Szybkie wytwarzanie amyloidu z białek natywnych in vitro

Białka są najliczniejszymi biologicznymi makrocząsteczkami obecnymi we wszystkich typach komórek. Występują w bardzo różnych rozmiarach, strukturach i modyfikacjach potranslacyjnych i spełniają ogromny zakres ważnych funkcji biologicznych, gdy są w swoich rodzimych formach. Ponad dwa tuziny nieprawidłowych polipeptydów jest zaangażowanych w liczne stany patologiczne człowieka, takie jak choroba Alzheimera, choroba Parkinsona i cukrzyca typu 2^1-4. Końcowe nieprawidłowo sfałdowane białka gromadzą się jako fibryle amyloidowe, nierozpuszczalne, stabilne agregaty, które występują zewnątrzkomórkowo lub wewnątrzkomórkowo.

Pomimo implikacji określonych białek w niektórych chorobach, coraz więcej dowodów potwierdza pogląd, że wszystkie polipeptydy mają wewnętrzne właściwości, które umożliwiają transformację amyloidu. Badanie sekwencji całego genomu zidentyfikowało "amylom", w którym fragmenty podatne na amyloid stanowią około 15% wszystkich kodujących segmentów peptydowych od E. coli do ludzi⁵. W związku z tym w ostatnich latach odkryto coraz większą liczbę funkcjonalnych amyloidów, które uczestniczą w różnych ważnych procesach komórkowych. Na przykład bakterie gromadzą amyloidy, tworząc biofilm i struktury zarodników, które mają kluczowe znaczenie dla ich przetrwania i patogenezy^6-9. Hormony peptydowe tworzą złogi amyloidu podczas przechowywania w granulkach wydzielniczych ssaków przed uwolnieniem, co dodatkowo sugeruje, że forma białka amyloidu może pełnić korzystne funkcje biologiczne^6,10,11. Co więcej, białka mogą również łączyć się w fibryle amyloidowe, aby przekazywać krytyczne sygnały komórkowe^12,13.

Przez wiele lat, najczęściej badane amyloidy są przygotowywane z pojedynczych peptydów, które są związane z chorobami ludzkimi, takich jak beta amyloid czy peptyd prionowy. Peptydy te zwykle nie mają dobrze zdefiniowanej struktury i spontanicznie tworzą amyloid w roztworze w miarę upływu czasu, w procesie pośredniczonym przez częściowo nieprawidłowo sfałdowany produkt pośredni, który służy jako prekursor nierozpuszczalnego amyloidu. Prekursor amyloidu nazywany jest również rozpuszczalnym oligomerem białkowym, który jest rzadki i niestabilny, gdy jest generowany z naturalnych peptydów^14,15. Jednak, jak opisano wcześniej, prawie każde białko w zasadzie może przyjąć konformację amyloidu w odpowiednich warunkach. Niedawno opracowaliśmy metodę otrzymywania stabilizowanych rozpuszczalnych oligomerów białek natywnych, które łatwo tworzą amyloid w obecności różnych kofaktorów¹⁶. Powstałe w ten sposób fibryle amyloidowe odzwierciedlają złożoną naturę końcowych agregatów nieprawidłowego fałdowania białek^17,18. Tutaj używamy terminu amyloid tylko białkowy w odniesieniu do włókien białkowych bez kofaktorów i amyloidu hybrydowego dla włókien zawierających składniki niebiałkowe.

Poprzednio, różne metody generowania amyloidu in vitro poprzez stosowanie warunków znanych z nieprawidłowego fałdowania białek, takich jak wysoka temperatura, hydrofobowe środowisko i wahania pH^19-23. Wiążą się one jednak z różnymi problemami, takimi jak niska wydajność, odwracalne składanie, duże różnice w partiach czy powolna kinetyka. Opisane tutaj podejście jest powtarzalne, łatwe do skalowania i pozwala precyzyjnie kontrolować czas i stan konwersji amyloidu.

1. Przygotuj bufor MES

1. Użyć buforu MES (0,1 M kwas 2-(N-morfolino)etanosulfonowy i 0,9 M NaCl) do przygotowania zarówno amyloidu zawierającego tylko białka, jak i stabilizowanych rozpuszczalnych oligomerów białkowych. Odważyć 1,95 g MES i 5,27 g NaCl. Dodać_H2Oi dostosować pH do 4,7. Uzupełnić końcową objętość do 100 ml. Przechowywać w temperaturze 4º C do 6 miesięcy.

2. Przygotuj amyloid zawierający tylko białko bezpośrednio z natywnych białek

1. Zważyć wybrane białko (dowolne białko natywne lub peptyd) i rozpuścić w buforze MES do 10 mg/ml.
2. Inkubować w temperaturze 65 °C w łaźni wodnej przez 4 godziny. Pod koniec okresu w roztworze widoczny jest biały osad.
3. Zneutralizować próbkę 10% (v/v) Tris-HCl (1 M, pH 10,5).
4. Białko należy dializować w kasecie dializacyjnej przez noc, aby wymienić je na żądany bufor w celu dalszej analizy.
5. Próbkę kontrolną białka natywnego można przygotować, wykonując kroki 2.1, 2.3 i 2.4 bez wytrącania ciepła (krok 2.2).

3. Przygotowanie hybrydowego amyloidu ze stabilizowanych rozpuszczalnych oligomerów natywnych białek

1. Przygotowanie stabilizowanych rozpuszczalnych oligomerów białkowych
   1. Zważyć wybrane białko i rozpuścić je w buforze MES do 10 mg/ml. Pozostawić w temperaturze pokojowej na 15 minut.
   2. Odważyć chlorowodorek 1-etylo-3-[3-dimetyloaminopropylo]karbodimidu (EDC) i przygotować świeży zapas 20 mg/ml w buforze MES.
   3. Wymieszać roztwory białka i EDC w stosunku 2:5 (v/v), tj. 2 mg białka na każde 10 mg EDC.
   4. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.
   5. Zneutralizować próbkę 10% (v/v) Tris-HCl (1 M, pH 10,5).
   6. Białko należy dializować w kasecie dializacyjnej przez noc, aby wymienić je na żądany bufor w celu dalszej analizy.
   7. Ustabilizowany rozpuszczalny oligomer białkowy należy przechowywać w temperaturze 4 ºC do 4 tygodni.
2. Przygotować hybrydowe amyloidy ze stabilizowanego rozpuszczalnego oligomeru białkowego.
   1. Aby przygotować amyloid zawierający DNA, należy wymieszać DNA i stabilizowany rozpuszczalny oligomer białkowy w stosunku 1:1 (w/w). Pozostawić w temperaturze 4 ºC na co najmniej 2 godziny. W tym okresie nierozpuszczalny osad jest widoczny w roztworze, gdy początkowe stężenie białka wynosi 0,5 mg/ml lub więcej.
   2. Aby przygotować amyloid zawierający RNA, należy wymieszać RNA i stabilizowany rozpuszczalny oligomer białkowy w stosunku 1:1 (w/w). Pozostawić w temperaturze 4 ºC na co najmniej 2 godziny. W tym okresie nierozpuszczalny osad jest widoczny w roztworze, gdy początkowe stężenie białka wynosi 0,5 mg/ml lub więcej.
   3. Aby przygotować amyloid zawierający heparynę, należy zmieszać heparynę i stabilizowany rozpuszczalny oligomer białkowy w stosunku 1:1 (w/w). Pozostawić w temperaturze 4 ºC na co najmniej 2 godziny. W tym okresie nierozpuszczalny osad jest widoczny w roztworze, gdy początkowe stężenie białka wynosi 0,5 mg/ml lub więcej.

Zdolność do bezpośredniego przekształcania natywnych białek w amyloid zależy od zmiany konformacyjnej zachodzącej w wysokiej temperaturze w buforze MES. Wytrącanie się w roztworze jest dobrym wskaźnikiem agregacji białek i możliwego tworzenia amyloidu. Z drugiej strony, aby umożliwić stabilizację rozpuszczalnego oligomeru białkowego, EDC jest używany do sieciowania białek w celu zestalenia konformacji oligomerycznej indukowanej w buforze MES. W rezultacie stabilizowane oligomery białkowe są białkami multimerycznymi (ryc. 1), różniącymi się od monomerycznych białek natywnych lub agregatów indukowanych ciepłem, gdy są oddzielone przez SDS-PAGE.

Stabilizowane rozpuszczalne oligomery białkowe są stałe w roztworze, więc konwersja amyloidu przez kofaktory może być przeprowadzana oddzielnie w dogodnym dla siebie sposób w pożądany sposób, aby kontrolować stan bufora, względny stosunek białka do kofaktora lub inne parametry. Proces konwersji oligomerów do amyloidu zachodzi szybko, dlatego nie powinno dziwić widok nierozpuszczalnych osadów tworzących się w ciągu kilku minut po zmieszaniu z kwasami nukleinowymi lub GAG. Aby zapewnić jakość stabilizowanych rozpuszczalnych oligomerów białkowych, można wykonać kilka prostych testów. Jak scharakteryzowanowcześniej16, stabilizowane rozpuszczalne oligomery białkowe mogą łatwo wiązać się z kwasami nukleinowymi, w tym zarówno DNA, jak i RNA, w sposób niezależny od sekwencji. W związku z tym można przeprowadzić test przesunięcia żelu, aby uwidocznić bezpośrednią interakcję między ustabilizowanymi rozpuszczalnymi oligomerami białkowymi a DNA, co skutkowałoby opóźnioną migracją DNA na żelu agarozowym (Figura 2). Cytotoksyczność jest archetypiczną cechą rozpuszczalnych oligomerów białkowych14. Wykazaliśmy wcześniej, że stabilizowane rozpuszczalne oligomery białkowe w zależności od dawki indukują śmierć komórki, która jest wykrywalna przez FACS, błękit trypanowy lub CellTiter Blue16. Jak pokazano na rysunku 3, komórki RPMI 8226 są niezwykle podatne na śmierć wywołaną przez rozpuszczalne oligomery białkowe, która jest mierzona za pomocą barwienia jodkiem propidyny.

Rysunek 1. Rozmiary molekularne amyloidu, prekursora amyloidu a białka natywnego. Przedstawiając albuminę surowicy ludzkiej (HSA) jako przykład, natywne HSA i amyloid HSA przygotowane w kroku 2 migrują na SDS-PAGE jako monomery. Stabilizowany rozpuszczalny oligomer HSA przygotowany w kroku 3.1 zawiera wiele prążków, które reprezentują różne oligomeryczne formy HSA (prawy pas). Po lewej stronie wskazano markery masy cząsteczkowej białka w kDa. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większy obraz.

Rysunek 2. Wiązanie rozpuszczalnego oligomeru białkowego z DNA. Genomowe DNA (0,5 mg) z nasienia łososia mieszano z różnymi ilościami stabilizowanego rozpuszczalnego oligomeru HSA przez 30 minut. Następnie próbki rozdzielono na 1% żelu agarozowym. W reakcji kontrolnej natywny HSA (1 mg) zmieszano z DNA. Uzyskany wynik wskazuje na ogólne zjawisko stabilizowanego oligomeru białkowego, który zyskuje zdolność do interakcji z kwasami nukleinowymi, w przeciwieństwie do swojej natywnej formy16. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większy obraz.

Rysunek 3. Cytotoksyczność rozpuszczalnego oligomeru białkowego. Różne ilości natywnego lub stabilizowanego rozpuszczalnego oligomeru HSA inkubowano z komórkami RPMI 8226 przez 30 minut. Zakres śmierci komórki analizowano za pomocą FACS po barwieniu jodkiem propidyny (PI). Wskazuje się procent populacji martwych komórek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większy obraz.

Nie mamy nic do ujawnienia.