Metody badania mechanizmów działania leków przeciwpsychotycznych w Caenorhabditis elegans

Podsumowanie

Przedstawiono podejścia do testowania działania leków przeciwpsychotycznych (APD) w Caenorhabditis elegans. Opisano testy do testowania wpływu leku na rozwój i żywotność oraz na szybkość pompowania gardła. Metody te mają również zastosowanie w eksperymentach farmakogenetycznych z klasami leków innymi niż APD.

Streszczenie

Caenorhabditis elegans to prosty organizm genetyczny, który można poddać zakrojonym na szeroką skalę przesiewom genetycznym do przodu i do tyłu oraz chemicznym badaniom genetycznym. W ramach projektu C. Genom Elegans obejmuje potencjalne cele leków przeciwpsychotycznych (APD) zachowane u ludzi, w tym geny kodujące białka niezbędne do syntezy neuroprzekaźników oraz do struktury i funkcji synaptycznej. Narażenie na APD powoduje opóźnienie rozwoju i/lub śmiertelność nicieni w sposób zależny od stężenia. Te fenotypy są częściowo spowodowane indukowanym przez APD hamowaniem pompowania gardła^1,2. Tak więc fenotyp rozwojowy ma podłoże nerwowo-mięśniowe, co czyni go przydatnym w badaniach farmakogenetycznych neuroleptyków. Tutaj przedstawiamy szczegółowe procedury testowania wpływu APD na rozwój nicieni i pompowanie gardła. W teście rozwojowym zsynchronizowane zarodki umieszcza się na płytkach z pożywką wzrostową nicieni (NGM) zawierającą APD, a następnie codziennie ocenia się etapy rozwoju zwierząt. W teście szybkości pompowania gardła młode dorosłe zwierzęta w stadium są testowane na płytkach NGM zawierających APD. Rejestrowana jest liczba pomp gardłowych w jednostce czasu i obliczana jest szybkość pompowania. Testy te mogą być wykorzystywane do badania wielu innych typów małych cząsteczek, a nawet dużych cząsteczek.

Wprowadzenie

Caenorhabditis elegans to prosty organizm genetyczny, który można poddać zakrojonym na szeroką skalę przesiewom genetycznym do przodu i do tyłu oraz chemicznym badaniom genetycznym. C. elegans jest wrażliwy na szerokie spektrum związków bioaktywnych i dlatego jest z powodzeniem stosowany do określania mechanizmów działania różnych takich związków. Na przykład związki bioaktywne badane za pomocą farmakogenetyki robaków obejmują agonistów receptora acetylocholiny (np. lewamizol, nikotynę, morintel i pyrantel), środki znieczulające (np. halotan), kofeinę, inhibitory cholinoesterazy (np. aldikarb, lannian i trichlorfon), fluor, związki pokrewne GABA (np. GABA i muscymol), iwermektynę, parakwat, estry forbolu i leki związane z serotoniną (np. serotoninę i imiprymina)³. Co więcej, C. elegans został wykorzystany do badań przesiewowych małych cząsteczek na dużą skalę, umożliwiając odkrycie nowych związków bioaktywnych i identyfikację nowych celów genetycznych⁴.

Genom C. elegans zawiera potencjalne cele leków przeciwpsychotycznych (APD) zachowane u ludzi, w tym geny kodujące białka niezbędne do syntezy neuroprzekaźników oraz struktury i funkcji synaptycznej⁵. W ten sposób neurogenetyka i neurobiologia C. elegans oferują metody odkrywania nowych molekularnych mechanizmów działania APD. U nicieni narażenie na APD we wczesnym okresie rozwoju powoduje opóźnienie rozwoju, a przy wyższych stężeniach śmiertelność^2,6. Ekspozycja na APD w wieku dorosłym powoduje fenotypy behawioralne. Na przykład ekspozycja na klozapinę hamuje poruszanie się i pompowanie gardła oraz zwiększa składanie jaj^1,2,7.

Opóźnienie rozwoju i śmiertelność wywołane przez APD są potężnymi fenotypami dla dużych chemicznych badań genetycznych. Te fenotypy są złożone o tyle, że prawdopodobnie mają więcej niż jedną podstawę komórkową i genetyczną. W związku z tym oczekuje się, że takie genetyczne badania przesiewowe dostarczą różnych pośrednich celów leków. Jednak nasze laboratorium przeprowadziło badania przesiewowe genów kandydujących i badanie przesiewowe RNAi całego genomu pod kątem supresorów opóźnienia rozwoju i śmiertelności wywołanej przez APD i z powodzeniem odzyskało geny, które prawdopodobnie kodują bezpośrednie cele, w tym receptory dopaminy, insuliny i nikotynowych receptorów acetylocholiny^2,8. Genetyczne badania przesiewowe oparte na zachowaniach wywołanych przez APD u dorosłych doprowadziły również do identyfikacji nowych celów APD, a obecnie walidujemy cele zarówno z rozwojowych, jak i behawioralnych badań przesiewowych u ssaków⁷. W związku z tym chemiczne podejście genetyczne bezkręgowców w celu odkrycia nowych molekularnych mechanizmów działania APD wydaje się być wykonalne^5,8.

Gardło C. elegans to narząd, który składa się z 20 neuronów, 20 komórek mięśniowych i 20 komórek dodatkowych, owiniętych błoną podstawną. Podobnie jak serce ssaków, gardło jest autonomiczne i stale pompuje pokarm ze środowiska zewnętrznego⁹. Zahamowanie tempa pompowania przez gardło upośledza wchłanianie pokarmu, a zatem mutacje lub leki, które hamują pompowanie przez gardło, powodują opóźnienie lub zatrzymanie rozwoju⁹. APD hamują tempo pompowania gardła, co częściowo odpowiada za ich wpływ na rozwój i żywotność^1,2. Tutaj używamy nietypowej klozapiny APD jako przykładu, aby zademonstrować testy leków na rozwój nicieni i pompowanie gardła.

Protokół

1. Test opóźnienia rozwoju/śmiertelności: Szczepy typu dzikiego (N2) i dwa zmutowane (Mut1 i Mut2) są testowane w trzech stężeniach klozapiny na płytce 12-dołkowej

1. W dniu 1 wlej 2 ml pożywki NGM¹⁰ do każdego dołka 12-dołkowej płytki (każda studzienka ma średnicę 2 cm) i pozostaw na noc do stwardnienia na stole w temperaturze pokojowej (RT). Tego samego dnia należy pobrać kolonię bakterii Escherichia coli OP50, zainfekować butelkę z 50 ml roztworu LB i wyhodować ją w wytrząsarce o temperaturze 37 °C przy obrotach 220 obr./min przez noc.
2. W dniu 2 przenieś 20 μl kultury bakteryjnej OP50 na środek każdej studzienki NGM. Inkubować płytki w inkubatorze o temperaturze 37 °C lub pozostawić je na noc w temperaturze pokojowej, aby trawnik bakteryjny stał się grubszy.
3. Przygotować roztwór podstawowy klozapiny o stężeniu 80 mM przez rozpuszczenie klozapiny w rozpuszczalniku DMSO (dimetylosulfotlenku). Następnie przygotować roztwór roboczy o stężeniu 80 μl z roztworem podstawowym rozcieńczonym w 1,7 mM kwasu octowego na podstawie tabeli 1.
   Uwaga: Roztwór roboczy dla danego narkotyku będącego przedmiotem zainteresowania musi zostać określony poprzez wykonanie serii wstępnych testów stężenia w celu znalezienia najbardziej odpowiedniego stężenia dla odróżnienia typu dzikiego od mutantów.
4. Przenieść 80 μl roztworu roboczego klozapiny na dobrze wysianą płytkę NGM i zakręcić płytką, aby roztwór mógł równomiernie rozprowadzić się na powierzchni. Poczekaj, aż talerz wyschnie. Płytkę należy użyć do oznaczenia tego samego dnia lub umieścić ją w inkubatorze o temperaturze 20 °C, aby użyć jej następnego dnia.
   Uwaga: Roztwór roboczy jest zawiesiną leku ze względu na niską rozpuszczalność klozapiny, zwłaszcza w wyższym stężeniu. Dlatego przed przeniesieniem roztworu na płytkę leku należy przetrząsnąć probówkę, aby zagwarantować, że stężenie leku jest dokładne.
5. Zmyj robaki z 3,5 cm płytki zawierającej wiele ciężarnych dorosłych osobników z buforem M9, a następnie odwiruj je w probówce o pojemności 15 ml z prędkością 2 000 obr./min przez 1 minutę.
6. Odessać supernatant. Dodać 5 ml roztworu wybielacza (NaOH:podchloryn:ddH₂O w stosunku 4:1:5) i rozbić nicienie, delikatnie odwracając probówki.
7. Obserwuj zwierzęta, aż połowa z nich się rozpuści po około 5 minutach. Obracaj jajka z prędkością 2,000 obr./min przez 1 minutę.
8. Odessać supernatant i szybko dodać 14 ml buforu M9.
9. Odwirowywać jaja z prędkością 2 000 obr./min przez 1 minutę i odessać supernatant, pozostawiając około 100 μl roztworu. Wiruj, aby zawiesić jaja.
10. Przenieś 2 μl jaj zawieszonych w M9 na zwykłą płytkę NGM, aby sprawdzić, ile jaj zostało przeniesionych. Dostosuj objętość zawieszonych jaj, aby upewnić się, że w każdym transferze jest około 30-35 jaj. Przenieść 30-35 jaj do każdego dołka na płytce testowej, a następnie inkubować w inkubatorze o temperaturze 20 °C przez 24 godziny.
11. W pierwszym dniu testu należy ocenić liczbę wyklutych jaj. Dostosuj całkowitą liczbę wyklutych zwierząt do 25 dołków, usuwając dodatkowe robaki, jeśli to konieczne.
12. W kolejnych dniach obserwuj zwierzęta i oceniaj je co 24 godziny. Etap rozwojowy jest oceniany na podstawie wielkości zwierzęcia i kształtu sromu¹¹. Eksperyment trwa 5-6 dni, a najsilniejszy efekt obserwuje się zwykle trzeciego lub czwartego dnia.
13. Wprowadź dane do pliku Excel i oblicz procent zwierząt na każdym etapie rozwoju dla każdego dnia eksperymentu. Generuj wykresy za pomocą funkcji "100% skumulowana kolumna" w menu "Kolumna 2-W".

2. Test pompowania gardła: młode dorosłe zwierzęta dla szczepów typu dzikiego i zmutowanego są oceniane na płytkach testowych z klozapiną

1. Płytka testowa jest wykonywana zgodnie z tym samym protokołem, który jest używany do testu opóźnienia rozwoju/śmiertelności.
2. Wybrać 50 zwierząt L4 dla każdego szczepu na wysiane płytki NGM na 24 godziny przed testem i inkubować robaki w temperaturze 20 °C.
3. Wybierz 10 zwierząt do dołka na płytce testowej. Następnie co 15-20 minut wybieraj 10 zwierząt do następnej studni.
4. Po tym, jak zwierzęta w pierwszej studzience były wystawione na działanie leku przez 30 minut, rozpocznij test, obserwując pompowanie gardła pod mikroskopem preparacyjnym i oceniaj pompy przez 20 sekund⁹. Po nacięciu pompowania gardła podnieś robaka z talerza.

Wyniki

1. Wynik testu opóźnienia rozwojowego/letalności

Typowy wynik testu opóźnienia rozwojowego/letalności przedstawiono na rycinach 1a i 1b. Podczas gdy zwierzęta typu dzikiego w grupie kontrolnej osiągnęły stadię dorosłych osobników ciężarnych (rycina 1a), zwierzęta typu dzikiego narażone na klozapinę znajdują się nadal w młodych stadiach larwalnych lub są martwe (rycina 1b). Rycina 1c przedstawia reprezentatywny wy...

Dyskusja

W tym miejscu opisujemy metody testowania wpływu APD na rozwój i zachowanie C. elegans. DMSO lub etanol służy do rozpuszczania klozapiny, ponieważ lek jest stosunkowo nierozpuszczalny w wodzie. Ponieważ donoszono, że rozpuszczalniki wpływają na biologię C. elegans ¹², niezbędne są grupy kontrolne z samym DMSO lub samym etanolem. Najwyższe stężenie DMSO stosowane w naszych testach wynosi do 3%, co nie ma oczywistego wpływu na rozwój C. elegans . DMSO może być stosowany do wielu małych...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Clozapine	Sigma	C6305
Dimetylosulfotlenek (DMSO)	Sigma	D8418
Kwas octowy (HAC)	Fisher	BP2401
Wodorotlenek sodu (NaOH)	EMD	SX0590-13
425044		podchlorynu	Sigma-Aldrich
5810	Eppendorf	5810 000.017
Wytrząsarka do inkubatora	New Brunswick Scientific	M1246-0006
Inkubator niskotemperaturowy 815	Precision Scientific	J1790-1B
Mikroskop stereoskopowy	Olympus	SZX12
szalka Petriego 35 x 10 mm	Fisher Scientific	NC9434271
12-dołkowa Płytka do hodowli tkankowych	BD Falcon	REF 353043

Wirówka