Artykuł metodologiczny

Indukcja inwazyjnego raka przejściowokomórkowego pęcherza moczowego u nienaruszonych immunologicznie ludzkich myszy transgenicznych MUC1: model rozwoju immunoterapii

DOI:

10.3791/50868

⸱

30 października 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine, Division of Hematology and Oncology, University of California, Davis, 2Comparative Pathology Laboratory, UC Davis School of Veterinary Medicine, University of California, Davis, 3Merck Serono Research, Merck KGaA, Darmstadt, Germany

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Model raka pęcherza moczowego wywołanego N-butylo-N-(4-hydroksybutylo)nitrozoaminą został opracowany u transgenicznych myszy ludzkich mucyny 1 (MUC1) w celu przetestowania immunoterapii ukierunkowanej na MUC1. Po podaniu szczepionki peptydowej ukierunkowanej na MUC1 potwierdzono odpowiedź cytotoksycznych limfocytów T na MUC1 poprzez pomiar poziomu cytokin w surowicy i aktywności specyficznej dla limfocytów T.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedkliniczny model inwazyjnego raka pęcherza moczowego został opracowany u transgenicznych (MUC1.Tg) myszy ludzkich mucyny 1 (MUC1) w celu oceny immunoterapii i/lub chemioterapii cytotoksycznej. Aby wywołać raka pęcherza moczowego, myszy C57BL/6 (MUC1.Tg i typu dzikiego) leczono doustnie rakotwórczą N-butylo-N-(4-hydroksybutylo)nitrozoaminą (OH-BBN) w dawce 3,0 mg / dobę, 5 dni / tydzień przez 12 tygodni. Aby ocenić wpływ OH-BBN na profil cytokin w surowicy podczas rozwoju guza, krew pełną pobierano przez krwawienia podżuchwowe przed leczeniem i co cztery tygodnie. Ponadto szczepionkę peptydową ukierunkowaną na MUC1 i placebo podawano grupom myszy co tydzień przez osiem tygodni. Przeprowadzono multipleksowe analizy immunologiczne mikrokulek fluorometrycznych cytokin w surowicy podczas rozwoju guza i po szczepieniu. Po zakończeniu badania przeprowadzono analizę ELISpot interferonu gamma (IFN-γ)/interleukiny-4 (IL-4) pod kątem odpowiedzi immunologicznej limfocytów T specyficznej dla MUC1 oraz oceny histopatologiczne typu i stopnia złośliwości nowotworu. Wyniki wykazały, że: (1) częstość występowania raka pęcherza moczowego zarówno u myszy typu MUC1.Tg, jak i dzikiego wynosiła 67%; (2) raki przejściowokomórkowe (TCC) rozwijające się w stosunku 2:1 w porównaniu z rakiem płaskonabłonkowym (SCC); (3) cytokiny zapalne zwiększały się z czasem podczas rozwoju guza; oraz (4) podanie szczepionki peptydowej indukuje profil cytokin w surowicy spolaryzowany Th1 i odpowiedź limfocytów T specyficzną dla MUC1. Wszystkie guzy u MUC1.Tg myszy były dodatnie pod względem ekspresji MUC1, a połowa wszystkich guzów u myszy MUC1.Tg i dzikich była inwazyjna. Podsumowując, stosując podejście zespołowe poprzez koordynację wysiłków farmakologów, immunologów, patologów i biologów molekularnych, opracowaliśmy immunologiczny, nienaruszony transgeniczny mysi model raka pęcherza moczowego, który wykazuje ekspresję hMUC1.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rak pęcherza moczowego jest czwartą najczęstszą formą raka i ósmą najczęstszą przyczyną zgonów z powodu raka u amerykańskich mężczyzn. Szacuje się, że w Stanach Zjednoczonych w 2013r. spodziewanych jest 72 500 nowych przypadków i 15 000 zgonów z powodu raka pęcherza moczowego wśród mężczyzn i kobiet1. Częstość występowania raka pęcherza moczowego jest około trzy razy wyższa u mężczyzn niż u kobiet. W Stanach Zjednoczonych rak przejściowokomórkowy (TCC) stanowi ponad 90% przypadków, podczas gdy rak płaskonabłonkowy (SCC) występuje mniej niż 2%2. Ogólny względny wskaźnik 5-letniego przeżycia w przypadku brodawkowatego TCC wynosi 91,5% w porównaniu do zaledwie 30,9% w przypadku SCC2. Chociaż nieinwazyjne brodawkowate TCC stanowią około 75% przypadków w momencie diagnozy, nawet przy leczeniu ponad 50% pacjentów doświadczy nawrotu w ciągu 5 lat, a do 30% tych pacjentów dojdzie do progresji do inwazyjnej choroby mięśni3,4. Typowe schematy leczenia choroby nieinwazyjnej mięśni obejmują przezcewkową resekcję (TUR), a następnie chemioterapię dopęcherzową. U pacjentów z guzami Ta lub T1 o wysokim stopniu złośliwości można wykonać powtórne TUR przed chemioterapią3,4. U pacjentów z nawrotami Ta o niskim stopniu złośliwości lub zmianami Ta lub T1 o wysokim stopniu złośliwości można zastosować TUR, a następnie chemioterapię uzupełniającą lub immunoterapię w postaci Bacillus Calmette-Guerin (BCG)3,4. Wykazano, że dopęcherzowa BCG jest lepsza od dopęcherzowej mitomycyny C pod względem czasu do nawrotu5. W przypadku inwazyjnej choroby mięśniowej T2 zalecanymsposobem leczenia jest radykalna cystektomia z chemioterapią neoadjuwantową lub bez niej3. U pacjentów z SCC radykalna cystektomia wydaje się być najskuteczniejszym sposobem leczenia6. Biorąc pod uwagę bardzo wysokie wskaźniki nawrotów pomimo najlepszych dostępnych metod leczenia, istnieje wyraźna potrzeba opracowania nowych, skuteczniejszych terapii raka pęcherza moczowego.

Rozszerzenie nowych immunoterapii raka pęcherza moczowego jest jednym z możliwych podejść, które może przynieść nadzieję na wydłużenie czasu przeżycia wolnego od choroby. Historycznie rzecz biorąc, BCG była jedyną skuteczną immunoterapią raka pęcherza moczowego. Uważa się, że jego mechanizm działania obejmuje niespecyficzną indukcję odpowiedzi immunologicznej typu T-helper 1 (Th1) poprzez wzrost poziomu interleukiny-2 (IL-2) i interferonu gamma (IFN-γ)4. Odporność komórkowa lub Th1 ma kluczowe znaczenie w immunoterapii nowotworów, ponieważ nigdy nie wykazano, aby odporność humoralna lub Th2 była skuteczna przeciwko guzom litym, z wyjątkiem przeciwciał skierowanych przeciwko receptorom czynnika wzrostu7. W celu poprawy korzyści płynących z monoterapii BCG, immunoterapia skojarzona IFN-α 2B/BCG została oceniona w badaniu klinicznym II fazy, uzyskując niejednoznaczne wyniki8. Alternatywnym podejściem do immunoterapii raka pęcherza moczowego może być celowanie w antygeny związane z nowotworem (TAA), których identyfikacja sprawiła, że immunoterapia nowotworów stała się bardziej specyficzna7.

Jednym z takich TAA jest mucyna 1 (MUC1), która jest glikoproteiną powierzchniową komórki, której nadekspresja występuje w wielu nowotworach komórek nabłonkowych, takich jak rak pęcherza moczowego, piersi, płuc i trzustki9,10. Ekspresja i modyfikacja MUC1 jest również znacznie zmieniona podczas kancerogenezy, tak że podglikozylacja odsłania antygenowe sekwencje aminokwasów znane jako zmienna liczba powtórzeń tandemowych (VNTR) na rdzeniu peptydu. Podczas gdy MUC1 jest własną cząsteczką, te immunodominujące regiony VNTR nie są zwykle narażone z powodu rozległej glikozylacji, a zatem są postrzegane przez układ odpornościowy jako obce11,12. Cytotoksyczne limfocyty T (CTL), które specyficznie rozpoznają epitopy MUC1, zostały wyizolowane z węzłów chłonnych drenujących guz pacjentek z rakiem piersi13, a także z krwi i szpiku kostnego pacjentów ze szpiczakiem14,15, co czyni MUC1 potencjalnym celem komórkowej odpowiedzi immunologicznej. Immunodominujące VNTR niedostatecznie glikozylowanej formy MUC1 są rozpoznawane przez CTL, co powoduje zniszczenie komórek nowotworowych16-19. Natywne komórkowe i/lub humoralne odpowiedzi immunologiczne na nowotworowy MUC1 nie są jednak wystarczająco silne, aby wyeliminować nowotwory. Aby wzmocnić już istniejącą słabą odpowiedź immunologiczną na MUC1, syntetyczne peptydy immunodominujące mogą być wprowadzone poprzez szczepienie, aby wytworzyć odpowiedź CTL wystarczająco silną, aby przynieść korzyści kliniczne18,20. Wykazano już, że liposomalna szczepionka MUC1 zwiększa przeżywalność pacjentów z rakiem płuc21,22, generuje CTL zdolne do zabijania komórek nowotworowych MUC1-dodatnich i wytwarza odpowiedź cytokin spolaryzowaną Th123,24. Przy wysokim poziomie ekspresji MUC19,11,25, rak pęcherza moczowego jest logicznym kandydatem do testowania immunoterapii ukierunkowanej na MUC126,27. Ponadto MUC1 ma potencjał jako czynnik prognostyczny w raku pęcherza moczowego28, ekspresja MUC1 w TCC jest istotnie związana ze stopniem i stopniem zaawansowania, a wykazano, że przerzutowe TCC nadal wykazują ekspresję MUC129.

Aby ocenić potencjalną użyteczność immunoterapii kierowanej przez MUC1 w raku pęcherza moczowego, opracowaliśmy immunologiczny, nienaruszony ludzki transgeniczny (MUC1.Tg) transgeniczny () model raka pęcherza moczowego na tle C57BL/630. Ludzki MUC1 ulega ekspresji jako białko własne pod kontrolą własnego promotora, co powoduje wzorzec ekspresji tkanek zgodny z obserwowanym u ludzi30,31. Myszy indukowano znanym czynnikiem rakotwórczym dla pęcherza moczowego N-butylo-N-(4-hydroksybutylo)nitrozoaminą (OH-BBN)32, a następnie powstałe guzy oceniano pod kątem ekspresji hMUC1 oraz typu i stopnia nowotworu. Aby ocenić wpływ czynnika rakotwórczego na poziom cytokin Th1/Th2 podczas rozwoju guza, okresowo pobierano próbki surowicy do analizy multipleksowej. Myszy były następnie leczone szczepionką peptydową ukierunkowaną na MUC1, a cytokina w surowicy i odpowiedzi immunologiczne oceniano za pomocą multipleksowego testu immunologicznego mikrokulek fluorometrycznych i ELISpot.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie badania i eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Uniwersytet Kalifornijski, Davis Institutional Animal Care and Use Administrative Advisory Committee.

1. MUC1.Tg Hodowla i rozmnażanie myszy

  1. UC Davis Mouse Biology Program (MBP) hoduje samce myszy typu dzikiego C57BL/6 z heterozygotycznymi samicami myszy MUC1.Tg C57BL/6 w celu założenia naszej kolonii hodowlanej. MUC1.Tg potomstwo jest dostarczane do badań w razie potrzeby.
  2. Personel MBP przycina palce u nóg potomstwa w określony wzór (0-99) w celu identyfikacji myszy i, jeśli ma to zastosowanie, przycina ogon. Tkanka palca u nogi lub ogona jest przetwarzana w celu genotypowania przy użyciu standardowej ekstrakcji DNA i analizy reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR).

2. Projekt badania

  1. Zadania w grupach analitycznych
    1. Zważ każdą mysz osobno na wadze i zapisz wagę w gramach dla każdej myszy.
    2. Ta część procedury obejmuje metodologię i projekt badania. W pierwszej części badania należy przypisać myszy MUC1.Tg i myszy typu dzikiego w tym samym wieku, aby rozpocząć indukcję raka pęcherza moczowego za pomocą OH-BBN. Eutanazja myszy 8 tygodni po ostatniej dawce OH-BBN w celu potwierdzenia obecności guzów pęcherza moczowego za pomocą histologii.
    3. W drugiej części badania losowo przydziel samce MUC1.Tg myszy do odpowiedniej liczby grup leczonych i kontrolnych. Myszy te będą monitorowane pod kątem cytokin w surowicy i odpowiedzi immunologicznej limfocytów T podczas indukcji i rozwoju guza, a następnie po zakończeniu badania 8 tygodni po ostatniej dawce OH-BBN.
  2. Indukcja raka pęcherza moczowego
    1. OH-BBN jest substancją rakotwórczą i wysoce toksyczną. Prosimy o zapoznanie się z wytycznymi zawartymi w karcie charakterystyki substancji niebezpiecznej i przestrzeganie ich podczas obchodzenia się z tą substancją chemiczną i jej przechowywania.
    2. Obliczyć stężenie roztworu dawkującego potrzebne do podania odpowiedniej dawki (3 mg) w objętości 100 μl każdej myszy na podstawie średniej masy ciała i liczby myszy w każdym badaniu i grupie.
    3. Rozcieńczyć OH-BBN w 100% etanolu. Doprowadzić końcowe stężenie do 30 mg/ml sterylną wodą. Końcowe stężenie etanolu w wodzie powinno wynosić 20:80, v/v.
    4. Podawać OH-BBN doustnie za pomocą igieł ze stali nierdzewnej, 20 G dziennie, 5 dni w tygodniu przez 12 tygodni, w zależności od przydziału grupy leczonej począwszy od 8 tygodnia życia.
  3. Zabiegi szczepień
    1. Rozpuść każdą fiolkę liofilizowanej szczepionki peptydowej w 600 μl 0,9% sterylnej soli fizjologicznej i dokładnie zawieś, pobierając roztwór przez igłę 0,5 cala 27 G 6x. Używając soli fizjologicznej, dostosuj stężenie tak, aby żądana dawka została dostarczona w objętości 100 μl.
    2. Począwszy od 20. tygodnia, po ostatniej dawce OH-BBN, szczepionkę należy podawać co tydzień przez ośmiotygodniowy cykl we wstrzyknięciu podskórnym 100 μl za pomocą igły 25 G (liczba tygodnia odpowiada wiekowi myszy).
  4. Monitorowanie i pobieranie próbek
    1. Zważ wszystkie myszy i badaj palpacyjnie pod kątem obecności nowych guzów raz w tygodniu. Poddaj eutanazji wszystkie myszy, które straciły ≥20% masy ciała lub jeśli występują wyczuwalne guzy, krew w moczu i/lub zatrzymanie moczu.
    2. Przed podaniem pierwszej dawki OH-BBN, a następnie w odstępach 4-tygodniowych, należy pobrać krew pełną poprzez krwawienie podżuchwowe. Zebrać krew do probówek do krzepnięcia surowicy (BD Microtainer) i odczekać 30 minut, aż krew zacznie krzepnąć.
    3. Odwirować próbki krwi w mikrowirówce o stężeniu 3 500 x g przez 10 minut. Ostrożnie przenieść surowicę do zakręcanych krioprobówek za pomocą pipety.
    4. Błyskawiczne zamrożenie w ciekłym azocie i przechowywanie w temperaturze -80 °C do czasu dalszej analizy za pomocą multipleksu.
    5. Osiem tygodni po ostatniej dawce OH-BBN poddać eutanazji wszystkie myszy przez uduszenie CO2 .
    6. Umieść każdą mysz na desce sekcyjnej i przygwoźdź za wszystkie cztery kończyny.
    7. Za pomocą kleszczy i nożyczek wykonaj poziome nacięcie w górnej części brzucha. Włóż nożyczki w nacięcie między warstwą naskórka a ścianą brzucha i delikatnie oddziel skórę od leżącej pod nią tkanki za pomocą kleszczy.
    8. Wykonaj pionowe nacięcie od poziomego nacięcia wzdłuż środkowej osi w kierunku przedniego końca myszy. Oddziel skórę od klatki piersiowej i za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml i igły 22 G nakłuj serce i zbierz krew płynnym i równomiernym pociągnięciem.
    9. Patrz kroki 2.4.3 i 2.4.4 w celu wyizolowania i przechowywania surowicy.
    10. Za pomocą kleszczy i nożyczek odetnij i odetnij resztę warstwy naskórka. Przeciąć ścianę jamy brzusznej i otrzewną i aseptycznie usunąć guz pęcherza moczowego do immunohistochemii (IHC) i Western blot.
    11. Zbierz śledzionę do analizy żywotności komórek (Muse) i ELISpot. W przypadku IHC umieść próbkę guza pęcherza moczowego w kasecie tkankowej i utrwal w schłodzonej formalinie przez noc w temperaturze pokojowej.
    12. Następnego dnia zastąp formalinę 70% etanolem.
    13. W celu analizy Western blot guza należy zhomogenizować guz, dodać bufor do ekstrakcji białka oraz inhibitory proteazy Halt i przenieść do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
    14. Wirować przez 30-60 sekund i trzymać na lodzie przez 5 minut. Błyskawicznie zamrozić w ciekłym azocie i rozmrozić w otaczającej wodzie. Powtórz proces wirowania, zamrażania i rozmrażania dwukrotnie.
    15. Odwirować próbki o masie 10 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i przenieść ekstrakty komórkowe do nowych, znakowanych probówek.
    16. Określ ilościowo stężenie, wykonując test białka kwasu bicynchoninowego (BCA) do pomiarów białka. Próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu, gdy będą gotowe do analizy Western blot.

3. Biologia molekularna/Western

Następujące procedury zostały przeprowadzone w celu sprawdzenia ekspresji MUC1 w tkance guza pęcherza myszy przy użyciu standardowego protokołu Western Blot (dane nie pokazane).

  1. Oddzielić ekstrakty białkowe za pomocą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym SDS (SDS-PAGE), a następnie przenieść na membranę PVDF za pomocą aparatu półsuchego.
  2. Zablokuj błonę przenoszoną przez białko 5% mlekiem beztłuszczowym w 0,1% Tween-20 w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS-T) o pH 7,4 przez 1 godzinę na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze pokojowej.
  3. Inkubować błonę przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej na wytrząsarce z przeciwciałem anty-MUC1 lub anty-β-aktyną w 0,1% PBS-T.
  4. Umyj membranę, dekantując roztwór i dodając 0,1% PBS-T. Obracaj membranę na wytrząsarce przez 5 minut i zdekantuj. Powtórz ten krok dwukrotnie.
  5. Inkubować błonę przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z peroksydazą chrzanowa (HRP).
  6. Umyć 3x (patrz krok 3.4).
  7. Postępuj zgodnie z protokołem zestawu do wzmocnionej chemiluminescencji (ECL), aby aktywować i odczytać fluorografię.

4. Multipleksowy fluorometryczny test immunologiczny mikrokulek

  1. Konfiguracja i obliczenia
    1. Korzystając z 96-dołkowej mapy płytowej, przypisz do studni puste miejsca, standardy, kontrole i nieznane. Obliczyć liczbę i objętość analitów, wychwytywać przeciwciała i streptawidynę-fikoerytrynę (SA-PE) potrzebne do testu.
    2. Pozwól, aby wszystkie i rozcieńczalniki osiągnęły równowagę do temperatury pokojowej. Przygotować wzorce i rozcieńczenia próbek, używając ślepej płytki 96-dołkowej.
    3. Odpuścić matrycę surowicy i liofilizowany wzorzec zgodnie z protokołem producenta i wykonać seryjne rozcieńczenia wzorca w stosunku 1:5 odpowiednim rozcieńczalnikiem w płytce 96-dołkowej. W przypadku studzienek ślepych użyj odpowiedniego rozcieńczalnika.
    4. Rozcieńczyć wszystkie kontrole i nieznane próbki w stosunku 1:2 w odpowiednim rozcieńczalniku w pozostałej części płytki 96-dołkowej.
    5. Aby uzyskać mieszaninę kulek, odpipetować wymaganą objętość odpowiedniego rozcieńczalnika do probówki o pojemności 15 ml. Wirować każdą fiolkę z kulkami przez 20 sekund i odpipetować wymaganą objętość każdego analitu do probówki o pojemności 15 ml.
    6. Zawsze chroń koraliki przed światłem, aby uniknąć fotowybielania. Nie umieszczaj płytki 96-dołkowej na materiale chłonnym, aby uniknąć utraty próbki w wyniku przesiąkania.
  2. Protokół testu
    1. Wstępnie zwilż dolną płytę 96-dołkowego filtra 200 μl buforu testowego i pozwól na całkowite namoczenie filtra. Delikatnie odcedź za pomocą 96-dołkowego aparatu próżniowego do płytek i osusz spód płytki ręcznikiem papierowym.
    2. Za pomocą pipety wielokanałowej odpipetować 25 μl matrycy surowicy do studzienek przypisanych dla ślepych prób i wzorców, a następnie odpipetować 25 μl buforu do oznaczania do studzienek przeznaczonych do kontroli i niewiadomych.
    3. Odpipetować 25 μl ślepej próby, wzorców, kontroli i niewiadomych do odpowiednich przypisanych studzienek. Wiruj mieszankę kulek przez 20 sekund i przenieś kulki do zbiornika.
    4. Odpipetować 25 μl kulki wymieszać z każdym dołkiem. Przykryj talerz folią aluminiową lub nieprzezroczystą pokrywką talerza, aby chronić go przed światłem.
    5. Potrząsaj płytką z prędkością 500 obr./min przez dwie godziny w temperaturze pokojowej na wytrząsarce do płytek. Odcedź i umyj płytkę 200 μl 0,1% Tween 20 w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS-T) dwukrotnie. Odcedź i osusz do sucha.
    6. Przygotować roztwór przeciwciała wychwytującego. Odpipetować wymaganą ilość 0,1% PBS-T i wychwycić przeciwciało do probówki o pojemności 15 ml i wirować przez 10 sekund. Przenieść mieszaninę przeciwciał wychwytujących do zbiornika i pipetować 25 μl do każdej studzienki.
    7. Potrząsaj płytką z prędkością 500 obr./min przez godzinę w temperaturze pokojowej na wytrząsarce do płytek. Odcedź i umyj płytkę dwukrotnie 200 μl 0,1% PBS-T. Odcedź i osusz do sucha.
    8. Przygotuj roztwór SA-PE. Odpipetować wymaganą objętość 0,1% PBS-T i SA-PE do probówki o pojemności 15 ml i wirować przez 10 sekund. Przenieść roztwór do zbiornika i odpipetować 25 μl do każdej studzienki.
    9. Potrząsaj płytką z prędkością 500 obr./min przez 30 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce do płytek. Odcedź i umyj płytkę dwukrotnie 200 μl 0,1% PBS-T. Odcedź i osusz do sucha.
    10. Odpipetować 100 μl 0,1% PBS-T i wstrząsnąć na wytrząsarce płytkowej z prędkością 500 obr./min przez co najmniej dwie minuty w celu ponownego zawieszenia kulek. Odczytaj i przeanalizuj tabliczkę na maszynie Luminex Lx200.

5. IFN-γ/IL-4 ELISpot Przygotowanie i analiza

  1. W komorze bezpieczeństwa biologicznego przetworzyć śledziony przez sita do tkanek nylonowych o wielkości 100 μm na 5 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) na sterylnych szalkach Petriego. Ułóż splenocyty na 3 ml pożywki do separacji limfocytów w sterylnych probówkach o pojemności 15 ml.
  2. Odwirować probówki o masie 600 x g przez 15 minut, aby oddzielić limfocyty od czerwonych krwinek. Przenieś warstwowe limfocyty powyżej gradientu do nowych sterylnych probówek o pojemności 15 ml.
  3. Dostosować objętość do 10 ml za pomocą sterylnego PBS. Odwirować zawiesinę o sile 600 x g przez 10 minut, aby osadzać komórki.
  4. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml PBS w celu zapewnienia żywotności komórek i policzyć za pomocą analizatora Muse. Postępuj zgodnie z protokołem Muse Count & Viability Kit.
  5. Wykonać seryjne rozcieńczenia limfocytów w probówkach wirówkowych z nakrętką zakrętką o pojemności 1,5 ml przy współczynnikach rozcieńczenia 1:10, 1:20 i 1:40 (lub w razie potrzeby) w odczynniku do liczenia i żywotności (minimalna całkowita objętość 300 μl). Kilkakrotnie pipetować każde rozcieńczenie w górę i w dół, aby wymieszać i przeanalizować na Muzie.
  6. Przygotuj mapę płytkową próbek i warunków dla płytki ELISpot. Przygotuj płytkę ELISpot zgodnie z protokołem producenta i odpipetuj 100 μl pożywki, peptydu (10 μg/ml) lub peptydu mieszającego (10 μg/ml) do każdego dołka.
  7. Odpipetować 100 μl zawiesiny komórek, dostarczając 1,0 x 106 komórek do każdego dołka i inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez noc.
  8. Postępuj zgodnie z protokołem producenta dla testu ELISpot. Przeanalizuj opracowaną płytkę ELISpot za pomocą mikroskopu preparacyjnego.
  9. Określ ilościowo wyniki, licząc liczbę kolorowych plamek odpowiadających każdemu analitowi w każdym dołku. Plamki odpowiadają liczbie komórek tworzących plamki (SFC) w każdym dołku.

6. Immunohistochemia (IHC) oraz barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E)

  1. Pobrać tkankę guza pęcherza moczowego zakonserwowaną w sposób opisany powyżej (sekcja 2.4.11), zanurzyć w parafinie i wykonać przekrój schodkowy pod kątem 4 μm w celu analizy immunohistochemicznej.
  2. Wykonaj IHC przy użyciu przeciwciała MUC1, które rozpoznaje region powtórzeń tandemowych MUC1. Użyj peroksydazy Animal Research Kit, aby zminimalizować reaktywność wtórnego przeciwciała myszy z endogenną immunoglobuliną obecną w tkance.
  3. Barwienie H&E należy wykonać przy użyciu standardowych protokołów.

7. Metody statystyczne

Dla Multiplex Fluorometric Microbead Immunoassay, użyj dwustronnego testu t Studenta, aby porównać średnie obserwowane stężenia cytokin w surowicy między grupą leczoną a kontrolną. W przypadku ELISpot użyj jednokierunkowej ANOVA, aby porównać kolonie tworzące plamki między kontrolą pożywki, zaszyfrowanymi peptydami i grupami peptydowymi. Użyj testu wielokrotnych porównań Dunnetta, aby zmniejszyć prawdopodobieństwo fałszywie dodatniego wyniku. Uważa się, że wartość p ≤0,05 jest znacząco różna dla wszystkich analiz.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedkliniczna ocena efektów nowych immunoterapii i kombinacji w raku pęcherza moczowego wymaga opracowania odpowiedniego modelu zwierzęcego. W naszym transgenicznym modelu myszy indukcja za pomocą chemicznego czynnika rakotwórczego OH-BBN spowodowała wysoki wskaźnik zachorowalności na raka pęcherza moczowego z przewagą TCC z pewną ilością SCC, co jest podobne do raka pęcherza moczowego u ludzi. Aby określić histologię guza, status ekspresji MUC1 i odpowiedź immunologiczną na leczenie szczepionką peptydową, 21 myszy MUC1...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Skuteczna indukcja inwazyjnego raka przejściowego i płaskonabłonkowego pęcherza moczowego u myszy MUC1.Tg ludzkich stanowi przedkliniczny model rozwoju immunoterapii. Badania immunoterapeutyczne wymagają zastosowania spontanicznego, nienaruszonego immunologicznie modelu w celu oceny odpowiedzi zapalnej na postęp guza w czasie, a także odpowiedzi immunologicznej na immunoterapię. W modelu spontanicznego rozwoju guza mikrośrodowisko guza pozostaje nienaruszone, a guzy rozwijają się w bardziej reprezentatywnym tempie wzrost...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DPV, GTW, SMG, CJK, AMG i GKH deklarują brak sprzecznych interesów. MWD jest głównym badaczem grantu otrzymanego od Merck KGaA, a MW jest pracownikiem Merck KGaA.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Programowi Biologii Myszy Uniwersytetu Kalifornijskiego w Davis za hodowlę myszy. Badania te zostały wsparte grantem firmy Merck KGaA z Darmstadt w Niemczech.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
odczynnik 
N-butyl-N-(4-hydroksybutylo)-nitrozoamina (OH-BBN)TCI AmericaB0938
20 G Igły do zgłębnikaPopper Sons, Inc.7921Szczepionka
peptydowaNieNie dotyczyŚrodek badany
BD MicrotainersBD365957
Kasety tkankoweSimportM490-12
10% neutralna buforowana formalinaFisher ScientificSF100-4
Bufor do lizyPierce87787
Zatrzymaj proteazę & Koktajl inhibitorów fosfatazyThermo Scientific78444
Zestaw do oznaczania białek Pierce BCAPierce23225
Zestaw cytokin myszy 20plexInvitrogenLMC006
Magnetyczne kulki mikrosferyczneLuminexMC100xx-01xx to region kulek
Przeciwciało anty-mysie TNF- Wychwytujące BDPharmingen551225
Przeciwciało anty-mysie wykrywające TNFBD Pharmingen554415
Przeciwciało przeciw myszom IFN- WychwytująceAbcamab10742
Przeciwciało anty-mysie IFN- WykrywająceAbcamab83136
PBS, pH 7,4SigmaP3813-10PAK
Tween-20FisherBP337-500
Bufor testowyMilliporeL-MAB
Cytokina StandardowaMilliporeMXM8070
Wieloekranowe płytki filtracyjne HTS 96wellMilliporeMSBVN1210
SA-PEInvitrogenSA10044
100 m Nylonowe sita tkankoweBD352360
Media do separacji splenocytówLonza17-829E
TNF- /IL-4 ELISpot płytkiR& D SystemsELD5217
Królicze przeciwciało monoklonalne anty-MUC1Epitomics2900-1
Koza Przeciwciało monoklonalne antyaktynySigmaA1978
Przeciwciało przeciw królikowi HRPPromegaW401B
Kozie przeciwciało anty-mysie HRPSanta Cruz Biotechnology, Inc.SC-2005
Membrana PVDFBioRad162-0174
Mini Protean TGX Prefabrykowane żeleBioRad456-1083
Muse Count & Zestaw żywotnościMilliporeMCH100104
Przeciwciało MUC1BD Pharmingen550486Przeciwciało IHC
Zestaw peroksydazy do badań na zwierzętach DakoK3954IHC barwienie
Sprzęt i oprogramowanie
Millipore Aparat próżniowyMilliporeMSVMHTS00
Luminex Lx200Millipore / Luminex40-013Wyprodukowany przez Luminex, dystrybuowany przez Millipore
Oprogramowanie Luminex XponentMillipore / LuminexN/Awersja 3.1; dołączone do oprogramowania Luminex Lx200
Milliple AnalystMilliplex / VigeneTech40-086wersja 5.1
Analizator komórek MuseOprogramowanie Millipore0500-3115
MuseMilliporeN/Awersja 1.1.0.0; dołączona do analizatora
mikroskopu preparacyjnegoUnitronZ730
Graphpad Prism SoftwareInc.Nie dotyczyWersja 5.1
Aparat Mini Protean Tetra Cell GelBioRad165-8001
Trans Blot SD Cell i PowerPacBioRad170-3849
ze stali nierdzewnej dotyczy

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Siegel, R., Naishadham, D., et al. CA Cancer J. Clin. 63, 11-30 (2013).
  2. Lynch, C. F., Davila, J. A. Chapter 23. Cancer of the urinary bladder. SEER Survival Monograph: Cancer Survival Among Adults: U.S. SEER Program, 1988-2001, Patient and Tumor Characteristics. Ries, L. A. G., Young, J. L., et al. , National Cancer Institute, SEER Program. Bethesda, MD. 07-6215(2007).
  3. Jacobs, B. L., Lee, C. T., et al. Bladder cancer in 2010: how far have we come. CA Cancer J. Clin. 60 (4), 244-272 (2010).
  4. Sexton, W. J., Wiegand, L. R., et al. Bladder cancer: a review of non-muscle invasive disease. Cancer Control. 17 (4), 256-268 (2010).
  5. Bohle, A., Jocham, D., et al. Intravesical bacillus Calmette-Guerin versus mitomycin C for superficial bladder cancer: a formal meta-analysis of comparative studies on recurrence and toxicity. J. Urol. 169 (1), 90-95 (2003).
  6. Shokeir, A. A. Squamous cell carcinoma of the bladder: pathology, diagnosis and treatment. BJU Int. 93 (2), 216-220 (2004).
  7. Rosenberg, S. A. Progress in human tumour immunology and immunotherapy. Nature. 411 (6835), 380-384 (2001).
  8. Joudi, F. N., Smith, B. J., et al. Final results from a national multicenter phase II trial of combination bacillus Calmette-Guerin plus interferon alpha-2B for reducing recurrence of superficial bladder cancer. Urol. Oncol. 24 (4), 344-348 (2006).
  9. Lau, S. K., Weiss, L. M., et al. Differential expression of MUC1, MUC2, and MUC5AC in carcinomas of various sites: an immunohistochemical study. Am. J. Clin. Pathol. 122 (1), 61-69 (2004).
  10. Hollingsworth, M. A., Swanson, B. J. Mucins in cancer: protection and control of the cell surface. Nat. Rev. Cancer. 4 (1), 45-60 (2004).
  11. Scholfield, D. P., Simms, M. S., et al. MUC1 mucin in urological malignancy. BJU Int. 91 (6), 560-566 (2003).
  12. Devine, P. L., McKenzie, I. F. Mucins: structure, function, and association with malignancy. Bioessays. 14 (9), 619-625 (1992).
  13. Jerome, K. R., Barnd, D. L., et al. Cytotoxic T-lymphocytes derived from patients with breast adenocarcinomas recognize an epitope present on the protein core of a mucin molecule preferentially expressed by malignant cells. Cancer Res. 51 (11), 2908-2916 (1991).
  14. Takahashi, T., Makiguchi, Y., et al. Expression of MUC1 on myeloma cells and induction of HLA-unrestricted CTL against MUC1 from a multiple myeloma patient. J. Immunol. 153 (5), 2102-2109 (1994).
  15. Choi, C., Witzens, M., et al. Enrichment of functional CD8 memory T cells specific for MUC1 in bone marrow of patients with multiple myeloma. Blood. 105 (5), 2132-2134 (2005).
  16. Barnd, D. L., Lan, M. S., et al. Specific, major histocompatibility complex- unrestricted recognition of tumor-associated mucins by human cytotoxic T-cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 (18), 7159-7163 (1989).
  17. Ioannides, C. G., Fisk, B., et al. Cytotoxic T-cells from ovarian malignant tumors can recognize polymorphic epithelial mucin core peptides. J. Immunol. 151 (7), 3693-3703 (1993).
  18. Tang, C. K., Katsara, M., et al. Strategies used for MUC1 immunotherapy: human clinical studies. Expert Rev. Vaccines. 7 (7), 963-975 (2008).
  19. Mukherjee, P., Ginardi, A. R., et al. MUC1-specific cytotoxic T lymphocytes eradicate tumors when adoptively transferred in vivo. Clin. Cancer Res. 7, 848-855 (2001).
  20. Acres, B., Limacher, J. M. MUC1 as a target antigen for cancer immunotherapy. Expert Rev. Vaccines. 4 (4), 493-502 (2005).
  21. Butts, C., Murray, N., et al. Randomized phase IIB trial of BLP25 liposome vaccine in stage IIIB and IV non-small-cell lung cancer. J. Clin. Oncol. 23 (27), 6674-6681 (2005).
  22. Butts, C., Maksymiuk, A., et al. Updated survival analysis in patients with stage IIIB or IV non-small-cell lung cancer receiving BLP25 liposome vaccine (L-BLP25), phase IIB randomized, multicenter, open-label trial. J. Cancer. Res. Clin. Oncol. 137 (9), 1337-1342 (2011).
  23. Agrawal, B., Krantz, M. J., et al. Rapid induction of primary human CD4+ and CD8+ T cell responses against cancer-associated MUC1 peptide epitopes. Int. Immunol. 10 (12), 1907-1916 (1998).
  24. Palmer, M., Parker, J., et al. Phase I study of the BLP25 (MUC1 peptide) liposomal vaccine for active specific immunotherapy in stage IIIB/IV non-small-cell lung cancer. Clin. Lung Cancer. 3 (1), 49-57 (2001).
  25. Walsh, M. D., Hohn, B. G., et al. Mucin expression by transitional cell carcinomas of the bladder. Br. J. Urol. 73 (3), 256-262 (1994).
  26. Murray, A., Simms, M., et al. Production and characterization of rhenium-188-C595 antibody for radioimmunotherapy of transitional cell bladder cancer. J. Nucl. Med. 42 (5), 726-732 (2001).
  27. Hughes, O., Bishop, M., et al. Targeting superficial bladder cancer by the intravesical administration of 67copper-labelled anti-MUC1 mucin monoclonal antibody C595. J. Clin. Oncol. 18 (2), 363-370 (2000).
  28. Conn, I. G., Crocker, J., et al. HMFG-2 as a prognostic indicator in superficial bladder cancer. J. Clin. Pathol. 41 (11), 1191-1195 (1988).
  29. Hughes, O., Denley, H., et al. MUC1 mucin expression in transitional cell carcinoma of the bladder: a target for diagnosis and therapy with monoclonal antibody C595. J. Urol. Pathol. 12, 185-197 (2000).
  30. Rowse, G. J., Tempero, R. M., et al. Tolerance and immunity to MUC1 in a human MUC1 transgenic murine model. Cancer Res. 58 (2), 315-321 (1998).
  31. Mukherjee, P., Madsen, C. S., et al. Mucin-1 specific immunotherapy in a mouse model of spontaneous breast cancer. J. Immunother. 26 (1), 47-62 (2003).
  32. McCormick, D. L., Ronan, S. S., et al. Influence of total dose and dose schedule on induction of urinary bladder cancer in the mouse by N-butyl-N-(4-hydroxy-butyl)nitrosamine. Carcinogenesis. 2 (3), 251-254 (1981).
  33. Wurz, G. T., Gutierrez, A. M., et al. Antitumor effects of L-BLP25 antigen-specific tumor immunotherapy in a novel human MUC1 transgenic lung cancer mouse model. J. Transl. Med. 11, 10-1186 (2013).
  34. Kunze, E., Schauer, A., et al. Stages of transformation in the development of N-butyl-N-(4hydroxybutyl)-nitrosamine-induced transitional cell carcinomas in the urinary bladder of rats. Z Krebsforsch Klin. Onkol. Cancer Res. Clin. Oncol. 87 (2), 139-160 (1976).
  35. Crallan, R. A., Georgopoulos, N. T., et al. Experimental models of human bladder carcinogenesis. Carcinogenesis. 27 (3), 374-381 (2006).
  36. Samma, S., Uemura, H., et al. Rapid induction of carcinoma in situ in dog urinary bladder by sequential treatment with N-methyl-N'-nitrosourea and N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)-nitrosamine. Gann. 75 (5), 385-387 (1984).
  37. Bornhof, C., Wolfrath, G., et al. Induction of urinary bladder urothelial cancers in the rabbit by dibutylnitrosamine with an artificial bladder calculus as cocarcinogen. Urologe A. 28 (6), 339-343 (1989).
  38. Irving, C. C., Tice, A. J., et al. Inhibition of N-n-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine-induced urinary bladder cancer in rats by administration of disulfiram in the diet. Cancer Res. 39 (8), 3040-3043 (1979).
  39. Mehta, N. R., Wurz, G. T., et al. L-BLP25 vaccine plus letrozole induces a TH1 immune response and has additive antitumor activity in MUC1-expresssing mammary tumors in mice. Clin. Cancer Res. 18 (10), 2861-2871 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Bladder Cancer ModelOH BBN CarcinogenPeptide VaccineCytotoxic T LymphocyteMultiplex Cytokine AnalysisELISpot AssayHistopathological EvaluationImmune Intact MiceTh1 Polarized Response

Powiązane artykuły