Analiza dynamiki białek za pomocą spektrometrii mas wymiany wodorowej

Podsumowanie

Konformacja i dynamika białek są kluczem do zrozumienia związku między strukturą a funkcją białka. Wymiana wodorowa w połączeniu ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości jest wszechstronną metodą badania dynamiki konformacyjnej białek, a także charakteryzowania interakcji białko-ligand i białko-białko, w tym interfejsów kontaktowych i efektów allosterycznych.

Streszczenie

Wszystkie procesy komórkowe zależą od funkcjonalności białek. Chociaż funkcjonalność danego białka jest bezpośrednią konsekwencją jego unikalnej sekwencji aminokwasów, jest ona realizowana tylko poprzez fałdowanie łańcucha polipeptydowego w pojedynczy zdefiniowany trójwymiarowy układ lub, częściej, w zespół konformacji przekształcających się. Badanie związku między konformacją białka a jego funkcją jest zatem niezbędne do pełnego zrozumienia, w jaki sposób białka są w stanie spełniać swoją różnorodną misję. Jedną z możliwości badania zmian konformacyjnych, jakie zachodzą w białku podczas przechodzenia przez swój cykl funkcjonalny, jest wymiana wodoru-1 H/²H w połączeniu ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości (HX-MS). HX-MS to wszechstronna i solidna metoda, która nadaje nowy wymiar informacjom strukturalnym uzyskanym np. za pomocą krystalografii. Służy do badania fałdowania i rozwijania białek, wiązania ligandów drobnocząsteczkowych, interakcji białko-białko, zmian konformacyjnych związanych z katalizą enzymatyczną i allosterii. Ponadto HX-MS jest często stosowany, gdy ilość białka jest bardzo ograniczona lub krystalizacja białka nie jest możliwa. W tym miejscu przedstawiamy ogólny protokół badania dynamiki białek za pomocą HX-MS i opisujemy jako przykład, jak ujawnić interfejs interakcji dwóch białek w kompleksie.   

Wprowadzenie

Liczba struktur krystalicznych białek i kompleksów białkowych gwałtownie wzrosła w ostatnich latach. Przedstawiają one bezcenne migawki organizacji strukturalnej tych białek i stanowią podstawę do analizy struktura-funkcja. Jednak dynamika białek i zmiany konformacyjne, które są niezbędne dla ich funkcji, rzadko są ujawniane przez krystalografię rentgenowską. Z drugiej strony mikroskopia krioelektronowa jest w stanie uchwycić białka i kompleksy białkowe w różnych konformacjach, ale generalnie nie jest w stanie rozwiązać zmian konformacyjnych aż do poziomu^struktury drugorzędowej 1. Dynamika konformacyjna białek w roztworze przy szczegółach atomowych może być rozwiązana tylko za pomocą NMR, ale ta metoda jest nadal ograniczona do białek o stosunkowo małych rozmiarach (zwykle ≤ 30 kDa) i wymaga wysokich stężeń białek (≥ 100 μM), co utrudnia eksperymenty z białkami podatnymi na oligomeryzację lub agregację². Jedną z metod, która jest w stanie połączyć krystalografię rentgenowską o wysokiej rozdzielczości z mikroskopią krioelektronową i która nie jest ograniczona wielkością ani stężeniem białka, jest wymiana H-change amidu wodoru-1 H/²(HX) w połączeniu ze spektrometrią mas (MS). W ostatnich latach metoda ta stała się cennym narzędziem analitycznym do analizy dynamiki białek, fałdowania białek, stabilności białek i zmian konformacyjnych^3-5. Podstawą molekularną tej metody jest labilny charakter wodorów amidowych w białkach, które wymieniają się z atomami deuteru, gdy białko zostanie umieszczone w roztworze_D2O. Późniejszy wzrost masy białka w czasie mierzy się za pomocą MS o wysokiej rozdzielczości.

W skrócie peptydy nieustrukturyzowane HX zależy tylko od temperatury, stężenia katalizatora ^(OH-, H₃O⁺ czyli pH, patrz Rysunek 3) i łańcuchów bocznych aminokwasów sąsiednich reszt z powodu efektów indukcyjnych, katalitycznych i sterycznych. Ten wpływ na wewnętrzny chemiczny kurs wymiany k_ch został elegancko określony ilościowo przez Bai i wsp. ⁶ i dostępny jest program (dzięki uprzejmości Z. Zhanga), który oblicza k_ch dla każdego aminokwasu w polipeptydzie w zależności od pH i temperatury. Przy neutralnym pH i temperaturze otoczenia k_ch jest rzędu 10 1-10 ^{3 sec-1}. W pofałdowanych białkach HX może być o 2-9 rzędów wielkości wolniejszy, głównie ze względu na wiązania wodorowe w strukturze drugorzędowej oraz w niewielkim stopniu z powodu ograniczonego dostępu uwodnionych jonów OH^- do wnętrza ciasno pofałdowanego białka. HX w białkach natywnych implikuje zatem częściowe lub globalne rozwijanie, wymianę chemiczną i ponowne fałdowanie do stanu natywnego zgodnie z równaniem (1), a obserwowane kursy wymiany k_obs zależą od szybkości otwarcia k_op, szybkości zamknięcia k_cl i wewnętrznej chemicznej stopy wymiany k_ch zgodnie z równaniem (2).

W warunkach stanu rodzimego k_op jest znacznie mniejsze niż k_ch i może być pominięte w mianowniku. Istnieją dwa ekstremalne reżimy wymiany zwane EX1 i EX2. Jeśli k_cl jest znacznie mniejsze niż k_ch (EX1), obserwowana szybkość jest praktycznie równa szybkości otwierania, a HX umożliwia natychmiastową obserwację rozkładania się elementu konstrukcyjnego. Taki reżim wymiany, w którym wszystkie protony amidowe wymieniają się jednocześnie po otwarciu elementu strukturalnego, jest łatwo obserwowany w MS przez bimodalny rozkład pików izotopów⁷. Jeżeli k_cl jest znacznie większe niż k_ch (EX2), obserwowana szybkość jest proporcjonalna do k_ch, przy czym stała proporcjonalności jest równa stałej równowagi fałdowania i rozwijania K_u = k_op/k_cl. W tych warunkach przed wymianą wszystkich protonów amidowych na deuterony koniecznych jest wiele zdarzeń otwierających i zamykających, co prowadzi do stopniowego wzrostu średniej masy, podczas gdy rozkład izotopów pozostaje mniej więcej taki sam. Reżim EX2 pozwala na określenie energii swobodnej rozkładania ΔG_u, a tym samym stabilności elementu konstrukcyjnego. W warunkach państwa rodzimego reżim EX2 jest najbardziej powszechny. Wzrost pH i dodanie czynników chaotropowych może przesunąć mechanizm wymiany do EX1. Dlatego HX-MS może być wykorzystywany do badania parametrów termodynamicznych i kinetycznych fałdowania białek i zmian konformacyjnych.

Jak wspomniano powyżej, HX jest wewnętrznie zależny od pH i temperatury, a okres półtrwania wymiany całkowicie odsłoniętego rozpuszczalnikiem protonu z grupy amidowej szkieletu wynosi między 5-400 ms przy fizjologicznym pH (pH 7,6) i 30 °C, ale od 10 minut do >15 godzin ze średnią >2 godziny przy pH 2,9 i 0 °C (z wyjątkiem protonu pierwszego szkieletowego wiązania amidowego polipeptydu, który wymienia się z okresem półtrwania >wynoszącym ok. 1-2 min). W tak powolnych warunkach wymiany możliwe jest trawienie próbki za pomocą proteaz (np. pepsyny), które są aktywne w tych warunkach, bez utraty wszystkich informacji zawartych we wprowadzonych deuteronach. Od czasu wprowadzenia trawienia trawiennego w warunkach powolnej wymiany, nie tylko można analizować ogólną kinetykę HX białek o pełnej długości, ale HX można zlokalizować w określonych regionach^8,9. Rozdzielczość przestrzenna jest obecnie ograniczona do wielkości generowanych fragmentów trawiennych, która na ogół wynosi od 10 do 30 reszt. Jednak nakładające się na siebie fragmenty powstałe w wyniku niespecyficznego charakteru rozszczepienia przez pepsynę mogą prowadzić do wzrostu rozdzielczości przestrzennej. Ponadto stwierdzono, że kilka innych proteaz jest aktywnych w warunkach wygaszania, jednak znacznie mniej wydajnych niż pepsyna¹⁰. Dalszy wzrost rozdzielczości przestrzennej można osiągnąć poprzez fragmentację peptydów w fazie gazowej metodami, które zachowały wzór deuteracji, takimi jak dysocjacja wychwytu elektronów (ECD), dysocjacja przenoszenia elektronów (ETD) i dysocjacja wielofotonowa w podczerwieni (IRMPD)^11-13. Techniki te zapobiegają utracie rozdzielczości przestrzennej spowodowanej wewnątrzcząsteczkową migracją protonów ("scrambling"), która jest obserwowana przez dysocjację wywołaną zderzeniem (CID), najczęściej stosowaną technikę fragmentacji. Jednak metody te wymagają optymalizacji dla każdego pojedynczego peptydu i dlatego nadal stanowią spore wyzwanie.

HX-MS został użyty do analizy interakcji białko-ligand i białko-białko, w tym składania kapsydu wirusa^14-17. Badano rozwijanie i ponowne fałdowanie białek oraz zmiany konformacyjne wywołane temperaturą^7,18,19. Przeanalizowano fosforylację i zmiany konformacyjne związane z mutacjami pojedynczych aminokwasów^16,20 oraz zmiany wywołane nukleotydami^21,22. Dlatego metoda ta wydaje się idealnie odpowiednia do analizy składania i dynamiki maszyn molekularnych. Jednym z atrakcyjnych kandydatów, którego mechanizm cieszy się dużym zainteresowaniem ogólnym, jest kompleks opiekuńczy Hsp90.

Protokół

1. Przygotowanie i próbek białek

1. Przygotować_H2O, bufor. Użyj standardowego buforu Hsp90 (40 mM HEPES/KOH, pH 7,5, 50 mM KCl, 5 mM MgCl₂, 10% glicerolu) jako bufor_H2O.
   Uwaga: Jeśli próbka była dializowana przed analizą, należy użyć buforu dializacyjnego jako buforu_H2O. Istotne jest, że bufor_D2O, od buforu_H2O, różni się tylko izotopem wodoru. Lotne, takie jak NH₄CO₃ lub NH_4-octan lub składniki buforowe, nie są odpowiednie!
2. Przygotować bufor_D2Oprzez liofilizację buforu wzorcowego Hsp90 przy użyciu koncentratora próżniowego. Po całkowitym odparowaniu_H2Ododać czysty_D2Odo probówki, aby osiągnąć początkową całkowitą objętość (np. 1 ml buforu z 15% glicerolem wymaga dodania 850 μl_D2O). Powtórzyć całkowite odparowanie buforu i ponownie rozpuścić składniki buforu/soli w D₂O 2 razy.
3. Przygotować bufor hartowniczy (0,4 M KH₂PO₄/H₃PO₄ pH 2,2).
   Uwaga: Aby poprawić efektywność trawienia trawiennego bardzo stabilnych białek, można dodać 4 M chlorowodorek guanidyny i 0,5 M tris(2-karboksyetylo)fosfinę (TCEP-HCl).
4. Przygotować 100% próbkę kontrolną (6 M chlorowodorek guanidyny, D₂O). Dodać chlorowodorek guanidyny do podwielokrotności Hsp90, aby osiągnąć końcowe stężenie 6 M. Całkowicie odparować_H2Oz próbki i dodać_D2Odo probówki, aby osiągnąć początkową objętość całkowitą (np. 100 μl próbki z 10% glicerolem wymaga dodania 90 μl D₂O). Powtórzyć całkowite odparowanie buforu i ponownie rozpuścić składniki buforu/soli w D₂O.
   Uwaga: Do każdego wstrzyknięcia wymagane jest 20-100 pmol próbki. Przygotuj wystarczającą ilość próbki, aby mieć 100% kontrolę na każdy dzień eksperymentów HX-MS.
5. Przygotować 50 pmol Hsp90 w 5 μl buforu standardowego Hsp90.
   Uwaga: Dla każdego punktu surowych danych wymagana jest ilość 20-100 pmol próbki. Objętość próbki w reakcji wynosi idealnie 1-5 μl. Dostosuj stężenie do tych wymagań. Można użyć dowolnego buforu, o ile nie zawiera detergentów ani składników lotnych.

2. Przygotowanie unieruchomionej pepsyny na kulkach aktywowanych aldehydem

1. Rozpuścić 80 mg świeżej pepsyny w 2 ml 50 mM cytrynianu sodu (pH 5).
2. Rozpuścić 20 mg cyjanoborowodorku sodu, obchodzić się z nim ostrożnie (bardzo toksycznie!) w 1 ml 2 M Na₂SO₄ i dodać do roztworu pepsyny.
3. Inkubować mieszaninę przez 10 minut w temperaturze pokojowej, delikatnie mieszając (np. wytrząsarką górną).
4. Do mieszaniny dodać kulki 600 mg z unieruchomionymi grupami aldehydowymi i inkubować przez 5-10 minut w temperaturze pokojowej.
5. Dodawać 2,2 ml 2 M Na₂SO₄ (pH 5) do 100 μl podwielokrotności co 3 minuty przez godzinę, aby powoli wysolić pepsynę. Delikatnie wymieszać próbkę między dodatkami w wytrząsarce nad głową w temperaturze pokojowej.
6. Inkubować kulki pepsyny w temperaturze 4 °C przez 14-16 godzin/noc w wytrząsarce nad głową.
7. Ugasić reakcję, dodając 1 ml 1 M etanoloaminy i inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.
8. Zakręć kulki w 50 ml probówce Falcon z prędkością 500 obr./min, wyrzuć supernatant i ponownie zawieś kulki w 0,1% kwasie mrówkowym. Powtórz ten krok 2 razy. Po ostatnim etapie wirowania odrzucić supernatant i oszacować objętość kulek. Dodać równoważną objętość 0,1% kwasu mrówkowego i przechowywać w temperaturze 4 °C.

3. Przygotowanie kolumn do wymiany wodoru amidowego

1. Stosować kolumny ochronne o średnicy wewnętrznej 1 mm do zalewania kolumn i o średnicy 2 mm do kolumn pepsynowych.
2. Odkręć jedną stronę kolumny ochronnej i wyjmij filtr. Mocno przykręć lejek do pakowania na otwartym końcu kolumny. Użyj adaptera 1/16 cala i rurki, aby przymocować pustą strzykawkę (5 ml) do dolnego wylotu kolumny. Upewnij się, że jest przymocowany gazoszczelnie do kolumny ochronnej.
3. Nałóż kilka kropel materiału do kulek gnojowicy na wierzch lejka. Pociągnąć tłok strzykawki, aby zassać gnojowicę przez lejek do kolumny ochronnej. Nałóż więcej materiału na kulki gnojowicy na lejek i kontynuuj procedurę, aż kolumna ochronna zostanie całkowicie wypełniona materiałem ściegu. Wyjmij lejek i umieść filtr i pierścień filtrujący na otwartym końcu. Mocno przykręcić nasadkę kolumny do kolumny ochronnej i wyjąć strzykawkę z drugiej strony. Zamknij oba końce kolumn ochronnych zatyczkami, aby uniknąć wysychania materiału kolumny.

4. Konfiguracja systemu spektrometrii mas wymiany wodoru (HX-MS)

1. Połącz kolumnę pułapki z systemem HPLC (rysunek 1). Zrównoważyć kolumnę, ustawiając natężenie przepływu pompy A na 0,4 ml/min z 0,1% kwasem mrówkowym jako rozpuszczalnikiem. Nie należy jeszcze łączyć kolumny pepsyny ani kolumny analitycznej.
2. Skalibrować spektrometr masowy i podłączyć wylot HPLC do źródła spektrometru masowego.

5. Wyznaczanie zakresu dynamiki wymiany

1. Przygotować ultraczysty rozpuszczalnik A (0,1% kwasu mrówkowego w wodzie) i ultraczysty rozpuszczalnik B (0,1% kwas mrówkowy w acetonitrylu); gotowe mieszaniny rozpuszczalników są dostępne w handlu. Oczyść pompy HPLC. Skonfiguruj metody chromatografii i spektrometrii mas w oprogramowaniu sterującym, wybierając program z gradientem krokowym po krótkim kroku odsalania. W przypadku pełnej długości Hsp90 należy wykonać 1-2 minutowy etap odsalania, a następnie przełączyć zawór 6-drogowy z DESALT/LOAD na ELUTE i stopniowy gradient od 90% rozpuszczalnika A/10% rozpuszczalnika B na 5% rozpuszczalnika A/95% rozpuszczalnika B. Przed wtryskiem ustawić zawór wtryskowy w pozycji LOAD, a zawór 6-drogowy w pozycji DESALT/LOADING.
   Uwaga: Podczas tego eksperymentu nie używaj pepsyny ani kolumny analitycznej.
2. Przygotować 100-200 pmol Hsp90 w 1-10 μl buforu_H2Oi inkubować przez 10 minut w temperaturze 30 °C. Dodać bufor_D2Oo o dostosowanej temperaturze, aby zwiększyć objętość próbki do 100 μl i inkubować dokładnie przez określony czas (np. 10 sekund, 100 sekund, 1000 sekund). Dodać 100 μl buforu gaszącego i mieszać, pipetując w górę i w dół. Wstrzyknąć próbkę o objętości 200 μl do portu iniekcyjnego zaworu iniekcyjnego za pomocą strzykawki Hamiltona. Uruchom program chromatograficzny i przełącz zawór wtryskowy w pozycję INJECT. Po 2 minutach przełącz zawór 6-drogowy z DESALT/LOADING na ELUTE. Powtórz to dla co najmniej trzech punktów czasowych.
3. Powtórzyć krok 5.2, ale dodać 2-3 razy nadmiar Sti1 do próbki Hsp90 przed inkubacją przez 10 minut w temperaturze 30 °C.
4. Określ masy białek o pełnej długości przez dekonwolucję widm w oprogramowaniu do spektrometrii mas. Obliczyć liczbę włączonych deuteronów, porównując masę cząsteczkową pełnej długości Hsp90 z masą obserwowaną po każdym przebiegu (np. 10 sekund, 100 sekund, 1 000 sekund).
5. Wykreślić włączone deuterony dla Hsp90 pod nieobecność i obecność Sti1 (oś y) w funkcji czasu (oś x). Określ punkt czasowy w zakresie dynamiki, w którym różnica między obiema krzywymi jest maksymalna. Użyj tej wartości dla czasu inkubacji w D₂O podczas identyfikacji granicy faz Hsp90-Sti1 i dynamiki na poziomie peptydu.

6. Oznaczanie peptydów peptydowych za pomocą widm MS/MS

1. Podłącz kolumnę pepsyny i kolumnę analityczną do systemu.
2. Ustaw parametry chromatografii i spektrometrii mas w oprogramowaniu sterującym, wybierając typ gradientu i metodę spektrometrii mas. Wybierz długi gradient (np. ponad 90 min), aby zapewnić dobrą rozdzielczość chromatograficzną. Włącz widma MS/MS na spektrometrze mas.
   nuta: Dobra rozdzielczość na HPLC i wysoka dokładność masy mają najwyższy priorytet na tym etapie.
3. Przygotować 100-200 pmol Hsp90 w 100 μl buforu H₂O. Dodać 100 μl buforu gaszącego i mieszać, pipetując w górę i w dół. Wstrzyknąć próbkę o objętości 200 μl do portu iniekcyjnego zaworu iniekcyjnego za pomocą strzykawki Hamiltona. Uruchom program chromatograficzny i przełącz zawór wtryskowy w pozycję INJECT. Po 2 minutach przełącz zawór 6-drogowy z pozycji DESALT/LOADING na pozycję ELUTE.
   Uwaga: Jeśli więcej niż jedno białko ma być analizowane w HX-MS (tj. interfejsy interakcji białko-białko), peptydy dla każdego białka muszą być oznaczane indywidualnie.
4. Zidentyfikuj peptydy peptydowe Hsp90, przeszukując bazę danych (np. Mascot) w poszukiwaniu powstałych peptydów.
   Uwaga: Możliwe jest użycie niestandardowej bazy danych, ponieważ celem jest określenie jak największej liczby peptydów trawiennych, a analiza odbywa się przy użyciu oczyszczonego białka. Należy wziąć pod uwagę czystość próbki.
5. Powtórz ten krok bez MS/MS i z gradientem, który zostanie użyty w rzeczywistym eksperymencie HX. W przypadku Hsp90 i Sti1 należy zastosować 10-minutowy gradient od 90% rozpuszczalnika A/10% rozpuszczalnika B do 45% rozpuszczalnika A/55% rozpuszczalnika B.
   Uwaga: Gradienty wynoszą zwykle od 5 do 15 minut i w dużym stopniu zależą od złożoności próbki i specyfikacji systemu HX.
6. Określić czasy retencji peptydów trawiennych zidentyfikowanych w ppkt 6.4 w gradiencie użytym w ppkt 6.5 i utworzyć listę zawierającą 1.) Sekwencja peptydowa 2.) stan ładunku peptydowego i 3.) czas przechowywania. Zostanie to wykorzystane do identyfikacji każdego peptydu po eksperymentach HX.
   Uwaga: Należy pamiętać, że peptydy o niewielkich różnicach m/z, identycznym stanie naładowania i identycznym czasie retencji mogą być źródłem niejednoznaczności.

7. Identyfikacja interfejsów interakcji białko-białko

1. Skonfiguruj metodę gradientu i spektrometrii mas w oprogramowaniu sterującym. Zastosuj 10-minutowy gradient liniowy od 90% rozpuszczalnika A/10% rozpuszczalnika B do 45% rozpuszczalnika A/55% rozpuszczalnika B. Załaduj metodę spektrometrii mas, która jest zoptymalizowana do wykrywania mas w zakresie 300-1,500 m/z, chociaż większość peptydów będzie poniżej 1,000 m/z. Ustaw zawór wtryskowy w pozycji LOAD, zawór 6-drogowy w pozycji LOADING/DESALTING. Ustawić natężenie przepływu pompy podawczej na 0.4 ml/min.
   Uwaga: Długość i typ gradientu są zależne od próbki i mogą wymagać optymalizacji. Dłuższe gradienty poprawiają rozdzielczość chromatografii, ale zmniejszają wprowadzanie deuteronów do białek w wyniku wymiany zwrotnej. Wybrane metody muszą być takie same, aby wszystkie eksperymenty mogły być porównywane.
2. Dla niewymiennego odniesienia przygotować 20-100 pmol Hsp90 w 100 μl buforu H₂O. Dodać 100 μl lodowatego buforu do gaszenia, dwukrotnie pipetować w górę i w dół i wstrzyknąć próbkę do zaworu iniekcyjnego HPLC. Natychmiast uruchom program chromatograficzny i przełącz zawór wtryskowy w pozycję INJECT. Po 2 minutach przełącz zawór 6-drogowy z pozycji DESALT/LOADING do pozycji ELUTE. Zrób to dla Hsp90 i Sti1 indywidualnie oraz dla mieszanki białek.
3. Przygotować 20-100 pmol Hsp90 w objętości 1-5 μl. Dodać bufor D₂O o dostosowanej temperaturze, aby zwiększyć objętość próbki do 100 μl i inkubować dokładnie przez określony czas (np. 30 sekund; dynamika konformacji patrz uwaga). Dodać 100 μl lodowatego buforu do gaszenia, dwukrotnie pipetować w górę i w dół i szybko wstrzyknąć 200 μl do zaworu iniekcyjnego HPLC. Natychmiast uruchom program chromatograficzny i przełącz zawór wtryskowy w pozycję INJECT. Po 2 minutach przełącz zawór 6-drogowy z pozycji DESALT/LOADING do pozycji ELUTE. Zrób to dla każdego białka indywidualnie, aby określić inkorporację deuteronu z każdym peptydem pod nieobecność białka oddziałującego.
   Uwaga: Badając dynamikę zmian konformacyjnych, powtórz eksperyment z różnymi czasami inkubacji Hsp90 w buforze D₂O. Staraj się objąć szeroką skalę czasową, wybierając czasy inkubacji logarytmicznie (np. 10 sekund, 30 sekund, 100 sekund, 300 sekund, 1,000 sekund itp.). D2O, bufor i bufor próbki muszą być dokładnie identyczne, z wyjątkiem izotopu wodoru.
4. Przygotować równą ilość 100% próbki kontrolnej (20-100 pmol) i dodać bufor_D2O, aby zwiększyć objętość próbki do 100 μl. Dodać 100 μl lodowatego buforu do gaszenia, dwukrotnie pipetować w górę i w dół i szybko wstrzyknąć 200 μl do zaworu iniekcyjnego HPLC. Natychmiast uruchom program chromatograficzny i przełącz zawór wtryskowy w pozycję INJECT. Po 2 minutach przełącz zawór 6-drogowy z pozycji DESALT/LOADING do pozycji ELUTE.
5. Aby określić powierzchnię oddziaływania, zmieszaj Hsp90 z co najmniej 2-krotnym nadmiarem Sti1, aby przesunąć równowagę do stanu związanego (patrz uwaga) i inkubować w żądanej temperaturze, aż tworzenie kompleksu osiągnie równowagę. Dodać bufor D_2Oo o dostosowanej temperaturze, aby zwiększyć objętość próbki do 100 μl i inkubować dokładnie przez określony czas (np. 30 sekund). Dodać 100 μl lodowatego buforu do gaszenia, dwukrotnie pipetować w górę i w dół i szybko wstrzyknąć do zaworu iniekcyjnego HPLC. Po 2 minutach przełącz zawór 6-drogowy z pozycji DESALT/LOADING do pozycji ELUTE. Powtórz ten eksperyment z 20-100 pmol Sti1 i nadmiarem Hsp90.
   Uwaga: Stężenia bezwzględne zależą od stałej równowagi dysocjacji oddziaływania. Idealnie, po rozcieńczeniu do_D2O, stężenie białka dodanego w nadmiarze powinno wynosić co najmniej 10 razy więcej niż_{K D} (co odpowiada >85% dolnego stężonego wiązania białka).
6. Przeanalizuj uzyskane dane za pomocą odpowiedniego oprogramowania i użyj czasów przechowywania określonych w kroku 6.5, aby znaleźć każdy peptyd w analizie. Obliczyć środek ciężkości rozkładu izotopów dla białka niewymienionego (krok 7.2) i dla doświadczeń HX (krok 7.3).
   Uwaga: Chociaż wzorce izotopowe wymienianych peptydów wyglądają inaczej niż ich niewymienne odpowiedniki, zarówno wiedza o stanie naładowania peptydu, jak i wysoka dokładność masowa spektrometru masowego pozwalają na łatwe wyznaczenie środków ciężkości.
7. Porównaj inkorporację deuteronów samego białka docelowego i z nadmiarem partnera wiążącego. Można to zrobić automatycznie za pomocą komercyjnego oprogramowania lub ręcznie za pomocą programu do obsługi arkuszy kalkulacyjnych. 100% wartości próbki kontrolnej oznaczają maksymalną wymianę dla każdego peptydu i mogą być wykorzystane do określenia ilości znacznika D₂O utraconego podczas eksperymentu w wyniku wymiany zwrotnej.

Wyniki

Hsp90 to molekularny chaperon u drożdży i członek rodziny białek opiekuńczych Hsp90. Przechodząc przez złożony cykl ATPazy, wspomaga późne etapy fałdowania wielu klientów białkowych. Efektywne składanie wymaga przeniesienia klientów z Hsp70 i współdziałania co-chaperone Sti1/Hop. Sti1 bezpośrednio wiąże się z Hsp90 i ułatwia wiązanie klienta poprzez hamowanie aktywności ATPazy Hsp90. Interakcja Hsp90 z Sti1 była ostatnio badana przy użyciu HX-MS²³. Poniżej przedstawiamy reprezentatywne wyniki podstawowych eksp...

Dyskusja

Wiązanie partnera interakcji z białkiem nieuchronnie powoduje zmiany w dostępności rozpuszczalnika w miejscu wiązania. Ponadto wiele białek ulega dynamicznym zmianom konformacyjnym po związaniu, które wpływają na inne regiony niż rzeczywisty interfejs wiązania. HX-MS jest solidną metodą monitorowania tych zmian i jest nawet w stanie ujawnić zmiany konformacyjne w białkach w skalach czasowych, których inne metody nie są w stanie pokryć.

Aby pomyślnie przeprowadzić HX-MS, kluczowe są trzy punkty...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
maXis QTOF	Bruker
nanoAcquity UPLC	Waters Corp.
Shimadzu 10AD-VP	Shimadzu
EPC6W z siłownikiem mikroelektrycznym	Valco	#EPC6W
Zawór wtryskowy (ręczny)	Rheodyne	#7725
Poros AL20 media	Applied Biosystems	#1-6029-06
Poros R2	Applied Biosystems	#1-1118-02
Pepsyna	Sigma	#P6887	użyj świeżej pepsyny
Microbore (1 mm)	IDEX	#C-128
Microbore (2 mm)	IDEX	#C-130B
Acquity UPLC BEH C8 Column	Waters Corp.	#186002876
Termomikser	Eppendorf	#5355000.011
Rurki (różne średnice)	IDEX
Złączki	IDEX	#PK-110 z PK-100