Wykorzystanie Caenorhabditis elegans jako systemu modelowego do badania homeostazy białek w organizmie wielokomórkowym

Podsumowanie

Aby zbadać związek między homeostazą białek, stresem i starzeniem się, monitorowaliśmy zmiany w fałdowaniu białek, śledząc dysfunkcję białek, lokalizację białek w komórce i stabilność białek na poziomie organizmu, komórkowym i białkowym, używając genetycznie wykonalnego metazoanu Caenorhabditis elegans jako systemu modelowego.

Streszczenie

Składanie i składanie białek jest niezbędne dla funkcjonowania białek, długoterminowego zdrowia komórki i długowieczności organizmu. Historycznie rzecz biorąc, funkcję i regulację fałdowania białek badano in vitro, w izolowanych komórkach hodowli tkankowej oraz w organizmach jednokomórkowych. Ostatnie badania ujawniły powiązania między homeostazą białek (proteostazą), metabolizmem, rozwojem, starzeniem się i wykrywaniem temperatury. Odkrycia te doprowadziły do opracowania nowych narzędzi do monitorowania fałdowania białek w modelowym organizmie metazoańskim Caenorhabditis elegans. W naszym laboratorium łączymy testy behawioralne, obrazowanie i podejścia biochemiczne, wykorzystując wrażliwe na temperaturę lub naturalnie występujące białka metastabilne jako czujniki środowiska fałdowania w celu monitorowania nieprawidłowego fałdowania białek. Testy behawioralne, które są związane z nieprawidłowym fałdowaniem określonego białka, zapewniają prosty i potężny odczyt fałdowania białek, umożliwiając szybkie badanie przesiewowe genów i warunków, które modulują fałdowanie. Podobnie, takie nieprawidłowe fałdowanie może być związane z nieprawidłową lokalizacją białka w komórce. Monitorowanie lokalizacji białek może zatem uwidocznić zmiany w zdolności fałdowania komórek zachodzące w różnych tkankach, na różnych etapach rozwoju i w obliczu zmieniających się warunków. Wreszcie, korzystając z narzędzi biochemicznych ex vivo, możemy bezpośrednio monitorować stabilność i konformację białek. W ten sposób, łącząc testy behawioralne, obrazowanie i techniki biochemiczne, jesteśmy w stanie monitorować nieprawidłowe fałdowanie białek z rozdzielczością odpowiednio organizmu, komórki i białka.

Wprowadzenie

Wzajemne oddziaływanie różnych etapów biosyntezy białek, takich jak transkrypcja, przetwarzanie i translacja mRNA, a także fałdowanie, translokacja i składanie/demontaż białek, determinuje obciążenie metastabilnych białek, które zależą od maszynerii kontroli jakości białek komórkowych dla ich funkcji¹. Brak lub nieprawidłowe działanie mechanizmów kontroli jakości białek może zatem skutkować pogorszeniem funkcjonalności różnych typów maszynerii komórkowej i wystąpieniem chorób związanych z nieprawidłowym fałdowaniem białek^2-7. Gdy zdolność maszynerii do fałdowania i usuwania białek jest zrównoważona z obciążeniem metastabilnych białek, osiąga się homeostazę białek (proteostazę), stan, który ostatecznie zapobiega akumulacji nieprawidłowo sfałdowanych białek i agregacji w komórkach⁶. Uważa się, że akumulacja nieprawidłowo sfałdowanych białek jest sygnałem, który aktywuje czynniki transkrypcyjne indukowane stresem, takie jak czynnik szoku cieplnego (HSF-1), i powoduje aktywację cytoprotekcyjnych odpowiedzi na stres^6,8.

Nasze zrozumienie funkcji sieci proteostazy w metazoanach pochodzi głównie z badań nad rekonstytucją in vitro oraz z obserwacji przeprowadzonych na komórkach hodowli tkankowej i organizmach jednokomórkowych⁹. Na przykład badania nad molekularnymi białkami opiekuńczymi, które zapobiegają uszkodzeniom białek i je rozwiązują, koncentrowały się na badaniach biochemicznych i biologicznych komórek nad mechanizmami fałdowania, dezagregacji i translokacji białek za pośrednictwem białek opiekuńczych^10-13. Dla porównania, dostępne są tylko ograniczone informacje na temat zintegrowanej funkcji różnych składników proteostazy w różnych komórkach i tkankach metazoanów w "normalnych" warunkach wzrostu i w odpowiedzi na stres¹¹. Odkrycie, że u C. elegans kontrola jakości białek komórkowych może być również regulowana w komórce nieautonomicznie, co znalazło odzwierciedlenie w eksperymentach pokazujących, że mutacje w dwóch neuronach, które postrzegają temperaturę, mogą blokować aktywację reakcji na szok cieplny i zmniejszać tolerancję termiczną, wykazało potrzebę zbadania regulacji proteostazy w organizmach wielokomórkowych1^4-17. Brakuje jednak spójnego obrazu tego, w jaki sposób sieci proteostazy, takie jak różne rodziny molekularnych białek opiekuńczych, funkcjonują w tkankach nienaruszonego metazoanu i jak dynamiczne są te sieci podczas rozwoju i starzenia się. Aby osiągnąć ten cel, potrzebne są niezawodne czujniki do monitorowania utrzymania proteomu u żywych zwierząt, aby określić zdolność proteostatyczną różnych komórek w organizmie wielokomórkowym w trakcie rozwoju i starzenia się.

Aby dane białko mogło funkcjonować jako czujnik proteostazy komórkowej, musi reagować na zmiany w środowisku fałdowania komórek, tylko minimalnie ingerując w fałdowanie niepowiązanych białek w komórce. Aby zbadać utrzymanie i regenerację proteostazy komórkowej w żywym organizmie, można zastosować dwa uzupełniające się podejścia, które zależą od składanych czujników. Pierwszy z nich opiera się na zaprojektowanych czujnikach składania, opartych na eksperymentalnie zidentyfikowanych metastabilnych białkach, o których wiadomo, że zależą od maszynerii proteostazy, takich jak lucyferazy świetlika^18-20 lub GFP oznaczone degronem^21-24. W drugim podejściu endogenne białka metastabilne, takie jak białka wrażliwe na temperaturę (ts) lub zależne od wieku białka agregujące, które reagują na przyrostowe zmiany w środowisku komórkowym, są śledzone^25-27. Zaprojektowane czujniki składane nie pełnią żadnej istotnej funkcji biologicznej, a mimo to mają tę zaletę, że są wykrywalne za pomocą potężnych testów sprawozdawczych, takich jak białka znakowane GFP, i mogą być stosowane w wielu różnych modelach komórkowych i zwierzęcych¹⁸. Ponieważ jednak wprowadzenie pojedynczego obcego białka może wpływać na środowisko fałdowania²⁷, takie polipeptydy mogą przeciążać maszynerię proteostazy komórkowej. Alternatywnie, zaprojektowane czujniki składania, które nie są natywne dla komórki, na którą składają raport, mogą nie być dotknięte zmianami w zdolności komórki do proteostazy. Na przykład, jeden substrat reporterowy proteasomu znakowany GFP wymagał zahamowania ~90% proteasomu przed wykryciem fenotypu²³. W przeciwieństwie do tego, endogenne białka metastabilne, które opierają się na maszynerii proteostazy komórki, mają tę zaletę, że mieszczą się w zakresie wrażliwości komórkowej. Jednak utrata funkcji związana z nieprawidłowym fałdowaniem takich białek może również wpływać na funkcjonowanie komórek i żywotność organizmu. W tym miejscu skupimy się na zastosowaniu endogennych czujników składania C. elegans.

C. elegans to dobrze znany model metazoanowy do badania zarówno rozwoju, jak i starzenia się, który wykorzystuje wiele zachowanych szlaków biologicznych i może być używany do śledzenia fałdowania białek w komórce, przy użyciu kombinacji podejścia biochemicznego i genetycznego. Wykorzystaliśmy białka metastabilne jako sondy zdolności proteostatycznej, monitorując zmiany w ich fenotypie, lokalizacji i stabilności. Co więcej, różne funkcje białek można badać za pomocą prostej analizy behawioralnej. Podobnie, znaczna błędna lokalizacja białek występuje, gdy sieci kontroli jakości białek komórkowych nie dostosowują się do wymagań komórkowych. Białka można łatwo uwidocznić w komórkach żywych zwierząt za pomocą białek znakowanych fluorescencyjnie lub poprzez barwienie immunologiczne. Wreszcie, przy użyciu metod ex vivo, możliwe jest monitorowanie ekspresji i stabilności białek. Pozwala to na szybkie i proste badania przesiewowe zmian behawioralnych i fizjologicznych, w połączeniu z dogłębną analizą lokalizacji i stabilności białek, co pozwala na monitorowanie modyfikatorów proteostazy. Łącząc te różne metody, można uzyskać szeroki obraz środowiska fałdowania białek w komórce. Rzeczywiście, strategia ta została z powodzeniem wykorzystana do monitorowania zaburzeń proteostazy u C. elegans, drożdży, kultur tkankowych i bakterii^15,25-35.

Protokół

Używanie testów behawioralnych do monitorowania fałdowania białek w żywym organizmie

1. Synchronizacja zwierząt do testów behawioralnych

1. Należy postępować zgodnie ze standardowymi metodami utrzymania C. elegans³⁶, w tym przygotowywaniem pożywek i płytek, przygotowywaniem żywności i warunkami wzrostu zwierząt. Dokładnie kontroluj warunki uprawy, w tym temperaturę (15-25 °C), wielkość populacji i dostępność żywności. Wyrzuć każdą płytkę, która wykazuje zanieczyszczenie bakteryjne lub grzybicze.
2. Weź 15-30 zarodków, przenieś je na nowe płytki i hoduj w żądanej temperaturze (15-25 °C) przez czas trwania eksperymentu. Alternatywnie, połóż 10-20 ciężarnych dorosłych na talerzu, pozwól im składać jaja przez 30-60 minut, a następnie wyjmij je z talerza. Zarówno bezpośrednie pobieranie zarodków, jak i ustawianie ciężaru dorosłych osobników spowoduje pewną zmienność wieku (±6 godz.). Aby zmniejszyć tę zmienność, wybierz zarodki na określonym etapie, na przykład w fazie przecinka, lub ustaw 10-20 dorosłych osobników, którzy dopiero zaczynają składać jaja (2 dzień dorosłości). Unikaj synchronizacji przez wybielanie, jeśli to możliwe, biorąc pod uwagę, że zabieg ten jest stresujący i może wpływać na proteostazę.
3. Wybierz zsynchronizowane zwierzęta, przenieś je na płytkę testową w celu oceny, a następnie odrzuć.

2. Test ruchu

Wybierz zsynchronizowane zwierzęta i przenieś je na czystą płytę w pożądanej temperaturze do oceny ruchu (15-25 °C). Dla każdej kontrpróby biologicznej należy ocenić >20 zwierząt i powtórzyć test co najmniej 3 razy na warunek doświadczalny. Użyj testu sumy rang Wilcoxona Manna-Whitneya, aby porównać dwa niezależne warunki eksperymentalne.

1. Aby sprawdzić, czy nie ma łagodnych zaburzeń ruchowych, ustaw 5-7 zwierząt razem na środku czystego trawnika bakteryjnego i pozwól zwierzętom poruszać się po talerzu przez 2 minuty. Ten przedział czasu został określony na podstawie czasu, w którym 90% zwierząt typu dzikiego pokonało 1-centymetrowy okrąg.
2. Policz liczbę zwierząt, które nie opuściły okręgu o szerokości 1 cm (np. które pozostały w promieniu 1 cm od punktu, w którym zostały ustawione) w ciągu 2 minut jako nieskoordynowane.
3. Aby stwierdzić poważne upośledzenie ruchowe, umieść zwierzęta na czystym trawniku bakteryjnym.
4. Sfotografuj kilka zwierząt w czasie zero (t=0) i ponownie 5 minut później (t=5). Oceniaj zwierzęta, które nie poruszyły się o jedną długość ciała po 5 minutach, jako sparaliżowane.

3. Odporność termiczna

1. Wybrać >20 zsynchronizowanych zwierząt i przenieść je na 24-dołkową płytkę zawierającą 450 μl buforu szoku cieplnego (HS) (Tabela 1). Dla każdej kontrpróby biologicznej należy ocenić wynik >20 zwierząt i powtórzyć test co najmniej 4 razy na każdy warunek doświadczalny.
2. Przenieść płytkę 24-dołkową do podgrzewanej kąpieli. Temperatura i czas trwania HS silnie zależą od warunków wzrostu, w szczególności od temperatury uprawy.
3. Uzupełnić bufor HS 9 μl oranżerii SYTOX.
4. Oceń przeżywalność zwierząt, monitorując wychwyt barwnika za pomocą stereoskopu fluorescencyjnego z filtrem TXR. Zwierzęta, które przyjęły barwnik, nie żyją. Użyj testu sumy rang Wilcoxona Manna-Whitneya, aby porównać dwa niezależne warunki eksperymentalne.

Używanie barwienia immunologicznego i oznaczonych białek do monitorowania fałdowania białek w określonych komórkach

4. Monitorowanie lokalizacji białek za pomocą barwienia immunologicznego

1. Na wymaganym etapie przenieść co najmniej 30 zwierząt do probówki Eppendorfa zawierającej bufor^{M9 36}.
2. Umyj zwierzęta kilka razy buforem M9, wykonując krótki etap wirowania przy niskiej prędkości (3 000 obr./min/900 x g, 2 min) i ponownie zawiesić.
3. Umieść rurki na lodzie na kilka minut, aby ostygły.
4. Usunąć nadmiar płynu i inkubować z 500 μl lodowatego 4% roztworu paraformaldehydu (Tabela 2). Czas inkubacji musi być skalibrowany dla każdego badanego białka i powinien wynosić około 5-30 minut w temperaturze pokojowej. Można również przeprowadzić przedłużoną inkubację w temperaturze 4 °C, ale może to pogorszyć przepuszczalność próbki.
5. Utrwalone zwierzęta umyć 3x buforem PBS-Tween (pH 7,2) przez odwirowanie (3 000 obr./min, 1-2 min). Na tym etapie zwierzęta mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni.
6. Zbierz zwierzęta przez odwirowanie (3 000 obr./min, 1-2 min).
7. Z okapu usunąć większość supernatantu i ponownie zawiesić osad w 1 ml roztworu β-merkaptoetanolu (β-ME) (Tabela 2).
8. Inkubować w temperaturze 37 °C przez noc, delikatnie kołysząc na nutatorze.
9. W kapturze umyj zwierzęta 3x buforem PBS-Tween (pH 7,2).
10. Zawiesić zwierzęta w 50-100 μl PBS-Tween (pH 7,2). Na tym etapie zwierzęta mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni.
11. Zbierz zwierzęta przez odwirowanie (3 000 obr./min, 1-2 min) i usuń większość buforu PBS-Tween.
12. Dodać 100-150 μl roztworu kolagenazy do każdej probówki i inkubować w temperaturze 37 °C z silnym mieszaniem (przy użyciu mieszalnika termicznego lub inkubatora z wytrząsaniem).
13. Badaj zwierzęta często pod mikroskopem stereoskopowym, rozpoczynając po 5 minutach inkubacji. Gdy 20% zwierząt zostanie złamanych, przerwij reakcję, umieszczając rurkę na lodzie. Ten krok jest bardzo wrażliwy! Czas trwania leczenia zależy od warunków utrwalenia i może się znacznie różnić w zależności od szczepu. Długotrwała inkubacja może spowodować całkowitą degradację zwierząt. Warunki muszą być skalibrowane dla każdej użytej partii enzymu, a degradacja powinna być dokładnie monitorowana.
14. Umyj zwierzęta dwukrotnie w PBS-Tween (pH 7,2), a następnie zbierz zwierzęta przez odwirowanie (3 000 obr./min, 1-2 min) i usuń większość buforu PBS-Tween.
15. Dodać 1 ml roztworu AbA (Tabela 2) i inkubować z delikatnym kołysaniem przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Na tym etapie zwierzęta mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni.
16. Zebrać zwierzęta przez odwirowanie (3 000 obr./min, 1-2 min) i ponownie zawiesić w 200 μl AbA.
17. Dodać przeciwciało pierwszorzędowe rozcieńczone w stosunku 1:100-1:1,000 w roztworze AbA i inkubować, delikatnie kołysząc. Temperatura i czas trwania inkubacji mogą się różnić w zależności od przeciwciał i powinny być kalibrowane dla każdego badanego białka. Zaczynamy od całonocnej inkubacji w temperaturze pokojowej.
18. Umyj zwierzęta przez odwirowanie (3 000 obr./min, 1-2 min).
19. Dodać bufor AbA (1 ml) i inkubować z delikatnym mieszaniem przez 15-60 minut w temperaturze pokojowej. Na tym etapie zwierzęta mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni.
20. Opcjonalnie: Próbka może być również barwiona barwnikami fluorescencyjnymi. W tym celu należy dodać barwnik (np. DAPI (2 mg/ml) lub falloidynę (1:100)) do 200 μl AbA i inkubować z delikatnym kołysaniem przez maksymalnie 1 godzinę. Ten krok można wykonać podczas jednego z etapów płukania przeciwciała wtórnego.
21. Umyj zwierzęta 3x, powtarzając kroki 4.18-4.19.
22. Dodać 100 μl AbA z odpowiednim fluorescencyjnie znakowanym przeciwciałem drugorzędowym, rozcieńczonym w stosunku 1:100.
23. Próbki należy przechowywać pod przykryciem (lub w ciemnej probówce) i inkubować z kołysaniem przez kilka godzin w temperaturze pokojowej.
24. Umyć zwierzęta 3x przez inkubację w buforze AbA (1 ml) z delikatnym mieszaniem przez 15-60 minut w temperaturze pokojowej, a następnie odwirować (3 000 obr./min, 1-2 min). Na tym etapie zwierzęta mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni.
25. Aby zamontować zwierzęta na szkiełkach, należy usunąć cały płyn i ponownie zawiesić w 10 μl tego samego buforu.
26. Odetnij koniec końcówki pipety, aby uniknąć przecierania się zwierząt, i przenieś 1-2 μl próbki na szkiełko
podstawowe.
27. Dodaj medium montażowe w proporcji 1:1.
28. Delikatnie przykryj szkiełko szkiełkiem nakrywkowym i uszczelnij lakierem do paznokci. Jeśli szkiełko nie jest natychmiast monitorowane, można je przechowywać w temperaturze -20 °C przez dłuższy czas.

5. Monitoruj lokalizację oznaczonych białek

1. Na wymaganym etapie zebrać co najmniej 15 zwierząt do 10 ml kropli buforu M9 na szkiełku.
2. Za pomocą "wykałacza do robaków" przenieś zwierzęta do 10 ml kropli roztworu paraformaldehydu (4%) (Tabela 2) i poczekaj, aż wszystkie zwierzęta przestaną się poruszać (około 5 minut).
3. Za pomocą "wytrycha do robaków" przenieś zwierzęta do 2 ml kropli buforu M9 i podłoża montażowego (1:1) (Tabela 2).
4. Delikatnie przykryj zwierzęta szkiełkiem nakrywkowym i uszczelnij lakierem do paznokci.

Używanie testów ex vivo do monitorowania fałdowania i stabilności białek

6. Częściowe trawienie

1. Umyj zwierzęta z 15 płytek (60 mm) za pomocą 1-2 ml buforu M9 w probówce do mikrofuge. Należy pamiętać, że zwierzęta nie powinny być stłoczone, a wystarczająca ilość pożywienia powinna być dostępna przez cały czas trwania eksperymentu.
2. Umyj zwierzęta kilka razy buforem M9 poprzez odwirowanie (3 000 obr./min, 2 min) i ponowne zawieszenie zwierząt.
3. Po ostatnim wirowaniu ponownie zawieś zwierzęta w buforze M9 o pojemności 100 μl.
4. Błyskawiczne zamrażanie w cieczy N₂. Próbki mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C.
5. Za pomocą schłodzonego tłuczka i zmotoryzowanego wiertła (można również użyć ręcznej wiertarki do hodowli tkankowych), zmielić próbkę. Trzymaj próbkę na lodzie i unikaj przegrzania.
6. Często badaj zwierzęta pod mikroskopem stereoskopowym, aby określić, czy mielenie zostało zakończone. Jeśli pozostaną nienaruszone zwierzęta, powtórz procedurę.
7. Oszacuj objętość, pipetując ekstrakt z robaków.
8. Dodać w stosunku 1:1 (2x) roztworu do lizy robaków (Tabela 3). Nie należy stosować żadnych inhibitorów proteazy.
9. Inkubować na lodzie przez 15 minut.
10. Usunąć zanieczyszczenia przez odwirowanie (1 000 x g przez 2 min) we wstępnie schłodzonej wirówce (4 °C).
11. Przenieść supernatant do czystej probówki do mikrofuge. Próbki mogą być używane bezpośrednio lub przechowywane w temperaturze -80 °C.
12. Przygotować roztwór chymotrypsyny (Tabela 3) i przechowywać na lodzie do momentu użycia.
13. Określ całkowite stężenie białka za pomocą testu Bradforda.
14. W razie potrzeby rozcieńczyć próbkę tak, aby całkowite stężenie białka wynosiło 3-3,5 mg/ml.
15. Dodać roztwór chymotrypsyny do całkowitego lizatu białkowego (1:1,200).
16. Aby określić czas inkubacji, inkubować próbkę z chymotrypsyną przez 60 minut. Usunąć 20 μl podwielokrotności z próbki w różnych punktach czasowych (np. 0, 5, 20, 40 i 60 min), natychmiast wymieszać z buforem próbki SDS i gotować przez 5 minut w temperaturze 96 °C. *Alternatywnie, inkubować próbkę z różnymi stężeniami chymotrypsyny i zatrzymać reakcję po określonym czasie, dodając bufor próbki SDS i gotując przez 5 minut w temperaturze 96 °C.
17. Uruchom próbki na żelu SDS-PAGE.
18. Przeprowadzić analizę western blot przy użyciu odpowiednich przeciwciał w celu określenia względnej stabilności białka.
19. Określ optymalne warunki (stężenie chymotrypsyny i czas trawienia), które wykazują znaczące zmiany między próbkami i wykorzystaj te warunki do przyszłych eksperymentów.
20. Określ intensywność różnych produktów trawienia (fragmenty o niższej masie cząsteczkowej) za pomocą oprogramowania do densytometrii, takiego jak moduł żelu do obrazowania NIH.

Wyniki

Naruszone środowisko składania może prowadzić do nieprawidłowego fałdowania i agregacji białek. Nieprawidłowe fałdowanie białek wiąże się ze zmienioną konformacją i powoduje utratę funkcji białka. Stosujemy komplementarne podejścia do monitorowania fałdowania i funkcji białek w nienaruszonych zwierzętach, określonych komórkach i ekstraktach białkowych. Inteligentny wybór czujnika fałdowania, oparty na silnych fenotypach behawioralnych i komórkowych, które są związane ze znaną mutacją destabilizującą, może być następnie w...

Dyskusja

Sondy o zdolności proteostazy komórkowej muszą być bardzo wrażliwe na zmiany w środowisku fałdowania i być łatwe do monitorowania, aby zapewnić ocenę w czasie rzeczywistym możliwości kontroli jakości fałdowania białek. Używając białek metastabilnych jako sond zdolności proteostazy, monitorowaliśmy zmiany w fenotypie, lokalizacji białek subkomórkowych i konformacji białek. Przedstawione tutaj protokoły koncentrują się na fenotypach związanych z białkami mięśniowymi, w tym ruchliwości, organizacji włókien mięśniowych i sta...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Ustalanie i fialekcja przeciwciał	paraformaldehyd	Merc
8187151000 Tween-20	Bio-Rad	1706531
Collagenase	Sigma	C5138-100MG
DABCO	Merc	8034560100
Triton X-100	Alfa	Aesar A16046
β -ME	Sigma 8057400250
BSA	Di Cam	000-40-100
Częściowe podsumowanie	Chymotrypsyna	Sigma	C4129-250MG
Odporność termiczna	SYTOX Orange	Invitrogen	S11368
Cholesterol	Amaresco	0433-250G
SPRZĘT
M165 FC fluorescencyjny stereoskop	Filtr Leica		TXR
EXi Kamera do mikroskopii fluorescencyjnej	niebieskiej QImaging	EXI-BLU-R-F-M-14-C
Mikroskop konfokalny ConfoCor 3/510 META	Tłuczki do pelletu Zeiss
	Sigma	Z359947-100EA
Akumulatorowy silnik do granulek	Kontes	K749540-0000
MicroCL 17 Seria mikrowirówek	Thermo	75002455	Chłodzenie, 230 V 50/60 Hz, zawiera 24x rotor 1,5/2,0 ml z pokrywą biologiczną ClickSeal