Metody modulacji i analizy neurogenezy dorosłych zależnej od NF-κB

Summary

Opisano metody manipulacji i analizy neurogenezy hipokampa zależnej od NF-κB u dorosłych. Przedstawiono szczegółowy protokół testu behawioralnego zależnego od zakrętu zębatego (określanego jako separacja wzorca przestrzennego - labirynt Barnesa) w celu zbadania wyników poznawczych u myszy. Technika ta powinna również pomóc w umożliwieniu badań w innych warunkach eksperymentalnych.

Abstract

Hipokamp odgrywa kluczową rolę w tworzeniu i utrwalaniu epizodycznych wspomnień oraz w orientacji przestrzennej. Historycznie rzecz biorąc, dorosły hipokamp był postrzegany jako bardzo statyczny obszar anatomiczny mózgu ssaków. Jednak ostatnie odkrycia wykazały, że zakręt zębaty hipokampa jest obszarem o ogromnej plastyczności u dorosłych, obejmującym nie tylko modyfikacje istniejących obwodów neuronalnych, ale także neurogenezę dorosłych. Ta plastyczność jest regulowana przez złożone sieci transkrypcyjne, w których czynnik transkrypcyjny NF-κB odgrywa znaczącą rolę. Do badania i manipulowania neurogenezą dorosłych można wykorzystać transgeniczny model myszy do specyficznego dla neuronów przodomózgowia hamowania aktywności NF-κB.

W tym badaniu opisano metody analizy neurogenezy zależnej od NF-κB, w tym jej aspekty strukturalne, apoptozę neuronów i proliferację progenitorów oraz znaczenie poznawcze, które zostało specjalnie ocenione za pomocą testu behawioralnego zależnego od zakrętu zębatego (DG), separacji przestrzennej - labirynt Barnesa (SPS-BM). Protokół SPS-BM można po prostu zaadaptować do użytku z innymi transgenicznymi modelami zwierzęcymi zaprojektowanymi do oceny wpływu poszczególnych genów na neurogenezę dorosłego hipokampa. Ponadto projekt SPS-BM może być stosowany w innych warunkach eksperymentalnych mających na celu badanie i manipulowanie uczeniem się zależnym od DG, na przykład przy użyciu środków farmakologicznych.

Introduction

Ontologicznie, hipokamp jest jedną z najstarszych znanych anatomicznych struktur mózgu. Jest odpowiedzialny za różnorodne złożone zadania, takie jak kluczowe funkcje w regulacji pamięci długotrwałej, orientacji przestrzennej oraz tworzeniu i utrwalaniu odpowiedniej pamięci. Anatomicznie hipokamp składa się z warstw komórek piramidalnych (stratum pyramidale), w tym regionów cornu Ammonis (CA1, CA2, CA3 i CA4) oraz zakrętu zębatego (gyrus dentatus), który zawiera komórki ziarniste i kilka neuronalnych komórek progenitorowych w swojej strefie subziarnistej. Komórki ziarniste wystają w kierunku regionu CA3 za pośrednictwem tak zwanych włókien omszałych (aksonów komórek ziarnistych).

Do końca ubiegłego wieku mózg dorosłego ssaka był uważany za statyczny organ pozbawiony plastyczności komórkowej i neurogenezy. Jednak w ciągu ostatnich dwóch dekad coraz więcej dowodów wyraźnie wskazuje na to, że neurogeneza dorosłych zachodzi w co najmniej dwóch regionach mózgu, strefie podkomorowej (SVZ) i strefie podziarnistej hipokampa.

Nasze poprzednie badania, jak i te z innych grup, wykazały, że czynnik transkrypcyjny NF-κB jest jednym z kluczowych molekularnych regulatorów neurogenezy u dorosłych, a jego deregulacja powoduje poważne strukturalne defekty hipokampa i zaburzenia poznawcze^1-6. NF-κB to ogólna nazwa indukowalnego czynnika transkrypcyjnego składającego się z różnych dimerycznych kombinacji pięciu podjednostek wiążących DNA: p50, p52, c-Rel, RelB i p65 (RelA), z których trzy ostatnie mają domeny transaktywacyjne. W mózgu najliczniejszą formą występującą w cytoplazmie jest heterodimer p50 i p65, który jest utrzymywany w nieaktywnej formie przez inhibitor białek kappa B (IκB).

Aby badać i bezpośrednio manipulować neurogenezą sterowaną przez NF-κB, używamy transgenicznych modeli myszy, aby umożliwić proste hamowanie wszystkich podjednostek NF-κB, szczególnie w przodomózgowiu⁷ (patrz Rysunek 1). W tym celu skrzyżowaliśmy następujące transgeniczne linie myszy, IκB/- i -/tTA. Transgeniczna linia IκB/- została wygenerowana przy użyciu trans-dominującego ujemnego mutanta inhibitora NF-κB IκBa (super-represora IκBa-AA1)⁸. W przeciwieństwie do IκBα typu dzikiego, IκBα-AA1 ma dwie reszty seryny zmutowane do alaniny (V32 i V36), które utrudniają fosforylację i późniejszą degradację proteasomalną inhibitora. W celu uzyskania specyficznej dla neuronów przodomózgowia ekspresji transgenu IκBa-AA1, myszy IκB/- krzyżowano z myszami posiadającymi zależny od kalmoduliny wapnia promotor kinazy IIα (CAMKIIα), który może być napędzany przez transaktywator tetracykliny (tTA)⁹.

p65 myszy z nokautem mają embrionalny fenotyp letalny, spowodowany masywną apoptozą wątroby¹⁰, więc pokazane tutaj podejście zapewnia elegancką metodę badania roli NF-κB w neurogenezie postnatalnej i dorosłej.

Klasyczny test behawioralny do badania przestrzennego uczenia się i pamięci został opisany w latach 80. przez Richarda Morrisa, test znany jako wodny labirynt Morrisa (MWM)¹¹. W tym labiryncie wodnym na otwartym polu zwierzęta uczą się uciekać z nieprzezroczystej wody na ukrytą platformę w oparciu o orientację i wskazówki poza labiryntem. Suchym wariantem MWM jest tzw. labirynt Barnesa (BM)¹². Ten test wykorzystuje okrągłą płytkę z 20 okrągłymi otworami rozmieszczonymi na granicy płyty, z jednym zdefiniowanym otworem jako polem ucieczki i wizualnymi wskazówkami dotyczącymi orientacji poza labiryntem. Oba eksperymentalne paradygmaty opierają się na zachowaniu podczas lotu wywołanym niechęcią gryzonia do wody lub otwartych, jasno oświetlonych przestrzeni. Oba testy pozwalają na zbadanie orientacji przestrzennej i związanej z nią wydajności pamięci. Chociaż hipokamp odgrywa ogólną i zasadniczą rolę w tworzeniu pamięci przestrzennej, zaangażowane regiony hipokampa różnią się w zależności od zastosowanego testu. Pamięć badana w BM powstaje w wyniku aktywności neuronalnej między korą enhorinalną (EC) a neuronami piramidowymi znajdującymi się w regionie CA1 hipokampa bez udziału DG^13-16. W szczególności klasyczny BM opiera się głównie na nawigacji za pośrednictwem monosynaptycznego szlaku czasowo-amonicznego od EC III do CA1 do EC V. Co ważne, DG jest w decydujący sposób zaangażowana w tzw. rozpoznawanie wzorców przestrzennych¹⁷, co oznacza nie tylko przetwarzanie informacji wizualnych i przestrzennych, ale także przekształcanie podobnych reprezentacji lub wspomnień w różne, Reprezentacje, które nie nakładają się na siebie. Zadanie to wymaga funkcjonalnego obwodu trisynaptycznego od EC II do DG do CA3 do CA1 i EC VI, którego nie można przetestować w BM¹⁵.

Aby sprostać tym wyzwaniom, opracowaliśmy SPS-BM jako test behawioralny do testowania zdolności poznawczych zależnych od zakrętu zębatego u zwierząt kontrolnych oraz w modelu super-represora IκB/tTA po inhibicji NF-κB. Co ważne, w przeciwieństwie do MWM lub BM, SPS-BM może ujawniać subtelne deficyty behawioralne wynikające z upośledzenia neurogenezy. Ponieważ separacja wzorców przestrzennych jest ściśle zależna od obwodu funkcjonalnego między EC II i DG oraz CA3 i CA1 i EC VI, test ten jest bardzo wrażliwy na potencjalne zmiany w neurogenezie, modyfikacje szlaku włókien omszałych lub zmiany homeostazy tkanek w DG.

Technicznie, konfiguracja naszego testu opiera się na badaniu przeprowadzonym przez Clelland et al., w którym wzorzec separacji przestrzennej został przetestowany przy użyciu drewnianego 8-ramiennego labiryntu z promieniowym ramieniem (RAM)¹⁹. W naszej zmodyfikowanej konfiguracji osiem ramion zostało zastąpionych siedmioma identycznymi żółtymi pojemnikami na żywność. Podsumowując, przedstawione tutaj metody, w tym analiza komórek z podwójną ekspresją kortyny (DCX+) w hipokampie, projekcje włókien omszałych, śmierć komórek neuronalnych, a w szczególności przedstawiony tutaj SPS-BM, mogą być zastosowane do badań innych modeli myszy zawierających transgeny, które mają wpływ na neurogenezę dorosłych. Dalsze zastosowania mogą obejmować badanie środków farmakologicznych i pomiar ich wpływu na DG i separację wzorców przestrzennych.

Protocol

Oświadczenie etyczne

To badanie zostało przeprowadzone w ścisłej zgodności z przepisami rządowego komitetu ds. zwierząt i opieki, LANUV kraju związkowego Nadrenia Północna-Westfalia, (Düsseldorf, Niemcy). Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez LANUV, Düsseldorf na podstawie licencji o numerze 8.87–51.04.20.09.317 (LANUV, NRW). Dołożono wszelkich starań, aby zminimalizować stres i liczbę zwierząt potrzebnych do badania.

1. Opieka nad zwierzętami i ich trzymanie

1. Wszystkie zwierzęta wykorzystywane w protokołach opisanych w niniejszym dokumencie powinny być trzymane w określonych warunkach wolnych od czynników chorobotwórczych, określonych przez Federację Europejskiego Stowarzyszenia Nauk o Zwierzętach Laboratoryjnych (FELASA).
2. Myszy powinny być trzymane w standardowych klatkach w pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze i wilgotności (22 °C) w warunkach dobowych (12-godzinny cykl światła/ciemności) z powietrzem filtrowanym HEPA.
3. Standaryzowane pożywienie i woda powinny być dostarczane ad libitum.
4. Jeżeli wykorzystuje się myszy kontrolne IκB/tTA i IκB /-, genotypowanie oparte na PCR należy przeprowadzić dla każdego zwierzęcia, jak opisano w^{pkt 7,18}.
5. Samce, u których różnica wieku jest mniejsza niż cztery dni, powinny być wykorzystywane w celu zmniejszenia zmienności osobniczej.
6. (OPCJONALNIE): W przypadku eksperymentów reaktywacji NF-κB doksycyklinę należy podawać w wodzie pitnej (2 mg/ml z 2,5% sacharozy) przez co najmniej 14 dni.

2. Separacja wzorców przestrzennych-labirynt Barnesa (SPS-BM)

1. Wszystkie testy behawioralne powinny być przeprowadzane zgodnie z międzynarodowymi i lokalnymi wytycznymi.
2. ważny! Używaj tylko samców myszy w wieku sześciu miesięcy lub starszych. Różnica wieku między zwierzętami w jednej serii badań powinna być mniejsza niż cztery dni. Badanie musi być przeprowadzone przez ten sam operator dla każdej serii. Myszy powinny otrzymać standardową dietę przed testem, aby jeszcze bardziej zwiększyć motywację, częściowo napędzaną przez nagrodę w postaci słodkiego jedzenia.
3. Ustaw białą okrągłą płytę wykonaną z twardego tworzywa sztucznego (średnica 120 cm, patrz rysunek 5A) w pomieszczeniu o kontrolowanej wilgotności i temperaturze (22 °C), oświetlonym świetlówkami neonowymi o mocy co najmniej 4 x 80 W i 3 x 215 W. WAŻNY! Upewnij się, że używane jest odpowiednie oświetlenie, ponieważ motywacja myszy do wchodzenia do pomieszczeń z jedzeniem jest częściowo napędzana przez ich niechęć do jasnych, odsłoniętych miejsc.
4. Skonfiguruj system śledzenia wideo. Kamera powinna być umieszczona 115 cm powyżej środka płyty (patrz Rysunek 5A).
5. Przymocuj wielokolorowe wskazówki do labiryntu (EMC) do białej tkaniny w miejscach łatwo widocznych dla zwierząt, około 100 cm od krawędzi tabliczki (patrz Rysunek 5A).
6. Ostrożnie wyczyść płytkę szybkim środkiem dezynfekującym, który może usunąć wszelkie zapachy z zestawu eksperymentalnego.
7. Umieść siedem identycznych żółtych domków na żywność (12 cm x 7 cm x 8 cm, patrz Rysunek 5A) na białym talerzu. Pozycje powinny być jednoznacznie oznaczone (patrz rysunek 5A).
8. Umieść nagrody w postaci słodkich granulek żywności (jedna czwarta pętli Kellogs's Froot Loop/domku z jedzeniem) we wszystkich pomieszczeniach z żywnością w określonych miejscach (patrz Rysunek 5A), przy czym tylko jeden zdefiniowany pojemnik na żywność jest swobodnie dostępny dla zwierzęcia (lokalizacja F, patrz Rysunek 5A). Zamknij niedocelowe pojemniki z żywnością przezroczystą folią.
9. Przed badaniem należy przeprowadzić habituację (dzień przed rozpoczęciem zadania). Zadbaj o to, aby wszystkie domki z jedzeniem były swobodnie dostępne i pozwalały myszom na swobodne eksplorowanie labiryntu i zdobywanie nagrody w postaci granulek jedzenia (10 minut na zwierzę).
10. Włącz komputer i kamerę, a następnie uruchom oprogramowanie systemu śledzenia wideo.
11. Rozpocznij nagrywanie.
12. Umieść zwierzę w określonym punkcie początkowym na okrągłej płytce (Rysunek 5A, S: pozycja początkowa) i pozwól myszom szukać docelowego domu z jedzeniem przez 10 minut.
13. Zatrzymaj śledzenie wideo.
14. ważny! Wyczyść okrągłą płytę i pojemniki na żywność po każdej próbie szybkim środkiem dezynfekującym.
15. Powtarzaj test codziennie przez siedem kolejnych dni (dla każdego zwierzęcia).
16. Analizuj wyniki (opóźnienia, pokonany dystans i błędy) za pomocą odpowiedniego oprogramowania statystycznego. Zdefiniuj błędy jako zbliżanie się do niewłaściwego pojemnika z żywnością i / lub kontakt z właściwym pudełkiem bez wejścia i odzyskania nagrody w postaci granulek żywności. Do analizy grupowej należy użyć dwukierunkowej ANOVA z testem post-hoc Bonferroniego.
17. (OPCJONALNIE) Poświęć myszy i przeanalizuj hipokampy, jak opisano poniżej.

3. Etykietowanie BrdU

1. Wstrzykiwać dootrzewnowo 50 mg/kg i.p. BrdU raz na dobę przez 3 dni (analiza różnicowania i integracji) lub 200 mg/kg i.p. w pojedynczym wstrzyknięciu (analiza proliferacji).
2. Złóż zwierzęta w ofierze, rozkrój hipokampa i przygotuj skrawki 40 μm, jak opisano poniżej.
3. Denaturować skrawki 2 M HCl przez 10 minut i inkubować w 0,1 M buforze boranowym przez 10 minut.
4. Oznaczyć jedną na dwanaście serii odcinków 40 μm (w odległości 240 μm od siebie) od każdego zwierzęcia immunohistochemicznie, jak opisano poniżej, używając przeciwciał skierowanych przeciwko BrdU.
5. Określ ilościowo znakowane komórki za pomocą analizy mikroskopii konfokalnej w całym zasięgu rostrocaudalnym warstwy komórek ziarnistych i strefy subziarnistej. Pomnóż otrzymane liczby przez 12, aby uzyskać szacunkową całkowitą liczbę komórek znakowanych BrdU na hipokamp i podziel przez dwa, aby uzyskać całkowitą liczbę znakowanych komórek na DG.

4. Usuwanie mózgów i przygotowanie kriosekcji od zwierząt bez perfuzji

1. Przestrzegaj lokalnie zatwierdzonych procedur eutanazji zwierząt. Myszy mogą zostać bezpośrednio poddane eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy.
2. (OPCJONALNIE) Zwierzęta mogą być znieczulone przed eutanazją zgodnie z lokalnymi i międzynarodowymi wytycznymi, np. poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie 0,8 ml Avertin dla myszy o wadze 33 g (świeżo przygotowanej przez zmieszanie 150 ml roztworu podstawowego sporządzonego z 2,2 mg 2,2,2-tribromoetanolu w 1 ml etanolu izoamylowego z 1,85 ml soli fizjologicznej lub buforu fizjologicznego).
3. Wysterylizuj głowę gazą nasączoną betadiną (10% jodowidonu), a następnie przetrzyj gazą nasączoną 70% etanolem.
4. Odetnij głowę zwierzęcia za pomocą odpowiednich nożyczek chirurgicznych i odciągnij skórę na bok.
5. (OPCJONALNIE) Można zastosować utrwalacze, aby uniknąć fałdowania się opóźnionej skóry.
6. Wykonaj nacięcie w linii środkowej czaszki i ostrożnie odciągnij fragmenty czaszki na bok.
7. Ostrożnie usuń cały mózg za pomocą odpowiedniego narzędzia chirurgicznego (np. łyżki Moria).
8. Schłodzić 25 ml 2-metylobutanu w zlewce o pojemności 50 ml (np. Schott Duran) do temperatury -30–-40 °C na suchym lodzie.
   Uwaga: W przypadku swobodnego barwienia "grubych" skrawków, które idealnie nadają się do konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej, należy usunąć mózg, przemyć 3 razy w buforze i przechowywać w temperaturze 4 °C w buforowanym fosforanem 30% roztworze sacharozy w probówce o pojemności 50 ml, aż mózg opadnie na dno (zwykle na noc).
9. Ostrożnie umieścić mózg na kawałku Nescofilmu (Parafilm) i przykryć dużą ilością związku TissueTek OCT, zamrozić na Nescofilm w 2-metylobutanie, przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia.
   Uwaga: W przypadku długotrwałego przechowywania w temperaturze -20 °C przechowywać w 9% sacharozy, 7 mM MgCl₂, 50 mM buforze fosforanowym, 44% glicerolu.
10. Pokrój mózg na skrawki o grubości 10-12 μm na odpowiednim kriomikrotomie.
    Uwaga: W przypadku grubych, swobodnie unoszących się odcinków, należy zamrozić mózg na etapie kriotomu odpowiedniego kriotomii (np. Reichert Jung, Frigomobil) i ciąć odcinki poziome o grubości 40 μm w temperaturze od -20° do -25 °C. Zebrać skrawki z noża za pomocą drobnej szczotki i zebrać w buforze lub przechowywać w roztworze do przechowywania (krok 4.9) w temperaturze -20 °C do długotrwałego przechowywania.
11. Ostrożnie zamontuj dwie plastry na pojedynczych szkiełkach mikroskopowych. Zdecydowanie zaleca się stosowanie prowadnic Superfrost UltraPlus, aby zmaksymalizować przyczepność sekcji.
12. Suszyć szkiełka przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Szkiełka można przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia.

5. Przygotowanie sekcji z perfekcji zwierząt

1. Znieczulić zwierzęta zgodnie z powyższym opisem (krok 4.2).
2. Ostrożnie perfuzję przezsercową zwierzęcia z solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) zawierającą heparynę (0,025 g/100 ml PBS) i prokainę (0,5 g/100 ml PBS) przez 2-4 minuty, a następnie 4% paraformaldehydu w PBS przez 10-15 min. Perfuzja jest optymalnie przeprowadzana przez perfuzję przez lewą komorę i otwarcie prawego przedsionka przy użyciu ciśnienia hydrostatycznego około 1,2-1,4 m lub przy użyciu pompy perystaltycznej ustawionej na około 15 ml/min. Optymalna perfuzja Powoduje blady biały mózg bez widocznych czerwonych naczyń krwionośnych.
3. Wypreparować i utrwalić mózgi w 4% paraformaldehydzie w temperaturze 4 °C przez 24 godziny.
4. Krioprotekcja mózgu w 30% sacharozie w PBS w temperaturze 4 °C przez co najmniej 24 godziny.
5. Zamroź mózgi na etapie kriotomii.
6. Przygotuj poziome odcinki o grubości 40 μm z całego przodomózgowia za pomocą odpowiedniego kriotomii.
7. Szkiełka można przechowywać w roztworze krioprotektantu (0,1 M bufor fosforanowy, 50% glicerol, 0,14% MgCl₂, 8,6% sacharozy) w temperaturze -20 °C do czasu użycia.

6. Immunohistochemia wycinków mózgu zwierząt bez perfuzji

1. Po utrwaleniu kriosekcji, przygotowanych w sposób opisany powyżej, przy użyciu metanolu w temperaturze -20 °C przez 10 minut.
2. Blok z 5% normalną surowicą zawierającą 0,3% Triton-X (z gatunku, który był używany do wytworzenia przeciwciała drugorzędowego) przez noc w temperaturze 4 °C.
3. Przepłukać 3x 1x PBS i inkubować z przeciwciałami pierwszorzędowymi przez noc w temperaturze 4 °C.
4. Przepłukać 3x 1x PBS i inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi w temperaturze pokojowej przez godzinę.
5. Płukać 3x za pomocą 1x PBS
6. Przeciwbarwić skrawek DNA za pomocą SYTOX green lub DAPI (lub alternatywnego barwnika DNA).
7. Płukać 3x za pomocą 1x PBS
8. Osadź skrawki w wodnym podłożu do zatapiania.
9. Pozwól pożywce do zatapiania polimeryzować przez co najmniej 48 godzin.

7. Immunohistochemia wycinków mózgu zwierząt z perfuzją

1. Blokować zgodnie z opisem w kroku 6.2, a następnie inkubować nieruchome skrawki mózgu w roztworze przeciwciała pierwszorzędowego rozcieńczonym w PBS zawierającym 0,3% Triton-X (swobodnie pływający) przez noc w temperaturze 4 °C.
2. Przepłukać trzykrotnie 1x PBS i inkubować w drugorzędowym roztworze przeciwciał rozcieńczonym w PBS zawierającym 0,3% Triton-X (swobodnie pływający) w temperaturze pokojowej przez 3 godziny.
3. Płukać 3x za pomocą 1x PBS
4. Przeciwbarwić skrawek DNA za pomocą SYTOX green lub DAPI (lub alternatywnego barwnika DNA).
5. Spłucz trzykrotnie 1x PBS
6. Osadź skrawki w wodnym podłożu do zatapiania.
7. Pozwól pożywce do zatapiania polimeryzować przez co najmniej 48 godzin.

8. Badanie projekcji włókien mszystych

1. Złożyć zwierzęta w ofierze, przygotować skrawki koronalne 40 μm, jak opisano powyżej, i wybarwić przekrój hipokampa za pomocą przeciwciała dla neurofilamentu M.
2. Zeskanuj skrawki przy odpowiedniej długości fali za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego, aby uwidocznić omszałe włókna i jądra. Rozpocznij skanowanie przy małym powiększeniu.
3. Użyj obrazów o małym powiększeniu do orientacji i celuj w hipokamp za pomocą projekcji z omszałych włókien.
4. Skanuj przekroje (przekrój z) w wysokiej rozdzielczości i dużym powiększeniu.
5. Przeanalizuj morfologiczny wygląd i łączność włókien omszałych uwidocznionych za pomocą barwienia dla NF-M.
6. (OPCJONALNIE) Przeanalizuj rozmiar i objętość łopatek hipokampa. Do pomiarów należy użyć sygnału DNA.

9. Test fluoro-jadeitowy C (śmierć komórek neuronalnych)

1. Złóż zwierzęta w ofierze, rozprowadź sekcję hipokampa i przygotuj skrawki 12 μm, jak opisano powyżej.
2. Pozostaw sekcje do wyschnięcia na 30 minut w temperaturze pokojowej.
3. Utrwalić sekcje w 4% PFA na 40 minut w temperaturze pokojowej.
4. Krótko umyć sekcje 3x za pomocą ddH₂O.
5. Inkubować skrawki z 0,06 % nadmanganianem potasu (KMnO₄) przez 10 minut pod ciągłym, delikatnym wstrząsaniem.
6. Umyć sekcje 3x za pomocą ddH₂O.
7. Inkubować sekcje z 0,002% roztworem fluoro-jadeitu C przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
8. (OPCJONALNIE) W przypadku jednoczesnego barwienia jądrowego, 0,002% roztwór fluoro-jadeitu C można uzupełnić 10 μg/ml DAPI.
9. Krótko umyć sekcje 3x za pomocą ddH₂O.
10. Pozostaw sekcje do wyschnięcia na 30 minut w temperaturze pokojowej.
11. Inkubacja skrawków z ksylenem (1 min)
12. Zamontuj sekcje za pomocą medium montażowego na bazie ksylenu (DPX).

Results

Krzyżowanie transgenicznych linii myszy IκB/- i tTA prowadzi do warunkowego zahamowania aktywności NF-κB w hipokampie.

Aby zbadać ekspresję transgenu IκBα-AA1 u podwójnej transgenicznej myszy (Rysunek 1A), mózgi zostały wyizolowane, poddane kriosekcji i wybarwione za pomocą przeciwciała przeciwko GFP (białemu zielonemu fluorescencyjnemu). Konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa ujawniła wysoką ekspresję transgenu w regionach CA1 i CA3 oraz w DG (Fi...

Discussion

Neurogeneza u dorosłych osób i możliwość jej manipulacji poprzez hamowanie NF-κB w neuronach, a następnie jej reaktywacja przez doksycyklinę, oferuje fascynujący system do badań nad nowo narodzonymi neuronami w dorosłym mózgu, a także nad degeneracją i regeneracją neuronów. Piękno tego systemu polega na tym, że hamowanie szlaku sygnałowego NF-κB w neuronach powoduje nie tylko zmiany w śmierci komórek neuronalnych, proliferację i migrację progenitorów oraz poważne zmiany strukturalne i anatomiczne, ale także oczywiste wad...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Łyżka perforowana Moria MC17	FST	10370-18	usuwanie mózgów
Mikroskop preparacyjny	Carl Zeiss	Stemi SV8	usuwanie mózgów
Nożyczki chirurgiczne	FST	14084-08	usuwanie mózgu
Nożyczki chirurgiczne	FST	14381-43	usuwanie mózgów
Kleszcze Dumont #5	FST	11254-20	usuwanie mózgów
Slajdy SuperFrost Szkiełka	Carla Rotha	1879	do immunohistochemii
Paraformaldehyd	Sigma-Aldrich	P6148	utrwalacz
Związek TissueTek OCT	Sakura Finetek	1004200018	osadzanie mózgów
Normalna surowica kozia	Jackson Immunolabs	005-000-001	blokowanie w IHC
Normalne serum królika	Jackson Immunolabs	011-000-001	blokowanie w IHC
Normalne surowice osła	Jackson Immunolabs	017-000-001	blokowanie przeciwciała IHC
anty-Neurofilament-M	Badania rozwojowe Hybridoma Bank	2H3	IHC, Rozcieńczenie 1:200
anty-Doublecortin  przeciwciało	sc-8066	Santa Cruz	IHC, Rozcieńczenie 1:800
przeciwciało anty-GFP	Abcam	ab290	IHC, Rozcieńczenie 1:2,000
przeciwciało anty-BrdU	OBT0030G	Accurate Chemicals	IHC, Rozcieńczenie 1:2,000
Fluoro-Jade C	FJ-C	HistoChem	Oznaczanie śmierci komórek neuronalnych
Betadine	Mundipharma	D08AG02	środek dezynfekujący
Kriomikrotom	Leica	CM1900	przygotowanie plastrów mózgu
Heparyna sól sodowa	Sigma-Aldrich	H3393	perfuzja
Okrągła płytka wykonana z twardego tworzywa sztucznego (średnica 120 cm)	wykonana w	laboratoriumbrak	talerz do SPS-BM, średnica 120 cm
Szybki środek dezynfekujący Buraton	Schü lke Mayr	113 911	środek dezynfekujący
System śledzenia wideo TSE VideoMot 2 z pakietem oprogramowania VideoMot2	TSE Systems	302050-SW-KIT	śledzenie i analiza SPS-BM
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787	permeabilizacja/IHC
Cryotome	Reichert Jung/Leica	Frigomobil 1206	przygotowanie 40 &mikro; m plastry mózgu
Mowiol 4-88	Carl Roth	Art.-Nr. 0713	osadzanie slajdów
SYTOX zielony	Invitrogen	S7020	Barwienie jądrowe
Granulki spożywcze (Kellog's Froot Loops)	Kellog's		SPS-BM
Prism, wersja 3.0	Graph Pad Software, San Diego, USA		Ocena statystyczna oprogramowania SPS-BM
Zen 2008 lub Zen 2011	Carl Zeiss		Software (mikroskop konfokalny)
D.P.X	Sigma-Aldrich	317616	podłoże montażowe do barwienia fluoro-jadeitu C