Ustalenie minimalnego stężenia bakteriobójczego środka przeciwdrobnoustrojowego dla komórek planktonowych (MBC-P) i komórek biofilmu (MBC-B)

Podsumowanie

Ten protokół pozwala na bezpośrednie porównanie odporności na planktonę i biofilm dla szczepu bakteryjnego, który może tworzyć biofilm in vitro przy użyciu 96-dołkowej płytki mikromiareczkowej. Bakterie planktonowe lub biofilm są narażone na seryjne rozcieńczenia wybranego środka przeciwdrobnoustrojowego. Żywotność określa się na podstawie wzrostu na płytkach agarowych.

Streszczenie

Ten protokół pozwala na bezpośrednie porównanie odporności na planktonę i biofilm dla szczepu bakteryjnego, który może tworzyć biofilm in vitro. Bakterie są inokulowane do studzienek 96-dołkowej płytki do mikromiareczkowania. W przypadku testu planktonowego do zawiesin bakteryjnych dodaje się seryjne rozcieńczenia wybranego środka przeciwdrobnoustrojowego. W teście biofilmu, po zaszczepieniu, bakterie pozostawia się do utworzenia biofilmu przez określony czas. Nieprzyłączone komórki są usuwane ze studzienek, pożywka jest uzupełniana i dodawane są seryjne rozcieńczenia wybranego środka przeciwdrobnoustrojowego. Po ekspozycji na środek przeciwdrobnoustrojowy komórki planktonu są badane pod kątem wzrostu. W przypadku testu biofilmu pożywkę odświeża się świeżą pożywką pozbawioną środka przeciwdrobnoustrojowego, a komórki biofilmu pozostawia się do regeneracji. Żywotność komórek biofilmu jest oznaczana po okresie rekonwalescencji. MBC-P dla środka przeciwdrobnoustrojowego definiuje się jako najniższe stężenie leku, który zabija komórki w kulturze planktonowej. Natomiast MBC-B dla szczepu określa się poprzez wystawienie wstępnie uformowanych biofilmów na rosnące stężenia środka przeciwdrobnoustrojowego przez 24 godziny. MBC-B definiuje się jako najniższe stężenie środka przeciwdrobnoustrojowego, który zabija komórki w biofilmie.

Wprowadzenie

Testy odporności na antybiotyki zostały początkowo opracowane do badania odporności planktonowych (swobodnie pływających) kultur bakterii. Ponieważ wiele infekcji bakteryjnych obejmuje biofilmy (komórki przyczepione powierzchniowo), byliśmy zainteresowani opracowaniem metody oznaczania oporności na antybiotyki specyficznej dla biofilmu. Jednak większość testów oporności na antybiotyki słabo nadaje się do pomiaru oporności biofilmów. Na przykład określenie minimalnego stężenia hamującego (MIC) jest złotym standardem w określaniu oporności kultur bakterii planktonowych na antybiotyki ¹. Test ten polega na zmieszaniu rozcieńczonej kultury planktonowej z serią rozcieńczeń antybiotyku. Stężenie antybiotyku, które hamuje widoczny wzrost komórek planktonu, to MIC. Ponieważ test ten opiera się na hamowaniu wzrostu, z definicji nie może działać z kulturami biofilmu, co wymaga zbadania wrażliwości komórek w wyrośniętym biofilmie na antybiotyki. Zamiast mierzyć zahamowanie wzrostu, opisany tutaj test MBC-B określa stężenie antybiotyku, który zabija komórki już istniejące w biofilmie. W związku z tym test ten ma na celu naśladowanie leczenia antybiotykami ustalonych infekcji biofilmu i zapewnienie bardziej odpowiedniego obrazu oporności bakterii na antybiotyki in vivo.

Ponieważ biofilmy są na ogół bardziej odporne na antybiotyki niż kultury planktonowe ^2-4 , konieczne było opracowanie metody, która bezpośrednio łączy odporność biofilmu na antybiotyki z odpornością kultury planktonowej. Kolejnym celem tej metody jest możliwość bezpośredniego porównania poziomu oporności na antybiotyki między komórkami planktonicznymi i biofilmowymi. Opisane tutaj testy MBC-P i MBC-B umożliwiają to, ponieważ komórki są hodowane w podobnych warunkach. Wykorzystaliśmy tę metodę do zbadania kilku genów, które są ważne dla oporności na antybiotyki specyficznej dla biofilmu ^5-8 .

Protokół

1. MBC-B

1. Uprawa biofilmu (zaadaptowane z O'Toole⁹).
   1. Hoduj kulturę interesującego gatunku dzikiego i zmutowanego szczepu przez 16 godzin w bogatym podłożu w temperaturze 37 °C.
   2. Rozcieńczyć nasycone kultury przez noc w stosunku 1:100 do świeżej pożywki w celu oznaczenia oporności na antybiotyki. Standardową pożywką dla P. aeruginosa jest pożywka minimalna M63 uzupełniona siarczanem magnezu i argininą (patrz Tabela 1). Pożywka ta stymuluje tworzenie bardziej wytrzymałego biofilmu.
   3. Dodać 100 μl rozcieńczenia na basenik do 96-dołkowego naczynia do mikromiareczkowania (patrz Tabela 1). Ponieważ testy te są zwykle wykonywane w trzech egzemplarzach dla każdego szczepu, powinny istnieć 24 dołki dla każdego szczepu.
   4. Inkubować płytkę do mikromiareczkowania przez 24 godziny w temperaturze 37 °C.
2. Wystawienie wstępnie uformowanego biofilmu na działanie gradientu stężeń antybiotyku
   1. Przygotuj serię 10-krotnych rozcieńczeń antybiotyku na 7 dołków. Przykład: dla antybiotyku tobramycyny końcowe stężenia w studzienkach wynoszą 0,4, 0,2, 0,1, 0,05, 0,025, 0,0125 i 0,006 mg/ml ^5-8 . Z zapasu 25 mg/ml przygotować 10 rozcieńczeń 4, 2, 1, 0,5, 0,25, 0,125 i 0,06 mg/ml. Pozostaw na lodzie.
   2. Usunąć zużyty supernatant (zawierający komórki planktonowe) za pomocą pipety wielokanałowej (patrz Tabela 1).
   3. Dodać 90 μl M63 (Mg/Arg) do wszystkich studzienek.
   4. Dodać 10 μl z każdego 10-krotnego stężenia antybiotyku, aby osiągnąć pożądane stężenia końcowe. Dodać 10 μl wody (bez kontroli antybiotyków) do końcowego dołka dla każdej kontrpróby i szczepu.
   5. Inkubować płytkę do mikromiareczkowania przez 24 godziny w temperaturze 37 °C.
3. Odświeżenie podłoża i umożliwienie oderwania żywych komórek.
   1. Usunąć zużyty supernatant (zawierający komórki planktonowe) za pomocą pipety wielokanałowej.
   2. Dodać 115 μl M63 (Mg/Arg) do wszystkich studzienek.
   3. Inkubować płytkę do mikromiareczkowania przez 24 godziny w temperaturze 37 °C.
4. Test na żywe komórki.
   1. Oznaczyć dwie płytki agarowe LB na 96-dołkową płytkę do mikromiareczkowania.
   2. Wysterylizuj urządzenie wielobolcowe (patrz Tabela 1), zanurzając zęby w 100% etanolu i przepuszczając bolce przez otwarty płomień palnika Bunsena. Powtórzyć. Niech zęby lekko ostygną. Za pomocą urządzenia wielobolcowego przenieś ~ 3 μl (ilość, która jest zwykle zatrzymywana na końcach zębów) kultury planktonowej z każdej studzienki płytki mikromiareczkowej na powierzchnię płytki agarowej LB.
   3. Inkubować płytki agarowe LB przez 16 godzin w temperaturze 37 °C.
   4. Określ minimalne stężenie bakteriobójcze antybiotyku, identyfikując na oko punkt odcięcia dla wzrostu bakterii (ryc. 1).

2. MBC-P

1. Przygotowanie szczepów bakteryjnych
   1. Hoduj kulturę interesującego gatunku dzikiego i zmutowanego szczepu przez 16 godzin w bogatym podłożu w temperaturze 37 °C.
   2. Rozcieńczyć nasycone kultury przez noc w stosunku 1:100 do świeżej pożywki w celu oznaczenia oporności na antybiotyki. Standardową pożywką dla P. aeruginosa jest pożywka minimalna M63 uzupełniona siarczanem magnezu i argininą (patrz Tabela 1).
   3. Dodać 90 μl rozcieńczenia na dołek do 96-dołkowego naczynia do mikromiareczkowania (patrz tabela 1). Ponieważ testy te są zwykle wykonywane w trzech egzemplarzach dla każdego szczepu, powinny istnieć 24 dołki dla każdego szczepu.
2. Wystawienie komórek planktonowych na działanie gradientu stężeń antybiotyku
   1. Przygotuj 10-krotną serię rozcieńczeń antybiotyku na 7 dołków. Przykład: dla antybiotyku tobramycyny końcowe stężenia w studzienkach wynoszą 0,032, 0,016, 0,008, 0,004, 0,002, 0,001 i 0,0005 mg/ml. Z zapasu 25 mg/ml przygotować roztwory 0,32, 0,16, 0,08, 0,04, 0,02, 0,01 i 0,005 mg/ml. Pozostaw na lodzie.
   2. Dodać 10 μl z każdego 10-krotnego stężenia antybiotyku, aby osiągnąć pożądane stężenia końcowe. Dodać 10 μl wody (bez kontroli antybiotyków) do końcowego dołka dla każdej kontrpróby i szczepu.
   3. Inkubować płytkę do mikromiareczkowania przez 24 godziny w temperaturze 37 °C.
3. Test na żywe komórki.
   1. Oznaczyć dwie płytki agarowe LB na 96-dołkową płytkę do mikromiareczkowania.
   2. Wysterylizuj urządzenie wielobolcowe (patrz Tabela 1), zanurzając zęby w 100% etanolu i przepuszczając bolce przez otwarty płomień palnika Bunsena. Powtórzyć. Niech zęby lekko ostygną. Za pomocą urządzenia wielobolcowego przenieś ~ 3 μl (ilość, która jest zwykle zatrzymywana na końcach zębów) kultury planktonowej z każdej studzienki płytki mikromiareczkowej na powierzchnię płytki agarowej LB.
   3. Inkubować płytki agarowe LB przez 16 godzin w temperaturze 37 °C.
   4. Określ minimalne stężenie bakteriobójcze antybiotyku, identyfikując na oko punkt odcięcia dla rozwoju bakterii (ryc. 2).

Wyniki

Testy MBC-P i MBC-B zostały przeprowadzone, porównując czułość dzikiego typu PA14 z PA14 ∆ndvB. Jako antybiotyk stosowano tobramycynę. Przedstawiono wyniki odpowiadające krokowi 1.4.4 (rysunek 1) i krokowi 2.3.4 (rysunek 2). PA14 i ∆ndvB inokulowano do testów MBC-P i MBC-B w trzech egzemplarzach. Po wykonaniu kroków 1.0-1.4 protokołu MBC-B i kroków 2.0-2.3 protokołu MBC-P, żywe komórki zostały posiane na płytce agarowej LB. Stężenia tobramycyny (

Dyskusja

Oporność na antybiotyki w komórkach planktonowych definiuje się jako wzrost minimalnego stężenia hamującego (MIC) antybiotyku spowodowany trwałą zmianą w komórkach (np. mutacją). Zidentyfikowane do tej pory mechanizmy odporności lub tolerancji specyficznej dla biofilmu są wynikiem ekspresji genów typu dzikiego w biofilmach. W związku z tym klasyczna definicja odporności nie ma zastosowania do biofilmów. Przedstawiono jednak inny zestaw definicji: mechanizmy oporności uniemożliwiają antybiotykowi dostęp do celu, ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1x  M63			Przygotuj się jako 5x  Zapas M63 przez rozpuszczenie 15 g KH2PO4, 35g K2HPO4 i 10g (NH4)2SO4 w 1 l wody. Ten bulion nie musi być sterylizowany w autoklawie i może być przechowywany w temperaturze pokojowej. Rozcieńczyć 5x  zapas 1:5, autoklaw, ostudzić, a następnie dodać żądane składniki.
KH2PO4	Fisher	P285-500
K2HPO4	Fisher	P288-500
(NH4)2SO4	Sigma	A5132
Siarczan magnezu	Fisher	M63-500	Dodaj do 1 mM końcowego stężenia.  Przygotuj jako 1 M zapas w wodzie i autoklawie.
Tobramycyna	Sigma		Przygotuj 50 mg/m  skład. Aliquot i przechowuj pod adresem -20°C.
Arginina	Sigma	A5131	Dodaj do 0,4% końcowego stężenia.  Przygotuj jako 20% zapas w wodzie i sterylizuj filtrem.  To alternatywne źródło węgla/energii może zastąpić glukozę i casaminokwasy
96-dołkowe płytki mikromiareczkowe	Corning	3595	> Sterylne, płaskie dno, niskie parowanie
Tranferpette (pipeta wielokanałowa)	BrandTech	2703610	8-kanałowy, 20-200 &mie.; l
Urządzenie wielobolcowe	Dan-Kar	MC48	48 zębów pasuje do ½ 96-dołkowej płytki do mikromiareczkowania