Mysi model krwotoku podpajęczynówkowego

Podsumowanie

Opisano standaryzowany mysi model krwotoku podpajęczynówkowego za pomocą wewnątrzświetlnego koła perforacji Willisa. Perforacja naczynia i krwawienie podpajęczynówkowe są monitorowane za pomocą monitorowania ciśnienia śródczaszkowego. Ponadto rejestrowane i kontrolowane są różne parametry życiowe w celu utrzymania warunków fizjologicznych.

Streszczenie

W tej publikacji wideo prezentowany jest standaryzowany mysi model krwotoku podpajęczynówkowego (SAH). Krwawienie jest wywoływane przez wewnątrznaczyniowe koło perforacji Willisa (CWp) i potwierdzane przez monitorowanie ciśnienia śródczaszkowego (ICP). W ten sposób uzyskuje się jednorodną dystrybucję krwi w przestrzeniach podpajęczynówkowych otaczających krążenie tętnicze i szczeliny móżdżku. Fizjologia zwierząt jest utrzymywana przez intubację, wentylację mechaniczną i ciągłe monitorowanie on-line różnych parametrów fizjologicznych i sercowo-naczyniowych: temperatury ciała, ogólnoustrojowego ciśnienia krwi, tętna i wysycenia hemoglobiny. W ten sposób ciśnienie perfuzji mózgowej może być ściśle monitorowane, co skutkuje mniej zmienną objętością wynaczynionej krwi. Pozwala to na lepszą standaryzację wewnątrznaczyniowej perforacji filamentu u myszy i sprawia, że cały model jest wysoce powtarzalny. Dzięki temu jest łatwo dostępny do badań farmakologicznych i patofizjologicznych na myszach typu dzikiego i genetycznie zmienionych.

Wprowadzenie

SAH to podtyp udaru o najmniej korzystnym wyniku dla pacjentów: 40% pacjentów umiera w ciągu miesiąca po krwawieniu¹, a ci, którzy przeżyli, rzadko mają klinicznie korzystny wynik.

Zdecydowana większość spontanicznych SAH (80%) jest spowodowana pęknięciem tętniaków wewnątrzczaszkowych, które najczęściej znajdują się wzdłuż przedniej i tylnej tętnicy łączącej, tętnicy podstawnej i tętnicy środkowej mózgu (MCA)².

Takie tętniaki są trudne do modelowania u zwierząt, dlatego też modele zwierzęce SAH są wykonywane albo przez wstrzyknięcie krwi do przestrzeni podpajęczynówkowej/komór mózgowych, albo przez wewnątrznaczyniową perforację naczynia podpajęczynówkowego.

Autologiczne wstrzyknięcie krwi do cisterna magna jest łatwe do wykonania i powtarzalne, ponieważ objętość krwi może być bezpośrednio kontrolowana³. Niestety, niektóre aspekty patofizjologii SAH, np. uszkodzenie naczynia, nie mogą być modelowane za pomocą tej procedury. Innym technicznym podejściem do indukcji SAH jest otwarcie żyły wewnątrzmostkowej⁴.

Jednak wewnątrzświetlne CWp w gałęzi MCA wydaje się być procedurą, która najdokładniej modeluje patofizjologię u ludzi⁵. Metoda została opracowana i po raz pierwszy opisana na szczurach przez Bedersona i współpracowników oraz w tym samym czasie przez Veelkena i współpracowników^6,7. Później model perforacji śródświetlnej został dostosowany do myszy^8,9. Włókno jest wprowadzane do tętnicy szyjnej zewnętrznej (ECA) i przesuwane do podstawy czaszki przez tętnicę szyjną wewnętrzną (ICA). W punkcie rozgałęzienia MCA włókno perforuje naczynie i indukuje krwawienie do przestrzeni podpajęczynówkowej u podstawy czaszki. Krew następnie rozprowadza się do pozostałej przestrzeni podpajęczynówkowej wzdłuż szczelin i naczyń krwionośnych. Krwawienie zostaje zatrzymane przez tworzenie się skrzepu w miejscu perforacji, ale mogą wystąpić krwawienia wtórne, które często są szkodliwe u pacjentów¹⁰. W związku z tym wewnątrznaczyniowy model filamentu stał się szeroko stosowanym modelem SAH w ciągu ostatnich kilku lat. Najczęściej wymienianą wadą modelu z perforacją filamentu jest to, że objętość wycieku nie może być bezpośrednio kontrolowana i dlatego może być zmienna. Zmienność tę można znacznie zmniejszyć poprzez ścisłą kontrolę fizjologii zwierząt i ICP po krwotoczności.

Myszy mają tę wielką zaletę, że dostępna jest duża liczba genetycznie modyfikowanych szczepów. Jednak ze względu na ich niewielkie rozmiary zabiegi chirurgiczne są zwykle bardziej skomplikowane niż u większych gatunków, np. szczurów czy królików. W związku z tym zmniejszanie skali technik opracowanych dla szczurów w stosunku do myszy często nie prowadzi do pożądanych rezultatów, np. ponieważ myszy mają bardzo ograniczoną masę ciała i objętość krwi, należy stosować nieinwazyjne techniki analizy ciśnienia krwi i gazometrii krwi, a także wysycenia hemoglobiny i monitorowania tętna, gdy tylko jest to możliwe. W związku z tym celem niniejszej publikacji jest opisanie modelu perforacji filamentu dla SAH u myszy oraz pokazanie, w jaki sposób model ten może być wykonany w sposób znormalizowany i wysoce powtarzalny.

Protokół

Wszystkie zabiegi chirurgiczne zostały poddane ocenie etycznej i zatwierdzone przez rząd Górnej Bawarii (numer referencyjny: 55.2-1-54-2532.3-13-13 i -2532-136-11). Zwierzęta to samce myszy C57BL/6 o masie ciała około 25 g.

1. Przygotowanie zwierząt

1. Wywołaj znieczulenie, umieszczając mysz w komorze. Przepłukać komorę 5% izofluranem, aż zwierzę straci przytomność.
2. Wstępnie zmieszane środki znieczulające wstrzyknąć dootrzewnowo: fentanyl (0,05 mg/kg), midazolam (5 mg/kg) i medetomidynę (0,5 mg/kg). Sprawdzaj refleksy przed i regularnie w trakcie zabiegu. Wstrzykuj ponownie jedną trzecią początkowej ilości co godzinę, aby utrzymać znieczulenie.
3. Zaintubować jamy ustnej i tchawicy za pomocą rurki wykonanej z cewnika żylnego 20 G¹¹. Do intubacji przymocuj zwierzę na pochyłej platformie (30°), cofnij język za pomocą zgiętych kleszczy, uwidocznij struny głosowe pod mikroskopem operacyjnym i włóż rurkę do tchawicy podczas wdechu.
4. Umieść mysz w pozycji leżącej i sprawdź prawidłowe ułożenie rurki za pomocą kawałka bawełny lub mikrokapnografu.
5. Podłączyć rurkę intubacyjną do respiratora. Przewietrz mysz powietrzem pokojowym uzupełnionym 25% tlenem o częstotliwości 180-220 oddechów/min i objętości wyrzutowej 200-250 μl.
6. Podłączyć rurkę intubacyjną do mikrokapnografu. Utrzymuj końcowe pCO₂ na poziomie 30 mmHg, regulując częstotliwość wentylacji.
7. Włożyć sondę temperatury doodbytniczej i umieścić zwierzę na poduszce grzewczej, aby utrzymać temperaturę ciała wynoszącą 37 °C.
8. Załóż czujnik pulsoksymetru pierścieniowego na prawą tylną łapę.
9. Otwórz skórę nad czaszką nożyczkami. Nacięcie powinno mieć długość około 0,5 cm i znajdować się między uchem a okiem.
10. Wytnij lewy mięsień skroniowy skalpelem z kości skroniowej.
11. Przyklej laserową sondę przepływomierza dopplerowskiego (LDF) do lewej kości skroniowej. Trzymaj sondę w ustalonej pozycji, aż klej stwardnieje.
12. Wywierć otwór o średnicy około 1.5 mm za pomocą wiertła dentystycznego w lewej kości skroniowej. Schłodzić kość solą fizjologiczną, aby zapobiec uszkodzeniom cieplnym.
13. Włóż sondę ICP do jamy czaszki. Przepchnij się do przodu tak grzbietowo, jak to możliwe, aby zapobiec uszkodzeniu tkanki mózgowej i krwawieniu.
14. Jeśli sonda znajduje się we właściwej pozycji, zamocuj ją i uszczelnij cementem. Pozostaw cement do wyschnięcia na 5 minut.
15. Ostrożnie obróć mysz do pozycji leżącej.
16. W celu ciągłego monitorowania ciśnienia krwi należy cewnikować lewą tętnicę udową.
17. Podłącz cewnik udowy do urządzenia monitorującego ciśnienie krwi.

2. Indukcja SAH

1. Otwórz skórę nożyczkami od mostka do podbródka (2 cm). Tępo wypreparuj tkankę łączną i odsuń gruczoły ślinowe na bok.
2. Odsłoń lewą tętnicę szyjną wspólną (CCA) i zmobilizuj ją. Zachowaj nerw błędny, który biegnie w tej samej osłonce tkanki łącznej co CCA. Poruszaj czaszką oraz odsłaniaj i mobilizuj ICA i ECA przy użyciu tej samej techniki.
3. Należy podwiązać Trybunał Obrachunkowy jak najdalej od czaszki.
4. Wstępnie ustaw dwie dodatkowe ligacje dla filamentu wokół ECA.
5. Tymczasowo zablokuj CCA i ICA za pomocą mikroklipsów. Umieść mikroklipsy za pomocą aplikatora do mikroklipsów. Upewnij się, że klipsy są prawidłowo założone, delikatnie odciągając je do tyłu.
6. Wytnij otwór do włożenia filamentu do ECA za pomocą nożyczek do naczyń.
7. Włóż filament Prolene 5-0 o długości 12 mm do ECA.
8. Zamknij miejsce wprowadzenia jednym wcześniej ustalonym podwiązaniem.
9. Usuń mikroklipsy za pomocą aplikatora Microclip z CCA i ICA.
10. Wsuń włókno za pomocą kleszczyków do ICA, aż ICP się podniesie. Nagły wzrost ICP wskazuje na indukcję krwawienia.
11. Natychmiast wyjąć włókno i podwiązać ECA, zamykając kolejno obie wstępnie ustawione ligacje. Zapobiega to wykrwawianiu się z miejsca wkłucia.
12. Zszyj ranę skóry.
13. Monitoruj parametry fizjologiczne zwierzęcia przez kolejne 20 minut.
14. Usuń sondy ICP i LDF i zszyj ranę skóry.

3. Koniec eksperymentu

1. Przeprowadzić perfuzję zwierzęcia przezsercowo z 20 ml soli fizjologicznej (temperatura pokojowa), a następnie 20 ml 4% PFA w PBS (4 °C).
2. Wypreparuj mózg z czaszki. Przetnij czaszkę w linii środkowej i między jamami oczodołu. Następnie oderwij kość od mózgu.
3. Oceń rozkład krwi w przestrzeni podpajęczynówkowej.

4. Rozważania w przypadku operacji przetrwania (nie pokazane w filmie)

1. Karprofen (4 mg/kg mc. należy wstrzyknąć podskórnie) w celu znieczulenia pooperacyjnego bezpośrednio po indukcji znieczulenia. W okresie obserwacji pooperacyjnej karprofen (4 mg/kg mc. podskórnie) jest wstrzykiwany co 24 godziny.
2. Zamiast inwazyjnego pomiaru ciśnienia krwi skorzystaj z nieinwazyjnego systemu monitorowania ciśnienia krwi.
3. W celu zakończenia znieczulenia należy wstrzyknąć podskórnie środki antagonizujące: nalokson (1,2 mg/kg), flumazenil (0,5 mg/kg) i atipamezol (2,5 mg/kg).
4. Ekstubować zwierzę.
5. Po odzyskaniu odruchów należy umieścić zwierzę w nagrzanej komorze. Utrzymywać zwierzę w temperaturze około 32 °C przez 24 godziny.
6. Zwierzęta są regularnie sprawdzane pod kątem spontanicznego oddychania i ich ogólnego stanu w pierwszych godzinach po zabiegu. Jeśli pień mózgu jest dotknięty chorobą, zwierzęta mają problemy z oddychaniem i powinny zostać poddane eutanazji.
7. Zwierzęta są codziennie badane pod kątem ich ogólnego stanu i masy ciała, a także pod kątem deficytów neurologicznych i sensorycznych¹⁵.

Wyniki

Śmiertelność

Po opanowaniu techniki chirurgicznej procedura ta nie powoduje śmiertelności śródoperacyjnej. Ponadto krwawienie można wywołać u niemal wszystkich zwierząt. Śmiertelność pooperacyjna wynosi 30-40%, przy czym większość zwierząt ginie w 1. dobie po zabiegu (Rycina 5).

Wartości ICP po SAH

ICP przed krwawieniem wynosi około 4 mmHg. Krwawienie powoduje gwałtowny wzrost ICP do 120 mmHg. Następnie wartości ICP stabilizują...

Dyskusja

Możliwości leczenia po SAH są rzadkie i w większości nieskuteczne. W związku z tym należy lepiej zrozumieć patofizjologię pokrwotocznego uszkodzenia mózgu, aby zidentyfikować nowe cele terapeutyczne i opracować nowe podejścia terapeutyczne. Standaryzowane i dobrze odtwarzalne modele zwierzęce zwierząt modyfikowanych genetycznie, tj. myszy, mają kluczowe znaczenie dla takich badań. Model CWp stał się szeroko stosowanym modelem SAH, ponieważ bardzo przypomina patofizjologię u ludzi; Jednak jego stosowanie u myszy ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Equipment
operation mikroskop	Leica	KL2500
parownik izofluranowy	Harvard Instruments	Ciągły przepływ waporyzatora
	Higo Sachs
	temperatury Hugo Sachs	Type 340
	FHC	DC Wiertarka
dentystyczna	Monitor ICP Paggen	Labset-N
Monitor			ICP Monitor ICP
Ciśnieniomierz	AD Instruments	FE221
	World Precision Instruments	SP101IZ
pulsoksymetr	Kent Scientific	MouseSTAT
Analogowy monitor danych LDF	Perimed	Periflux 5000
	AD Instruments	Power Lab 16/35
Materiał
cement do mocowania sondy ICP	cementowy		Speiko
do mocowania sondy LDF	Klej cyjanoakrylowy Bob Smith Industries (zestaw Maxi Cure i Insta)
cewnik żylny	Johnson Johnson	Jelco skrzydlaty cewnik dożylny; REF 4076	zmodyfikowana rurka intubacyjna
do cewnika udowego	Smiths Medical	Fine Bore Polythene Tubing; średnica wewnętrzna: 0,28 mm, średnica zewnętrzna: 0,61 mm; REF 800/100/100	przycięty do długości 30 cm
filament do perforacji naczyń	Ethicon	Prolene 5-0	przycięty do 12 mm
długości sprzęt chirurgiczny	Fine Scientific Instruments	kleszcze medyczne #5, nożyczki do naczyń 8 cm, mikroklips 4 mm szczęka

Mikrokapnograf Hugo Sachs Regulator Regulator temperatury Bridge Amp Pompa strzykawkowa Klej karboksylowy