Artykuł metodologiczny

Testy polimeryzacji FtsZ: proste protokoły i rozważania

15.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50844

⸱

16 listopada 2013

 , 
1Department of Molecular Microbiology, Groningen Biomolecular Sciences and Biotechnology Institute, University of Groningen

W tym artykule

Podsumowanie

Polimeryzacja FtsZ jest niezbędna do podziału komórek bakteryjnych. W tym raporcie szczegółowo opisujemy proste protokoły monitorowania aktywności polimeryzacji FtsZ i omawiamy wpływ składu buforu. Protokoły mogą być wykorzystywane do badania interakcji FtsZ z białkami regulatorowymi lub lekami przeciwbakteryjnymi, które wpływają na polimeryzację FtsZ.

Streszczenie

Podczas podziału komórki bakteryjnej, niezbędne białko FtsZ gromadzi się w środku komórki, tworząc tzw. Z-ring. FtsZ polimeryzuje w długie włókna w obecności GTP in vitro, a polimeryzacja jest regulowana przez kilka białek pomocniczych. Polimeryzacja FtsZ została szeroko zbadana in vitro przy użyciu podstawowych metod, w tym rozpraszania światła, sedymentacji, testów hydrolizy GTP i mikroskopii elektronowej. Warunki buforowe wpływają zarówno na właściwości polimeryzacyjne FtsZ, jak i na zdolność FtsZ do interakcji z białkami regulatorowymi. W tym miejscu opisujemy protokoły badań polimeryzacji FtsZ oraz walidujemy warunki i kontrole przy użyciu Escherichia coli i Bacillus subtilis FtsZ jako białek modelowych. Wprowadza się test sedymentacji o niskiej prędkości, który umożliwia badanie interakcji FtsZ z białkami, które wiążą lub rurkowaczą polimery FtsZ. Opisano ulepszony protokół testu GTPazy, który umożliwia testowanie hydrolizy GTP w czasie przy użyciu różnych warunków w konfiguracji 96-dołkowej płytki, ze znormalizowanymi czasami inkubacji, które znoszą zmiany w rozwoju koloru w reakcji wykrywania fosforanów. Opisano przygotowanie próbek do badań rozpraszania światła i mikroskopii elektronowej. Stosuje się kilka w celu ustalenia odpowiedniego pH buforu i stężenia soli do badań polimeryzacji FtsZ. Wysokie stężenie KCl jest najlepsze dla większości eksperymentów. Nasze metody stanowią punkt wyjścia do charakterystyki in vitro FtsZ, nie tylko z E. coli i B. subtilis, ale z każdej innej bakterii. W związku z tym metody te mogą być wykorzystywane do badań interakcji FtsZ z białkami regulatorowymi lub do testowania leków przeciwbakteryjnych, które mogą wpływać na polimeryzację FtsZ.

Wprowadzenie

Niezbędne białko bakteryjne FtsZ jest najlepiej scharakteryzowanym białkiem w maszynerii podziału komórek bakteryjnych. FtsZ jest prokariotycznym homologiem tubuliny i polimeryzuje in vitro w sposób zależny od GTP. FtsZ jest bardzo atrakcyjnym celem dla nowych antybiotyków ze względu na swój konserwatywny charakter i unikalność w stosunku do bakterii1,2. Na początku podziału komórki FtsZ tworzy cytokinetyczny pierścień w środkowej komórce, który służy jako rusztowanie do składania innych białek podziału komórki. Formowanie pierścienia Z ma kluczowe znaczenie dla prawidłowego usytuowania płaszczyzny podziału. Dynamika składania FtsZ jest regulowana przez kilka białek pomocniczych, takich jak (w zależności od gatunku bakterii) MinC, SepF, ZapA, UgtP i EzrA2. Polimeryzacja FtsZ była intensywnie badana in vitro i opisano wiele różnych struktur, w tym proste protofilamenty, zakrzywione protofilamenty, arkusze włókien, wiązki włókien i rurki z filamentami, w zależności od buforu montażowego, nukleotydu i dodatkowych białek zawartych w teście3. Architektura protofilamentów FtsZ in vivo nie jest jeszcze w pełni poznana, chociaż eksperymenty kriotomografii elektronowej w Caulobacter crescentus sugerują, że pierścień Z składa się ze stosunkowo krótkich, nieciągłych pojedynczych protofilamentów bez rozległego wiązania4.

In vitro, właściwości polimeryzacyjne FtsZ i oddziaływanie FtsZ z białkami regulatorowymi są zależne od składu buforu reakcyjnego. Na przykład niedawno opisaliśmy miejsce interakcji dla SepF na C-końcu FtsZ i wykazaliśmy, że obcinanie C-końca FtsZBs∆16 nie wiąże się już z SepF5. W poprzednim badaniu nad oddziaływaniem SepF-FtsZBs, podobny FtsZBs∆16 nadal obcinał się z SepF, co sugerowało, że SepF wiąże się z miejscem wtórnym na FtsZ6. Różnica między tymi badaniami polegała na składzie reakcyjnych – przy pH 7,5 nie stwierdzono kosedymentacji SepF z obciątym FtsZ, natomiast przy pH 6,5 występowała kosedymentacja. Gündoğdu et al. zauważono, że SepF nie działa i wytrąca się przy pH 6,57, co pokazuje, że obserwowana koedymentacja przy pH 6,5 jest prawdopodobnie spowodowana wytrącaniem SepF, a nie interakcją z C-końcowym cięciem FtsZBs∆16. Wpływ pH i stężenia KCl na polimeryzację FtsZ był już wcześniej badany. Polimery E. coli FtsZ (FtsZEc) przy pH 6,5 są dłuższe i liczniejsze niż te powstałe przy pHobojętnym 8,9. Tadros i wsp. badali polimeryzację FtsZEc w obecności kationów jednowartościowych, zauważając, że wiązanie K+ jest związane z polimeryzacjąFtsZ Ec i ma kluczowe znaczenie dla aktywności FtsZ10. pH jest bardziej krytyczne, gdy bada się interakcję FtsZ z innymi białkami, jak pokazano w poprzednim przykładzie SepF, oraz zależność pH hamującego działania MinC na FtsZ11. Ponieważ zarówno pH, jak i stężenie soli mogą wpływać na interakcję FtsZ z innymi białkami, ważne jest, aby wybrać odpowiednie warunki i kontrole do badań polimeryzacji FtsZ.

Tutaj opisujemy protokoły do badania polimeryzacji FtsZ i aktywności GTPazy poprzez rozpraszanie światła, mikroskopię elektronową, sedymentację i testy GTPazy. Rozpraszanie światła pod kątem prostym jest standardową metodą badania polimeryzacji FtsZ w czasie rzeczywistym12. Wprowadziliśmy kilka ulepszeń w teście sedymentacji i GTPazy. Szczegółowo przedstawiamy, jak przygotować próbki do rozpraszania światła i mikroskopii elektronowej. Przetestowano kilka stosowanych w literaturze do badania polimeryzacji FtsZ i opisujemy najlepsze warunki dla każdego eksperymentu. Pokazujemy również, jakie kontrole należy wprowadzić, aby uzyskać najlepsze dane.

Te metody pozwalają na szybkie badanie polimeryzacji FtsZ, aktywności i interakcji z innymi białkami przy użyciu prostych metod i sprzętu, który jest dostępny w większości laboratoriów. Istnieją bardziej wyrafinowane metody badania polimeryzacji FtsZ, ale często wymagają dostępu do bardziej specjalistycznego sprzętu i/lub modyfikacji FtsZ za pomocą znaczników fluorescencyjnych8,13,14. Proste metody opisane w tym artykule zilustrowano przy użyciu FtsZ z B. subtilis i E. coli, najczęstszych organizmów modelowych Gram+ i Gram-. Protokoły można dostosować do dowolnego innego białka FtsZ. Na podstawie wstępnych testów z tymi nowymi FtsZ, dla uzyskania optymalnego wyniku mogą być konieczne niewielkie zmiany dotyczące czasu, bufora lub temperatury inkubacji. Opisane tutaj eksperymenty powinny pomóc w znalezieniu tych optymalnych warunków.

Protokół

Nieoznaczone białka FtsZ zostały oczyszczone zgodnie z wcześniejszym opisem11,15, poddane dializie z 20 mM Tris/ HCl (pH 7,9), 50 mM KCl, 1 mM EGTA, 2,5 mM MgAc i 10% glicerolu i przechowywane w temperaturze -80 °C. W takich warunkach białko może być przechowywane przez ponad 2 lata bez znaczącej utraty aktywności. Białko powinno być przechowywane w podwielokrotnościach o objętości 100 μl, aby uniknąć rozmrożenia i zamrożenia próbki. Po rozmrożeniu próbkę można przechowywać w temperaturze 4 °C maksymalnie przez tydzień. FtsZ jest rozpuszczalny w wysokich stężeniach i może być przechowywany w stężeniu 7-10 mg/ml. Ważne jest, aby utrzymywać wysokie stężenie białka, aby uniknąć niepożądanych skutków składników bufora magazynowego w późniejszych eksperymentach. W związku z tym stężenie magazynowe powinno pozwalać na rozcieńczenie FtsZ co najmniej 10-krotnie, aby stężenie glicerolu spadło poniżej 1% i zminimalizowało stężenie pozostałych składników buforu dializacyjnego w mieszaninie reakcyjnej. Na polimeryzację FtsZ może mieć również wpływ obecność wysokich stężeń sodu9 lub imidazolu, dlatego składniki te muszą zostać usunięte z buforu polimeryzacyjnego. SepF oczyszczono zgodnie z opisem7 i przechowywano w buforze elucyjnym w temperaturze -80 °C. Alternatywne opublikowane procedury oczyszczania FtsZ z E. coli i B. subtilis, jak również odniesienia do procedur oczyszczania FtsZ z różnych źródeł podsumowano w tabeli 1 (patrz sekcja dotycząca reprezentatywnych wyników).

1. Przygotowanie próbki

  1. Przygotować polimeryzacyjne: 1 50 mM Hepes/ NaOH, pH 7,5 cyfra arabska 25 mM RURY/ NaOH, pH 6,8 3 50 mM MES/ NaOH, pH 6,5 4 50 mM Hepes/ NaOH, pH 7,5; 50 mM KCl 5 25 mM RURY/ NaOH, pH 6,8; 50 mM KCl 6 50 mM MES/ NaOH, pH 6,5; 50 mM KCl 7 50 mM Hepes/ NaOH, pH 7,5; 300 mM KCl 8 25 mM RURY/ NaOH, pH 6,8; 300 mM KCl 9 50 mM MES/ NaOH, pH 6,5; 300 mM KCl
  2. Filtr Wysterylizuj wszystkie za pomocą filtra membranowego 22 μm.
  3. Przygotować 100 mM ROZTWORÓW PODSTAWOWYCH GTP, GDP i MgCl2 w każdym buforze polimeryzacyjnym z (1).
  4. Wstępnie oczyść białka, wirując z prędkością 100 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C dla wszystkich eksperymentów.

2. Test sedymentacji FtsZ

  1. Przygotować mieszaninę reakcyjną przez dodanie MgCl2 i FtsZ do jednego z polimeryzacyjnych (patrz punkt przygotowania próbki 1) w probówkach kompatybilnych z wirowaniem o dużej prędkości. Całkowita objętość powinna wynosić 49 μl, przy czym MgCl2 wynosi 10 mM, a FtsZ 12 μM przy 50 μl objętości końcowej.
  2. Umieścić probówkę w inkubatorze z funkcją wytrząsania, inkubować przez 2 minuty w temperaturze 30 °C przy 300 obr./min (alternatywnie próbkę można delikatnie strzepnąć i krótko zmikrofukować, a następnie wstępnie ogrzać w temperaturze 30 °C).
  3. Polimeryzację należy rozpocząć od dodania 1 μl roztworu podstawowego GTP lub GDP do tego samego buforu, który został użyty w doświadczeniu (stężenie końcowe 2 mM). Inkubować przez 10 lub 2 minuty (dla zawierających odpowiednio 50 mM KCl i 300 mM KCl) w temperaturze 30 °C przy 300 obr./min (lub w inkubatorze z funkcją wytrząsania).
  4. Przenieść probówki do wirnika ultrawirówki i wirować przez 10 minut przy 350 000 x g (89 700 obr./min dla wirnika TLA 120.1) w temperaturze 25 °C.
  5. Po odwirowaniu ostrożnie wyjmij probówki z wirnika i natychmiast przenieś supernatant do czystej probówki. Przygotować próbki do SDS-PAGE, dodając 20 μl supernatantu do 20 μl buforu 2x próbki. Gotować przez 10 minut w temperaturze 98 °C.
  6. Dodać 50 μl 2x buforu do próbki do frakcji granulek zawierających polimery FtsZ. Umieść probówkę ultrawirówki w probówce o pojemności 2 ml. Zawiesić osad przez gotowanie przez 10 minut w temperaturze 98 °C, a następnie dodać 50 μl zdemineralizowanegoH2O, aby próbka była tak samo rozcieńczona 2x jak próbka sklarowana nad osadem.
  7. Odwróć probówkę ultrawirówki do góry dnem w probówce o pojemności 2 ml i wiruj przez 5 minut w wirówce Eppendorf przy 18 000 x g. Wyjmij probówkę ultrawirówki z probówki o pojemności 2 ml.
  8. Załadować 10 μl każdego supernatantu i próbki granulki obok siebie na 10% żelu SDS-PAGE. Uruchom żel pod napięciem 150 V.
  9. Zabarwić żel środkiem Coomassie Brilliant Blue G-250 i zachować do oceny ilościowej.

3. Test sedymentacji FtsZ przy wolnym wirowaniu

  1. Przygotować roztwór polimeryzacyjny jak w kroku 2, dodać SepF i/lub FtsZ (stężenie końcowe 12 μM). Eksperymenty te można przeprowadzić w jednorazowych probówkach Beckman o pojemności 1,5 ml w połączeniu z rotorem TLA-55.
  2. Umieścić probówkę w inkubatorze z funkcją wytrząsania i inkubować przez 2 minuty w temperaturze 30 °C przy 300 obr./min.
  3. Rozpocząć polimeryzację od dodania 1 μl GTP lub GDP z roztworu podstawowego (stężenie końcowe 2 mM), inkubować przez 20 minut w temperaturze 30 °C przy 300 obr./min.
  4. Wirować przez 15 minut przy 24 600 x g (20 000 obr./min dla wirnika TLA 55) w temperaturze 25 °C.
  5. Usunąć supernatant i przenieść do czystej probówki, pobrać 20 μl i przenieść do 20 μl 2x buforu do próbek. Gotować przez 10 minut w temperaturze 98 °C.
  6. Dodać 50 μl buforu 2x próbki do frakcji osadów zawierających polimery i ponownie zawiesić przez gotowanie przez 10 minut w temperaturze 98 °C, dodać 50 μl zdemineralizowanegoH2O.
  7. Załadować 10 μl każdego supernatantu i próbki granulki obok siebie na 10% żelu SDS-PAGE. Uruchom żel pod napięciem 150 V.
  8. Zabarwić żel środkiem Coomassie Brilliant Blue G-250 i zachować do oceny ilościowej.

4. Kwantyfikacja testów sedymentacji FtsZ

  1. Zrób zdjęcie barwionego żelu Coomassie za pomocą systemu dokumentacji żelu (np. LAS-4000, Fujifilm).
  2. Otwórz obraz żelu w programie odpowiednim do analizy densytometrycznej żeli (np. program do analizy obrazu AIDA (Raytest)) i opisz analizę w tym programie poniżej.
  3. Kliknij przycisk "Ocena" na pasku narzędzi.
  4. Wybierz z listy "Densytometria 2D" i kliknij OK.
  5. W menu głównym kliknij "Ocena" i wybierz pozycję "Określenie regionu".
  6. Aby utworzyć region na żelu, kliknij symbol narzędzia Automatyczne konturowanie w przyborniku Określanie regionu.
  7. Kliknij w lewym górnym rogu opaski białkowej na żelu, przytrzymaj przycisk myszy i przeciągnij go do żądanego prawego dolnego końca opaski i zwolnij przycisk myszy.
  8. Oznacz każde pasmo FtsZ/SepF w ten sam sposób.
  9. Wszystkie informacje na temat oceny przypisanych regionów można znaleźć w Raporcie Regionów. Aby uzyskać raport regionu, kliknij przycisk "Pokaż raport regionu" w przyborniku Określanie regionu.
  10. Aby wyeksportować raport, w menu głównym kliknij Plik i wybierz pozycję "Eksportuj à raport regionu 2D".
  11. W raporcie regionu należy znaleźć intensywność każdego utworzonego regionu. Obliczyć procentową zawartość białka (FtsZ, białko regulatorowe) w osadzie, korzystając z wartości intensywności z raportu.

5. Rozpraszanie światła pod kątem 90°

  1. Włączyć spektrometr fluorescencyjny (np. AMINCO-Bowman Series 2), pozostawić lampę do rozgrzania się przez kilka minut, aby uniknąć wahań temperatury i włączyć łaźnię wodną obiegową, aby utrzymać temperaturę komory kuwety na poziomie 30 °C.
  2. Określ parametry pracy spektrometru: detektor wysokiego napięcia 300 V, długość fali emisji i wzbudzenia: 350 nm, szerokość szczeliny: 4 nm. Należy zauważyć, że wiele spektrometrów automatycznie dostosowuje sygnał na początku eksperymentu do określonego procentu (np. 60%) maksimum. Powoduje to, że sygnał rozproszony wychodzi poza zasięg, gdy tylko GTP zostanie dodany w celu polimeryzacji FtsZ. Mądrze jest najpierw ustalić odpowiednie wzmocnienie sygnału - wysokie napięcie detektora - dla maksymalnej polimeryzacji przed rozpoczęciem serii eksperymentów.
  3. Zaprogramuj protokół gromadzenia danych. Wybierz akwizycję czasową, trwającą 3 600 sek.
  4. Ostrożnie wyczyść kuwetę fluorescencyjną wodą i etanolem, w razie potrzeby poddaj sonikacji w łaźni wodnej w temperaturze pokojowej przez 5 min. W tym protokole użyto kuwet o długości ścieżki 1 cm i objętości 200 μl i przechowywano je w roztworze do przechowywania (0,5-1% Hellmanex). Alternatywnie można zastosować jednorazowe kuwety plastikowe odporne na promieniowanie UV (UVette, Eppendorf).
  5. Przygotować 294 μl mieszanki wzorcowej buforu polimeryzacyjnego (patrz punkt przygotowania próbki 1) z 10 mM MgCl2 i 12 μM FtsZ jako stężeniem końcowym obliczonym dla 300 μl i odwirować.
  6. Przenieść 196 μl buforu polimeryzacyjnego do kuwety i umieścić go w spektrometrze. Inkubować przez 2 minuty w temperaturze 30 °C.
  7. Rozpocznij akwizycję danych i odczekaj 90 sekund, aby sprawdzić, czy sygnał jest stabilny.
  8. Dodać 4 μl 100 mM GTP lub GDP (stężenie końcowe: 2 mM), aby uzyskać końcową objętość reakcji 200 μl, pipetować w górę i w dół pipetą o większej objętości, aby wymieszać i wznowić akwizycję.

6. Transmisyjna mikroskopia elektronowa

  1. Przygotować próbki jak w teście sedymentacyjnym FtsZ (objętość można zmniejszyć do 10 μl objętości końcowej w celu zaoszczędzenia materiału).
  2. Po czasie inkubacji nanieść 2 μl próbki na siatkę miedzianą pokrytą węglem o siatce 400 mesh i inkubować przez 15 sekund.
  3. Osusz siatkę, delikatnie dotykając lub przeciągając siatkę równolegle lub prostopadle do kawałka bibuły filtracyjnej.
  4. Zabarwić siatkę za pomocą 4 μl 2% roztworu octanu uranu. Osusz siatkę do sucha zgodnie z opisem w kroku 6.3.
  5. Zobacz siatkę w mikroskopie elektronowym CM120 firmy Philips pracującym przy napięciu 120 kV przy powiększeniu 39 200x.

7. Test hydrolizy GTP

Konfiguracja eksperymentu jest zaprojektowana w taki sposób, że hydroliza GTP FtsZ jest zatrzymywana po różnych czasach reakcji poprzez zmieszanie reakcji z zielenią malachitową. W ten sposób czas rozwoju koloru zieleni malachitowej jest taki sam dla każdej próbki.

  1. Przygotować 1,5 ml 2 mM GTP w jednym z polimeryzacyjnych (patrz przygotowanie próbki, pkt 1).
    Przygotować wzorcowe rozcieńczenie fosforanu 0-40 μM w buforze polimeryzacyjnym i przygotować odczynnik roboczy w kolorze zieleni malachitowej zgodnie z opisem w zestawie POMG-25H (testy biologiczne). Alternatywnie, odczynniki robocze mogą być przygotowywane we własnym zakresie zgodnie z protokołami opisanymi przez Lanzetta i wsp.16
  2. Przygotować mieszanki wzorcowe o łącznej objętości 360 μl: ja 24 μM FtsZBs, 20 mM MgCl2, bufor polimeryzacyjny Ii 12 μM FtsZEc, 20 mM MgCl2, bufor polimeryzacyjny III (kontrola 1) 24 μM FtsZBs, 2 mM EDTA, bufor polimeryzacyjny IV (kontrola 2) 12 μM FtsZEc, 2 mM EDTA, bufor polimeryzacyjny
  3. Odpipetować 20 μl podwielokrotności mieszanin wzorcowych, 100 μl wzorców fosforanowych i 180 μl 2 mM GTP na 96-dołkowej płytce qPCR w następującej kolejności: ZA W Z D E Z Z H 1 Iii Iii ja ja Iv Iv Ii Ii cyfra arabska Iii Iii ja ja Iv Iv Ii Ii 3 Iii Iii ja ja Iv Iv Ii Ii 4 Iii Iii ja ja Iv Iv Ii Ii 5 Iii Iii ja ja Iv Iv Ii Ii 6 Iii Iii ja ja Iv Iv Ii Ii 7 Iii Iii ja ja Iv Iv Ii Ii 8 Iii Iii ja ja Iv Iv Ii Ii 9 PS PS PS PS PS PS PS PS 10 PS PS PS PS PS PS PS PS 11 12 GTP (GTP) GTP (GTP) GTP (GTP) GTP (GTP) GTP (GTP) GTP (GTP) GTP (GTP) GTP (GTP)
    PS - wzorzec fosforanowy
  4. Umieścić płytkę qPCR w maszynie do PCR z programem ustawionym na 40-minutowy cykl w temperaturze 30 °C.
  5. Przygotować 20 μl porcji odczynnika roboczego w kolorze zieleni malachitowej na 96-dołkowej płytce. Dodać 60 μl buforu polimeryzacyjnego z eksperymentu do pasów 1'-8'. Próbka zostanie rozcieńczona 4x w porównaniu do wzorca fosforanowego, należy wziąć ten fakt pod uwagę podczas końcowych obliczeń.
    ZAWZDEZZH
    1'IiiIiijajaIvIvIiIi
    2'IiiIiijajaIvIvIiIi
    3'IiiIiijajaIvIvIiIi
    4'IiiIiijajaIvIvIiIi
    5'IiiIiijajaIvIvIiIi
    6'IiiIiijajaIvIvIiIi
    7'IiiIiijajaIvIvIiIi
    8'IiiIiijajaIvIvIiIi
    9'PSPSPSPSPSPSPSPS
    10'PSPSPSPSPSPSPSPS
  6. Dodać 20 μl GTP do toru 1, pipetować w górę i w dół, aby wymieszać, uruchomić timer (jest to punkt początkowy dla 30-minutowej reakcji).
  7. Po 10 minutach, 30 sekundach dodaj GTP do toru 2, pipetuj w górę i w dół, aby wymieszać (20 min reakcji).
  8. Po 16 minutach dodać GTP do toru 3, pipetować w górę i w dół, aby wymieszać (15 min reakcji).
  9. Po 21 minutach i 30 sekundach dodaj GTP do linii 4, pipetuj w górę i w dół, aby wymieszać (reakcja 10 minut).
  10. Po 25 minutach dodać GTP do toru 5, pipetować w górę i w dół, aby wymieszać (7 minut reakcji).
  11. Po 27 minutach i 30 sekundach dodaj GTP do linii 6, pipetuj w górę i w dół, aby wymieszać (reakcja 5 minut).
  12. Po 29 minutach dodać GTP do toru 7, pipetować w górę i w dół, aby wymieszać (4 minuty reakcji).
  13. Po 30 minutach przenieść 20 μl z toru 1 na tor 1', pipetować w górę i w dół, aby wymieszać (punkt początkowy rozwoju zielonego koloru malachitu dla 30-minutowej reakcji).
  14. Po 30 minutach, 30 sekundach przenieś 20 μl z toru 2 do 2', pipetuj w górę i w dół, aby wymieszać (punkt wyjścia rozwoju zielonego koloru malachitu dla 20-minutowej reakcji).
  15. Powtarzaj ten krok dla pasów 3-7 co 30 sekund.
  16. Po 33 minutach i 30 sekundach dodaj 20 μl GTP do toru 8, pipetuj w górę iw dół, aby wymieszać i przenieś 20 μl na tor 8', pipetuj w górę i w dół, aby wymieszać (0 min reakcji i punkt początkowy dla rozwoju zielonego koloru malachitu dla reakcji).
  17. Po 34 minutach dodać 80 μl z pasa 9 do 9', pipetować w górę i w dół, aby wymieszać (punkt początkowy dla rozwoju zielonego koloru malachitu dla wzorca fosforanowego 1).
  18. Po 34 minutach i 30 sekundach przenieś 80 μl z toru 10 do 10', pipetuj w górę i w dół, aby wymieszać (punkt początkowy dla rozwoju zielonego koloru malachitu dla wzorca fosforanowego 2).
  19. Usunąć wszystkie pęcherzyki powietrza z próbek i inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez kolejne 25 minut i 30 sekund.
  20. Umieścić płytkę w 96-dołkowym czytniku płytek.
  21. Po 60 minutach należy zmierzyć płytkę 10x co 30 sekund przy długości fali 630 nm (rozwój zielonego koloru malachitu wynosi teraz 30 minut dla pierwszej reakcji). Każdy pomiar odpowiada każdemu punktowi czasowemu z kroków 7.6-7.12 i 7.16 i musi być obliczony oddzielnie podczas analizy danych.
  22. Obliczyć zawartość wolnego fosforanu w każdej próbce, korzystając z krzywej kalibracyjnej wzorca fosforanu.
  23. Wykreśl dane jako uwalnianie fosforanów w czasie i oblicz aktywność hydrolizy FtsZ GTP na podstawie liniowego zakresu krzywej.

Wyniki

Oczyszczanie białka FtsZ z różnych źródeł bakteryjnych zostało opisane w literaturze i zestawiono w Tabeli 1.

Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.MetodaModyfikacjaWydajność [mg/L hodowli]>Bibliografia
B. subtilis1) Wytrącanie siarczanem amonu/chromatografia wymiany jonowejnie40Niniejsza praca, 11,15
2) Chromatografia powinowactwaznacznik His (His-tag)ND17
*E. coli*1) Wytrącanie siarczanem amonu/chromatografia wymiany jonowejnie35Niniejsza praca, 11,15
2) Wytrącanie wapnia, chromatografia jonowymiennanie4018
Methanococcus jannaschii1) Chromatografia powinowactwa w warunkach denaturujących/renaturacja/wytrącanie siarczanem amonu/filtracja żelowaznaczniki His-tag1.319
2) Chromatografia powinowactwa/ filtracja żelowaznacznik His-tagND20
Thermotoga maritimaChromatografia wymiany jonowej/filtracja żelowanie6.719
Pseudomonas aeruginosaChromatografia powinowactwa/filtracja żelowaznacznik Strep, znacznik HisND21
Mycobacterium tuberculosis1) Chromatografia powinowactwa/wymiany jonowejnieND22
2) Chromatografia powinowactwa/ filtracja żelowanie3023
Aquifex aeolicusChromatografia powinowactwa/filtracja żelowaznacznik His-tag, trunkacja C-końcowa (331-367)ND24
Caulobacter crescentusChromatografia wymiany jonowej/wytrącanie siarczanem amonu/filtracja żelowanieND25

Tabela 1. Opisane protokoły oczyszczania FtsZ. ND: nieokreślono.

Sedymentacja polimerów FtsZ

Wstępnie zastosowaliśmy dwie różne prędkości wirowania w celu osadzenia polimerów FtsZ. Stwierdzono, że tylko przy prędkości 350 000 x g osadzają się pojedyncze polimery FtsZEc (Rysunek 1), podczas gdy przy 190 000 x g w frakcji osadu obecne są jedynie wiązki FtsZBs (dane nie przedstawiono). W związku z tym w dalszych eksperymentach zastosowano prędkość 350 000 x g. Procent spolimeryzowanego FtsZEc i FtsZBs jest podobny przy 50 mM KCl, mimo że eksperymenty z rozpraszania światła wykazały znacznie silniejszy sygnał rozproszenia dla FtsZBs. Wynika to z tworzenia przez FtsZBs wiązek, które rozpraszają więcej światła niż pojedyncze polimery FtsZEc. W eksperymencie z 300 mM KCl nie udało się uzyskać dużej ilości polimerów FtsZ w frakcji osadu zarówno dla FtsZEc, jak i FtsZBs (Rysunek 1). Przypisujemy to kombinacji szybkiego rozpadu struktur FtsZ oraz zmniejszonego wiązania filamentów w wiązki.

Sedymentacja rurek FtsZ-SepF

Aby przeanalizować oddziaływanie FtsZ z określonymi aktywatorami, można przeprowadzić testy sedymentacyjne przy niższych prędkościach wirowania. Przy takiej prędkości mogą zostać osadzone jedynie duże struktury FtsZ, np. duże tubule tworzone przez pierścienie SepF i filamenty FtsZBs5 lub pęczki tworzone przez FtsZ i ZapA. Zastosowaliśmy niższe wirowanie (24 600 x g), aby wykazać wykonalność tego podejścia dla tubul tworzonych przez FtsZ i SepF. FtsZ odzyskano w osadzie powyżej poziomów tła tylko wtedy, gdy w próbce obecne były zarówno SepF, jak i GTP (Rycina 2), a obecność SepF nie wpływa na aktywność GTP-azy FtsZ7, co pokazuje, że FtsZ jest w pełni aktywny w obecności SepF. Specyficzna sedymentacja SepF i FtsZ wynosi około 45% całkowitej ilości SepF i 15% całkowitej ilości FtsZ (w porównaniu do materiału sedymentującego po dodaniu GDP). Wskazuje to, że tubule SepF-FtsZ zawierają więcej SepF niż FtsZ. Może to wynikać z faktu, że wiele pierścieni SepF organizuje tubule FtsZ-SepF5,7. Dokładna stechiometria SepF-FtsZ w tych tubulach nie jest znana, ale nasze wyniki sugerują, że obecna jest większa ilość SepF niż FtsZ.

Właściwości polimeryzacji i wiązkowania FtsZEc oraz FtsZBs

Aby scharakteryzować wydajność polimeryzacji FtsZBs i FtsZEc w różnych buforach, przeanalizowano oba białka za pomocą rozpraszania światła pod kątem 90°. Przy stężeniu 50 mM KCl białko FtsZBs daje sygnał rozpraszania światła od 20 do 40 razy wyższy niż FtsZEc, w zależności od pH buforu (Rycina 3A i B), co potwierdza wyniki Buske et al.26 Zwiększenie stężenia KCl w buforze nie wpłynęło znacząco na sygnał rozpraszania światła FtsZEc (Rycina 3D), jednak sygnał FtsZBs spadł około 80-krotnie przy pH 7,5, około 30-krotnie przy pH 6,8 oraz około 45-krotnie przy pH 6,5 w 300 mM KCl (Rycina 3C) w porównaniu do buforów z 50 mM KCl (Rycina 3A). Rozpad polimerów FtsZ przebiega szybciej przy wyższym stężeniu KCl dla obu białek (Ryciny 3C i D). Badania Pacheco-Gómez et al. wykazują, że polimeryzacja i wiązanie w pęczki FtsZ z E. coli są zależne od pH. Autorzy ci stwierdzili, że w buforze z 50 mM KCl sygnał rozpraszania światła podczas polimeryzacji FtsZ był wyższy, a rozpad FtsZ trwał dłużej przy pH 6,0 w porównaniu do pH 7,0 8. Wyniki te nie są zgodne z naszymi danymi dotyczącymi polimeryzacji FtsZEc przy 50 mM KCl (Rycina 3B), jednak należy zauważyć, że zastosowaliśmy trzy różne bufory (HEPES, MES i PIPES), podczas gdy Pacheco-Gómez et al. użyli wyłącznie MES. Zatem nie tylko pH, ale także skład buforu (siła jonowa) wpływa na kinetykę polimerów FtsZ przy 50 mM KCl. Natomiast przy 300 mM KCl ani skład buforu, ani pH nie wpłynęły na montaż FtsZEc w sposób wykrywalny.

Przeprowadzenie eksperymentu rozpraszania światła dla FtsZBs w buforach bez KCl nie było możliwe ze względu na wytrącanie się białka w tych warunkach. Obniżenie stężenia FtsZBs do 3 µM zapobiegło wytrącaniu. Jednakże 3 µM nie jest fizjologicznym stężeniem FtsZ w komórce. W kuwetach plastikowych FtsZBs nie wytrącał się przy stężeniu 12 µM i pH 7,5, natomiast przy pH 6,8 oraz 6,5 FtsZ nadal wytrącał się wobec braku KCl.

Morfologie struktur FtsZ z E. coli i B. subtilis

Struktury utworzone przez FtsZ poddano analizie za pomocą TEM. FtsZBs tworzyły gęsto upakowane polimery, które pokrywały całą siatkę we wszystkich buforach przy niskim stężeniu soli (Ryciny 4A-C). FtsZEc tworzył długie filamenty, kable i wiązki we wszystkich buforach przy niskim stężeniu soli (Ryciny 4D-F). Jednak zauważalna ilość polimerów utworzonych przez FtsZEc była mniejsza niż ilość polimerów utworzonych przez FtsZBs. W buforach o wysokim stężeniu soli FtsZBs tworzył dłuższe, pojedyncze protofilamenty, które nie łączyły się w wiązki (Ryciny 4G-I). Podczas gdy protofilamenty FtsZBs zmieniały strukturę przy wyższym stężeniu soli, FtsZEc tworzył struktury nieodróżnialne od tych z bufora o niskim stężeniu soli (Ryciny 4J-L). Nie zaobserwowano wpływu pH na polimeryzację FtsZEc, natomiast FtsZBs tworzy więcej wiązek przy pH 6,5, które są widoczne jako gęsto upakowane polimery i arkusze (Rycina 4B). Wyniki te są zgodne z naszymi eksperymentami z rozpraszania światła oraz wcześniej opublikowanymi pracami z wykorzystaniem TEM8,11,26.

Aktywność GTP-azy FtsZ przy wysokim i niskim stężeniu KCl

Aktywność hydrolizy GTP białka FtsZ mierzono w różnych warunkach, stosując test kolorymetryczny na obecność wolnego fosforanu. Jak raportowano wcześniej15, aktywność GTPazy FtsZ wzrastała wraz ze zwiększaniem stężenia KCl: w zależności od zastosowanego buforu, aktywność GTPazy FtsZBs wzrosła 3-7 krotnie, a FtsZEc 1,5-2,5 krotnie przy stężeniu 300 mM KCl w porównaniu do 50 mM KCl. Obniżona aktywność GTPazy przy 50 mM KCl wynika z tworzenia się wiązek filamentów FtsZBs. Przy 50 mM KCl białko FtsZEc wykazywało 3-6 krotnie wyższą aktywność GTPazy niż FtsZBs, co wynikało z szybszego rozpadu polimerów FtsZEc. Różnica w aktywności hydrolizy GTP pomiędzy FtsZBs a FtsZEc zmniejszyła się przy 300 mM KCl, prawdopodobnie z powodu ograniczenia tworzenia wiązek filamentów FtsZBs (Rycina 5).

Polimeryzacja FtsZ, analiza % osadu, wykres słupkowy, elektroforeza żelowa, porównanie efektu GTP/GDP.
Rycina 1. Ilościowe oznaczenie polimeryzacji FtsZ metodą sedymentacji. (A) 12 µM FtsZ polimeryzowano w obecności 2 mM GTP lub GDP przy pH 7,5 (czarne słupki), 6,8 (szare słupki) lub 6,5 (białe słupki). Ilość białka w osadzie określono za pomocą analizy densytometrycznej żeli barwionych Coomassie. GDP służyło jako kontrola specyficzności sedymentacji, a odsetek FtsZ osadzonego z GDP odjęto od odsetka FtsZ osadzonego z GTP, aby uzyskać wartości przedstawione na wykresie. Po lewej: FtsZ osadzony przy 50 mM KCl, po prawej: FtsZ osadzony przy 300 mM KCl. (B) Reprezentatywne wyniki z żeli barwionych Coomassie. Polimeryzacja FtsZBs (górny żel) i FtsZEc (dolny żel) przy 50 mM KCl. (S) nadosad, (P) frakcje osadu z eksperymentu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

Wykres oddziaływania FtsZ i SepF oraz żel pokazujący wpływ GTP/GDP na procentową zawartość białka w osadzie.
Rysunek 2. Sedymentacja rurek SepF/FtsZ przy niskiej prędkości. (A) 12 µM FtsZBs spolimeryzowano z 2 mM GDP (białe słupki) lub GTP (czarne słupki). Ilość białka w osadzie określono za pomocą analizy densytometrycznej żeli barwionych Coomassie. Znaki + i - pod osią x wskazują obecność lub brak FtsZ i SepF w reakcji. (B) Reprezentatywne wyniki z żelu barwionego Coomassie. Polimeryzacja FtsZBs w obecności i przy braku SepF. Jako kontrolę zastosowano SepF bez FtsZ. Polimeryzację przeprowadzono z GTP i GDP. (S) nadsadczyna, (P) frakcje osadu z eksperymentu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

Wykresy rozpraszania światła FtsZ przy różnych stężeniach KCl; pokazujące efekty pH 6,5, 6,8, 7,5.
Rysunek 3. Rozpraszanie światła dla 12 μM FtsZEc i 12 μM FtsZBs. Białka FtsZ montowano w obecności 2 mM GTP, a polimeryzację monitorowano za pomocą rozpraszania światła pod kątem 90°. Polimeryzacja FtsZBs (A) i FtsZEc (B) przy 50 mM KCl przy pH 7,5, pH 6,8, pH 6,5. Polimeryzacja FtsZBs (C) i FtsZEc (D) przy 300 mM KCl przy pH 7,5, pH 6,8 i pH 6,5. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

Mikroskopia elektronowa polimerów FtsZ przy zmiennym pH i stężeniach KCl; analiza strukturalna.
Rycina 4. Struktury polimerów FtsZBs i FtsZEc wizualizowane za pomocą mikroskopii elektronowej. (A-L) Obrazy 12 µM FtsZBs (A-C i G-I) oraz FtsZEc (D-F) i (J-L) spolimeryzowanych z 2 mM GTP. (A-C) FtsZBs w buforze z 50 mM KCl i pH odpowiednio 7,5, 6,8 oraz 6,5. (D-F) FtsZEc w buforze z 50 mM KCl i pH odpowiednio 7,5, 6,8 oraz 6,5. (G-I) FtsZBs w buforze z 300 mM KCl i pH odpowiednio 7,5, 6,8 oraz 6,5. (J-L) FtsZEc w buforze z 300 mM KCl i pH odpowiednio 7,5, 6,8 oraz 6,5. Pasek skali: 100 nm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększony obraz.

Wykres aktywności GTPazy; wykres słupkowy FtsZ przy 50mM vs 300mM KCl, zmienne pH 7,5, 6,8, 6,5.
Rysunek 5. Hydroliza GTP podczas polimeryzacji FtsZ w 6 różnych buforach.We wszystkich eksperymentach zastosowano 2 mM GTP. Jako próbę kontrolną wykorzystano próbkę bez MgCl2. Aktywność FtsZ bez MgCl2 odjęto od aktywności FtsZ w obecności MgCl2. Po lewej: aktywność GTPazy FtsZ przy 50 mM KCl, po prawej: aktywność GTPazy FtsZ przy 300 mM KCl. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

Dyskusja

Opisujemy zestaw metod, który pozwala na szybką analizę aktywności FtsZ i jego interakcji z innymi białkami. Rozpraszanie światła, sedymentacja i testy GTPazy, a także mikroskopia elektronowa są szeroko stosowane do badania polimeryzacji FtsZ. Wprowadziliśmy pewne ulepszenia do istniejących protokołów, pokazaliśmy wpływ różnych warunków na montaż FtsZ i proponujemy kontrole, które powinny być uwzględnione w badaniach FtsZ.

Wprowadzamy wirowanie z niską prędkością w celu odróżnienia dużych struktur powstałych w wyniku asocjacji między FtsZ i jego oddziałującymi białkami z polimerów FtsZ. Metoda ta ma dwie zalety w porównaniu ze standardowym testem sedymentacji. Po pierwsze, polimery FtsZ nie tworzą tła we frakcji granulek, ponieważ nie są one odwirowywane przy 24 600 x g. Po drugie, ilość FtsZ obecną w strukturze utworzonej z białkiem oddziałującym można obliczyć na podstawie żelu. Dwa kluczowe etapy w tej metodzie to czas inkubacji i stężenie GTP. Ważne jest, aby odwirować dużą strukturę białka, gdy jest ona kompletna, ale przed jej rozkładem, gdy całe GTP jest hydrolizowane. Najlepszą kontrolą dla tego badania jest polimeryzacja FtsZ z GDP. Istnieje jedno potencjalne ograniczenie testu. FtsZ tworzy stabilny kompleks z SepF, który można łatwo odwirować przy 24 600 x g. W przypadku przeprowadzenia sedymentacji innym aktywatorem lub lekiem, który wiąże polimery FtsZ, może być konieczne dostosowanie testu. Można to zrobić poprzez zmianę czasu inkubacji lub zwiększenie prędkości wirowania.

Właściwe przygotowanie próbki jest najważniejsze w eksperymentach z rozpraszaniem światła. Białka muszą być wstępnie oczyszczone przez wirowanie, a wszystkie powinny zostać przefiltrowane przed użyciem. Jeśli w próbce obecne są jakiekolwiek agregaty, zakłócą one stabilny sygnał uzyskany z polimerów FtsZ. W przypadku analizy struktur FtsZ za pomocą mikroskopii elektronowej głównym krokiem jest przygotowanie siatki. Czas inkubacji próbki na siatce będzie miał wpływ na wytworzenie mniej lub bardziej zagęszczonych polimerów. W przypadku wiązek FtsZBs czas inkubacji musi być krótszy niż w przypadkuFtsZ Ec i FtsZBs przy wysokim stężeniu KCl. Dla każdej próbki zastosowaliśmy stężenie 12 μM, aby móc porównać wyniki. Jednak w przypadku FtsZB przy 50 mM KCl należy zastosować niższe stężenie FtsZ, ponieważ 12 μM spowodowało pełne nasycenie siatki. To sprawia, że polimery są mocno zagęszczone i trudne do wykrycia. Mniej zagęszczone polimery są lepsze do wykrycia na EM.

Test GTPazy jest jedynym eksperymentem stosowanym do badania aktywności, a nie struktur FtsZ. Mg2+ jest niezbędny do obrotu GTP w polimerach FtsZ. Tak więc przy braku Mg2+ FtsZ nie hydrolizuje GTP. Dlatego próbka bez Mg2+ jest właściwą kontrolą w tym teście, ale kationy Mg są obecne w buforze magazynowym FtsZ. Mogą one zostać usunięte przez dodanie 1 mM EDTA do próbki kontrolnej. Krytycznym krokiem w tym teście jest czas inkubacji. Ważne jest, aby po określonym czasie zatrzymać aktywność FtsZ. Osiąga się to poprzez przeniesienie próbki FtsZ do roztworu zieleni malachitowej na 96-dołkowej płytce. Jednak rozwój zielonego koloru malachitu jest procesem ciągłym. W związku z tym pomiary muszą być wykonywane w tym samym czasie dla każdej próbki. Korzystając z dobrze zaplanowanego protokołu dodawania GTP z pomiarami wykonywanymi w odstępie 30 sekund w ustalonej kolejności, możliwe jest uzyskanie tego samego czasu inkubacji i obsługi próbki dla każdego punktu czasowego. Kolejnym krytycznym krokiem jest wybór stężenia białka do eksperymentu. W eksperymencie zastosowaliśmy dwa różne stężenia dla FtsZEc i FtsZBs. Hydroliza GTP jest znacznie szybsza dla FtsZEc w porównaniu do FtsZBs. Aktywność GTPazyFtsZ Ec w wybranych warunkach i przy 12 μM jest liniowa tylko przez maksymalnie 5 minut, a po tym czasie szybkość hydrolizy utrzymuje się na stałym poziomie. W związku z tym trudno jest zinterpretować dane z eksperymentu, gdy jest on przeprowadzany w tych warunkach. W tym przypadku FtsZEc musi być stosowany w niższym stężeniu niż FtsZBs, aby móc porównać aktywność obu białek. Aktywność GTPazy FtsZ z różnych źródeł może się różnić. W związku z tym należy wybrać odpowiednie stężenie. Stężenie dla polimeryzacji FtsZ powinno być znacznie wyższe od stężenia krytycznego (na ogół od 2,5-10 μM). Nie bez znaczenia jest również dynamika montażu i demontażu FtsZ. Niektóre białka wykazują znaczne opóźnienie w polimeryzacji po dodaniu GTP, jak pokazano dla FtsZB przy 50 mM KCl. Przydatne jest wykonanie testu rozpraszania światła przed testem GTPazy w celu przybliżenia czasu montażu i demontażu polimerów FtsZ. Następnie można wybrać czas inkubacji i koncentrację białka. Ponieważ warunki wybrane do polimeryzacji FtsZ mają kluczowe znaczenie, ważne jest, aby w każdej metodzie stosować odpowiednie stężenie pH i KCl. W niniejszej pracy badano 9 różnych o pH w zakresie 6,5-7,5 i stężeniach KCl od 0 M do 300 mM. Zauważyliśmy, że najlepszym warunkiem do analizy FtsZ z B. subtilis i E.coli oraz ich aktywności biologicznej jest pH zbliżone do poziomu fizjologicznego (7,5) wraz z wysokim stężeniem KCl. Przy wysokim stężeniu KCl FtsZ ma wyższą aktywność GTPazy i wytwarza polimery, które są lepiej wykrywalne przez mikroskopię elektronową. Potwierdziliśmy również, że fizjologiczne pH i wysokie stężenie KCl są lepsze do badania interakcji między FtsZ a białkami regulatorowymi niż jakiekolwiek inne używane głównie do badania składania FtsZ. FtsZBs wykazuje podobną aktywność do FtsZEc, gdy jest badany przy wysokim stężeniu KCl. Ponadto przy niskim stężeniu soli wpływ pH jest bardziej widoczny niż w o wysokim stężeniu soli. FtsZ czasami wytrąca się podczas stosowania bez KCl, w związku z czym należy unikać bez soli. Sedymentacja polimerów FtsZ jest niska w przypadku stosowania o wysokich stężeniach KCl. Może to być zaletą podczas badania interakcji między FtsZ a białkami, które składają włókna FtsZ, takimi jak SepF i ZapA, ponieważ te struktury wyższego rzędu są łatwe do wykrycia za pomocą wirowania. We wszystkich naszych eksperymentach stosowaliśmy MgCl2 w stężeniu 10 mM. Wykazano, że stosunkowo wysokie stężenieMg2+ stabilizuje polimery FtsZ i zmniejsza aktywność GTPazy FtsZ. W tabeli 2 podsumowano wyniki różnych badań opisujących polimeryzację FtsZ i aktywność GTPazy przy różnych stężeniachMg2+ przy użyciu identycznych warunków buforowych 27. Zmierzone stężenie wolnego cytoplazmy Mg2+ wynosi 0,9 mM3. Należy zauważyć, że GTP chelatuje równoważną ilość Mg2+. Tak więc optymalne stężenie Mg2+ do eksperymentów GTPazy wynosi około 2-2,5 mM, co jest bliskie fizjologicznemu poziomowi3. Jednak w naszych eksperymentach użyliśmy MgCl2 o stężeniu 10 mM, aby uzyskać łatwo wykrywalny sygnał rozpraszania światła i ustabilizować polimery FtsZ podczas testu sedymentacji.

Chociaż zastosowaliśmy nasze protokoły do FtsZ z organizmów modelowych E. coli i B. subtilis, można je zaadaptować do FtsZ z dowolnego innego organizmu. Należy zauważyć, że fizjologiczne pH oraz stężenia kationów jednowartościowych i dwuwartościowych różnią się w zależności od organizmu. W związku z tym optymalne warunki polimeryzacji FtsZ mogą się różnić. Różnice w czasie podwajania i warunkach wzrostu różnych bakterii mogą skutkować różną kinetyką składania FtsZ i optymalnymi warunkami eksperymentów. Jednak nasz protokół stanowi dobry punkt wyjścia do eksperymentów z FtsZ z innych organizmów. Protokoły powinny być przydatne do badania FtsZ z białkami regulatorowymi lub do badania wpływu małych związków i leków na FtsZ.

ŹródłoPolimeryzacja [% sedymentacji FtsZ]GTPaza [Pi/FtsZ/min]Stężenie Mg2+ [mM]Stężenie FtsZ [μM]Odwołania
FtsZEc~ 28%~ 2,11012Ta praca
~ 50%~ 2,41012.527
~ 43%~ 3,5512.527
~ 27%~ 4,62.512.527
ND~ 5,42.5526
FtsZBs~ 30%~ 0,812Ta praca
~ 52% (z dekstranem DEAE)~ 0,5101011
ND~ 2,252.5526

Tabela 2. Wpływ na Mg2+ na polimeryzację FtsZ i GTPazę. Wyniki tej pracy porównano z danymi opublikowanymi. Wszystkie doświadczenia przeprowadzono w 50 mM MES/ NaOH, pH=6,5, 50 mM KCl.

Oświadczenia

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

Praca w naszym laboratorium jest finansowana z grantu VIDI od Holenderskiej Organizacji Badań Naukowych (dla DJS). Dziękujemy Markowi Stuartowi i Zakładowi Mikroskopii Elektronowej naszej uczelni za pomoc i udostępnienie transmisyjnego mikroskopu elektronowego.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
GTPRoche10106399001Część 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7
Grubościenne rurki poliwęglanoweBeckman Coulter343776Część 2
Ultrawirówka Optima MAX-XPRedlica Beckman 393315Część 2, 3
Rurka polialomerowa z nasadką zatrzaskowąRedlica Beckman357448Część 3
AIDA Bio-pakiet, 1D, 2D, FLRaytest Isotopenmessgerä te GmbH15000001Część 4
Analizator obrazu luminescencji LAS-4000FujifilmCzęść 4
Spektrometr luminescencyjny Thermo Spectronic AMINCO-BowmanInstrumentyCzęść 5
Komórka fluorescencyjnaHellma Analytics105-250-15-40Część 5
Kwadratowa siatka 400, miedź, 100 / fiolkęMikroskopia elektronowa NaukiG400-CuCzęść 6
Mikroskop elektronowy CM120 pracujący przy napięciu 120 kVPhilipsCzęść 6
Płytka 96 ml x 0,2 mlBIOplasticsB70501Część 7
Zestaw do oznaczania zielonego fosforanu malachitu SystemtestowyPOMG-25HCzęść 7
Spektrofotometr MicroPlate PowerWave HTBioTekCzęść 7
Spectronic

Bibliografia

  1. Haydon, D. J., Stokes, N. R., et al. An inhibitor of FtsZ with potent and selective anti-staphylococcal activity. Science. 321 (5896), 1673-1675 (2008).
  2. Adams, D. W., Errington, J. Bacterial cell division: assembly, maintenance and disassembly of the Z ring. Nat. Rev. Microbiol. 7 (9), 642-653 (2009).
  3. Erickson, H. P., Anderson, D. E., Osawa, M. FtsZ in bacterial cytokinesis: cytoskeleton and force generator all in one. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 74 (4), 504-528 (2010).
  4. Li, Z., Trimble, M. J., Brun, Y. V., Jensen, G. J. The structure of FtsZ filaments in vivo suggests a force-generating role in cell division. EMBO J. 26 (22), 4694-4708 (2007).
  5. Król, E., van Kessel, S. P., van Bezouwen, L. S., Kumar, N., Boekema, E. J., Scheffers, D. J. Bacillus subtilis SepF binds to the C-terminus of FtsZ. PLoS One. 7 (8), e43293(2012).
  6. Singh, J. K., Makde, R. D., Kumar, V., Panda, D. SepF increases the assembly and bundling of FtsZ polymers and stabilizes FtsZ protofilaments by binding along its length. J. Biol. Chem. 283 (45), 31116-31124 (2008).
  7. Gündoğdu, M. E., Kawai, Y., et al. Large ring polymers align FtsZ polymers for normal septum formation. EMBO J. 30 (3), 617-626 (2011).
  8. Pacheco-Gomez, R., Roper, D. I., Dafforn, T. R., Rodger, A. The pH dependence of polymerization and bundling by the essential bacterial cytoskeletal protein FtsZ. PLoS One. 6 (6), e19369(2011).
  9. Mendieta, J., Rico, A. I., Lopez-Vinas, E., Vicente, M., Mingorance, J., Gomez-Puertas, P. Structural and functional model for ionic (K(+)/Na(+)) and pH dependence of GTPase activity and polymerization of FtsZ, the prokaryotic ortholog of tubulin. J. Mol. Biol. 390 (1), 17-25 (2009).
  10. Tadros, M., Gonzalez, J. M., Rivas, G., Vicente, M., Mingorance, J. Activation of the Escherichia coli cell division protein FtsZ by a low-affinity interaction with monovalent cations. FEBS Lett. 580 (20), 4941-4946 (2006).
  11. Scheffers, D. J. The effect of MinC on FtsZ polymerization is pH dependent and can be counteracted by ZapA. FEBS Lett. 582 (17), 2601-2608 (2008).
  12. Mukherjee, A., Lutkenhaus, J. Analysis of FtsZ assembly by light scattering and determination of the role of divalent metal cations. J. Bacteriol. 181 (3), 823-832 (1999).
  13. Chen, Y., Erickson, H. P. Rapid in vitro assembly dynamics and subunit turnover of FtsZ demonstrated by fluorescence resonance energy transfer. J. Biol. Chem. 280 (23), 22549-22554 (2005).
  14. Hou, S., Wieczorek, S. A., et al. Characterization of Caulobacter crescentus FtsZ protein using dynamic light scattering. J. Biol. Chem. 287 (28), 23878-23886 (2012).
  15. Mukherjee, A., Lutkenhaus, J. Dynamic assembly of FtsZ regulated by GTP hydrolysis. EMBO J. 17 (2), 462-469 (1998).
  16. Lanzetta, P. A., Alvarez, L. J., Reinach, P. S., Candia, O. A. An improved assay for nanomole amounts of inorganic phosphate. Anal. Biochem. 100 (1), 95-97 (1979).
  17. Ray, S., Kumar, A., Panda, D. GTP regulates the interaction between MciZ and FtsZ: a possible role of MciZ in bacterial cell division. Biochemistry. 52 (2), 392-401 (2013).
  18. Rivas, G., Lopez, A., et al. Magnesium-induced linear self-association of the FtsZ bacterial cell division protein monomer. The primary steps for FtsZ assembly. J. Biol. Chem. 275 (16), 11740-11749 (2000).
  19. Oliva, M. A., Cordell, S. C., Lowe, J. Structural insights into FtsZ protofilament formation. Nat. Struct. Mol. Biol. 11 (12), 1243-1250 (2004).
  20. Lowe, J., Amos, L. A. Crystal structure of the bacterial cell-division protein FtsZ. Nature. 391 (6663), 203-206 (1998).
  21. Cordell, S. C., Robinson, E. J., Lowe, J. Crystal structure of the SOS cell division inhibitor SulA and in complex with FtsZ. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (13), 7889-7894 (2003).
  22. Chen, Y., Anderson, D. E., Rajagopalan, M., Erickson, H. P. Assembly dynamics of Mycobacterium tuberculosis FtsZ. J. Biol. Chem. 282 (38), 27736-27743 (2007).
  23. White, E. L., Ross, L. J., Reynolds, R. C., Seitz, L. E., Moore, G. D., Borhani, D. W. Slow polymerization of Mycobacterium tuberculosis FtsZ. J. Bacteriol. 182 (14), 4028-4034 (2000).
  24. Oliva, M. A., Trambaiolo, D., Lowe, J. Structural insights into the conformational variability of FtsZ. J. Mol. Biol. 373 (5), 1229-1242 (2007).
  25. Thanbichler, M., Shapiro, L. M. ipZ. a spatial regulator coordinating chromosome segregation with cell division in Caulobacter. Cell. 126 (1), 147-162 (2006).
  26. Buske, P. J., Levin, P. A. Extreme C terminus of bacterial cytoskeletal protein FtsZ plays fundamental role in assembly independent of modulatory proteins. J. Biol. Chem. 287 (14), 10945-10957 (2012).
  27. Mukherjee, A., Lutkenhaus, J. Analysis of FtsZ assembly by light scattering and determination of the role of divalent metal cations. J. Bacteriol. 181 (3), 823-832 (1999).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Analiza rozpraszania wiat aanaliza sedymentacjianaliza hydrolizy GTPmikroskopia elektronowawarunki buforowechlorek potasuEscherichia coliBacillus subtilisoddzia ywania bia kowe

Powiązane artykuły