Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Szybkie wytwarzanie amyloidu z białek natywnych in vitro

6.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50869

⸱

5 grudnia 2013

 ,  , 
1Department of Immunology, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

W tym artykule

Podsumowanie

Białka mogą albo przyjąć natywną strukturę, albo nieprawidłowo sfałdować się w nierozpuszczalny amyloid. Warunki, które sprzyjają szlakowi nieprawidłowego fałdowania, prowadzą do powstawania różnych typów włókienek amyloidowych. Opisane tu metody pozwalają na szybką konwersję natywnych białek do amyloidu in vitro.

Streszczenie

Białka wykonują kluczowe zadania w organizmach, pełniąc funkcje wynikające z ich specyficznych trójwymiarowych fałd. Chociaż natywne struktury polipeptydów spełniają wiele celów, obecnie uznaje się, że większość białek może przyjąć alternatywny zestaw amyloidu bogatego w arkusze beta. Nierozpuszczalne fibryle amyloidowe są początkowo kojarzone z wieloma dolegliwościami u ludzi, ale coraz częściej są przedstawiane jako funkcjonalni gracze uczestniczący w różnych ważnych procesach komórkowych. Ponadto amyloid zdeponowany w tkankach pacjenta zawiera składniki niebiałkowe, takie jak kwasy nukleinowe i glikozaminoglikany (GAG). Kofaktory te mogą ułatwiać tworzenie się amyloidu, co skutkuje powstawaniem różnego rodzaju nierozpuszczalnych osadów. Wykorzystując naszą wiedzę na temat nieprawidłowego fałdowania białek na pośrednim etapie rozpuszczalnego prekursora amyloidu, opracowaliśmy metodę przekształcania natywnych białek w fibryle amyloidowe in vitro. Takie podejście pozwala na przygotowanie amyloidu w dużych ilościach, zbadanie właściwości amyloidu generowanego z określonych białek oraz ocenę zmian strukturalnych towarzyszących konwersji.

Wprowadzenie

Białka są najliczniejszymi biologicznymi makrocząsteczkami obecnymi we wszystkich typach komórek. Występują w bardzo różnych rozmiarach, strukturach i modyfikacjach potranslacyjnych i spełniają ogromny zakres ważnych funkcji biologicznych, gdy są w swoich rodzimych formach. Ponad dwa tuziny nieprawidłowych polipeptydów jest zaangażowanych w liczne stany patologiczne człowieka, takie jak choroba Alzheimera, choroba Parkinsona i cukrzyca typu 21-4. Końcowe nieprawidłowo sfałdowane białka gromadzą się jako fibryle amyloidowe, nierozpuszczalne, stabilne agregaty, które występują zewnątrzkomórkowo lub wewnątrzkomórkowo.

Pomimo implikacji określonych białek w niektórych chorobach, coraz więcej dowodów potwierdza pogląd, że wszystkie polipeptydy mają wewnętrzne właściwości, które umożliwiają transformację amyloidu. Badanie sekwencji całego genomu zidentyfikowało "amylom", w którym fragmenty podatne na amyloid stanowią około 15% wszystkich kodujących segmentów peptydowych od E. coli do ludzi5. W związku z tym w ostatnich latach odkryto coraz większą liczbę funkcjonalnych amyloidów, które uczestniczą w różnych ważnych procesach komórkowych. Na przykład bakterie gromadzą amyloidy, tworząc biofilm i struktury zarodników, które mają kluczowe znaczenie dla ich przetrwania i patogenezy6-9. Hormony peptydowe tworzą złogi amyloidu podczas przechowywania w granulkach wydzielniczych ssaków przed uwolnieniem, co dodatkowo sugeruje, że forma białka amyloidu może pełnić korzystne funkcje biologiczne6,10,11. Co więcej, białka mogą również łączyć się w fibryle amyloidowe, aby przekazywać krytyczne sygnały komórkowe12,13.

Przez wiele lat, najczęściej badane amyloidy są przygotowywane z pojedynczych peptydów, które są związane z chorobami ludzkimi, takich jak beta amyloid czy peptyd prionowy. Peptydy te zwykle nie mają dobrze zdefiniowanej struktury i spontanicznie tworzą amyloid w roztworze w miarę upływu czasu, w procesie pośredniczonym przez częściowo nieprawidłowo sfałdowany produkt pośredni, który służy jako prekursor nierozpuszczalnego amyloidu. Prekursor amyloidu nazywany jest również rozpuszczalnym oligomerem białkowym, który jest rzadki i niestabilny, gdy jest generowany z naturalnych peptydów14,15. Jednak, jak opisano wcześniej, prawie każde białko w zasadzie może przyjąć konformację amyloidu w odpowiednich warunkach. Niedawno opracowaliśmy metodę otrzymywania stabilizowanych rozpuszczalnych oligomerów białek natywnych, które łatwo tworzą amyloid w obecności różnych kofaktorów16. Powstałe w ten sposób fibryle amyloidowe odzwierciedlają złożoną naturę końcowych agregatów nieprawidłowego fałdowania białek17,18. Tutaj używamy terminu amyloid tylko białkowy w odniesieniu do włókien białkowych bez kofaktorów i amyloidu hybrydowego dla włókien zawierających składniki niebiałkowe.

Poprzednio, różne metody generowania amyloidu in vitro poprzez stosowanie warunków znanych z nieprawidłowego fałdowania białek, takich jak wysoka temperatura, hydrofobowe środowisko i wahania pH19-23. Wiążą się one jednak z różnymi problemami, takimi jak niska wydajność, odwracalne składanie, duże różnice w partiach czy powolna kinetyka. Opisane tutaj podejście jest powtarzalne, łatwe do skalowania i pozwala precyzyjnie kontrolować czas i stan konwersji amyloidu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotuj bufor MES

  1. Użyć buforu MES (0,1 M kwas 2-(N-morfolino)etanosulfonowy i 0,9 M NaCl) do przygotowania zarówno amyloidu zawierającego tylko białka, jak i stabilizowanych rozpuszczalnych oligomerów białkowych. Odważyć 1,95 g MES i 5,27 g NaCl. DodaćH2Oi dostosować pH do 4,7. Uzupełnić końcową objętość do 100 ml. Przechowywać w temperaturze 4º C do 6 miesięcy.

2. Przygotuj amyloid zawierający tylko białko bezpośrednio z natywnych białek

  1. Zważyć wybrane białko (dowolne białko natywne lub peptyd) i rozpuścić w buforze MES do 10 mg/ml.
  2. Inkubować w temperaturze 65 °C w łaźni wodnej przez 4 godziny. Pod koniec okresu w roztworze widoczny jest biały osad.
  3. Zneutralizować próbkę 10% (v/v) Tris-HCl (1 M, pH 10,5).
  4. Białko należy dializować w kasecie dializacyjnej przez noc, aby wymienić je na żądany bufor w celu dalszej analizy.
  5. Próbkę kontrolną białka natywnego można przygotować, wykonując kroki 2.1, 2.3 i 2.4 bez wytrącania ciepła (krok 2.2).

3. Przygotowanie hybrydowego amyloidu ze stabilizowanych rozpuszczalnych oligomerów natywnych białek

  1. Przygotowanie stabilizowanych rozpuszczalnych oligomerów białkowych
    1. Zważyć wybrane białko i rozpuścić je w buforze MES do 10 mg/ml. Pozostawić w temperaturze pokojowej na 15 minut.
    2. Odważyć chlorowodorek 1-etylo-3-[3-dimetyloaminopropylo]karbodimidu (EDC) i przygotować świeży zapas 20 mg/ml w buforze MES.
    3. Wymieszać roztwory białka i EDC w stosunku 2:5 (v/v), tj. 2 mg białka na każde 10 mg EDC.
    4. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.
    5. Zneutralizować próbkę 10% (v/v) Tris-HCl (1 M, pH 10,5).
    6. Białko należy dializować w kasecie dializacyjnej przez noc, aby wymienić je na żądany bufor w celu dalszej analizy.
    7. Ustabilizowany rozpuszczalny oligomer białkowy należy przechowywać w temperaturze 4 ºC do 4 tygodni.
  2. Przygotować hybrydowe amyloidy ze stabilizowanego rozpuszczalnego oligomeru białkowego.
    1. Aby przygotować amyloid zawierający DNA, należy wymieszać DNA i stabilizowany rozpuszczalny oligomer białkowy w stosunku 1:1 (w/w). Pozostawić w temperaturze 4 ºC na co najmniej 2 godziny. W tym okresie nierozpuszczalny osad jest widoczny w roztworze, gdy początkowe stężenie białka wynosi 0,5 mg/ml lub więcej.
    2. Aby przygotować amyloid zawierający RNA, należy wymieszać RNA i stabilizowany rozpuszczalny oligomer białkowy w stosunku 1:1 (w/w). Pozostawić w temperaturze 4 ºC na co najmniej 2 godziny. W tym okresie nierozpuszczalny osad jest widoczny w roztworze, gdy początkowe stężenie białka wynosi 0,5 mg/ml lub więcej.
    3. Aby przygotować amyloid zawierający heparynę, należy zmieszać heparynę i stabilizowany rozpuszczalny oligomer białkowy w stosunku 1:1 (w/w). Pozostawić w temperaturze 4 ºC na co najmniej 2 godziny. W tym okresie nierozpuszczalny osad jest widoczny w roztworze, gdy początkowe stężenie białka wynosi 0,5 mg/ml lub więcej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zdolność do bezpośredniej konwersji białek natywnych w amyloid opiera się na zmianie konformacyjnej występującej w wysokiej temperaturze w buforze MES. Wytrącanie w roztworze jest dobrym wskaźnikiem agregacji białek i prawdopodobnego tworzenia się amyloidu. Z drugiej strony, aby umożliwić stabilizację rozpuszczalnych oligomerów białkowych, stosuje się EDC do sieciowania białek w celu utrwalenia konformacji oligomerycznej indukowanej w buforze MES. W rezultacie ustabilizowane oligomery białkowe są białkami multimerycznymi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisana tutaj metoda oferuje szybki i elastyczny sposób przygotowania włókienek amyloidowych in vitro z praktycznie dowolnego białka lub peptydu. Można niezawodnie przygotować kilka różnych rodzajów amyloidu - fibryle zawierające tylko białko lub agregaty hybrydowe zawierające DNA, RNA lub glikozaminoglikany. Stosowane procedury są proste, nieskomplikowane i nie wymagają zaawansowanego szkolenia technicznego. Amyloid przygotowany tą metodą jest dość stabilny i może być bezpiecznie przechowywany w temperaturze -8...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie mamy nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca jest wspierana przez granty dla W.C. z National Institutes of Health Grant AI074809 oraz The University of Texas M. D. Anderson Cancer Center Institutional Research Grant Program.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kwas 2-(N-morfolino)etanosulfonowy (MES)Sigma-AldrichM8250
NaClFisherBP358-10
Chlorowodorek 1-etylo-3-[3-dimetylo-aminopropylo]karbodimidu (EDC)Thermo/Pierce22980
DNA z plemników łososiaSigmaD1626
RNA z drożdży torulaSigmaR6625
Heparyna z błony śluzowej jelit świńSigmaH3149
Tris baseFisherBP152-1
Sprzęt:
Łaźnia wodnaFisher ScienceIsotemp 210
Kaseta do dializy Slide-A-LyzerThermo/Pierce66380

Bibliografia

  1. Selkoe, D. J. Folding proteins in fatal ways. Nature. 426, 900-904 (2003).
  2. Schnabel, J. Protein folding: The dark side of proteins. Nature. 464, 828-829 (2010).
  3. Goldberg, A. L. Protein degradation and protection against misfolded or damaged proteins. Nature. 426, 895-899 (2003).
  4. Chiti, F., Dobson, C. M. Protein misfolding, functional amyloid, and human disease. Annu. Rev. Biochem. 75, 333-366 (2006).
  5. Goldschmidt, L., Teng, P. K., Riek, R., Eisenberg, D. Identifying the amylome, proteins capable of forming amyloid-like fibrils. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 3487-3492 (2010).
  6. Fowler, D. M., Koulov, A. V., Balch, W. E., Kelly, J. W. Functional amyloid - from bacteria to humans. Trends Biochem. Sci. 32, 217-224 (2007).
  7. Chapman, M. R., et al. Role of Escherichia coli Curli Operons in Directing Amyloid Fiber Formation. Science. 295, 851-855 (2002).
  8. Barnhart, M. M., Chapman, M. R. Curli Biogenesis and Function. Annu. Rev. Microbiol. 60, 131-147 (2006).
  9. Claessen, D., et al. A n olved in aerial hyphae formation in Streptomyces coelicolor by forming amyloid-like fibrils. Genes Dev. 17, 1714-1726 (2003).
  10. Maji, S. K., et al. Functional Amyloids As Natural Storage of Peptide Hormones in Pituitary Secretory Granules. Science. 325, 328-332 (2009).
  11. Badtke, M. P., Hammer, N. D., Chapman, M. R. Functional Amyloids Signal Their Arrival. Sci. Signal. 2, pe43(2009).
  12. Li, J., et al. The RIP1/RIP3 Necrosome Forms a Functional Amyloid Signaling Complex Required for Programmed Necrosis. Cell. 150, 339-350 (2012).
  13. Hou, F., et al. MAVS forms functional prion-like aggregates to activate and propagate antiviral innate immune response. Cell. 146, 448-461 (2011).
  14. Stefani, M. Biochemical and biophysical features of both oligomer/fibril and cell membrane in amyloid cytotoxicity. FEBS J. 277, 4602-4613 (2010).
  15. Glabe, C. G. Structural classification of toxic amyloid oligomers. J. Biol. Chem. 283, 29639-29643 (1074).
  16. Di Domizio, J., et al. Binding with nucleic acids or glycosaminoglycans converts soluble protein oligomers to amyloid. J. Biol. Chem. 287, 736-747 (2012).
  17. Zhang, X., Li, J. -P., Lijuan, Z. Heparan sulfate proteoglycans in amyloidosis. Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. 93, 309-334 (2010).
  18. Jiménez, J. S. Protein-DNA Interaction at the Origin of Neurological Diseases: A Hypothesis. J. Alzheimer's Dis. 22, 375-391 (2010).
  19. Bhattacharya, M., Jain, N., Mukhopadhyay, S. Insights into the Mechanism of Aggregation and Fibril Formation from Bovine Serum Albumin. J. Phys. Chem. B. 115, 4195-4205 (2011).
  20. Vetri, V., et al. Bovine Serum Albumin protofibril-like aggregates formation: Solo but not simple mechanism. Arch. Biochem. Biophysics. 508, 13-24 (2011).
  21. Bucciantini, M., et al. Inherent toxicity of aggregates implies a common mechanism for protein misfolding diseases. Nature. 416, 507-511 (2002).
  22. McParland, V. J., Kalverda, A. P., Homans, S. W., Radford, S. E. Structural properties of an amyloid precursor of b2-microglobulin. Nat. Struct. Mol. Biol. 9, 326-331 (2002).
  23. Chiti, F., et al. Designing conditions for in vitro formation of amyloid protofilaments and fibrils. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 3590-3594 (1999).
  24. McParland, V. J., et al. Partially Unfolded States of b2-Microglobulin and Amyloid Formation in vitro. Biochemistry. 39, 8735-8746 (2000).
  25. Liu, K., Cho, H. S., Lashuel, H. A., Kelly, J. W., Wemmer, D. E. A glimpse of a possible amyloidogenic intermediate of transthyretin. Nat. Struct. Mol. Biol. 7, 754-757 (2000).
  26. Pfefferkorn, C. M., McGlinchey, R. P., Lee, J. C. Effects of pH on aggregation kinetics of the repeat domain of a functional amyloid. Pmel17. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 21447-21452 (2010).
  27. Di Domizio, J., et al. Nucleic acid-containing amyloid fibrils potently induce type I interferon and stimulate systemic autoimmunity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 14550-14555 (2012).
  28. Halle, A., Hornung, V., Petzold, G. C., Stewart, C. R., Monks, B. G., Reinheckel, T., Fitzgerald, K. A., Latz, E., Moore, K. J., Golenbock, D. T. The NALP3 inflammasome is involved in the innate immune response to amyloid-β. Nat. Immunol. 9, 857(2008).
  29. Masters, S. L., O'Neill, L. A. Disease-associated amyloid and misfolded protein aggregates activate the inflammasome. Trends Mol. Med. 17, 276-282 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Tworzenie amyloid wb dne fa dowanie bia ekbufor MESprecypitacja termicznasieciowanie EDCamyloidy kwas w nukleinowychamyloidy heparynyrozpuszczalne oligomery bia koweanaliza przesuni cia w eluanaliza cytotoksyczno ci
Szybkie wytwarzanie amyloidu z białek natywnych in vitro
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.