTV) o dużej objętości. Wysoki poziom ekspresji transfekowanych genów można osiągnąć w dorosłych hepatocytach dzięki tej niewirusowej metodzie transferu genów. Co więcej, technologia ta minimalizuje potencjalne ryzyko związane ze stosowaniem wektorów wirusowych (np. trwała insercja genomowa, mutageneza insercyjna).

Protokół

1. Przeprogramowanie in vivo tkanki wątroby za pomocą HTV Podawanie pDNA

  1. Pozwól samicom myszy Balb/C w wieku 6 tygodni zaaklimatyzować się w obiekcie dla zwierząt przez tydzień przed wykonaniem jakiegokolwiek zabiegu.
  2. Przygotuj 0,9% soli fizjologicznej w wodzie destylowanej i przefiltruj przez mikrofiltr 0,22 μm.
  3. Przygotować roztwór zawierający 75 μg pCX-OKS-2A i 75 μg plazmidowego DNA pCX-cMyc w 1,5 ml 0,9% soli fizjologicznej na mysz. nuta: Całkowita objętość wstrzyknięcia musi wynosić od 8 do 10% całkowitej masy ciała.
    Uwaga: przed wstrzyknięciem należy przechowywać myszy w komorze grzewczej w temperaturze 37 °C do momentu, gdy żyły ogonowe będą łatwo widoczne i będą wyglądały na rozszerzone.
  4. Znieczulenie izofluranem należy wywołać przed (w komorze grzewczej) i w trakcie wstrzyknięcia (za pomocą maski znieczulającej).
  5. Podać roztwór pDNA lub sól fizjologiczną za pomocą strzykawki 27 G przez wstrzyknięcie HTV. Uwaga: aby transfekcja zakończyła się sukcesem, całkowita objętość powinna zostać wstrzyknięta w nie więcej niż 5-7 sekund.
  6. Należy monitorować, czy zwierzęta prawidłowo wracają do zdrowia po wstrzyknięciu.

2. Perfuzja wątroby i izolacja pierwotnych hepaktocytów do badań qRT-PCR

  1. W różnych punktach czasowych, w tym 2, 4, 8, 12 i 24 dni po wstrzyknięciu HTV, wywołaj głębokie znieczulenie izofluranem.
  2. Rozpyl 70% etanolu na brzuch zwierzęcia, wykonaj nacięcie przez skórę na brzusznej linii środkowej nożyczkami chirurgicznymi i wypreparuj warstwę mięśni brzucha, aby odsłonić wnętrzności.
  3. Przetnij przeponę, aby odsłonić jamę piersiową nożyczkami i zaciśnij żyłę jamy głównej za pomocą kleszczy blokujących.
  4. Przesuń wnętrzności w prawo i płaty wątroby tak, aby zarówno dolna jama, jak i żyła wrotna były łatwo dostępne.
  5. Kanulować dolną żyłę główną za pomocą cewnika 22 G i przeciąć żyłę wrotną, aby uniknąć nadmiernego ciśnienia.
  6. Perfuzję należy rozpocząć od 10 ml buforu HBSS (wolnego od Ca2+ i Mg2+, z wodorowęglanem), podgrzanego w temperaturze 37 °C. Roztwory należy powoli perfronizować za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml, aż do zbielenia wątroby (3 min).
  7. Kontynuować perfuzję za pomocą pożywki Liver Digest Medium, podgrzanej w temperaturze 37 °C, z szybkością przepływu 0,6 ml/min (przez 15 minut), aż wątroba stanie się opuchnięta i luźna. nuta: Nadmierne trawienie i perfuzja mogą uszkodzić hepatocyty lub przeprogramowane komórki.
  8. Kontynuować eksperyment w temperaturze 4 °C.
  9. Usuń wątrobę kleszczami po przecięciu więzadeł sierpowych i wieńcowych i umyj ją pożywką do przemywania Hepatocytów, przepuszczając ją przez sitko do komórek 100 μm w celu uzyskania zawiesiny komórek.
  10. Zebrać zawiesinę komórkową do probówek o pojemności 50 ml i zwiększyć objętość do 15 ml za pomocą Hepatocyte Wash Medium.
  11. Odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 50 g przez 4 minuty. Utrzymać temperaturę 4 °C. Odrzucić supernatant (który zawiera Kupffer i komórki nabłonkowe) i ponownie zawiesić osad komórkowy (zawierający hepatocyty) w 10 ml pożywki do przemywania hepatocytów. nuta: Osad komórkowy należy bardzo ostrożnie zawiesić, hepatocyty są bardzo delikatnymi komórkami.
  12. Powtórzyć procedurę wirowania w sumie trzy razy i ponownie zawiesić końcowe osady w 10 ml pożywki do przemywania hepatocytów.
  13. Oszacuj liczbę komórek za pomocą mikroskopu optycznego i hemocytometru.
  14. Przygotować podwielokrotności po 2 x 106 komórek, odwirować przy 300 x g w celu odzyskania wszystkich komórek i odrzucić supernatant.
  15. Na tym etapie osad komórkowy można zamrozić i przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu dalszego przetwarzania lub od razu wykorzystać do ekstrakcji RNA.

3. Badanie ekspresji genów izolowanych hepatocytów w celu zwiększenia ilości genów pluripotencjalnych

  1. Ekstrahuj RNA z 2 x 106 komórek za pomocą zestawu kolumny wirowej, postępując zgodnie z instrukcjami dostawcy.
  2. Użyj 1 μg wyekstrahowanego RNA, aby przeprowadzić dwuetapowy qRT-PCR zgodnie z instrukcjami dostawcy.
  3. Użyj hepatocytów zwierząt, którym wstrzyknięto sól fizjologiczną, jako kontrolę, aby skorygować względną ekspresję genów markerów przeprogramowania, pluripotencji i hepatocytów.

4. Analiza cytometrii przepływowej zwiększonej pluripotencji na poziomie białka

  1. W 1. i 4. dniu po wstrzyknięciu należy wykonać perfuzję wątroby i wyizolować pierwotne hepatocyty, jak wskazano powyżej.
  2. Dostosować gęstość komórek do 1 x 107 komórek/ml i przygotować 100 μl porcji.
  3. Utrwalić komórki za pomocą bufora utrwalającego BD Cytofix i przepuszczalnie za pomocą 1x buforu BD Perm/Wash.
  4. Inkubować komórki z anty-mysim OCT4-PerCP-Cy5.5 lub anty-mysim Nanog-PE przez 30 minut.
  5. Uwzględnij kontrole ujemne i izotypowe.
  6. Przeanalizuj wybarwione komórki za pomocą cytometru przepływowego CyAn ADP o wysokiej wydajności.

5. Barwienie immunologiczne skrawków wątroby dla markerów pluripotencji

  1. Cztery dni po wstrzyknięciu należy wykonać perfuzję wątroby, jak wskazano powyżej, ale tylko za pomocą buforu HBSS w celu usunięcia krwi z tkanki wątroby.
  2. Wytnij kawałek tkanki wątroby i zanurz go w 2-metylobutanie (wstępnie schłodzonym w ciekłym azocie), aby kontynuować kriosekcję.
  3. Zamrożone tkanki mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C lub bezpośrednio cięte na odcinki o grubości 14 μm za pomocą kriostatu.
  4. Wysuszyć skrawki tkanki na powietrzu przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie utrwalić metanolem, wstępnie schłodzonym w temperaturze -20 °C przez 10 minut. Wysuszyć na powietrzu przez 15 minut, a następnie dwukrotnie umyć skrawki PBS (po 5 minut każdy).
  5. Inkubować skrawki w buforze blokującym (5% surowicy koziej - 0,1% Tryton w PBS pH 7,3) w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, a następnie dwa etapy przemywania z buforem płuczącym (1% BSA-0,1% Triton w PBS, pH 7,3).
  6. Skrawki tkanki inkubować przez noc w temperaturze 4 °C z pierwszorzędowymi przeciwciałami anty-OCT4, anty-SOX2 i anty-Nanog.
  7. Następnego dnia przemyć sekcje 3x (po 5 min każda) buforem płuczącym i inkubować je przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej z przeciwciałem drugorzędowym.
  8. Umyj skrawki wątroby PBS (3x, 5 min każda) i zamontuj je w pożywce DAPI i zapobiegającej blaknięciu.
  9. Wizualizuj szkiełka pod mikroskopem epifluorescencyjnym.

6. Barwienie skrawków tkanki wątroby fosfatazą alkaliczną (ALP)

  1. Uzyskać skrawki tkanki wątroby, jak opisano wcześniej.
  2. Ogrzej skrawki tkanki w temperaturze pokojowej przez 15 minut przed wykonaniem barwienia.
  3. Utrwalaj 4% paraformaldehydem przez 2 minuty. Uwaga: zbyt długi czas utrwalania może zmniejszyć aktywność ALP.
  4. Suszyć skrawki na powietrzu przez 30 minut, a następnie inkubować z płynnym substratem BCIP/NBT w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
  5. Umyj szkiełka wodą destylowaną i zamontuj za pomocą wodnego środka montażowego.
  6. Uchwyć losowe obrazy za pomocą mikroskopii świetlnej.

7. Kwantyfikacja poziomów albumin i enzymów wątrobowych w surowicy w celu oceny toksyczności wątroby

  1. W 4, 8, 12 i 120 dniu po transfekcji należy pobrać 300 μl krwi bezpośrednio z komory serca.
  2. Utrzymuj krew na lodzie podczas pobierania różnych próbek, aby uniknąć krzepnięcia.
  3. Gdy wszystkie próbki są gotowe, inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C, aż do zakrzepnięcia krwi.
  4. Odwirować próbki o masie 2 000 x g przez 5 minut.
  5. Ostrożnie odpipetować surowicę (znajdującą się w supernatencie) do nowej probówki Eppendorfa i zamrozić w temperaturze -80 °C do czasu przetworzenia próbek.
  6. Analizuj poziomy albuminy, ALT, AST, ALP i GLDH w surowicy.

8. Barwienie skrawków wątroby hematoksyliną i eozyną (H&E) oraz kwasem okresowym Schiffa (PAS) w celu oceny toksyczności wątroby

  1. W różnych punktach czasowych, w tym 2, 4, 8, 12, 24, 50 i 120 dni po wstrzyknięciu HTV; wykonać perfuzję wątroby z buforem HBSS tylko tak, jak opisano wcześniej.
  2. Wytnij kawałek tkanki wątroby i utrwal w 4% paraformaldehydzie.
  3. Osadź tkankę wątroby w blokach parafinowych, przekrój i wybarwij za pomocą barwienia H&E lub PAS.
  4. Uchwyć losowe obrazy za pomocą mikroskopii świetlnej.

Wyniki

Rycina 1 przedstawia schemat procedury obejmującej transfer genów plazmidów kodujących OKSM do wątroby myszy oraz różne techniki zastosowane w celu obserwacji przeprogramowania komórek in vivo. Po wstrzyknięciu plazmidów metodą HTV, w 2. dniu po iniekcji zaobserwowano znaczny wzrost ekspresji genów przetransferowanych czynników przeprogramowania (Oct3/4, Sox2, Klf4 i cMyc) na poziomie mRNA. Ekspresja tych czynników z czasem po iniekcji maleje, co pokazano na Rycini 2a. W odniesieniu do ekspresji endogennych markerów pluripotencji (Nanog, Ecat1 i Rex1), ich poziomy były znacząco podwyższone w porównaniu z hepatocytami zwierząt, którym wstrzyknięto sól fizjologiczną, w 2. i 4. dniu po iniekcji, a od 8. dnia wróciły do poziomów bazowych (Rycina 2b). Jednocześnie dedyferencjację populacji hepatocytów potwierdzono poprzez obniżenie ekspresji genów specyficznych dla hepatocytów (Alb, Aat i Trf), co było statystycznie istotne w 4. dniu i osiągnęło poziomy bazowe od 8. dnia (Rycina 2d).

Ekspresję Oct3/4 i Nanog na poziomie białka zbadano za pomocą cytometrii przepływowej. Jak pokazano na Rysunku 2c, w 1. dniu po wstrzyknięciu HTV ekspresyjny jest tylko Oct3/4, natomiast w przypadku ekspresji endogennego markera pluripotencji Nanog konieczne było odczekanie do 4. dnia.

Występowanie przeprogramowania komórkowego in vivo zostało dodatkowo potwierdzone za pomocą analizy immunohistochemicznej tkanek wątroby z użyciem przeciwciał anty-OCT4, anty-SOX2 i anty-Nanog oraz poprzez specyficzne barwienie na aktywność ALP. Komórki wykazujące pozytywny wynik dla wszystkich markerów i aktywności enzymatycznej są powtarzalnie znajdowane w tkankach wątroby zwierząt, którym wstrzyknięto OKSM, natomiast nie stwierdzono ich w kontrolnych grupach, którym wstrzyknięto sól fizjologiczną (Rycina 3).

Potencjalne toksyczne skutki uboczne oraz powstawanie potworniaków w wyniku przeprogramowania komórek in vivo poprzez wstrzyknięcie pDNA za pomocą HTV badano poprzez ilościowe oznaczenie poziomów enzymów wątrobowych w surowicy, a także barwienie preparatów tkanek wątroby metodą H&E i PAS w okresie 120 dni. Do 2. dnia obserwowano przejściowe i niewielkie oznaki uszkodzenia tkanek, które nie utrzymywały się dłużej. W okresie badania nie zaobserwowano powstawania potworniaków ani żadnych oznak dysplazji lub zmian morfologicznych (Rycina 4). U żadnego z zwierząt w trakcie badania nie stwierdzono strukturalnych ani funkcjonalnych nieprawidłowości wątroby, co potwierdzono poziomami albumin i enzymów wątrobowych oraz barwieniem glikogenu w preparatach tkankowych (Ryciny 4b i c).

Iniekcja czynników reprogramujących in vivo, schemat myszy, plazmid, analiza tkanek, PCR, cytometry.
Rycina 1. Schematyczny przegląd procedury reprogramowania in vivo oraz jej analizy. Protokół składa się z dwóch głównych etapów: (i) podania czynników reprogramujących in vivo oraz (ii) pobrania tkanek i analizy próbek. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę.

Analiza ekspresji genów; wykresy słupkowe z danymi dotyczącymi ekspresji względnej w czasie; rysunki a-d; wyniki naukowe.
Rycina 2. Nadekspresja in vivo czynników transkrypcyjnych Yamanaki w wątrobie dorosłych myszy. Myszy Balb/C otrzymały wstrzyknięcie HTV samej 0,9% soli fizjologicznej lub 75 μg pCX-OKS-2A i 75 μg pCX-cMyc w 0,9% soli fizjologicznej; w dniach 2, 4, 8, 12 i 24 przeprowadzono analizę RT-qPCR hepatocytów w celu określenia względnej ekspresji genów: (a) transfekowanych czynników transkrypcyjnych (OKSM) oraz (b) endogennych markerów pluripotencji; (c) analiza cytometrii przepływowej komórek pozytywnych pod kątem OCT3/4 i Nanog; (d) względna ekspresja genów markerów hepatocytów określona za pomocą RT-qPCR. Wszystkie poziomy ekspresji genów znormalizowano względem grupy z wstrzyknięciem HTV z solą fizjologiczną. (* p<0.05 oznacza statystycznie istotną różnicę w porównaniu z grupami z wstrzyknięciem HTV z solą fizjologiczną, uzyskaną za pomocą analizy wariancji i testu porównań wielokrotnych Tukeya). Rycina zaadaptowana z Yilmazer et al.29 Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę.

Porównanie mikroskopii immunofluorescencyjnej dla OCT4, SOX2, NANOG w komórkach traktowanych solą fizjologiczną a traktowanych OKSM.
Rysunek 3. Reprogramowanie komórek in vivo w tkance wątroby dorosłych myszy za pomocą immunohistochemii. Myszy Balb/C poddane wtryskiwaniu HTV z samą 0,9% solą fizjologiczną, 75 μg pCX-OKS-2A i 75 μg pCX-cMyc w 0,9% soli fizjologicznej. W 4. dniu pobrano wątroby, a zamrożone przekroje tkanki zabarwiono przeciwciałami anty-OCT4, anty-SOX2 lub anty-Nanog w celu oceny immunoreaktywności, lub BCIP/NBT w celu oznaczenia aktywności ALP w tkance (40X). Paski skali reprezentują 100 μm. Rysunek zaadaptowany z Yilmazer et al.29 Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.

Histologia wątroby, poziomy enzymów i albuminy w leczeniu solą fizjologiczną vs. OKSM, wyniki eksperymentu.
Rysunek 4. Wpływ przeprogramowania komórek in vivo na funkcjonalność i histopatologię wątroby. Myszy Balb/C z HTV, którym wstrzyknięto albo 75 μg pCX-OKS-2A i 75 μg pCX-cMyc w 0,9% soli fizjologicznej, albo tylko 0,9% soli fizjologicznej. W dniach 2, 4, 8, 12, 50 i 120 izolowano tkanki wątroby oraz surowice i poddano je analizie w celu oceny: (a) barwienia H&E; (b) poziomów enzymów wątrobowych; (c) poziomów albuminy; (d) barwienia PAS. Reprezentatywne obrazy wykonano za pomocą mikroskopii świetlnej (10X). Paski skali reprezentują 100 μm. Rysunek zaadaptowano z Yilmazer et al.29 Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy rysunek.

Dyskusja

Badanie to dostarcza dowodów na przeprogramowanie komórek in vivo w kierunku pluripotencji po skutecznym transferze i nadekspresji czynników OKSM do wątroby dorosłej myszy. Za pomocą różnych technik, takich jak qRT-PCR, cytometria przepływowa, IHC lub analiza surowicy, zbadano tkankę docelową, aby zaobserwować przeprogramowanie komórek in vivo . Bardzo szybko od indukcji nadekspresji czynnika OKSM w tkance, markery pluripotencji uległy zwiększeniu na poziomie mRNA i białka (w ciągu 48 godzin). W trakcie tych eksperymentów wykazano, że od 5 do 15% komórek wyekstrahowanych z tkanki jest dodatnich pod względem Nanog i Oct3/4. Ponadto przez 120 dni nie zaobserwowano żadnych nieprawidłowości strukturalnych ani funkcjonalnych w wątrobie. Ekspresja transgenów przez wstrzyknięcie plazmidowego DNA HTV do tkanek innych niż wątroba (płuca, śledziona, nerki i serce) została wcześniej opisana, jednak poziomy ekspresji genów były co najmniej 3 rzędy wielkości niższe niż w hepatocytach30. Dane zawarte w tym badaniu wskazują, że przeprogramowanie komórek somatycznych do stanu pluripotencjalnego in vivo jest bezpieczne, szybkie i skuteczne. Biorąc pod uwagę większość istniejących metodologii przeprogramowania komórek in vitro , które na ogół osiągają wytwarzanie komórek pluripotencjalnych (iPS) w ciągu 3 tygodni przy skuteczności mniejszej niż 1% 32, przeprogramowanie in vivo do pluripotencji może stanowić bardzo interesującą alternatywę. Stawiamy hipotezę, że koncepcja przeprogramowania in vivo do pluripotencji może być zastosowana do różnych typów komórek somatycznych z wysoką wydajnością (w zależności od użytego wektora), jednak poziom funkcjonalnej pluripotencji osiągnięty w komórkach przeprogramowanych in vivo będzie musiał zostać określony. Co więcej, wraz z rozwojem ulepszonych protokołów i technologii, przeprogramowane komórki in vivo mogą być potencjalnie ekstrahowane i wykorzystywane do celów medycyny regeneracyjnej.

Istnieje kilka krytycznych kroków, które należy wykonać, aby przeprogramować dorosłe komórki somatyczne in vivo z wysoką wydajnością. Warunkiem wstępnym jest osiągnięcie wysokiego poziomu ekspresji genów w tkance docelowej. W tym badaniu zostało to zilustrowane poprzez wykorzystanie efektywnego transferu i ekspresji plazmidowego DNA do hepatocytów za pomocą wstrzyknięcia HTV. Najważniejszymi czynnikami przy iniekcji HTV są objętość, która powinna wynosić od 8 do 10% całkowitej masy ciała zwierzęcia oraz szybkość wstrzyknięcia, które musi być wykonane w ciągu 5-7 sekund. Nie należy stosować myszy w wieku poniżej 6 tygodni, ponieważ wstrzyknięcie HTV może spowodować większe uszkodzenie tkanek w wątrobie, co może wpłynąć na skuteczność przeprogramowania komórkowego. Podłoże genetyczne zwierząt nie miało wpływu na określenie skuteczności przeprogramowania in vivo , ponieważ wcześniej informowaliśmy o podobnych poziomach przeprogramowania zarówno u myszy Balb/C, jak i TNG-A, przy czym ta ostatnia jest szczepem transgenicznym, który przenosi reporter eGFP wstawiony do locus Nanog i jest hodowany na tle Sv12929.

Spekulujemy, że przeprogramowanie komórek in vivo do stanu pluripotencjalnego (który będzie musiał zostać określony) może być zastosowane do innych typów tkanek, pod warunkiem, że czynniki OKSM są skutecznie dostarczane do komórek docelowych, umożliwiając wysoki poziom ekspresji genów. W badaniach przedklinicznych i klinicznych badano różne niewirusowe i wirusowe wektory dostarczania genów w celu ukierunkowania na różne typy komórek i tkanek33. Na przykład, w przypadku tkanek nerwowych lub oczu, wirusy związane z adenowirusami były preferowanym wyborem wektorów do skutecznego transferu genów in vivo 34-37, podczas gdy w tkance mięśniowej wykazano, że wstrzyknięcia nagiego plazmidowego DNA powodują stosunkowo wysoki poziom ekspresji genów38,39. Dlatego metoda wektora transferu genów powinna być starannie dobrana w zależności od typu tkanki, aby osiągnąć skuteczne i szybkie przeprogramowanie komórek in vivo w kierunku stanu pluripotencjalnego.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca była częściowo wspierana przez Radę ds. Badań Nauk Inżynieryjnych i Fizycznych (EPSRC, Swindon, Wielka Brytania) oraz Komisję Europejską FP-7 Programy NANONEUROHOP (PIEF-GA-2010-276051) i ANTICARB (HEALTH-2008-20157). AY otrzymało stypendium doktoranckie w pełnym wymiarze godzin z Ministerstwa Edukacji (Turcja), a IL dziękuje za częściowe wsparcie ze strony British Council i Fundacji CAIXA (Hiszpania). Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
pCX-OKS-2A pDNAAddgene19771Otrzymywany z Addgene jako ukłucie bakteryjne, produkcja plazmidu przeprowadzona w Fabryce Plazmidów (Niemcy)
pCX-cMycAddgene19772Otrzymywana z Addgene jako dźgnięcie bakteryjne, produkcja plazmidu przeprowadzona w Fabryce Plazmidów (Niemcy)
0,22 i mu; m filtrMillioporeSLGP033RS
IsofluraneAbbottB505
HBSS bufferSigma-AldrichH6648Ca2+ i Mg2+ z wodorowęglanem
Liver Digest MediumGibco17703-034
Hepatocyte Wash MediumGibco17704-024
100 & mu; m Sitko komórkoweBD Biosciences352360
Zestaw nukleospinowego RNA IIMacherey-Nagel740955.25Zestaw do izolacji RNA z komórek i tkanek
Zestaw do syntezy cDNA iScriptBio-Rad170-8890
iO SYBR Green SupermixBio-Rad170-8880
Oct3/4 forward primersekwencja Sigmapodana w komentarzachTGAGAACCTTCAGGAGATATGCAA
Oct3/4 odwrotna sekwencjastartera Sigmapodana w komentarzachCTCAATGCTAGTTCGCTCTCTCTTC
Sox2 sekwencja Sigma startera do przodupodana w komentarzachGGTTACCTCTCCTCTCCCCCACTCCAG
Sox2 odwrotna sekwencjastartera Sigmapodana w komentarzachTCACATGTGCGACAGGGGCAG
C-myc forward primerSigmasekwencja podana w komentarzachCAGAGGAGGAACGAGCTGAAGCGC
C-myc odwrotny startersekwencja Sigmapodana w komentarzachTTATGCACCAGAGTTTCGAAGCTGTTCG
Nanog forward starterSigma sekwencja podana w komentarzachCAGAAAAACCAACCAGTGGTTGAAGACTAG
Nanog odwrotny starterSekwencja Sigmapodana w komentarzachGCAATGGATGCTGGGATACTC
Ecat1 forward primerSigma sequence podane w komentarzachTGTGGGGCCCTGAAAGGCGAGCTGAGAT
Ecat1 odwrotny startersekwencja Sigmapodawana w komentarzachATGGGCCGCCATACGACGACGCTCAACT
Rex1 starter naprzódSigmapodana w komentarzachACGAGTGGCAGTTTCTTCTTGGGA
Rex1 odwrócony starterSigmasekwencja podana w komentarzachTATGACTCACTTCCAGGGGGCACT
Alb forward primerSigmasekwencja podana w komentarzachGTTCGCTACACCCAGAAAGC
Alb odwrócony starterSigmasekwencja podana w komentarzachCCACACAAGGCAGTCTCTGA
Aat forward primerSigmasekwencja podana w komentarzachCAGAGGAGGCCAAGAAAGTG
Aat odwrotna sekwencjastartera Sigmapodana w komentarzachATGGACAGTCTGGGGAAGTG
Trf forward primerSigmasekwencja podana w komentarzachACCATGTTGTGGTCTCACGA
Trf odwrócony starterSekwencja Sigmapodana w komentarzachACAGAAGGTCCTTGGTGGTG
B aktyna do przodu starterSigmasekwencja podana w komentarzachGACCTCTATGCCAACACAGGT
B aktyna odwrócony starterSekwencja Sigmapodana w komentarzachAGTACTTGCGCTCAGGAGGA
BD Bufor utrwalający CytofixBD Biosciences
1x BD Perm/Wash bufferBD Biosciences560585
anty-mysie OCT4-PerCP-Cy5.5BD Biosciences560585
anty-mysie Nanog-PEBD Biosciences560585
2-metylobutanSigma-AldrichM32631
X100-TritonSigma-AldrichX100-500ML
Surowica koziaSigma-AldrichG9023
BSASigmaA2153
królik pAb anty-OCT4Abcamab19857Stosować w stężeniu 3 μ g/ml
króliczek pAb anty-SOX2Abcamab97959Stosować w stężeniu 1 μ g/ml
królik pAb anty-NanogAbcamab80892Stosować w stężeniu 1 μ g/ml
mysi mAb anty-SSEA1Abcamab16285Stosować w stężeniu 20 μ g / ml
koziego pAb anty-króliczego IgG znakowane Cy3Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.111-165-003-JIRStosować w stężeniu 1/250
koziego pAb anty-mysiego IgG znakowanego Cy3Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.115-165-003-JIRStosować w stężeniu 1/250
Podłoże montażowe VECTASHIELD z systemem DAPIVector LaboratoriesH-1200
BCIP/NBT System płynnych substratówSigmaB1911
Wodne podłoże montażoweSigma
16% ParaformaldehydFisherAA433689MRoztwór podstawowy wynosi 16%, należy go stosować w stężeniu 4%
Hematoksylina i eosinSigmaGH53/HT110216
PAS barwienieSigma395B
Sekwencja 560585

Bibliografia

  1. Blelloch, R., Venere, M., Yen, J., Ramalho-Santos, M. Generation Of Induced Pluripotent Stem Cells In The Absence Of Drug Selection. Cell Stem Cell. 1, 245-247 (2007).
  2. Stadtfeld, M., Nagaya, M., Utikal, J., Weir, G., Hochedlinger, K. Induced Pluripotent Stem Cells Generated Without Viral Integration. Science. 322, 945-949 (2008).
  3. Takahashi, K., et al. Induction Of Pluripotent Stem Cells From Adult Human Fibroblasts By Defined Factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  4. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction Of Pluripotent Stem Cells From Mouse Embryonic And Adult Fibroblast Cultures By Defined Factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
  5. Yu, J., et al. Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derived From Human Somatic Cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
  6. Gonzalez, F., et al. Generation Of Mouse-Induced Pluripotent Stem Cells By Transient Expression Of A Single Nonviral Polycistronic Vector. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 8918-8922 (2009).
  7. Okita, K., Nakagawa, M., Hyenjong, H., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation Of Mouse Induced Pluripotent Stem Cells Without Viral Vectors. Science. 322, 949-953 (2008).
  8. Woltjen, K., et al. Piggybac Transposition Reprograms Fibroblasts To Induced Pluripotent Stem Cells. Nature. 458, 766-770 (2009).
  9. Yusa, K., Rad, R., Takeda, J., Bradley, A. Generation Of Transgene-Free Induced Pluripotent Mouse Stem Cells By The Piggybac Transposon. Nat. Meth. 6, 363-369 (2009).
  10. Warren, L., et al. Highly Efficient Reprogramming To Pluripotency And Directed Differentiation Of Human Cells With Synthetic Modified Mrna. Cell Stem Cell. 7, 618-630 (2010).
  11. Kim, D., et al. Generation Of Human Induced Pluripotent Stem Cells By Direct Delivery Of Reprogramming Proteins. Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).
  12. Zhou, H., et al. Generation Of Induced Pluripotent Stem Cells Using Recombinant Proteins. Cell Stem Cell. 4, 381-384 (2009).
  13. Anokye-Danso, F., et al. Highly Efficient Mirna-Mediated Reprogramming Of Mouse And Human Somatic Cells To Pluripotency. Cell Stem Cell. 8, 376-388 (2011).
  14. Lin, S. -L., et al. Regulation Of Somatic Cell Reprogramming Through Inducible Mir-302 Expression. Nucleic Acids Res. , (2011).
  15. Miyoshi, N., et al. Reprogramming Of Mouse And Human Cells To Pluripotency Using Mature Micrornas. Cell Stem Cell. 8, 633-638 (2011).
  16. Subramanyam, D., et al. Multiple Targets Of Mir-302 And Mir-372 Promote Reprogramming Of Human Fibroblasts To Induced Pluripotent Stem Cells. Nat. Biotechnol. 29, 443-448 (2011).
  17. Dolgin, E. Flaw In Induced-Stem-Cell Model. Nature. 470, 13 (2011).
  18. Miura, K., et al. Variation In The Safety Of Induced Pluripotent Stem Cell Lines. Nat. Biotech. 27, 743-745 (2009).
  19. Pera, M. The Dark Side Of Pluripotency. Nature. 471, 46-47 (2011).
  20. Saha, K., Jaenisch, R. Technical Challenges In Using Human Induced Pluripotent Stem Cells To Model Disease. Cell Stem Cell. 5, 584-595 (2009).
  21. Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation Of Germline-Competent Induced Pluripotent Stem Cells. Nature. 448, 313-317 (2007).
  22. Varas, F., et al. Fibroblast-Derived Induced Pluripotent Stem Cells Show No Common Retroviral Vector Insertions. Stem Cells. 27, 300-306 (2009).
  23. Jia, F., et al. A Nonviral Minicircle Vector For Deriving Human Ips Cells. Nat. Meth. 7, 197-199 (2010).
  24. Gonzalez, F., Boue, S., Belmonte, J. C. I. Methods For Making Induced Pluripotent Stem Cells: Reprogramming A La. Nat. Rev. Genet. 12, 231-242 (2011).
  25. Stadtfeld, M., Hochedlinger, K. Induced Pluripotency: History, Mechanisms, And Applications. Genes Dev. 24, 2239-2263 (2011).
  26. Gore, A., et al. Somatic Coding Mutations In Human Induced Pluripotent Stem Cells. Nature. 471, 63-67 (2011).
  27. Hussein, S. M., et al. Copy Number Variation And Selection During Reprogramming To Pluripotency. Nature. 471, 58-62 (2011).
  28. Lister, R., et al. Hotspots Of Aberrant Epigenomic Reprogramming In Human Induced Pluripotent Stem Cells. Nature. 471, 68-73 (2011).
  29. Yilmazer, A., De Lázaro, I., Bussy, C., Kostarelos, K. In Vivo Cell Reprogramming Towards Pluripotency By Virus-Free Overexpression Of Defined Factors. Plos One. 8, (2013).
  30. Liu, F., Song, Y. K., Liu, D. Hydrodynamics-Based Transfection In Animals By Systemic Administration Of Plasmid Dna. Gene Ther. 6, 1258-1266 (1999).
  31. Zhang, G., Budker, V., Wolff, J. A. High Levels Of Foreign Gene Expression In Hepatocytes After Tail Vein Injections Of Naked Plasmid Dna. Hum. Gene. Ther. 10, 1735-1737 (1999).
  32. Yamanaka, S. Induced Pluripotent Stem Cells: Past, Present, And Future. Cell Stem Cell. 10, 678-684 (2012).
  33. Therapy Giacca, M. G. ene , Springer. (2010).
  34. Colella, P., Auricchio, A. Aav-Mediated Gene Supply For Treatment Of Degenerative And Neovascular Retinal Diseases. Curr. Gene Ther. 10, 371-380 (2010).
  35. Dayton, R. D., Wang, D. B., Klein, R. L. The Advent Of Aav9 Expands Applications For Brain And Spinal Cord Gene Delivery. Expert Opin. Biol. Ther. 12, 757-766 (2012).
  36. Mccown, T. J. Adeno-Associated Virus (Aav) Vectors In The Cns. Curr. Gene Ther. 11, 181-188 (2011).
  37. Vandenberghe, L. H., Auricchio, A. Novel Adeno-Associated Viral Vectors For Retinal Gene Therapy. Gene Ther. 19, 162-168 (2012).
  38. Herweijer, H., Wolff, J. A. Progress And Prospects: Naked Dna Gene Transfer And Therapy. Gene Ther. 10, 453-458 (2003).
  39. Wolff, J. A., Budker, V. The Mechanism Of Naked Dna Uptake And Expression. Adv. Genet. 54, 3-20 (2005).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Indukcja pluripotencjihydrodynamiczne wstrzykiwanie do ogona żyłyizolacja pierwotnych hepatocytówanaliza cytometrycznaekspresja genów metodą qRT-PCRbarwienie immunohistochemicznesekcjonowanie tkanki wątrobyocena tworzenia potworniaków
In vivo (in vivo) Przeprogramowanie dorosłych komórek somatycznych na pluripotencję przez nadekspresję czynników Yamanaka
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.