Testy polimeryzacji FtsZ: proste protokoły i rozważania

Podsumowanie

Polimeryzacja FtsZ jest niezbędna do podziału komórek bakteryjnych. W tym raporcie szczegółowo opisujemy proste protokoły monitorowania aktywności polimeryzacji FtsZ i omawiamy wpływ składu buforu. Protokoły mogą być wykorzystywane do badania interakcji FtsZ z białkami regulatorowymi lub lekami przeciwbakteryjnymi, które wpływają na polimeryzację FtsZ.

Streszczenie

Podczas podziału komórki bakteryjnej, niezbędne białko FtsZ gromadzi się w środku komórki, tworząc tzw. Z-ring. FtsZ polimeryzuje w długie włókna w obecności GTP in vitro, a polimeryzacja jest regulowana przez kilka białek pomocniczych. Polimeryzacja FtsZ została szeroko zbadana in vitro przy użyciu podstawowych metod, w tym rozpraszania światła, sedymentacji, testów hydrolizy GTP i mikroskopii elektronowej. Warunki buforowe wpływają zarówno na właściwości polimeryzacyjne FtsZ, jak i na zdolność FtsZ do interakcji z białkami regulatorowymi. W tym miejscu opisujemy protokoły badań polimeryzacji FtsZ oraz walidujemy warunki i kontrole przy użyciu Escherichia coli i Bacillus subtilis FtsZ jako białek modelowych. Wprowadza się test sedymentacji o niskiej prędkości, który umożliwia badanie interakcji FtsZ z białkami, które wiążą lub rurkowaczą polimery FtsZ. Opisano ulepszony protokół testu GTPazy, który umożliwia testowanie hydrolizy GTP w czasie przy użyciu różnych warunków w konfiguracji 96-dołkowej płytki, ze znormalizowanymi czasami inkubacji, które znoszą zmiany w rozwoju koloru w reakcji wykrywania fosforanów. Opisano przygotowanie próbek do badań rozpraszania światła i mikroskopii elektronowej. Stosuje się kilka w celu ustalenia odpowiedniego pH buforu i stężenia soli do badań polimeryzacji FtsZ. Wysokie stężenie KCl jest najlepsze dla większości eksperymentów. Nasze metody stanowią punkt wyjścia do charakterystyki in vitro FtsZ, nie tylko z E. coli i B. subtilis, ale z każdej innej bakterii. W związku z tym metody te mogą być wykorzystywane do badań interakcji FtsZ z białkami regulatorowymi lub do testowania leków przeciwbakteryjnych, które mogą wpływać na polimeryzację FtsZ.

Wprowadzenie

Niezbędne białko bakteryjne FtsZ jest najlepiej scharakteryzowanym białkiem w maszynerii podziału komórek bakteryjnych. FtsZ jest prokariotycznym homologiem tubuliny i polimeryzuje in vitro w sposób zależny od GTP. FtsZ jest bardzo atrakcyjnym celem dla nowych antybiotyków ze względu na swój konserwatywny charakter i unikalność w stosunku do bakterii^1,2. Na początku podziału komórki FtsZ tworzy cytokinetyczny pierścień w środkowej komórce, który służy jako rusztowanie do składania innych białek podziału komórki. Formowanie pierścienia Z ma kluczowe znaczenie dla prawidłowego usytuowania płaszczyzny podziału. Dynamika składania FtsZ jest regulowana przez kilka białek pomocniczych, takich jak (w zależności od gatunku bakterii) MinC, SepF, ZapA, UgtP i EzrA². Polimeryzacja FtsZ była intensywnie badana in vitro i opisano wiele różnych struktur, w tym proste protofilamenty, zakrzywione protofilamenty, arkusze włókien, wiązki włókien i rurki z filamentami, w zależności od buforu montażowego, nukleotydu i dodatkowych białek zawartych w teście³. Architektura protofilamentów FtsZ in vivo nie jest jeszcze w pełni poznana, chociaż eksperymenty kriotomografii elektronowej w Caulobacter crescentus sugerują, że pierścień Z składa się ze stosunkowo krótkich, nieciągłych pojedynczych protofilamentów bez rozległego wiązania⁴.

In vitro, właściwości polimeryzacyjne FtsZ i oddziaływanie FtsZ z białkami regulatorowymi są zależne od składu buforu reakcyjnego. Na przykład niedawno opisaliśmy miejsce interakcji dla SepF na C-końcu FtsZ i wykazaliśmy, że obcinanie C-końca FtsZ_Bs∆16 nie wiąże się już z SepF⁵. W poprzednim badaniu nad oddziaływaniem SepF-FtsZ_Bs, podobny FtsZ_Bs∆16 nadal obcinał się z SepF, co sugerowało, że SepF wiąże się z miejscem wtórnym na FtsZ⁶. Różnica między tymi badaniami polegała na składzie reakcyjnych – przy pH 7,5 nie stwierdzono kosedymentacji SepF z obciątym FtsZ, natomiast przy pH 6,5 występowała kosedymentacja. Gündoğdu et al. zauważono, że SepF nie działa i wytrąca się przy pH 6,5⁷, co pokazuje, że obserwowana koedymentacja przy pH 6,5 jest prawdopodobnie spowodowana wytrącaniem SepF, a nie interakcją z C-końcowym cięciem FtsZ_Bs∆16. Wpływ pH i stężenia KCl na polimeryzację FtsZ był już wcześniej badany. Polimery E. coli FtsZ (FtsZ_Ec) przy pH 6,5 są dłuższe i liczniejsze niż te powstałe przy pH^{obojętnym 8,9}. Tadros i wsp. badali polimeryzację FtsZ_Ec w obecności kationów jednowartościowych, zauważając, że wiązanie K⁺ jest związane z polimeryzacją_{FtsZ Ec} i ma kluczowe znaczenie dla aktywności FtsZ¹⁰. pH jest bardziej krytyczne, gdy bada się interakcję FtsZ z innymi białkami, jak pokazano w poprzednim przykładzie SepF, oraz zależność pH hamującego działania MinC na FtsZ¹¹. Ponieważ zarówno pH, jak i stężenie soli mogą wpływać na interakcję FtsZ z innymi białkami, ważne jest, aby wybrać odpowiednie warunki i kontrole do badań polimeryzacji FtsZ.

Tutaj opisujemy protokoły do badania polimeryzacji FtsZ i aktywności GTPazy poprzez rozpraszanie światła, mikroskopię elektronową, sedymentację i testy GTPazy. Rozpraszanie światła pod kątem prostym jest standardową metodą badania polimeryzacji FtsZ w czasie rzeczywistym¹². Wprowadziliśmy kilka ulepszeń w teście sedymentacji i GTPazy. Szczegółowo przedstawiamy, jak przygotować próbki do rozpraszania światła i mikroskopii elektronowej. Przetestowano kilka stosowanych w literaturze do badania polimeryzacji FtsZ i opisujemy najlepsze warunki dla każdego eksperymentu. Pokazujemy również, jakie kontrole należy wprowadzić, aby uzyskać najlepsze dane.

Te metody pozwalają na szybkie badanie polimeryzacji FtsZ, aktywności i interakcji z innymi białkami przy użyciu prostych metod i sprzętu, który jest dostępny w większości laboratoriów. Istnieją bardziej wyrafinowane metody badania polimeryzacji FtsZ, ale często wymagają dostępu do bardziej specjalistycznego sprzętu i/lub modyfikacji FtsZ za pomocą znaczników fluorescencyjnych^8,13,14. Proste metody opisane w tym artykule zilustrowano przy użyciu FtsZ z B. subtilis i E. coli, najczęstszych organizmów modelowych Gram+ i Gram-. Protokoły można dostosować do dowolnego innego białka FtsZ. Na podstawie wstępnych testów z tymi nowymi FtsZ, dla uzyskania optymalnego wyniku mogą być konieczne niewielkie zmiany dotyczące czasu, bufora lub temperatury inkubacji. Opisane tutaj eksperymenty powinny pomóc w znalezieniu tych optymalnych warunków.

Protokół

Nieoznaczone białka FtsZ zostały oczyszczone zgodnie z wcześniejszym opisem^11,15, poddane dializie z 20 mM Tris/ HCl (pH 7,9), 50 mM KCl, 1 mM EGTA, 2,5 mM MgAc i 10% glicerolu i przechowywane w temperaturze -80 °C. W takich warunkach białko może być przechowywane przez ponad 2 lata bez znaczącej utraty aktywności. Białko powinno być przechowywane w podwielokrotnościach o objętości 100 μl, aby uniknąć rozmrożenia i zamrożenia próbki. Po rozmrożeniu próbkę można przechowywać w temperaturze 4 °C maksymalnie przez tydzień. FtsZ jest rozpuszczalny w wysokich stężeniach i może być przechowywany w stężeniu 7-10 mg/ml. Ważne jest, aby utrzymywać wysokie stężenie białka, aby uniknąć niepożądanych skutków składników bufora magazynowego w późniejszych eksperymentach. W związku z tym stężenie magazynowe powinno pozwalać na rozcieńczenie FtsZ co najmniej 10-krotnie, aby stężenie glicerolu spadło poniżej 1% i zminimalizowało stężenie pozostałych składników buforu dializacyjnego w mieszaninie reakcyjnej. Na polimeryzację FtsZ może mieć również wpływ obecność wysokich stężeń sodu⁹ lub imidazolu, dlatego składniki te muszą zostać usunięte z buforu polimeryzacyjnego. SepF oczyszczono zgodnie z opisem⁷ i przechowywano w buforze elucyjnym w temperaturze -80 °C. Alternatywne opublikowane procedury oczyszczania FtsZ z E. coli i B. subtilis, jak również odniesienia do procedur oczyszczania FtsZ z różnych źródeł podsumowano w tabeli 1 (patrz sekcja dotycząca reprezentatywnych wyników).

1. Przygotowanie próbki

1. Przygotować polimeryzacyjne: 1 50 mM Hepes/ NaOH, pH 7,5 cyfra arabska 25 mM RURY/ NaOH, pH 6,8 3 50 mM MES/ NaOH, pH 6,5 4 50 mM Hepes/ NaOH, pH 7,5; 50 mM KCl 5 25 mM RURY/ NaOH, pH 6,8; 50 mM KCl 6 50 mM MES/ NaOH, pH 6,5; 50 mM KCl 7 50 mM Hepes/ NaOH, pH 7,5; 300 mM KCl 8 25 mM RURY/ NaOH, pH 6,8; 300 mM KCl 9 50 mM MES/ NaOH, pH 6,5; 300 mM KCl
2. Filtr Wysterylizuj wszystkie za pomocą filtra membranowego 22 μm.
3. Przygotować 100 mM ROZTWORÓW PODSTAWOWYCH GTP, GDP i MgCl₂ w każdym buforze polimeryzacyjnym z (1).
4. Wstępnie oczyść białka, wirując z prędkością 100 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C dla wszystkich eksperymentów.

2. Test sedymentacji FtsZ

1. Przygotować mieszaninę reakcyjną przez dodanie MgCl₂ i FtsZ do jednego z polimeryzacyjnych (patrz punkt przygotowania próbki 1) w probówkach kompatybilnych z wirowaniem o dużej prędkości. Całkowita objętość powinna wynosić 49 μl, przy czym MgCl₂ wynosi 10 mM, a FtsZ 12 μM przy 50 μl objętości końcowej.
2. Umieścić probówkę w inkubatorze z funkcją wytrząsania, inkubować przez 2 minuty w temperaturze 30 °C przy 300 obr./min (alternatywnie próbkę można delikatnie strzepnąć i krótko zmikrofukować, a następnie wstępnie ogrzać w temperaturze 30 °C).
3. Polimeryzację należy rozpocząć od dodania 1 μl roztworu podstawowego GTP lub GDP do tego samego buforu, który został użyty w doświadczeniu (stężenie końcowe 2 mM). Inkubować przez 10 lub 2 minuty (dla zawierających odpowiednio 50 mM KCl i 300 mM KCl) w temperaturze 30 °C przy 300 obr./min (lub w inkubatorze z funkcją wytrząsania).
4. Przenieść probówki do wirnika ultrawirówki i wirować przez 10 minut przy 350 000 x g (89 700 obr./min dla wirnika TLA 120.1) w temperaturze 25 °C.
5. Po odwirowaniu ostrożnie wyjmij probówki z wirnika i natychmiast przenieś supernatant do czystej probówki. Przygotować próbki do SDS-PAGE, dodając 20 μl supernatantu do 20 μl buforu 2x próbki. Gotować przez 10 minut w temperaturze 98 °C.
6. Dodać 50 μl 2x buforu do próbki do frakcji granulek zawierających polimery FtsZ. Umieść probówkę ultrawirówki w probówce o pojemności 2 ml. Zawiesić osad przez gotowanie przez 10 minut w temperaturze 98 °C, a następnie dodać 50 μl zdemineralizowanego_H2O, aby próbka była tak samo rozcieńczona 2x jak próbka sklarowana nad osadem.
7. Odwróć probówkę ultrawirówki do góry dnem w probówce o pojemności 2 ml i wiruj przez 5 minut w wirówce Eppendorf przy 18 000 x g. Wyjmij probówkę ultrawirówki z probówki o pojemności 2 ml.
8. Załadować 10 μl każdego supernatantu i próbki granulki obok siebie na 10% żelu SDS-PAGE. Uruchom żel pod napięciem 150 V.
9. Zabarwić żel środkiem Coomassie Brilliant Blue G-250 i zachować do oceny ilościowej.

3. Test sedymentacji FtsZ przy wolnym wirowaniu

1. Przygotować roztwór polimeryzacyjny jak w kroku 2, dodać SepF i/lub FtsZ (stężenie końcowe 12 μM). Eksperymenty te można przeprowadzić w jednorazowych probówkach Beckman o pojemności 1,5 ml w połączeniu z rotorem TLA-55.
2. Umieścić probówkę w inkubatorze z funkcją wytrząsania i inkubować przez 2 minuty w temperaturze 30 °C przy 300 obr./min.
3. Rozpocząć polimeryzację od dodania 1 μl GTP lub GDP z roztworu podstawowego (stężenie końcowe 2 mM), inkubować przez 20 minut w temperaturze 30 °C przy 300 obr./min.
4. Wirować przez 15 minut przy 24 600 x g (20 000 obr./min dla wirnika TLA 55) w temperaturze 25 °C.
5. Usunąć supernatant i przenieść do czystej probówki, pobrać 20 μl i przenieść do 20 μl 2x buforu do próbek. Gotować przez 10 minut w temperaturze 98 °C.
6. Dodać 50 μl buforu 2x próbki do frakcji osadów zawierających polimery i ponownie zawiesić przez gotowanie przez 10 minut w temperaturze 98 °C, dodać 50 μl zdemineralizowanego_H2O.
7. Załadować 10 μl każdego supernatantu i próbki granulki obok siebie na 10% żelu SDS-PAGE. Uruchom żel pod napięciem 150 V.
8. Zabarwić żel środkiem Coomassie Brilliant Blue G-250 i zachować do oceny ilościowej.

4. Kwantyfikacja testów sedymentacji FtsZ

1. Zrób zdjęcie barwionego żelu Coomassie za pomocą systemu dokumentacji żelu (np. LAS-4000, Fujifilm).
2. Otwórz obraz żelu w programie odpowiednim do analizy densytometrycznej żeli (np. program do analizy obrazu AIDA (Raytest)) i opisz analizę w tym programie poniżej.
3. Kliknij przycisk "Ocena" na pasku narzędzi.
4. Wybierz z listy "Densytometria 2D" i kliknij OK.
5. W menu głównym kliknij "Ocena" i wybierz pozycję "Określenie regionu".
6. Aby utworzyć region na żelu, kliknij symbol narzędzia Automatyczne konturowanie w przyborniku Określanie regionu.
7. Kliknij w lewym górnym rogu opaski białkowej na żelu, przytrzymaj przycisk myszy i przeciągnij go do żądanego prawego dolnego końca opaski i zwolnij przycisk myszy.
8. Oznacz każde pasmo FtsZ/SepF w ten sam sposób.
9. Wszystkie informacje na temat oceny przypisanych regionów można znaleźć w Raporcie Regionów. Aby uzyskać raport regionu, kliknij przycisk "Pokaż raport regionu" w przyborniku Określanie regionu.
10. Aby wyeksportować raport, w menu głównym kliknij Plik i wybierz pozycję "Eksportuj à raport regionu 2D".
11. W raporcie regionu należy znaleźć intensywność każdego utworzonego regionu. Obliczyć procentową zawartość białka (FtsZ, białko regulatorowe) w osadzie, korzystając z wartości intensywności z raportu.

5. Rozpraszanie światła pod kątem 90°

1. Włączyć spektrometr fluorescencyjny (np. AMINCO-Bowman Series 2), pozostawić lampę do rozgrzania się przez kilka minut, aby uniknąć wahań temperatury i włączyć łaźnię wodną obiegową, aby utrzymać temperaturę komory kuwety na poziomie 30 °C.
2. Określ parametry pracy spektrometru: detektor wysokiego napięcia 300 V, długość fali emisji i wzbudzenia: 350 nm, szerokość szczeliny: 4 nm. Należy zauważyć, że wiele spektrometrów automatycznie dostosowuje sygnał na początku eksperymentu do określonego procentu (np. 60%) maksimum. Powoduje to, że sygnał rozproszony wychodzi poza zasięg, gdy tylko GTP zostanie dodany w celu polimeryzacji FtsZ. Mądrze jest najpierw ustalić odpowiednie wzmocnienie sygnału - wysokie napięcie detektora - dla maksymalnej polimeryzacji przed rozpoczęciem serii eksperymentów.
3. Zaprogramuj protokół gromadzenia danych. Wybierz akwizycję czasową, trwającą 3 600 sek.
4. Ostrożnie wyczyść kuwetę fluorescencyjną wodą i etanolem, w razie potrzeby poddaj sonikacji w łaźni wodnej w temperaturze pokojowej przez 5 min. W tym protokole użyto kuwet o długości ścieżki 1 cm i objętości 200 μl i przechowywano je w roztworze do przechowywania (0,5-1% Hellmanex). Alternatywnie można zastosować jednorazowe kuwety plastikowe odporne na promieniowanie UV (UVette, Eppendorf).
5. Przygotować 294 μl mieszanki wzorcowej buforu polimeryzacyjnego (patrz punkt przygotowania próbki 1) z 10 mM MgCl₂ i 12 μM FtsZ jako stężeniem końcowym obliczonym dla 300 μl i odwirować.
6. Przenieść 196 μl buforu polimeryzacyjnego do kuwety i umieścić go w spektrometrze. Inkubować przez 2 minuty w temperaturze 30 °C.
7. Rozpocznij akwizycję danych i odczekaj 90 sekund, aby sprawdzić, czy sygnał jest stabilny.
8. Dodać 4 μl 100 mM GTP lub GDP (stężenie końcowe: 2 mM), aby uzyskać końcową objętość reakcji 200 μl, pipetować w górę i w dół pipetą o większej objętości, aby wymieszać i wznowić akwizycję.

6. Transmisyjna mikroskopia elektronowa

1. Przygotować próbki jak w teście sedymentacyjnym FtsZ (objętość można zmniejszyć do 10 μl objętości końcowej w celu zaoszczędzenia materiału).
2. Po czasie inkubacji nanieść 2 μl próbki na siatkę miedzianą pokrytą węglem o siatce 400 mesh i inkubować przez 15 sekund.
3. Osusz siatkę, delikatnie dotykając lub przeciągając siatkę równolegle lub prostopadle do kawałka bibuły filtracyjnej.
4. Zabarwić siatkę za pomocą 4 μl 2% roztworu octanu uranu. Osusz siatkę do sucha zgodnie z opisem w kroku 6.3.
5. Zobacz siatkę w mikroskopie elektronowym CM120 firmy Philips pracującym przy napięciu 120 kV przy powiększeniu 39 200x.

7. Test hydrolizy GTP

Konfiguracja eksperymentu jest zaprojektowana w taki sposób, że hydroliza GTP FtsZ jest zatrzymywana po różnych czasach reakcji poprzez zmieszanie reakcji z zielenią malachitową. W ten sposób czas rozwoju koloru zieleni malachitowej jest taki sam dla każdej próbki.

1. Przygotować 1,5 ml 2 mM GTP w jednym z polimeryzacyjnych (patrz przygotowanie próbki, pkt 1).
   Przygotować wzorcowe rozcieńczenie fosforanu 0-40 μM w buforze polimeryzacyjnym i przygotować odczynnik roboczy w kolorze zieleni malachitowej zgodnie z opisem w zestawie POMG-25H (testy biologiczne). Alternatywnie, odczynniki robocze mogą być przygotowywane we własnym zakresie zgodnie z protokołami opisanymi przez Lanzetta i wsp.¹⁶
2. Przygotować mieszanki wzorcowe o łącznej objętości 360 μl: ja 24 μM FtsZ_Bs, 20 mM MgCl₂, bufor polimeryzacyjny Ii 12 μM FtsZ_Ec, 20 mM MgCl₂, bufor polimeryzacyjny III (kontrola 1) 24 μM FtsZ_Bs, 2 mM EDTA, bufor polimeryzacyjny IV (kontrola 2) 12 μM FtsZ_Ec, 2 mM EDTA, bufor polimeryzacyjny
3. Odpipetować 20 μl podwielokrotności mieszanin wzorcowych, 100 μl wzorców fosforanowych i 180 μl 2 mM GTP na 96-dołkowej płytce qPCR w następującej kolejności: ZA W Z D E Z Z H 1 Iii Iii ja ja Iv Iv Ii Ii cyfra arabska Iii Iii ja ja Iv Iv Ii Ii 3 Iii Iii ja ja Iv Iv Ii Ii 4 Iii Iii ja ja Iv Iv Ii Ii 5 Iii Iii ja ja Iv Iv Ii Ii 6 Iii Iii ja ja Iv Iv Ii Ii 7 Iii Iii ja ja Iv Iv Ii Ii 8 Iii Iii ja ja Iv Iv Ii Ii 9 PS PS PS PS PS PS PS PS 10 PS PS PS PS PS PS PS PS 11 12 GTP (GTP) GTP (GTP) GTP (GTP) GTP (GTP) GTP (GTP) GTP (GTP) GTP (GTP) GTP (GTP)
   PS - wzorzec fosforanowy
4. Umieścić płytkę qPCR w maszynie do PCR z programem ustawionym na 40-minutowy cykl w temperaturze 30 °C.
5. Przygotować 20 μl porcji odczynnika roboczego w kolorze zieleni malachitowej na 96-dołkowej płytce. Dodać 60 μl buforu polimeryzacyjnego z eksperymentu do pasów 1'-8'. Próbka zostanie rozcieńczona 4x w porównaniu do wzorca fosforanowego, należy wziąć ten fakt pod uwagę podczas końcowych obliczeń.

   	ZA	W	Z	D	E	Z	Z	H
   1'	Iii	Iii	ja	ja	Iv	Iv	Ii	Ii
   2'	Iii	Iii	ja	ja	Iv	Iv	Ii	Ii
   3'	Iii	Iii	ja	ja	Iv	Iv	Ii	Ii
   4'	Iii	Iii	ja	ja	Iv	Iv	Ii	Ii
   5'	Iii	Iii	ja	ja	Iv	Iv	Ii	Ii
   6'	Iii	Iii	ja	ja	Iv	Iv	Ii	Ii
   7'	Iii	Iii	ja	ja	Iv	Iv	Ii	Ii
   8'	Iii	Iii	ja	ja	Iv	Iv	Ii	Ii
   9'	PS	PS	PS	PS	PS	PS	PS	PS
   10'	PS	PS	PS	PS	PS	PS	PS	PS

6. Dodać 20 μl GTP do toru 1, pipetować w górę i w dół, aby wymieszać, uruchomić timer (jest to punkt początkowy dla 30-minutowej reakcji).
7. Po 10 minutach, 30 sekundach dodaj GTP do toru 2, pipetuj w górę i w dół, aby wymieszać (20 min reakcji).
8. Po 16 minutach dodać GTP do toru 3, pipetować w górę i w dół, aby wymieszać (15 min reakcji).
9. Po 21 minutach i 30 sekundach dodaj GTP do linii 4, pipetuj w górę i w dół, aby wymieszać (reakcja 10 minut).
10. Po 25 minutach dodać GTP do toru 5, pipetować w górę i w dół, aby wymieszać (7 minut reakcji).
11. Po 27 minutach i 30 sekundach dodaj GTP do linii 6, pipetuj w górę i w dół, aby wymieszać (reakcja 5 minut).
12. Po 29 minutach dodać GTP do toru 7, pipetować w górę i w dół, aby wymieszać (4 minuty reakcji).
13. Po 30 minutach przenieść 20 μl z toru 1 na tor 1', pipetować w górę i w dół, aby wymieszać (punkt początkowy rozwoju zielonego koloru malachitu dla 30-minutowej reakcji).
14. Po 30 minutach, 30 sekundach przenieś 20 μl z toru 2 do 2', pipetuj w górę i w dół, aby wymieszać (punkt wyjścia rozwoju zielonego koloru malachitu dla 20-minutowej reakcji).
15. Powtarzaj ten krok dla pasów 3-7 co 30 sekund.
16. Po 33 minutach i 30 sekundach dodaj 20 μl GTP do toru 8, pipetuj w górę iw dół, aby wymieszać i przenieś 20 μl na tor 8', pipetuj w górę i w dół, aby wymieszać (0 min reakcji i punkt początkowy dla rozwoju zielonego koloru malachitu dla reakcji).
17. Po 34 minutach dodać 80 μl z pasa 9 do 9', pipetować w górę i w dół, aby wymieszać (punkt początkowy dla rozwoju zielonego koloru malachitu dla wzorca fosforanowego 1).
18. Po 34 minutach i 30 sekundach przenieś 80 μl z toru 10 do 10', pipetuj w górę i w dół, aby wymieszać (punkt początkowy dla rozwoju zielonego koloru malachitu dla wzorca fosforanowego 2).
19. Usunąć wszystkie pęcherzyki powietrza z próbek i inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez kolejne 25 minut i 30 sekund.
20. Umieścić płytkę w 96-dołkowym czytniku płytek.
21. Po 60 minutach należy zmierzyć płytkę 10x co 30 sekund przy długości fali 630 nm (rozwój zielonego koloru malachitu wynosi teraz 30 minut dla pierwszej reakcji). Każdy pomiar odpowiada każdemu punktowi czasowemu z kroków 7.6-7.12 i 7.16 i musi być obliczony oddzielnie podczas analizy danych.
22. Obliczyć zawartość wolnego fosforanu w każdej próbce, korzystając z krzywej kalibracyjnej wzorca fosforanu.
23. Wykreśl dane jako uwalnianie fosforanów w czasie i oblicz aktywność hydrolizy FtsZ GTP na podstawie liniowego zakresu krzywej.

Wyniki

Oczyszczanie FtsZ z różnych źródeł bakteryjnych zostało opisane w literaturze i podsumowane w Tabeli 1.

źródło metoda Modyfikacji Uzyskany plon [mg/l uprawy]> Odwołania B. subtilis 1) Wytrącanie siarczanu amonu/chromatografia jonowymienna Nie Rozdział 40 To dzieło, 11,15 2) Chromatografia powinowactwa Jego-tag Nd 17 Bakteria E. coli 1) Wytrącanie siarczanu amonu/chromatografia jonowymienna Nie 35 Rozdział To dzieło, 11,15 2) Wytrącanie wapnia, chromatografia jonowymienna Nie Rozdział 40 Rozdział 18 Methanococcus jannaschii (Methanococcus jannaschii) 1) Chromatografia powinowactwa w warunkach denaturacji / ponowne fałdowanie / wytrącanie siarczanu amonu / filtracja żelowa Jego-tag 1.3 Rozdział 19 2) Chromatografia powinowactwa / filtracja żelowa Jego-tag Nd 20 Thermotoga maritima (Thermotoga maritima) Chromatografia jonowymienna/filtracja żelowa Nie 6.7 Rozdział 19 Pseudomonas aeruginosa Chromatografia powinowactwa/filtracja żelowa Strep-tag, jego-tag Nd 21 Mycobacterium tuberculosis (prątki gruźlicy) 1) Chromatografia powinowactwa/chromatografii jonowymiennej Nie Nd 22 Rozdział 22 2) Chromatografia powinowactwa / filtracja żelowa Nie Rozdział 30 23 Aquifex aeolicus (Aquifex aeolicus) Chromatografia powinowactwa/filtracja żelowa His-tag, obcięcie C-końca (331-367) Nd 24 Caulobacter crescentus (Caulobacter crescentus) Chromatografia jonowymienna/wytrącanie siarczanu amonu/filtracja żelowa Nie Nd 25

Tabela 1. Opisano protokoły oczyszczania FtsZ. ND: Nie określono.

Sedymentacja polimerów FtsZ

Początkowo używaliśmy dwóch różnych prędkości do rozkręcania polimerów FtsZ. Stwierdziliśmy, że tylko przy prędkości 350 000 x g pojedyncze polimery FtsZ_Ec są wirowane (rysunek 1), podczas gdy przy 190 000 x g we frakcji granulek obecne są tylko wiązki FtsZ_B (dane nie pokazane). Dlatego w naszych dalszych eksperymentach wykorzystaliśmy 350 000 x g. Procent spolimeryzowanych_{FtsZ Ec} i FtsZ_Bs jest podobny i wynosi 50 mM KCl, mimo że eksperymenty z rozpraszaniem światła wykazały znacznie wyższy sygnał rozpraszania dla FtsZ_Bs. Dzieje się tak za sprawą wiązek utworzonych przez FtsZ_B, które rozpraszają więcej światła niż pojedyncze polimery FtsZ_Ec. Nie udało się uzyskać dużej ilości polimerów FtsZ we frakcji granulek w eksperymencie o stężeniu 300 mM KCl zarówno dla FtsZ_Ec, jak i FtsZ_Bs (ryc. 1). Przypisujemy to połączeniu szybkiego demontażu struktur FtsZ i zmniejszonego wiązania włókien.

Sedymentacja kanalików FtsZ-SepF

Aby przeanalizować interakcję FtsZ z niektórymi aktywatorami, testy sedymentacyjne mogą być wykonywane przy niższych prędkościach wirowania. Przy tej prędkości mogą być granulowane tylko duże struktury FtsZ, np. duże kanaliki utworzone przez pierścienie SepF i włókna FtsZ_Bs ⁵ lub wiązki utworzone przez FtsZ i ZapA. Zastosowaliśmy dolne wirowanie (24 600 x g), aby zademonstrować wykonalność tego podejścia dla kanalików utworzonych przez FtsZ i SepF. FtsZ został odzyskany w osadzie powyżej poziomów tła tylko wtedy, gdy zarówno SepF, jak i GTP były obecne w próbce (ryc. 2), a obecność SepF nie wpływa na aktywność GTPazy FtsZ⁷, co pokazuje, że FtsZ jest w pełni aktywny w obecności SepF. Sedymentacja specyficzna SepF i FtsZ wynosi około 45% całkowitego SepF i 15% całkowitego FtsZ (w porównaniu z sedymentacją materiału po dodaniu PKB). Pokazuje to, że kanaliki SepF-FtsZ zawierają więcej SepF niż FtsZ. Może to być spowodowane tym, że wiele pierścieni SepF organizuje kanaliki FtsZ-SepF^5,7. Dokładna stechiometria SepF-FtsZ w tych kanalikach nie jest znana, ale nasze wyniki sugerują, że jest więcej SepF niż FtsZ.

FtsZ_Ec i FtsZ_Bs właściwości polimeryzacji i sprzedaży wiązanej

Aby scharakteryzować efektywność polimeryzacji FtsZ_Bs i_{FtsZ Ec} w różnych, przeanalizowaliśmy oba białka za pomocą rozpraszania światła pod kątem 90°. Przy 50 mM KCl, FtsZ_Bs daje 20-40-krotnie wyższy sygnał rozpraszania światła niż FtsZ_Ec, w zależności od pH bufora (ryc. 3A i B) potwierdzającego wyniki Buske i wsp. ²⁶ Zwiększenie stężenia KCl w buforze nie wpłynęło znacząco na sygnał rozpraszania światła FtsZ_Ec (rysunek 3D), ale sygnał FtsZ_Bs zmniejszył się ~80-krotnie przy pH 7,5, ~30-krotnie przy pH 6,8 i ~45-krotnie przy pH 6,5 w 300 mM KCl (rysunek 3C) w porównaniu z o 50 mM KCl (Rysunek 3A). Demontaż polimerów FtsZ jest szybszy przy wyższym stężeniu KCl dla obu białek (ryc. 3C i D). Badania Pacheco-Gómez i wsp. wykazać, że polimeryzacja i wiązanie FtsZ E. coli są zależne od pH. coli. Autorzy ci odkryli, że w buforze z 50 mM KCl sygnał rozpraszania światła polimeryzacji FtsZ był wyższy, a demontaż FtsZ trwał dłużej przy pH 6,0 w porównaniu do pH 7,0 ⁸. Wyniki te nie są zgodne z naszymi danymi z polimeryzacji FtsZ_Ec przy 50 mM KCl (rysunek 3B), ale należy zauważyć, że użyliśmy trzech różnych (HEPES, MES i PIPES), w których Pacheco-Gómez i wsp. tylko używany MES. Tak więc nie tylko pH, ale także skład buforowy (siła jonowa) wpływa na kinetykę polimerów FtsZ przy 50 mM KCl. Jednak przy 300 mM KCl ani skład buforu, ani pH nie wpływały na tworzenie FtsZ_Ec w wykrywalny sposób.

Eksperyment z rozpraszaniem światła FtsZ_B w bez KCl nie był możliwy z powodu wytrącania się białka w tych warunkach. Gdy stężenie FtsZ_Bs zostało obniżone do 3 μM, opady nie wystąpiły. Jednak 3 μM nie jest fizjologicznym stężeniem FtsZ w komórce. W kuwetach plastikowych FtsZ_B nie wytrącały się przy 12 μM przy pH 7,5, ale przy pH 6,8 i 6,5 FtsZ nadal wytrącały się przy braku KCl.

Morfologie struktur FtsZ z E. coli i B. subtilis

Struktury utworzone przez FtsZ zostały sprawdzone przez TEM. FtsZ_B połączone w ściśle zagęszczone polimery, które pokrywały całą siatkę we wszystkich przy niskiej zawartości soli (rysunki 4A-C). FtsZ_Ec tworzył długie włókna, i wiązki we wszystkich o niskiej zawartości soli (rysunki 4D-F). Jednak obserwowalna ilość polimerów utworzonych przez FtsZ_Ec była mniejsza niż ilość utworzona przez FtsZ_Bs. W o wysokiej zawartości soli FtsZ_{B tworzyły} dłuższe jednoniciowe protofilamenty, które nie łączyły się w wiązki (ryc. 4G-I). Podczas gdy protofilamenty FtsZ_Bs zmieniały strukturę przy wyższym stężeniu soli, FtsZ_Ec tworzyły struktury nie do odróżnienia od tych z buforem o niskiej zawartości soli (ryc. 4J-L). Nie stwierdzono zauważalnego wpływu pH na polimeryzację FtsZ_Ec, ale FtsZ_Bs tworzy więcej wiązek przy pH 6,5, które są widoczne jako ściśle zagęszczone polimery i arkusze (Figura 4B). Wyniki te są zgodne z naszymi eksperymentami z rozpraszaniem światła i wcześniej opublikowanymi pracami TEM^8,11,26.

Aktywność GTPazy FtsZ przy wysokich i niskich stężeniach KCl

Aktywność hydrolizy GTP FtsZ została zmierzona w różnych warunkach za pomocą testu kolorymetrycznego dla wolnego fosforanu. Jak informowaliśmy wcześniej¹⁵, aktywność GTPazy FtsZ wzrastała wraz ze wzrostem stężenia KCl: w zależności od zastosowanego buforu FtsZ_Bs. wykazały 3-7-krotny wzrost, a FtsZ_Ec wykazał 1,5-2,5-krotny wzrost aktywności GTPazy przy 300 mM KCl w porównaniu do 50 mM KCl. Zmniejszona aktywność GTPazy przy 50 mM KCl jest spowodowana wiązaniem włókien FtsZ_Bs. Przy 50 mM KCl FtsZ_Ec miał 3-6 razy wyższą aktywność GTPazy niż FtsZ_Bs ze względu na szybszy demontaż polimerów FtsZ_Ec. Różnica w aktywności hydrolizy GTP między FtsZ_Bs i FtsZ_Ec została zmniejszona przy 300 mM KCl, prawdopodobnie z powodu zmniejszonego wiązania włókien FtsZ_Bs (Rysunek 5).

Rysunek 1. Kwantyfikacja polimeryzacji FtsZ przez sedymentację. (A) 12 μM FtsZ polimeryzowano w obecności 2 mM GTP lub GDP przy pH 7,5 (czarne paski), 6,8 (szare paski) lub 6,5 (białe paski). Ilość granulowanego białka określono za pomocą analizy densytometrycznej barwionych żeli Coomassie. PKB służył jako kontrola dla określonej sedymentacji, a procent FtsZ osadzony PKB został odjęty od procentu FtsZ osadzonego GTP w celu uzyskania wartości wykreślonych na wykresie. Po lewej: FtsZ sedymentowany przy 50 mM KCl, po prawej: FtsZ sedymentowany przy 300 mM KCl. (B) Reprezentatywne wyniki z barwionych żeli Coomassie. Polimeryzacja FtsZ_Bs (górny żel) i FtsZ_Ec (dolny żel) przy 50 mM KCl. (S) supernatant, (P) frakcje osadów z doświadczenia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większy obraz.

Rysunek 2. Sedymentacja kanalików SepF/FtsZ przy niskiej prędkości. (A) 12 μM FtsZ_Bs polimeryzowano z 2 mM GDP (białe paski) lub GTP (czarne paski). Ilość granulowanego białka określono za pomocą analizy densytometrycznej barwionych żeli Coomassie. Znaki + i - pod osią x wskazują na obecność lub brak FtsZ i SepF w reakcji. (B) Reprezentatywne wyniki z barwionego żelu Coomassie. Polimeryzacja FtsZ_Bs w obecności i bez SepF. Jako kontrolę zastosowano SepF bez FtsZ. Polimeryzację przeprowadzono za pomocą GTP i GDP. (S) supernatant, (P) frakcje osadów z doświadczenia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większy obraz.

Rysunek 3. Rozpraszanie światła: 12 μM_{FtsZ Ec} i 12 μM FtsZ_Bs. FtsZ zmontowano w obecności 2 mM GTP, a polimeryzację monitorowano za pomocą rozpraszania światła pod kątem 90°. Polimeryzacja FtsZ_Bs (A) i FtsZ_Ec (B) przy 50 mM KCl przy pH 7,5, pH 6,8, pH 6,5. Polimeryzacja FtsZ_Bs (C) i FtsZ_Ec (D) przy 300 mM KCl przy pH 7,5, pH 6,8 i pH 6,5. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

Rysunek 4. Struktury polimerów FtsZ_Bs i FtsZ_Ec uwidocznione za pomocą mikroskopii elektronowej. (A-L) Obrazy 12 μM FtsZ_Bs (A-C i G-I) oraz FtsZ_Ec (D-F) i (J-L) polimeryzowanych 2 mM GTP. (A-C) FtsZ_{Bs w buforze} o 50 mM KCl i pH odpowiednio 7,5, 6,8 i 6,5. (D-F) FtsZ_Ec w buforze o 50 mM KCl i pH odpowiednio 7,5, 6,8 i 6,5. (G-I) FtsZ_Bs w buforze o 300 mM KCl i pH odpowiednio 7,5, 6,8 i 6,5. (J-L) FtsZ_Ec w buforze o 300 mM KCl i pH odpowiednio 7,5, 6,8 i 6,5. Podziałka: 100 nm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

Rysunek 5. Hydroliza GTP podczas polimeryzacji FtsZ w 6 różnych. We wszystkich eksperymentach zastosowano 2 mM GTP. Jako próbkę kontrolną bez MgCl₂ użyto. Aktywność FtsZ bez MgCl₂ odejmowano od aktywności FtsZ w obecności MgCl₂. Po lewej: aktywność GTPazy FtsZ przy 50 mM KCl, po prawej: aktywność GTPazy FtsZ przy 300 mM KCl. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

Dyskusja

Opisujemy zestaw metod, który pozwala na szybką analizę aktywności FtsZ i jego interakcji z innymi białkami. Rozpraszanie światła, sedymentacja i testy GTPazy, a także mikroskopia elektronowa są szeroko stosowane do badania polimeryzacji FtsZ. Wprowadziliśmy pewne ulepszenia do istniejących protokołów, pokazaliśmy wpływ różnych warunków na montaż FtsZ i proponujemy kontrole, które powinny być uwzględnione w badaniach FtsZ.

Wprowadzamy wirowanie z niską prędkością w celu odróżnienia dużych struktur powstałych w wyniku asocjacji między FtsZ i jego oddziałującymi białkami z polimerów FtsZ. Metoda ta ma dwie zalety w porównaniu ze standardowym testem sedymentacji. Po pierwsze, polimery FtsZ nie tworzą tła we frakcji granulek, ponieważ nie są one odwirowywane przy 24 600 x g. Po drugie, ilość FtsZ obecną w strukturze utworzonej z białkiem oddziałującym można obliczyć na podstawie żelu. Dwa kluczowe etapy w tej metodzie to czas inkubacji i stężenie GTP. Ważne jest, aby odwirować dużą strukturę białka, gdy jest ona kompletna, ale przed jej rozkładem, gdy całe GTP jest hydrolizowane. Najlepszą kontrolą dla tego badania jest polimeryzacja FtsZ z GDP. Istnieje jedno potencjalne ograniczenie testu. FtsZ tworzy stabilny kompleks z SepF, który można łatwo odwirować przy 24 600 x g. W przypadku przeprowadzenia sedymentacji innym aktywatorem lub lekiem, który wiąże polimery FtsZ, może być konieczne dostosowanie testu. Można to zrobić poprzez zmianę czasu inkubacji lub zwiększenie prędkości wirowania.

Właściwe przygotowanie próbki jest najważniejsze w eksperymentach z rozpraszaniem światła. Białka muszą być wstępnie oczyszczone przez wirowanie, a wszystkie powinny zostać przefiltrowane przed użyciem. Jeśli w próbce obecne są jakiekolwiek agregaty, zakłócą one stabilny sygnał uzyskany z polimerów FtsZ. W przypadku analizy struktur FtsZ za pomocą mikroskopii elektronowej głównym krokiem jest przygotowanie siatki. Czas inkubacji próbki na siatce będzie miał wpływ na wytworzenie mniej lub bardziej zagęszczonych polimerów. W przypadku wiązek FtsZ_Bs czas inkubacji musi być krótszy niż w przypadku_{FtsZ Ec} i FtsZ_Bs przy wysokim stężeniu KCl. Dla każdej próbki zastosowaliśmy stężenie 12 μM, aby móc porównać wyniki. Jednak w przypadku FtsZ_B przy 50 mM KCl należy zastosować niższe stężenie FtsZ, ponieważ 12 μM spowodowało pełne nasycenie siatki. To sprawia, że polimery są mocno zagęszczone i trudne do wykrycia. Mniej zagęszczone polimery są lepsze do wykrycia na EM.

Test GTPazy jest jedynym eksperymentem stosowanym do badania aktywności, a nie struktur FtsZ. Mg²⁺ jest niezbędny do obrotu GTP w polimerach FtsZ. Tak więc przy braku Mg²⁺ FtsZ nie hydrolizuje GTP. Dlatego próbka bez Mg²⁺ jest właściwą kontrolą w tym teście, ale kationy Mg są obecne w buforze magazynowym FtsZ. Mogą one zostać usunięte przez dodanie 1 mM EDTA do próbki kontrolnej. Krytycznym krokiem w tym teście jest czas inkubacji. Ważne jest, aby po określonym czasie zatrzymać aktywność FtsZ. Osiąga się to poprzez przeniesienie próbki FtsZ do roztworu zieleni malachitowej na 96-dołkowej płytce. Jednak rozwój zielonego koloru malachitu jest procesem ciągłym. W związku z tym pomiary muszą być wykonywane w tym samym czasie dla każdej próbki. Korzystając z dobrze zaplanowanego protokołu dodawania GTP z pomiarami wykonywanymi w odstępie 30 sekund w ustalonej kolejności, możliwe jest uzyskanie tego samego czasu inkubacji i obsługi próbki dla każdego punktu czasowego. Kolejnym krytycznym krokiem jest wybór stężenia białka do eksperymentu. W eksperymencie zastosowaliśmy dwa różne stężenia dla FtsZ_Ec i FtsZ_Bs. Hydroliza GTP jest znacznie szybsza dla FtsZ_Ec w porównaniu do FtsZ_Bs. Aktywność GTPazy_{FtsZ Ec} w wybranych warunkach i przy 12 μM jest liniowa tylko przez maksymalnie 5 minut, a po tym czasie szybkość hydrolizy utrzymuje się na stałym poziomie. W związku z tym trudno jest zinterpretować dane z eksperymentu, gdy jest on przeprowadzany w tych warunkach. W tym przypadku FtsZEc musi być stosowany w niższym stężeniu niż FtsZ_Bs, aby móc porównać aktywność obu białek. Aktywność GTPazy FtsZ z różnych źródeł może się różnić. W związku z tym należy wybrać odpowiednie stężenie. Stężenie dla polimeryzacji FtsZ powinno być znacznie wyższe od stężenia krytycznego (na ogół od 2,5-10 μM). Nie bez znaczenia jest również dynamika montażu i demontażu FtsZ. Niektóre białka wykazują znaczne opóźnienie w polimeryzacji po dodaniu GTP, jak pokazano dla FtsZB przy 50 mM KCl. Przydatne jest wykonanie testu rozpraszania światła przed testem GTPazy w celu przybliżenia czasu montażu i demontażu polimerów FtsZ. Następnie można wybrać czas inkubacji i koncentrację białka. Ponieważ warunki wybrane do polimeryzacji FtsZ mają kluczowe znaczenie, ważne jest, aby w każdej metodzie stosować odpowiednie stężenie pH i KCl. W niniejszej pracy badano 9 różnych o pH w zakresie 6,5-7,5 i stężeniach KCl od 0 M do 300 mM. Zauważyliśmy, że najlepszym warunkiem do analizy FtsZ z B. subtilis i E.coli oraz ich aktywności biologicznej jest pH zbliżone do poziomu fizjologicznego (7,5) wraz z wysokim stężeniem KCl. Przy wysokim stężeniu KCl FtsZ ma wyższą aktywność GTPazy i wytwarza polimery, które są lepiej wykrywalne przez mikroskopię elektronową. Potwierdziliśmy również, że fizjologiczne pH i wysokie stężenie KCl są lepsze do badania interakcji między FtsZ a białkami regulatorowymi niż jakiekolwiek inne używane głównie do badania składania FtsZ. FtsZBs wykazuje podobną aktywność do FtsZEc, gdy jest badany przy wysokim stężeniu KCl. Ponadto przy niskim stężeniu soli wpływ pH jest bardziej widoczny niż w o wysokim stężeniu soli. FtsZ czasami wytrąca się podczas stosowania bez KCl, w związku z czym należy unikać bez soli. Sedymentacja polimerów FtsZ jest niska w przypadku stosowania o wysokich stężeniach KCl. Może to być zaletą podczas badania interakcji między FtsZ a białkami, które składają włókna FtsZ, takimi jak SepF i ZapA, ponieważ te struktury wyższego rzędu są łatwe do wykrycia za pomocą wirowania. We wszystkich naszych eksperymentach stosowaliśmy MgCl₂ w stężeniu 10 mM. Wykazano, że stosunkowo wysokie stężenie^Mg2+ stabilizuje polimery FtsZ i zmniejsza aktywność GTPazy FtsZ. W tabeli 2 podsumowano wyniki różnych badań opisujących polimeryzację FtsZ i aktywność GTPazy przy różnych stężeniach^Mg2+ przy użyciu identycznych warunków buforowych ²⁷. Zmierzone stężenie wolnego cytoplazmy Mg²⁺ wynosi 0,9 mM³. Należy zauważyć, że GTP chelatuje równoważną ilość Mg²⁺. Tak więc optymalne stężenie Mg²⁺ do eksperymentów GTPazy wynosi około 2-2,5 mM, co jest bliskie fizjologicznemu poziomowi³. Jednak w naszych eksperymentach użyliśmy MgCl₂ o stężeniu 10 mM, aby uzyskać łatwo wykrywalny sygnał rozpraszania światła i ustabilizować polimery FtsZ podczas testu sedymentacji.

Chociaż zastosowaliśmy nasze protokoły do FtsZ z organizmów modelowych E. coli i B. subtilis, można je zaadaptować do FtsZ z dowolnego innego organizmu. Należy zauważyć, że fizjologiczne pH oraz stężenia kationów jednowartościowych i dwuwartościowych różnią się w zależności od organizmu. W związku z tym optymalne warunki polimeryzacji FtsZ mogą się różnić. Różnice w czasie podwajania i warunkach wzrostu różnych bakterii mogą skutkować różną kinetyką składania FtsZ i optymalnymi warunkami eksperymentów. Jednak nasz protokół stanowi dobry punkt wyjścia do eksperymentów z FtsZ z innych organizmów. Protokoły powinny być przydatne do badania FtsZ z białkami regulatorowymi lub do badania wpływu małych związków i leków na FtsZ.

Źródło	Polimeryzacja [% sedymentacji FtsZ]	GTPaza [Pi/FtsZ/min]	Stężenie Mg2+ [mM]	Stężenie FtsZ [μM]	Odwołania
FtsZEc	~ 28%	~ 2,1	10	12	Ta praca
	~ 50%	~ 2,4	10	12.5	27
	~ 43%	~ 3,5	5	12.5	27
	~ 27%	~ 4,6	2.5	12.5	27
	ND	~ 5,4	2.5	5	26
FtsZBs	~ 30%	~ 0,8		12	Ta praca
	~ 52% (z dekstranem DEAE)	~ 0,5	10	10	11
	ND	~ 2,25	2.5	5	26

Tabela 2. Wpływ na Mg²⁺ na polimeryzację FtsZ i GTPazę. Wyniki tej pracy porównano z danymi opublikowanymi. Wszystkie doświadczenia przeprowadzono w 50 mM MES/ NaOH, pH=6,5, 50 mM KCl.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
GTP	Roche	10106399001	Część 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7
Grubościenne rurki poliwęglanowe	Beckman Coulter	343776	Część 2
Ultrawirówka Optima MAX-XP	Redlica Beckman 393315		Część 2, 3
Rurka polialomerowa z nasadką zatrzaskową	Redlica Beckman	357448	Część 3
AIDA Bio-pakiet, 1D, 2D, FL	Raytest Isotopenmessgerä te GmbH	15000001	Część 4
Analizator obrazu luminescencji LAS-4000	Fujifilm		Część 4
Spektrometr luminescencyjny Thermo Spectronic AMINCO-Bowman	Instrumenty		Część 5
Komórka fluorescencyjna	Hellma Analytics	105-250-15-40	Część 5
Kwadratowa siatka 400, miedź, 100 / fiolkę	Mikroskopia elektronowa Nauki	G400-Cu	Część 6
Mikroskop elektronowy CM120 pracujący przy napięciu 120 kV	Philips		Część 6
Płytka 96 ml x 0,2 ml	BIOplastics	B70501	Część 7
Zestaw do oznaczania zielonego fosforanu malachitu System	testowy	POMG-25H	Część 7
Spektrofotometr MicroPlate PowerWave HT	BioTek		Część 7