Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Analiza dynamiki białek za pomocą spektrometrii mas wymiany wodorowej

18K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50839

⸱

29 listopada 2013

 , 
1Zentrum für Molekulare Biologie der Universität Heidelberg (ZMBH), University of Heidelberg

W tym artykule

Podsumowanie

Konformacja i dynamika białek są kluczem do zrozumienia związku między strukturą a funkcją białka. Wymiana wodorowa w połączeniu ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości jest wszechstronną metodą badania dynamiki konformacyjnej białek, a także charakteryzowania interakcji białko-ligand i białko-białko, w tym interfejsów kontaktowych i efektów allosterycznych.

Streszczenie

Wszystkie procesy komórkowe zależą od funkcjonalności białek. Chociaż funkcjonalność danego białka jest bezpośrednią konsekwencją jego unikalnej sekwencji aminokwasów, jest ona realizowana tylko poprzez fałdowanie łańcucha polipeptydowego w pojedynczy zdefiniowany trójwymiarowy układ lub, częściej, w zespół konformacji przekształcających się. Badanie związku między konformacją białka a jego funkcją jest zatem niezbędne do pełnego zrozumienia, w jaki sposób białka są w stanie spełniać swoją różnorodną misję. Jedną z możliwości badania zmian konformacyjnych, jakie zachodzą w białku podczas przechodzenia przez swój cykl funkcjonalny, jest wymiana wodoru-1 H/2H w połączeniu ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości (HX-MS). HX-MS to wszechstronna i solidna metoda, która nadaje nowy wymiar informacjom strukturalnym uzyskanym np. za pomocą krystalografii. Służy do badania fałdowania i rozwijania białek, wiązania ligandów drobnocząsteczkowych, interakcji białko-białko, zmian konformacyjnych związanych z katalizą enzymatyczną i allosterii. Ponadto HX-MS jest często stosowany, gdy ilość białka jest bardzo ograniczona lub krystalizacja białka nie jest możliwa. W tym miejscu przedstawiamy ogólny protokół badania dynamiki białek za pomocą HX-MS i opisujemy jako przykład, jak ujawnić interfejs interakcji dwóch białek w kompleksie.   

Wprowadzenie

Liczba struktur krystalicznych białek i kompleksów białkowych gwałtownie wzrosła w ostatnich latach. Stanowią one nieocenione obrazy organizacji strukturalnej tych białek i stanowią podstawę do analizy zależności struktura-funkcja. Jednak dynamika białek oraz zmiany konformacyjne, które są kluczowe dla ich funkcji, są rzadko ujawniane przez krystalografię rentgenowską. Kriomikroskopia elektronowa z kolei pozwala na uchwycenie białek i kompleksów białkowych w różnych konformacjach, ale zazwyczaj nie pozwala na rozdzielczość zmian konformacyjnych na poziomie struktury drugorzędowej1. Dynamika konformacyjna białek w roztworze z dokładnością atomową może być rozdzielona jedynie za pomocą NMR, jednak metoda ta jest wciąż ograniczona do białek o stosunkowo niewielkich rozmiarach (zazwyczaj ≤ 30 kDa) i wymaga wysokich stężeń białek (≥ 100 μM), co utrudnia eksperymenty z białkami podatnymi na oligomeryzację lub agregację2. Metodą, która pozwala wypełnić lukę między wysokorozdzielczą krystalografią rentgenowską a kriomikroskopią elektronową i która nie jest ograniczona rozmiarem ani stężeniem białka, jest wymiana wodoru amidowego 1H/2H (HX) w połączeniu ze spektrometrią mas (MS). W ostatnich latach metoda ta rozwinęła się w wartościowe narzędzie analityczne do badania dynamiki białek, fałdowania białek, ich stabilności oraz zmian konformacyjnych3-5. Podstawą molekularną tej metody jest labilna natura wodorów amidowych szkieletu białek, które wymieniają się z atomami deuteru, gdy białko zostanie umieszczone w roztworze D2O. Następujący w czasie wzrost masy białka jest mierzony za pomocą wysokorozdzielczej MS.

W krótkich, nieustrukturyzowanych peptydach HX zależy jedynie od temperatury, stężenia katalizatora (OH-, H3O+, tzn. pH, patrz Rysunek 3) oraz łańcuchów bocznych aminokwasów sąsiednich reszt ze względu na efekty indukcyjne, katalityczne i steryczne. Wpływy te na wewnętrzną szybkość wymiany chemicznej kch zostały w elegancki sposób określone ilościowo przez Bai et al.6, a dostępny jest program (uprzejmie udostępniony przez Z. Zhang), który oblicza kch dla każdego aminokwasu w polipeptydzie w zależności od pH i temperatury. Przy neutralnym pH i temperaturze otoczenia kch wynosi od 101 do 103 sec-1. W białkach pofałdowanych HX może być od 2 do 9 rzędów wielkości wolniejszy, głównie ze względu na wiązania wodorowe w strukturze drugorzędowej oraz w mniejszym stopniu z powodu ograniczonego dostępu uwodnionych jonów OH- do wnętrza ciasno pofałdowanego białka. HX w białkach natywnych wiąże się zatem z częściowym lub globalnym rozfałdowaniem, wymianą chemiczną i ponownym pofałdowaniem do stanu natywnego zgodnie z równaniem (1), a obserwowane szybkości wymiany kobs zależą od szybkości otwierania kop, szybkości zamykania kcl oraz wewnętrznej szybkości wymiany chemicznej kch zgodnie z równaniem (2).

Równania mechanizmu zwijania białek; kinetyka chemiczna, stałe szybkości; analiza naukowa.
W warunkach stanu natywnego kop jest znacznie mniejsza od kch i może zostać pominięta w mianowniku. Istnieją dwa skrajne reżimy wymiany nazywane EX1 i EX2. Jeśli kcl jest znacznie mniejsza od kch (EX1), obserwowana szybkość jest praktycznie równa szybkości otwierania, a HX pozwala na natychmiastową obserwację rozwijania elementu strukturalnego. Taki reżim wymiany, w którym wszystkie protony amidowe wymieniają się jednocześnie po otwarciu elementu strukturalnego, jest łatwo obserwowalny w MS poprzez bimodalny rozkład pików izotopowych7. Jeśli kcl jest znacznie większa od kch (EX2), obserwowana szybkość jest proporcjonalna do kch, przy czym stała proporcjonalności jest równa stałej równowagi zwijania i rozwijania Ku = kop/kcl. W tych warunkach wiele zdarzeń otwarcia i zamknięcia jest niezbędnych, zanim wszystkie protony amidowe zostaną zastąpione deuteronami, co prowadzi do stopniowego wzrostu średniej masy, podczas gdy rozkład izotopowy pozostaje w przybliżeniu taki sam. Reżim EX2 pozwala na wyznaczenie wolnej energii rozwijania ΔGu, a tym samym stabilności elementu strukturalnego. W warunkach stanu natywnego najczęściej występuje reżim EX2. Zwiększenie pH i dodanie czynników chaotropowych może przesunąć mechanizm wymiany w stronę EX1. Zatem HX-MS może być wykorzystywany do badania parametrów termodynamicznych oraz kinetycznych zwijania białek i zmian konformacyjnych.

Jak wspomniano powyżej, HX jest z natury zależny od pH i temperatury, a okres półtrwania wymiany protonu grupy amidowej szkieletu całkowicie wyeksponowanego na rozpuszczalnik wynosi od 5-400 msec przy fizjologicznym pH (pH 7.6) i 30 °C, ale od 10 min do >15 hr, ze średnią >2 hr przy pH 2.9 i 0 °C (z wyjątkiem protonu pierwszego wiązania amidowego szkieletu polipeptydu, który wymienia się z okresem półtrwania ca. 1-2 min). W tak wolnych warunkach wymiany możliwe jest trawienie próbki za pomocą proteaz (np. pepsyny), które są aktywne w tych warunkach, bez utraty wszystkich informacji zawartych w wbudowanych deuteronach. Od czasu wprowadzenia trawienia pepsynowego w warunkach wolnej wymiany możliwe stało się analizowanie nie tylko ogólnej kinetyki HX pełnowymiarowych białek, ale także lokalizacja HX w konkretnych regionach8,9. Rozdzielczość przestrzenna jest obecnie ograniczona do wielkości generowanych fragmentów pepsynowych, która zazwyczaj wynosi od 10-30 reszt. Jednakże nakładające się fragmenty powstające w wyniku niespecyficznego charakteru cięcia przez pepsynę mogą prowadzić do zwiększenia rozdzielczości przestrzennej. Ponadto stwierdzono, że kilka innych proteaz jest aktywnych w warunkach gwałtownego schłodzenia (quench), jednak są one znacznie mniej wydajne niż pepsyna10. Dalszy wzrost rozdzielczości przestrzennej można osiągnąć poprzez fragmentację peptydów w fazie gazowej metodami zachowującymi wzór deuterowania, takimi jak dysocjacja z wychwytem elektronów (ECD), dysocjacja z transferem elektronów (ETD) i wielofotonowa dysocjacja podczerwona (IRMPD)11-13. Techniki te zapobiegają utracie rozdzielczości przestrzennej z powodu wewnątrzcząsteczkowej migracji protonów („scrambling”), która jest obserwowana przy dysocjacji indukowanej zderzeniem (CID), najczęściej stosowanej technice fragmentacji. Metody te wymagają jednak optymalizacji dla każdego pojedynczego peptydu, co wciąż stanowi spore wyzwanie.

Metoda HX-MS była wykorzystywana do analizy oddziaływań białko-ligand oraz białko-białko, w tym montażu kapsydów wirusowych14-17. Badano rozfałdowanie i refałdowanie białek, a także zmiany konformacyjne indukowane temperaturą7,18,19. Analizowano zmiany konformacyjne związane z fosforylacją i mutacją pojedynczych aminokwasów16,20 oraz zmiany indukowane nukleotydami21,22. W związku z tym metoda ta wydaje się idealnie nadawać do analizy montażu i dynamiki maszyn molekularnych. Atrakcyjnym kandydatem, którego mechanizm budzi duże ogólne zainteresowanie, jest kompleks chaperonowy Hsp90.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie i próbek białek

  1. PrzygotowaćH2O, bufor. Użyj standardowego buforu Hsp90 (40 mM HEPES/KOH, pH 7,5, 50 mM KCl, 5 mM MgCl2, 10% glicerolu) jako buforH2O.
    Uwaga: Jeśli próbka była dializowana przed analizą, należy użyć buforu dializacyjnego jako buforuH2O. Istotne jest, że buforD2O, od buforuH2O, różni się tylko izotopem wodoru. Lotne, takie jak NH4CO3 lub NH4-octan lub składniki buforowe, nie są odpowiednie!
  2. Przygotować buforD2Oprzez liofilizację buforu wzorcowego Hsp90 przy użyciu koncentratora próżniowego. Po całkowitym odparowaniuH2Ododać czystyD2Odo probówki, aby osiągnąć początkową całkowitą objętość (np. 1 ml buforu z 15% glicerolem wymaga dodania 850 μlD2O). Powtórzyć całkowite odparowanie buforu i ponownie rozpuścić składniki buforu/soli w D2O 2 razy.
  3. Przygotować bufor hartowniczy (0,4 M KH2PO4/H3PO4 pH 2,2).
    Uwaga: Aby poprawić efektywność trawienia trawiennego bardzo stabilnych białek, można dodać 4 M chlorowodorek guanidyny i 0,5 M tris(2-karboksyetylo)fosfinę (TCEP-HCl).
  4. Przygotować 100% próbkę kontrolną (6 M chlorowodorek guanidyny, D2O). Dodać chlorowodorek guanidyny do podwielokrotności Hsp90, aby osiągnąć końcowe stężenie 6 M. Całkowicie odparowaćH2Oz próbki i dodaćD2Odo probówki, aby osiągnąć początkową objętość całkowitą (np. 100 μl próbki z 10% glicerolem wymaga dodania 90 μl D2O). Powtórzyć całkowite odparowanie buforu i ponownie rozpuścić składniki buforu/soli w D2O.
    Uwaga: Do każdego wstrzyknięcia wymagane jest 20-100 pmol próbki. Przygotuj wystarczającą ilość próbki, aby mieć 100% kontrolę na każdy dzień eksperymentów HX-MS.
  5. Przygotować 50 pmol Hsp90 w 5 μl buforu standardowego Hsp90.
    Uwaga: Dla każdego punktu surowych danych wymagana jest ilość 20-100 pmol próbki. Objętość próbki w reakcji wynosi idealnie 1-5 μl. Dostosuj stężenie do tych wymagań. Można użyć dowolnego buforu, o ile nie zawiera detergentów ani składników lotnych.

2. Przygotowanie unieruchomionej pepsyny na kulkach aktywowanych aldehydem

  1. Rozpuścić 80 mg świeżej pepsyny w 2 ml 50 mM cytrynianu sodu (pH 5).
  2. Rozpuścić 20 mg cyjanoborowodorku sodu, obchodzić się z nim ostrożnie (bardzo toksycznie!) w 1 ml 2 M Na2SO4 i dodać do roztworu pepsyny.
  3. Inkubować mieszaninę przez 10 minut w temperaturze pokojowej, delikatnie mieszając (np. wytrząsarką górną).
  4. Do mieszaniny dodać kulki 600 mg z unieruchomionymi grupami aldehydowymi i inkubować przez 5-10 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Dodawać 2,2 ml 2 M Na2SO4 (pH 5) do 100 μl podwielokrotności co 3 minuty przez godzinę, aby powoli wysolić pepsynę. Delikatnie wymieszać próbkę między dodatkami w wytrząsarce nad głową w temperaturze pokojowej.
  6. Inkubować kulki pepsyny w temperaturze 4 °C przez 14-16 godzin/noc w wytrząsarce nad głową.
  7. Ugasić reakcję, dodając 1 ml 1 M etanoloaminy i inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.
  8. Zakręć kulki w 50 ml probówce Falcon z prędkością 500 obr./min, wyrzuć supernatant i ponownie zawieś kulki w 0,1% kwasie mrówkowym. Powtórz ten krok 2 razy. Po ostatnim etapie wirowania odrzucić supernatant i oszacować objętość kulek. Dodać równoważną objętość 0,1% kwasu mrówkowego i przechowywać w temperaturze 4 °C.

3. Przygotowanie kolumn do wymiany wodoru amidowego

  1. Stosować kolumny ochronne o średnicy wewnętrznej 1 mm do zalewania kolumn i o średnicy 2 mm do kolumn pepsynowych.
  2. Odkręć jedną stronę kolumny ochronnej i wyjmij filtr. Mocno przykręć lejek do pakowania na otwartym końcu kolumny. Użyj adaptera 1/16 cala i rurki, aby przymocować pustą strzykawkę (5 ml) do dolnego wylotu kolumny. Upewnij się, że jest przymocowany gazoszczelnie do kolumny ochronnej.
  3. Nałóż kilka kropel materiału do kulek gnojowicy na wierzch lejka. Pociągnąć tłok strzykawki, aby zassać gnojowicę przez lejek do kolumny ochronnej. Nałóż więcej materiału na kulki gnojowicy na lejek i kontynuuj procedurę, aż kolumna ochronna zostanie całkowicie wypełniona materiałem ściegu. Wyjmij lejek i umieść filtr i pierścień filtrujący na otwartym końcu. Mocno przykręcić nasadkę kolumny do kolumny ochronnej i wyjąć strzykawkę z drugiej strony. Zamknij oba końce kolumn ochronnych zatyczkami, aby uniknąć wysychania materiału kolumny.

4. Konfiguracja systemu spektrometrii mas wymiany wodoru (HX-MS)

  1. Połącz kolumnę pułapki z systemem HPLC (rysunek 1). Zrównoważyć kolumnę, ustawiając natężenie przepływu pompy A na 0,4 ml/min z 0,1% kwasem mrówkowym jako rozpuszczalnikiem. Nie należy jeszcze łączyć kolumny pepsyny ani kolumny analitycznej.
  2. Skalibrować spektrometr masowy i podłączyć wylot HPLC do źródła spektrometru masowego.

5. Wyznaczanie zakresu dynamiki wymiany

  1. Przygotować ultraczysty rozpuszczalnik A (0,1% kwasu mrówkowego w wodzie) i ultraczysty rozpuszczalnik B (0,1% kwas mrówkowy w acetonitrylu); gotowe mieszaniny rozpuszczalników są dostępne w handlu. Oczyść pompy HPLC. Skonfiguruj metody chromatografii i spektrometrii mas w oprogramowaniu sterującym, wybierając program z gradientem krokowym po krótkim kroku odsalania. W przypadku pełnej długości Hsp90 należy wykonać 1-2 minutowy etap odsalania, a następnie przełączyć zawór 6-drogowy z DESALT/LOAD na ELUTE i stopniowy gradient od 90% rozpuszczalnika A/10% rozpuszczalnika B na 5% rozpuszczalnika A/95% rozpuszczalnika B. Przed wtryskiem ustawić zawór wtryskowy w pozycji LOAD, a zawór 6-drogowy w pozycji DESALT/LOADING.
    Uwaga: Podczas tego eksperymentu nie używaj pepsyny ani kolumny analitycznej.
  2. Przygotować 100-200 pmol Hsp90 w 1-10 μl buforuH2Oi inkubować przez 10 minut w temperaturze 30 °C. Dodać buforD2Oo o dostosowanej temperaturze, aby zwiększyć objętość próbki do 100 μl i inkubować dokładnie przez określony czas (np. 10 sekund, 100 sekund, 1000 sekund). Dodać 100 μl buforu gaszącego i mieszać, pipetując w górę i w dół. Wstrzyknąć próbkę o objętości 200 μl do portu iniekcyjnego zaworu iniekcyjnego za pomocą strzykawki Hamiltona. Uruchom program chromatograficzny i przełącz zawór wtryskowy w pozycję INJECT. Po 2 minutach przełącz zawór 6-drogowy z DESALT/LOADING na ELUTE. Powtórz to dla co najmniej trzech punktów czasowych.
  3. Powtórzyć krok 5.2, ale dodać 2-3 razy nadmiar Sti1 do próbki Hsp90 przed inkubacją przez 10 minut w temperaturze 30 °C.
  4. Określ masy białek o pełnej długości przez dekonwolucję widm w oprogramowaniu do spektrometrii mas. Obliczyć liczbę włączonych deuteronów, porównując masę cząsteczkową pełnej długości Hsp90 z masą obserwowaną po każdym przebiegu (np. 10 sekund, 100 sekund, 1 000 sekund).
  5. Wykreślić włączone deuterony dla Hsp90 pod nieobecność i obecność Sti1 (oś y) w funkcji czasu (oś x). Określ punkt czasowy w zakresie dynamiki, w którym różnica między obiema krzywymi jest maksymalna. Użyj tej wartości dla czasu inkubacji w D2O podczas identyfikacji granicy faz Hsp90-Sti1 i dynamiki na poziomie peptydu.

6. Oznaczanie peptydów peptydowych za pomocą widm MS/MS

  1. Podłącz kolumnę pepsyny i kolumnę analityczną do systemu.
  2. Ustaw parametry chromatografii i spektrometrii mas w oprogramowaniu sterującym, wybierając typ gradientu i metodę spektrometrii mas. Wybierz długi gradient (np. ponad 90 min), aby zapewnić dobrą rozdzielczość chromatograficzną. Włącz widma MS/MS na spektrometrze mas.
    nuta: Dobra rozdzielczość na HPLC i wysoka dokładność masy mają najwyższy priorytet na tym etapie.
  3. Przygotować 100-200 pmol Hsp90 w 100 μl buforu H2O. Dodać 100 μl buforu gaszącego i mieszać, pipetując w górę i w dół. Wstrzyknąć próbkę o objętości 200 μl do portu iniekcyjnego zaworu iniekcyjnego za pomocą strzykawki Hamiltona. Uruchom program chromatograficzny i przełącz zawór wtryskowy w pozycję INJECT. Po 2 minutach przełącz zawór 6-drogowy z pozycji DESALT/LOADING na pozycję ELUTE.
    Uwaga: Jeśli więcej niż jedno białko ma być analizowane w HX-MS (tj. interfejsy interakcji białko-białko), peptydy dla każdego białka muszą być oznaczane indywidualnie.
  4. Zidentyfikuj peptydy peptydowe Hsp90, przeszukując bazę danych (np. Mascot) w poszukiwaniu powstałych peptydów.
    Uwaga: Możliwe jest użycie niestandardowej bazy danych, ponieważ celem jest określenie jak największej liczby peptydów trawiennych, a analiza odbywa się przy użyciu oczyszczonego białka. Należy wziąć pod uwagę czystość próbki.
  5. Powtórz ten krok bez MS/MS i z gradientem, który zostanie użyty w rzeczywistym eksperymencie HX. W przypadku Hsp90 i Sti1 należy zastosować 10-minutowy gradient od 90% rozpuszczalnika A/10% rozpuszczalnika B do 45% rozpuszczalnika A/55% rozpuszczalnika B.
    Uwaga: Gradienty wynoszą zwykle od 5 do 15 minut i w dużym stopniu zależą od złożoności próbki i specyfikacji systemu HX.
  6. Określić czasy retencji peptydów trawiennych zidentyfikowanych w ppkt 6.4 w gradiencie użytym w ppkt 6.5 i utworzyć listę zawierającą 1.) Sekwencja peptydowa 2.) stan ładunku peptydowego i 3.) czas przechowywania. Zostanie to wykorzystane do identyfikacji każdego peptydu po eksperymentach HX.
    Uwaga: Należy pamiętać, że peptydy o niewielkich różnicach m/z, identycznym stanie naładowania i identycznym czasie retencji mogą być źródłem niejednoznaczności.

7. Identyfikacja interfejsów interakcji białko-białko

  1. Skonfiguruj metodę gradientu i spektrometrii mas w oprogramowaniu sterującym. Zastosuj 10-minutowy gradient liniowy od 90% rozpuszczalnika A/10% rozpuszczalnika B do 45% rozpuszczalnika A/55% rozpuszczalnika B. Załaduj metodę spektrometrii mas, która jest zoptymalizowana do wykrywania mas w zakresie 300-1,500 m/z, chociaż większość peptydów będzie poniżej 1,000 m/z. Ustaw zawór wtryskowy w pozycji LOAD, zawór 6-drogowy w pozycji LOADING/DESALTING. Ustawić natężenie przepływu pompy podawczej na 0.4 ml/min.
    Uwaga: Długość i typ gradientu są zależne od próbki i mogą wymagać optymalizacji. Dłuższe gradienty poprawiają rozdzielczość chromatografii, ale zmniejszają wprowadzanie deuteronów do białek w wyniku wymiany zwrotnej. Wybrane metody muszą być takie same, aby wszystkie eksperymenty mogły być porównywane.
  2. Dla niewymiennego odniesienia przygotować 20-100 pmol Hsp90 w 100 μl buforu H2O. Dodać 100 μl lodowatego buforu do gaszenia, dwukrotnie pipetować w górę i w dół i wstrzyknąć próbkę do zaworu iniekcyjnego HPLC. Natychmiast uruchom program chromatograficzny i przełącz zawór wtryskowy w pozycję INJECT. Po 2 minutach przełącz zawór 6-drogowy z pozycji DESALT/LOADING do pozycji ELUTE. Zrób to dla Hsp90 i Sti1 indywidualnie oraz dla mieszanki białek.
  3. Przygotować 20-100 pmol Hsp90 w objętości 1-5 μl. Dodać bufor D2O o dostosowanej temperaturze, aby zwiększyć objętość próbki do 100 μl i inkubować dokładnie przez określony czas (np. 30 sekund; dynamika konformacji patrz uwaga). Dodać 100 μl lodowatego buforu do gaszenia, dwukrotnie pipetować w górę i w dół i szybko wstrzyknąć 200 μl do zaworu iniekcyjnego HPLC. Natychmiast uruchom program chromatograficzny i przełącz zawór wtryskowy w pozycję INJECT. Po 2 minutach przełącz zawór 6-drogowy z pozycji DESALT/LOADING do pozycji ELUTE. Zrób to dla każdego białka indywidualnie, aby określić inkorporację deuteronu z każdym peptydem pod nieobecność białka oddziałującego.
    Uwaga: Badając dynamikę zmian konformacyjnych, powtórz eksperyment z różnymi czasami inkubacji Hsp90 w buforze D2O. Staraj się objąć szeroką skalę czasową, wybierając czasy inkubacji logarytmicznie (np. 10 sekund, 30 sekund, 100 sekund, 300 sekund, 1,000 sekund itp.). D2O, bufor i bufor próbki muszą być dokładnie identyczne, z wyjątkiem izotopu wodoru.
  4. Przygotować równą ilość 100% próbki kontrolnej (20-100 pmol) i dodać buforD2O, aby zwiększyć objętość próbki do 100 μl. Dodać 100 μl lodowatego buforu do gaszenia, dwukrotnie pipetować w górę i w dół i szybko wstrzyknąć 200 μl do zaworu iniekcyjnego HPLC. Natychmiast uruchom program chromatograficzny i przełącz zawór wtryskowy w pozycję INJECT. Po 2 minutach przełącz zawór 6-drogowy z pozycji DESALT/LOADING do pozycji ELUTE.
  5. Aby określić powierzchnię oddziaływania, zmieszaj Hsp90 z co najmniej 2-krotnym nadmiarem Sti1, aby przesunąć równowagę do stanu związanego (patrz uwaga) i inkubować w żądanej temperaturze, aż tworzenie kompleksu osiągnie równowagę. Dodać bufor D2Oo o dostosowanej temperaturze, aby zwiększyć objętość próbki do 100 μl i inkubować dokładnie przez określony czas (np. 30 sekund). Dodać 100 μl lodowatego buforu do gaszenia, dwukrotnie pipetować w górę i w dół i szybko wstrzyknąć do zaworu iniekcyjnego HPLC. Po 2 minutach przełącz zawór 6-drogowy z pozycji DESALT/LOADING do pozycji ELUTE. Powtórz ten eksperyment z 20-100 pmol Sti1 i nadmiarem Hsp90.
    Uwaga: Stężenia bezwzględne zależą od stałej równowagi dysocjacji oddziaływania. Idealnie, po rozcieńczeniu doD2O, stężenie białka dodanego w nadmiarze powinno wynosić co najmniej 10 razy więcej niżK D (co odpowiada >85% dolnego stężonego wiązania białka).
  6. Przeanalizuj uzyskane dane za pomocą odpowiedniego oprogramowania i użyj czasów przechowywania określonych w kroku 6.5, aby znaleźć każdy peptyd w analizie. Obliczyć środek ciężkości rozkładu izotopów dla białka niewymienionego (krok 7.2) i dla doświadczeń HX (krok 7.3).
    Uwaga: Chociaż wzorce izotopowe wymienianych peptydów wyglądają inaczej niż ich niewymienne odpowiedniki, zarówno wiedza o stanie naładowania peptydu, jak i wysoka dokładność masowa spektrometru masowego pozwalają na łatwe wyznaczenie środków ciężkości.
  7. Porównaj inkorporację deuteronów samego białka docelowego i z nadmiarem partnera wiążącego. Można to zrobić automatycznie za pomocą komercyjnego oprogramowania lub ręcznie za pomocą programu do obsługi arkuszy kalkulacyjnych. 100% wartości próbki kontrolnej oznaczają maksymalną wymianę dla każdego peptydu i mogą być wykorzystane do określenia ilości znacznika D2O utraconego podczas eksperymentu w wyniku wymiany zwrotnej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Hsp90 jest chaperoną molekularną u drożdży i członkiem rodziny chaperonów Hsp90. Poprzez przejście przez złożony cykl ATPase wspomaga późne etapy fałdowania wielu białek klienckich. Efektywne fałdowanie wymaga przekazania klientów z Hsp70 oraz interakcji z koperonem Sti1/Hop. Sti1 wiąże się bezpośrednio z Hsp90 i ułatwia wiązanie klientów poprzez hamowanie aktywności ATPase Hsp90. Interakcja Hsp90 ze Sti1 została niedawno zbadana przy użyciu HX-MS23. Przedstawiamy tutaj reprezentatywne wyniki eksperymentów prz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Wiązanie partnera interakcji z białkiem nieuchronnie powoduje zmiany w dostępności rozpuszczalnika w miejscu wiązania. Ponadto wiele białek ulega dynamicznym zmianom konformacyjnym po związaniu, które wpływają na inne regiony niż rzeczywisty interfejs wiązania. HX-MS jest solidną metodą monitorowania tych zmian i jest nawet w stanie ujawnić zmiany konformacyjne w białkach w skalach czasowych, których inne metody nie są w stanie pokryć.

Aby pomyślnie przeprowadzić HX-MS, kluczowe są trzy punkty...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie mamy nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy M. Boysenowi za komentarze do manuskryptu. Projekt ten został sfinansowany przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB638 i MA 1278/4-1 do M.P.M. oraz Cluster of Excellence: CellNetworks EXC 81/1). M.P.M. jest badaczem Klastra Doskonałości: Sieci Komórkowe.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
maXis QTOFBruker
nanoAcquity UPLCWaters Corp.
Shimadzu 10AD-VPShimadzu
EPC6W z siłownikiem mikroelektrycznymValco#EPC6W
Zawór wtryskowy (ręczny)Rheodyne#7725
Poros AL20 mediaApplied Biosystems#1-6029-06
Poros R2Applied Biosystems#1-1118-02
PepsynaSigma#P6887użyj świeżej pepsyny
Microbore (1 mm)IDEX#C-128
Microbore (2 mm)IDEX#C-130B
Acquity UPLC BEH C8 ColumnWaters Corp.#186002876
TermomikserEppendorf#5355000.011
Rurki (różne średnice)IDEX
ZłączkiIDEX#PK-110 z PK-100
Zawór 6-drogowy

Bibliografia

  1. Saibil, H. R. Conformational changes studied by cryo-electron microscopy. Nat. Struct. Biol. 7 (9), 711-714 (2000).
  2. Mittermaier, A., Kay, L. E. New tools provide new insights in NMR studies of protein dynamics. Science. 312 (5771), 224-228 (2006).
  3. Hoofnagle, A. N., Resing, K. A., Ahn, N. G. Protein analysis by hydrogen exchange mass spectrometry. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 32, 1-25 (2003).
  4. Wales, T. E., Engen, J. R. Hydrogen exchange mass spectrometry for the analysis of protein dynamics. Mass. Spectrom. Rev. 25 (1), 158-170 (2006).
  5. Konermann, L., Pan, J., Liu, Y. -H. Hydrogen exchange mass spectrometry for studying protein structure and dynamics. Chem Soc. Rev. 40 (3), 1224-1210 (2011).
  6. Bai, Y., Milne, J. S., Mayne, L., Englander, S. W. Primary structure effects on peptide group hydrogen exchange. Proteins. 17 (1), 75-86 (1993).
  7. Rist, W., Jørgensen, T. J. D., Roepstorff, P., Bukau, B., Mayer, M. P. Mapping temperature-induced conformational changes in the Escherichia coli heat shock transcription factor sigma 32 by amide hydrogen exchange. The Journal of biological chemistry. 278 (51), 51415-51421 (1074).
  8. Englander, J. J., Rogero, J. R., Englander, S. W. Protein hydrogen exchange studied by the fragment separation method. Anal Biochem. 147 (1), 234-244 (1985).
  9. Zhang, Z., Smith, D. L. Determination of amide hydrogen exchange by mass spectrometry: a new tool for protein structure elucidation. Protein Sci. 2 (4), 522-531 (1993).
  10. Cravello, L., Lascoux, D., Forest, E. Use of different proteases working in acidic conditions to improve sequence coverage and resolution in hydrogen/deuterium exchange of large proteins. Rapid Commun. Mass Spectrom. : RCM. 17 (21), 2387-2393 (2003).
  11. Rand, K. D., Zehl, M., Jensen, O. N., Jørgensen, T. J. D. Protein hydrogen exchange measured at single-residue resolution by electron transfer dissociation mass spectrometry. Anal chem. 81 (14), 5577-5584 (2009).
  12. Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Electron capture dissociation of electrosprayed protein ions for spatially resolved hydrogen exchange measurements. J. Am. Chem. Soc. 130 (35), 11574-11575 (2008).
  13. Yamada, N., Suzuki, E. -I., Hirayama, K. Identification of the interface of a large protein-protein complex using H/D exchange and Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 16 (4), 293-299 (2002).
  14. Lee, T., Hoofnagle, A. N., et al. Docking motif interactions in MAP kinases revealed by hydrogen exchange mass spectrometry. Mol. Cell. 14 (1), 43-55 (2004).
  15. Hasan, A., Smith, D. L., Smith, J. B. Alpha-crystallin regions affected by adenosine 5'-triphosphate identified by hydrogen-deuterium exchange. Biochem. 41 (52), 15876-15882 (2002).
  16. Lanman, J., Lam, T. T., Emmett, M. R., Marshall, A. G., Sakalian, M., Prevelige, P. E. Key interactions in HIV-1 maturation identified by hydrogen-deuterium exchange. Nat. Struct. Mol. Biol. 11 (7), 676-677 (2004).
  17. Wang, L., Lane, L. C., Smith, D. L. Detecting structural changes in viral capsids by hydrogen exchange and mass spectrometry. Protein Sci. 10 (6), 1234-1243 (2001).
  18. Pan, H., Raza, A. S., Smith, D. L. Equilibrium and kinetic folding of rabbit muscle triosephosphate isomerase by hydrogen exchange mass spectrometry. J. Mol. Biol. 336 (5), 1251-1263 (2004).
  19. Mazon, H., Marcillat, O., Forest, E., Smith, D. L., Vial, C. Conformational dynamics of the GdmHCl-induced molten globule state of creatine kinase monitored by hydrogen exchange and mass spectrometry. Biochem. 43 (17), 5045-5054 (2004).
  20. Lanman, J., Lam, T. T., et al. Identification of novel interactions in HIV-1 capsid protein assembly by high-resolution mass spectrometry. J. Mol. Biol. 325 (4), 759-772 (2003).
  21. Rist, W., Graf, C., Bukau, B., Mayer, M. P. Amide hydrogen exchange reveals conformational changes in hsp70 chaperones important for allosteric regulation. J. Biol. chem. 281 (24), 16493-16501 (2006).
  22. Graf, C., Stankiewicz, M., Kramer, G., Mayer, M. P. Spatially and kinetically resolved changes in the conformational dynamics of the Hsp90 chaperone machine. EMBO J. 28 (5), 602-613 (2009).
  23. Lee, C. -T., Graf, C., Mayer, F. J., Richter, S. M., Mayer, M. P. Dynamics of the regulation of Hsp90 by the co-chaperone Sti1. EMBO J. 31 (6), 1518-1528 (2012).
  24. Lou, X., Kirchner, M., et al. Deuteration distribution estimation with improved sequence coverage for HX/MS experiments. Bioinformatics. 26 (12), 1535-1541 (2010).
  25. Kreshuk, A., Stankiewicz, M., Lou, X., Kirchner, M., Hamprecht, F. A., Mayer, M. P. Automated detection and analysis of bimodal isotope peak distributions in H/D exchange mass spectrometry using HeXicon. Intl. J. mass spectrom. 302 (1-3), 125-131 (2011).
  26. Walters, B. T., Ricciuti, A., Mayne, L., Englander, S. W. Minimizing back exchange in the hydrogen exchange-mass spectrometry experiment. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 23 (12), 2132-2139 (2012).
  27. Weis, D. D., Wales, T. E., Engen, J. R., Hotchko, M., Ten Eyck, L. F. Identification and characterization of EX1 kinetics in H/D exchange mass spectrometry by peak width analysis. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 17 (11), 1498-1509 (2006).
  28. Fang, J., Rand, K. D., Beuning, P. J., Engen, J. R. False EX1 signatures caused by sample carryover during HX MS analyses. Intl. J. Mass Spectrom. 302 (1-3), 19-25 (2011).
  29. Deng, Y., Smith, D. L. Identification of unfolding domains in large proteins by their unfolding rates. Biochem. 37 (18), 6256-6262 (1998).
  30. Wales, T. E., Engen, J. R. Partial unfolding of diverse SH3 domains on a wide timescale. J. Mol. Biol. 357 (5), 1592-1604 (2006).
  31. Pan, Y., Piyadasa, H., O'Neil, J. D., Konermann, L. Conformational dynamics of a membrane transport protein probed by h/d exchange and covalent labeling: the glycerol facilitator. J. Mol. Biol. 416 (3), 400-413 (2012).
  32. Hebling, C. M., Morgan, C. R., Stafford, D. W., Jorgenson, J. W., Rand, K. D., Engen, J. R. Conformational analysis of membrane proteins in phospholipid bilayer nanodiscs by hydrogen exchange mass spectrometry. Anal chem. 82 (13), 5415-5419 (2010).
  33. Abzalimov, R. R., Kaplan, D. A., Easterling, M. L., Kaltashov, I. A. Protein conformations can be probed in top-down HDX MS experiments utilizing electron transfer dissociation of protein ions without hydrogen scrambling. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 20 (8), 1514-1517 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Analiza dynamiki białekoddziaływania białko-białkomapowanie peptydówwbudowywanie deuteruchromatografia cieczowaidentyfikacja miejsca wiązaniazmiany konformacyjnefałdowanie białek
Analiza dynamiki białek za pomocą spektrometrii mas wymiany wodorowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.