Artykuł metodologiczny

Kontekstowy i sygnalizowany test warunkowania strachu przy użyciu systemu analizy wideo u myszy

57K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50871

⸱

1 marca 2014

 ,  ,  , 
1Division of Systems Medical Science, Institute for Comprehensive Medical Science, Fujita Health University, 2Japan Science and Technology Agency, Core Research for Evolutionary Science and Technology (CREST), 3Center for Genetic Analysis of Behavior, National Institute for Physiological Sciences, National Institutes of Natural Sciences

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł przedstawia protokół dla kontekstowego i podpowiedzianego testu warunkowania strachu przy użyciu systemu analizy wideo do oceny uczenia się strachu i pamięci u myszy.

Streszczenie

Test warunkowania strachu kontekstowego i podpowiedzianego jest jednym z testów behawioralnych, które oceniają zdolność myszy do uczenia się i zapamiętywania związku między sygnałami środowiskowymi a doświadczeniami awersyjnymi. W tym teście myszy umieszcza się w komorze kondycjonującej i podaje się im porcje bodźca warunkowego (sygnał słuchowy) i awersyjnego bodźca bezwarunkowego (elektryczny wstrząs stopą). Po pewnym czasie opóźnienia myszy są poddawane działaniu tej samej komory kondycjonującej i komory o innym kształcie z prezentacją sygnału słuchowego. Zachowanie podczas testu jest mierzone jako wskaźnik pamięci strachu. Aby automatycznie analizować zachowanie, opracowaliśmy system analizy wideo za pomocą aplikacji ImageFZ, która jest dostępna do bezpłatnego pobrania na stronie http://www.mouse-phenotype.org/. Tutaj, aby pokazać szczegóły naszego protokołu, demonstrujemy naszą procedurę dla kontekstowego i sygnalizowanego testu warunkowania strachu na myszach C57BL/6J przy użyciu systemu ImageFZ. Ponadto zweryfikowaliśmy działanie naszego protokołu i systemu analizy wideo, porównując czas zamrażania zmierzony przez system ImageFZ lub komputerowy system pomiarowy oparty na promieniach słonecznych z czasem ocenionym przez ludzkiego obserwatora. Jak pokazują nasze reprezentatywne wyniki, dane uzyskane przez ImageFZ były podobne do tych analizowanych przez ludzkiego obserwatora, co wskazuje, że analiza behawioralna przy użyciu systemu ImageFZ jest wysoce wiarygodna. Niniejszy artykuł filmowy zawiera szczegółowe informacje dotyczące procedur testowych i pomoże w zrozumieniu sytuacji eksperymentalnej.

Wprowadzenie

Kontekstowy i sygnalizowany test warunkowania strachu jest paradygmatem behawioralnym używanym do oceny asocjacyjnego uczenia się strachu i pamięci u gryzoni1-3. Test ten jest szeroko stosowany do zrozumienia neurobiologicznych mechanizmów uczenia się strachu i pamięci u myszy transgenicznych i nokautujących1,4-16. Zachowanie zamrożenia, które definiuje się jako całkowity bezruch z wyjątkiem oddychania, jest powszechną reakcją na sytuacje lękowe. W tym paradygmacie behawioralnym, po tym, jak zwierzęta są wystawione na połączenie sygnału słuchowego z elektrycznym wstrząsem stopy, reagują na bodziec wywołujący strach, wykazując zachowanie zamrożenia, które jest mierzone jako wskaźnik asocjacyjnego uczenia się strachu i pamięci. Ten test wymaga mniej wyszukanego sprzętu, mniejszego wysiłku fizycznego badacza i znacznie mniej czasu na trening myszy niż inne zadania związane z uczeniem się i pamięcią; Zwykle wymaga około 5-10 minut dziennie na mysz przez 2 dni. Chociaż procedura testowa jest prosta i zajmuje niewiele czasu, badacz musi uważnie obserwować i mierzyć zachowanie myszy; W związku z tym opracowano kilka zautomatyzowanych systemów pomiarowych do przeprowadzania analizy behawioralnej17-20. Nasz system analizy wideo, który opracowaliśmy za pomocą oprogramowania ImageFZ, pozwala nam łatwo analizować zamarzanie i uzyskiwać wysoce wiarygodne wyniki. Ten artykuł zawiera szczegółowe informacje na temat naszej procedury testowania i opisuje, jak korzystać z oprogramowania ImageFZ.

Protokół

Wszystkie eksperymenty powinny być przeprowadzane zgodnie z wytycznymi i protokołami ustalonymi przez lokalne Komitety ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania.

1. Ustawienie aparatury

  1. Aparaturą do badania kondycjonowania i kontekstu jest kwadratowa komora z elektryzowaną podłogą siatkową, źródłem dźwięku i skalibrowanym generatorem wstrząsów. Stosowane są różne rozmiary komór, o wymiarach od 54 cm x 27 cm x 30 cm 21 do 25 cm x 35 cm x 30 cm 22. W tym protokole aparat składa się z akrylowej kwadratowej komory (33 cm x 25 cm x 28 cm; przezroczysta na przedniej i tylnej ścianie; biała na ścianach bocznych) z metalowymi kratkami (o średnicy 0,2 cm, oddalona od siebie o 0,5 cm) pokrytą przezroczystą akrylową pokrywą (ryc. 1A). Konieczne jest umieszczenie komory na białej akrylowej podłodze (Rysunek 1B) w celu przeanalizowania zachowania czarnych, agouti lub rozcieńczonych brązowych myszy, ponieważ system analizy obrazu za pomocą oprogramowania ImageFZ (dostępnego do bezpłatnego pobrania, patrz Tabela materiałów/odczynników) odróżnia ciemny obiekt od białego tła na każdym przechwyconym obrazie wideo. Myszy albinosy można również testować za pomocą czarnych metalowych siatek i czarnej akrylowej podłogi (ryc. 1B). Lampy z diodami elektroluminescencyjnymi (LED) są przymocowane do sufitu nad urządzeniem. Podłoga z siatki jest oświetlona światłem LED o natężeniu 100 luksów. Głośnik podłączony do generatora białego szumu/tonu (rysunek 1C) jest zamontowany na suficie 5 cm nad pokrywą, aby przedstawić wskazówkę dźwiękową (biały szum, 55 dB) jako bodziec warunkowany (CS). Siatki są podłączone do generatora wstrząsów (rysunek 1C) w celu dostarczenia elektrycznego wstrząsu stopowego jako bodźca bezwarunkowego (US). Komora testowa jest umieszczona w dźwiękoszczelnym pomieszczeniu (170 cm x 210 cm x 200 cm) (rysunek 1D) w celu zminimalizowania hałasu zewnętrznego podczas testów. Ten warunek uniemożliwia również myszom, które nie są obecnie poddawane testowi, usłyszenie sygnału słuchowego lub wokalizacji myszy testowych.
  2. Aparatura do testu z sygnałem składa się z komory, która ma inne właściwości niż komora kondycjonująca, co zapewnia nowy kontekst. Konieczna jest zmiana sygnałów sensorycznych tak bardzo, jak to możliwe, tak aby mysz postrzegała nowy kontekst jako niezwiązany z komorą kondycyjną. Ogólnie rzecz biorąc, stosuje się pudełko o innym kształcie lub trójkątną komorę. Ponadto mysz ma również zapewnione różne sygnały świetlne i/lub węchowe. W tym protokole aparat jest akrylową trójkątną komorą (33 cm x 29 cm x 32 cm; biała na każdej bocznej ścianie) z płaską, białą podłogą dla czarnych, agouti lub rozcieńczonych brązowych myszy lub płaską, czarną podłogą dla myszy albinosów, pokrytą przezroczystą akrylową pokrywą (ryc. 1E). Światła LED są przymocowane do sufitu nad aparatem. Poziom oświetlenia podłogi jest ustawiony na 30 luksów. Głośnik jest zamontowany na suficie 5 cm nad pokrywą, aby zapewnić sygnał dźwiękowy, który jest taki sam, jak ten, który jest dostarczany myszom w czasie kondycjonowania. Komora trójkątna znajduje się w innym pomieszczeniu dźwiękoszczelnym niż pomieszczenie, w którym wykonywane są testy kondycjonowania i kontekstu.
  3. Każda komora jest wyposażona w zamontowaną na suficie kamerę CCD (Charge Coupled Device) łączącą się z komputerem z systemem Windows za pomocą poczwórnego rozdzielacza wideo i urządzenia USB do przechwytywania obrazu w celu monitorowania zachowania myszy, a obrazy urządzenia i myszy są przechwytywane i analizowane przez program użytkowy ImageFZ (patrz Protokół 6). Generatory białego szumu i wstrząsów nożnych są automatycznie sterowane przez oprogramowanie ImageFZ; Czas rozpoczęcia i czas trwania białego szumu i wstrząsów nożnych musi być zapisany w pliku tekstowym (zobacz przykładowy plik tekstowy "simple-cond" pokazany na filmie, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat tego, jak parametry są zapisywane w pliku), który jest wczytywany do aplikacji.
  4. Przed rozpoczęciem każdego testu akrylowe ściany i podłogi są wycierane ręcznikiem nasączonym bardzo podchlorawym wodą (pH 6-7), a siatki są czyszczone 70% etanolem, aby zapobiec odchyleniu opartemu na sygnałach węchowych. Kratki są przecierane etanolem zamiast super podchloraną wodą, aby zapewnić, że kratki nie zmniejszają swojej przewodności elektrycznej z powodu rdzy.

2. Przygotowanie zwierząt

  1. Ogólnie rzecz biorąc, od dwóch do czterech myszy w klatce trzyma się w pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze (23±2 °C) z 12-godzinnym cyklem światła/ciemności (np. światła włączają się o 7:00 rano).
  2. W tym protokole, w celu zmniejszenia możliwego wpływu transportu w klatkach na zachowanie i przystosowania myszy do środowiska eksperymentalnego, klatki zawierające myszy są przenoszone z pomieszczenia do przetrzymywania zwierząt do dźwiękoszczelnej poczekalni przylegającej do dźwiękoszczelnego pomieszczenia testowego co najmniej 30 minut przed rozpoczęciem każdego testu.
  3. Wszystkie eksperymenty (Rysunek 2A) powinny być wykonywane w tym samym okresie czasu w fazie jasnej lub ciemnej każdego dnia, aby zminimalizować różnice behawioralne wynikające z testowania w różnych momentach23,24. W tym protokole wszystkie eksperymenty są przeprowadzane między 1 godziną po nadejściu fazy światła a 1 godziną przed nadejściem fazy ciemnej (od 8:00 do 18:00 w fazie światła). Jeśli dostępne jest tylko jedno urządzenie, myszy z każdego genotypu powinny być testowane w przeciwnej kolejności, aby zmniejszyć potencjalny wpływ czasu eksperymentu i kolejności testowania badanych na wyniki behawioralne. ImageFZ może sterować maksymalnie 4 aparatami. Testowanie 4 myszy jednocześnie przy użyciu 4 aparatów w przeciwwadze pozwala badaczowi zaoszczędzić czas i zmniejsza możliwy wpływ parametrów eksperymentalnych na zachowanie myszy.

3. Kondycjonowanie

  1. Myszy umieszcza się w komorze kondycjonującej, a myszy zazwyczaj mogą swobodnie eksplorować komorę przez 120 sekund. Następnie sygnał słuchowy, taki jak biały szum, ton i klik dźwiękowy, jest prezentowany jako CS przez 30 sekund, a wstrząs stopowy o natężeniu 0,1-0,8 mA jest podawany myszom jako US w ciągu ostatnich 2 sekund dźwięku. Prezentacja parowania CS-US jest powtarzana w celu wzmocnienia stowarzyszenia. Myszy pozostawia się w komorze na pewien czas po ostatniej prezentacji, aby jeszcze bardziej ustalić związek między kontekstem komory a doświadczeniem awersyjnym. W tym protokole, po 120 sekundach swobodnej eksploracji, przez 30 sekund prezentowana jest wskazówka dźwiękowa (biały szum, 55 dB), a wstrząs nożny o natężeniu 0,3 mA jest dostarczany w sposób ciągły przez ostatnie 2 sekundy białego szumu. Po 90 sekundach para sygnału słuchowego z wstrząsem stopy jest ponownie podawana badanym. Prezentacja CS-US jest powtarzana trzy razy na sesję (120, 240 i 360 sekund po rozpoczęciu kondycjonowania) (Rysunek 2B). Po ostatnim wstrząsie stopy myszy pozostawia się w komorach w spokoju przez 90 sekund.
  2. Przed rozpoczęciem sesji kondycjonowania uruchom aplikację ImageFZ, wybierz menu wtyczek "Kondycjonowanie FZ i FZ Online (4 komory)" i ustaw wartości parametrów krok po kroku w następujący sposób.
    1. Krok 1: Identyfikator projektu. Określ folder, w którym chcesz przechowywać pliki danych.
    2. Krok 2: Nazwa sesji. Wpisz dowolne słowa, np. datę eksperymentu, w polu "Sesja" i wybierz referencyjny plik tekstowy, w którym zapisana jest godzina rozpoczęcia i czas trwania białego szumu i wstrząsu stopy, w polu "Odniesienie". Przykładowy plik tekstowy jest pokazany w filmie.
    3. Krok 3: Ustawienia parametrów. Wprowadź wartości parametrów w każdym polu w następujący sposób.
      1. Szybkość (klatka/s): szybkość akwizycji obrazu, np. 1 klatka/s.
      2. Czas trwania (s): w przypadku kondycjonowania całkowity czas trwania wynosi 480 sek.
      3. Czas trwania kosza (s): np. 60 sek.; dane są analizowane w każdym bloku 60 sek.
      4. Rozmiar obiektu - min (piksele): ImageFZ wykrywa mysz i szum jako czarne cząsteczki (pewną masę pikseli) na białym tle na każdym obrazie. Gdy powierzchnia czarnej cząstki (pikseli) jest mniejsza niż wartość "Rozmiar obiektu – min (piksele)" (np. 100 pikseli), cząstki są traktowane jako szum i są wyłączane z analizy obrazu.
      5. Rozmiar obiektu - maksimum (piksele): gdy rozmiary czarnych cząstek są większe niż rozmiar wartości "Rozmiar obiektu – maksimum (piksele)", cząstki są wykluczane z analizy.
      6. Wymiary ramy - szerokość/wysokość (cm): wymiar komory, tj. 33 cm szerokości i 25 cm wysokości.
      7. Kryterium zamrażania (piksele): np. 30 pikseli, szczegóły znajdują się w Protokole 6.
      8. Czas zamrożenia - min (s): np. 2 sekundy; jeśli żaden ruch myszy nie zostanie wykryty tylko przez mniej niż 2 sekundy, jego zachowanie nie jest liczone jako "zamrożenie".
      9. Częstotliwość wstrząsów (klatka/s): patrz szczegóły w Protokole 6.
    4. Krok 4: Identyfikator podmiotu. Wprowadź dane identyfikacyjne podmiotu.
    5. Krok 5: Ustawienia aparatu. Kontroluj jasność i kontrast przechwyconego obrazu.
    6. Krok 6: Ustawienia progowe. Dostosuj wartości progowe, aby wykrywać czarną mysz jako czarne piksele na białym tle na każdym obrazie i oceniać zachowanie myszy jako "zamrożenie" lub "niezamrożenie" (patrz szczegóły w Protokole 6). Aby przeanalizować mysz albinosa, kliknij pole wyboru "tryb odwrócenia" i odpowiednio dostosuj wartości progowe.
    7. Krok 7: Ustaw pole klatki. Określ pole każdej komory, którą chcesz przechwycić. Po kliknięciu przycisku prostokąta w przyborniku, narysuj prostokąt wokół podłogi komory w oknie obrazu na żywo. Następnie wybierz numer komory i kliknij przycisk "Ustaw". Na koniec kliknij przycisk "Zakończ".
  3. Po ustawieniu ustawień parametrów należy przeprowadzić test przygotowawczy na myszach treningowych (myszy nie używane jako testery) przed pierwszym testem dnia, aby określić, czy system analizy obrazu i generatory białego szumu/wstrząsów działają bez problemów.
  4. Przenieś domową klatkę zawierającą myszy ćwiczebne do dźwiękoszczelnego pomieszczenia testowego z sąsiedniej poczekalni i umieść każdą mysz w komorze kondycjonalnej. Natychmiast po umieszczeniu myszy w komorze kliknij przycisk start ImageFZ. Oprogramowanie aplikacyjne będzie prezentować myszom sygnały dźwiękowe i/lub elektryczne wstrząsy stóp w kolejności określonej w pliku referencyjnym.
  5. Po upływie 480 sekund zwróć myszy do ich klatki domowej i odłóż klatkę na półkę w pomieszczeniu do trzymania.
  6. Dokładnie wyczyść komory. Następnie kliknij przycisk "Następna analiza" i powtórz kroki 3.2.4-3.6 dla myszy testowych.
  7. ImageFZ przechowuje obrazy na żywo i obrazy trasowania w formacie TIFF. Program pozwala nam na przeprowadzenie analizy offline w celu ponownej analizy obrazów przy użyciu zmodyfikowanych wartości parametrów. Jeśli przeprowadzasz analizę w trybie offline, wybierz menu wtyczki "Fear Conditioning and FZ Offline" i wybierz folder danych, który chcesz ponownie przeanalizować. Następnie ponownie wprowadź wartości parametrów i kliknij przycisk "Zakończ".

4. Test kontekstowy

  1. Po zakończeniu sesji warunkowania myszy są wracane do tej samej komory kondycjonowania i oceniane pod kątem zachowania zamrażającego w celu zmierzenia kontekstowo uwarunkowanego strachu (test kontekstowy). Odstęp czasu między kondycjonowaniem a testem kontekstowym jest zazwyczaj ustalany na 24 godziny. W tym protokole, w celu oceny pamięci najnowszej i pamięci zdalnej (mierzonej w teście odpowiednio 1 dzień i ponad 28 dni po kondycjonowaniu)25, myszy są poddawane testowi kontekstowemu około 24 godziny i 30 dni po sesji kondycjonowania. Myszy umieszcza się w komorze kondycjonującej i pozwala się im swobodnie eksplorować komorę przez 300 sekund bez prezentacji CS i US (ryc. 2C).
  2. Uruchomić program ImageFZ i ustawić wartości parametrów aplikacji w taki sam sposób, jak w kondycjonowaniu (patrz sekcja 3.2.3); należy jednak zmodyfikować czas trwania tego testu na 300 sekund i wybrać referencyjny plik tekstowy do testu kontekstowego. Po zmianie ustawienia należy przeprowadzić test przygotowawczy z użyciem myszy ćwiczebnych w celu sprawdzenia systemu ImageFZ.
  3. Umieść każdą mysz w komorze kondycjonowania i kliknij przycisk start. Po upływie 300 sekund włóż myszy z powrotem do ich domowej klatki i pozostaw klatkę w spokoju do momentu rozpoczęcia testu z sygnałem.
  4. Wyczyść komory. Następnie kliknij przycisk "Następna analiza" i powtórz kroki 4.3-4.4 na myszach testowych.

5. Test Cued

  1. Test Cued jest przeprowadzany w tym samym dniu, w którym przeprowadzono test kontekstowy lub w dniu następnym. W tym teście myszy są umieszczane w innej komorze testowej o bardzo różnych właściwościach, zapewniając nowy kontekst, który nie jest związany z komorą kondycjonującą przez 3 minuty. Pod koniec pierwszych 3 minut sygnał dźwiękowy, który jest prezentowany w momencie kondycjonowania, jest podawany myszom przez 3 minuty w nowym środowisku kontekstowym. W tym protokole test cued jest wykonywany kilka godzin po teście kontekstowym. Myszy mogą eksplorować trójkątną komorę przez 360 sekund. W ciągu pierwszych 3 minut nie jest prezentowany ani CS, ani US, a następnie CS (biały szum 55 dB) jest prezentowany przez ostatnie 3 minuty.
  2. Uruchom oprogramowanie ImageFZ i ustaw wartości parametrów w taki sam sposób, jak w kondycjonowaniu, z wyjątkiem modyfikacji czasu trwania testu na 360 sekund i wybrania referencyjnego pliku tekstowego dla testu cued. Po dostosowaniu ustawienia należy przeprowadzić test przygotowawczy przy użyciu myszy ćwiczebnej w celu sprawdzenia systemu ImageFZ.
  3. Umieść każdą mysz w trójkątnej komorze i kliknij przycisk Start. Po upływie 360 sekund włóż myszy z powrotem do klatki domowej i odłóż klatkę na półkę w pomieszczeniu do przetrzymywania.
  4. Wyczyść komory. Następnie kliknij przycisk "Następna analiza" i powtórz kroki 5.3-5.4 na myszach testowych.
  5. Aby dokładniej przetestować pamięć zdalną, powtórz protokoły 4-5 około 30 dni po sesji kondycjonowania (Rysunek 2A).

6. Analiza obrazu

  1. Automatyczne pobieranie i analizowanie danych za pomocą ImageFZ. Ta aplikacja jest oparta na domenie publicznej programie ImageJ (opracowanym przez Wayne'a Rasbanda z National Institutes of Health i dostępnym pod adresem http://rsb.info.nih.gov/ij/), zmodyfikowanym przez Tsuyoshi Miyakawa (aplikacja ImageFZ, dostępna do bezpłatnego pobrania, patrz Tabela materiałów/odczynników).
  2. We wszystkich eksperymentach należy rejestrować obrazy z określoną liczbą klatek na sekundę (np. 1 kl./s) za pomocą funkcji ImageFZ za pomocą urządzenia USB do przechwytywania wideo, w tym kamery wideo. Aby zmierzyć przebytą odległość od kolejnych obrazów, dostosuj wartość "progu minimalnego" programu (np. 80 pikseli), która jest ustawiona na segmentację obrazów na czarną cząstkę (mysz) i białe tło. Przebyta odległość jest obliczana na podstawie odległości między każdym zestawem współrzędnych x-y środka ciężkości cząstki na kolejnych obrazach.
  3. Aby zmierzyć zachowanie zamrożenia kolejnych obrazów, dostosuj wartość "progu min (xor)" programu (np. 160 pikseli), która jest ustawiona na segmentację obrazów na czarną cząstkę (mysz) i tło, a następnie oblicz ilość obszaru (pikseli) nienakładających się obszarów między cząstkami każdej pary kolejnych obrazów. Dostosuj wartość za pomocą suwaka narzędzia próg, aż cząstka na każdym obrazie będzie pasować do kształtu całej obudowy myszy z wyjątkiem ogona. Jeśli obszar obszaru nienakładającego się na siebie jest poniżej wartości "kryterium zamrożenia" (np. 30 pikseli), zachowanie to uważa się za "zamrożenie" (rysunek 3), które jest ogólnie definiowane jako całkowity brak jakiegokolwiek ruchu z wyjątkiem oddychania i bicia serca. Gdy obszar przekroczy tę wartość, zachowanie jest uważane za "niezamarzające" (rysunek 3). Ocena powinna być dokonana w oparciu o definicję zamrażania. Myszy czasami wykazują subtelny ruch i chwilowy bezruch, co może nie być uważane za zachowanie zastygające w bezruchu, które odzwierciedla strach. Bezruch trwający przez krótki czas (np. krótszy niż 2 sekundy), który prawdopodobnie różni się od przejawu lęku, można wykluczyć z analizy, ustalając próg czasowy zamrożenia. Aby ustawić próg czasowy, wprowadź wartość "Czas zamrożenia – min (s)" (np. 2 sekundy).
  4. Program ImageFZ automatycznie oblicza przebytą odległość (cm) i procent zamarznięcia. Wyniki są zapisywane w plikach tekstowych, a obrazy aktywne i obrazy trasowania są przechowywane w formacie TIFF. Aby zmierzyć przebytą odległość (cm) jako wskaźnik wrażliwości na wstrząsy elektryczne, program ImageFZ rejestruje również obrazy z dużą liczbą klatek na sekundę (np. 4 kl./s) przez 6 sekund, mierzoną od 2 sekund przed dostarczeniem 2-sekundowego wstrząsu stopą do 2 sekund po wstrząsie stopy podczas analizy online. Aby ustawić liczbę klatek na sekundę dla przechwytywania obrazu przed, w trakcie i po wstrząsie nożnym, wprowadź wartość w polu "Szybkość wstrząsów (klatka/s)". Po analizie online przeprowadź analizę offline, wybierając menu wtyczki "FZ Shock Offline", aby uzyskać dane dotyczące przebytej odległości.
  5. Wartości parametrów programu ImageFZ powinny być zoptymalizowane tak, aby generować wyniki podobne do tych uzyskiwanych przez obserwatorów w testach przygotowawczych. W przypadku ręcznej oceny zachowanie zamarzania jest mierzone w sposób ciągły za pomocą stopera i programu rejestrującego zdarzenia lub procedury natychmiastowego próbkowania czasu co 3-10 sekund, podczas analizy za pomocą oprogramowania ImageFZ. Obserwację behawioralną zazwyczaj przeprowadza dwóch obserwatorów. Aby dostosować wartości parametrów programu ImageFZ w celu zapewnienia, że wyniki analizy obrazu są zgodne z wynikami obserwatorów, należy przeprowadzić analizę programu ImageFZ w trybie offline, modyfikując wartości "progu minimalnego (xor)" i "kryterium zamrażania". Aby przeprowadzić analizę w trybie offline, wybierz menu wtyczki "FZ Offline" i wprowadź dowolne wartości parametrów.

7. Rozwiązywanie problemów

  1. W jaki sposób można pobrać i zainstalować program ImageFZ?
    Program ImageFZ jest dostępny do bezpłatnego pobrania z naszej strony internetowej (patrz Tabela materiałów/odczynników) i działa na komputerze z systemem Windows. Pobierz folder zip dla ImageFZ i zainstaluj oprogramowanie na swoim komputerze. Zobacz plik "readme.txt", aby uzyskać szczegółowe informacje na temat instalacji i postępuj zgodnie z instrukcjami krok po kroku.
  2. Dlaczego wyświetlany jest komunikat o błędzie "Błąd ustawienia urządzenia przechwytującego"?
    Sprawdź podłączenie kamery i instalację sterownika urządzenia USB do przechwytywania obrazu. Jeśli nie ma problemu z ustawieniami, oprogramowanie ImageFZ może nie działać z urządzeniem do przechwytywania obrazu. Zapoznaj się z plikiem "readme.txt" dotyczącym odpowiedniego urządzenia do użytku z oprogramowaniem ImageFZ.
  3. ImageFZ nie może wykryć całego ciała myszy jako cząstki.
    Ustaw wartość "threshold min" i/lub "threshold min (xor)" niższą niż bieżąca wartość. Jeśli ImageFZ nie może wykryć myszy w określonym miejscu, np. w rogu komory testowej, mogą istnieć niewystarczające warunki testowe, takie jak równomiernie oświetlona podłoga lub lekko kontrastująca różnica między myszą a tłem. Aby rozwiązać ten problem, dostosuj wartości parametrów (np. jasność i kontrast obrazu na żywo oraz wartości progowe) ImageFZ, kontroluj liczbę i położenie świateł lub użyj białego tła dla czarnej myszy.
  4. Przechwytywanie obrazu z dużą liczbą klatek na sekundę spowalnia komputer podczas analizy online.
    Ustaw liczbę klatek na sekundę na wartość niższą niż bieżąca częstotliwość i przeprowadź analizę online. Analiza ImageFZ, polegająca na akwizycji obrazu z prędkością 1 kl./s, jest wystarczająca do dokładnego pomiaru zamarzania, jak pokazano w sekcji dotyczącej reprezentatywnych wyników.
  5. Wyniki analizy ImageFZ nie zgadzają się z wynikami oceny ludzkiej.
    Sprawdź zapisany obraz i pliki wyników oceny. Jeśli ImageFZ zawyża wartość zamrożenia, ustaw "kryterium zamrażania" na wartość niższą niż bieżąca wartość i przeprowadź analizę w trybie offline. Jeśli ImageFZ nie docenia zamrożenia, ustaw "kryterium zamrażania" na wartość wyższą niż bieżąca wartość.
  6. W eksperymentach optogenetycznych i elektrofizjologicznych in vivo światłowodowy przymocowany do głowy myszy zakłóca ocenę zamarzania.
    Pokryj na biało, aby uzyskać czarną mysz i zmieniaj położenie i kąt kamery, aż nie zostaną wykryte.
  7. Co jest potrzebne do analizy offline?
    Utwórz folder o nazwie "Image_FZ" w katalogu głównym programu ImageFZ. W tym folderze utwórz podfoldery "Obrazy" i "Sesje". Przenieś 8-bitowy obraz w skali szarości do folderu "Obrazy" i utwórz plik tekstowy, w którym nazwa pliku obrazu jest zapisana w folderze "Sesje". Następnie uruchom analizę offline ImageFZ i postępuj zgodnie z instrukcjami programu.

Wyniki

W teście warunkowania lękowego eksperymentatorzy-ludzie ilościowo określali zachowanie zamarcia (freezing) poprzez pracochłonną bezpośrednią obserwację26-29, jednak ostatnio do automatycznego pomiaru zachowania zamarcia stosuje się pomiary komputerowe oparte na fotokomórkach (np. system „Freeze Monitor”) oraz systemy analizy obrazu26,30-32. ImageFZ to zautomatyzowany system analizy obrazu, który generuje wyniki porównywalne z tymi uzyskanymi poprzez obserwację ludzką, jak opisano poniżej. W niniejszym badaniu porównano wyniki obserwacji ludzkiej z wynikami analizy ImageFZ przy różnych parametrach: „Rate (frame/sec)” oraz „Freezing criterion (pixels)”. W eksperymencie wykorzystano pięć samców myszy C57BL/6J (średnia masa ciała ± SD (g), 31,4±3,55; średni rozmiar ciała ± SD (pixels), 351,6±62,2) w wieku od 15 do 27 tygodni. Obserwacja ludzka była prowadzona przy użyciu programu do rejestracji zdarzeń (oprogramowanie dla systemu Macintosh OS9); zdarzenie polegające na naciśnięciu klawisza, trwające 2 s lub dłużej w czasie, gdy mysz wykazywała brak ruchu, uznawano za „zamarcia”. Procent zamarcia obliczano co 60 s w każdym teście i wykorzystywano do analiz korelacyjnych. Procent zamarcia oceniony przez 2 obserwatorów (wiarygodność międzyobserwatorska: dla warunkowania r=0,879; dla testu kontekstowego r=0,957; dla testu z sygnałem r=0,866; dla wszystkich przypadków r=0,888) uśredniano w celu uzyskania wyniku ludzkiego. Zbadano korelacje między procentami zamarcia zmierzonymi za pomocą ImageFZ przy każdej częstotliwości klatek (tj. 1, 2 i 4 fps) a wynikami uzyskanymi poprzez obserwacje ludzkie. Jak pokazano na Rysunku 4, procenty zamarcia obliczone przez ImageFZ (1, 2 i 4 fps) były silnie skorelowane ze średnią wartością uzyskaną z pomiarów 2 obserwatorów. Co istotne, przechwytywanie obrazów przy wyższej częstotliwości klatek nie zawsze daje najlepszą korelację. Analiza obrazu przy 1 fps generowała wyniki zbliżone do tych uzyskanych od obserwatorów ludzkich w każdym teście. Zbadano korelacje między procentami zamarcia zmierzonymi poprzez obserwacje ludzkie a wynikami z ImageFZ przy każdym ustawieniu parametru „Freezing criterion (pixels)” (tj. 20, 30 i 40 pixels). Procenty zamarcia obliczone za pomocą ImageFZ przy „Freezing criterion (pixels)” wynoszących 20, 30 i 40 pixels były we wszystkich przypadkach silnie skorelowane z wynikami uzyskanymi poprzez obserwacje ludzkie (Rysunek 5). Jak pokazano na Rysunku 5D, gdy kryterium zamarcia jest ustawione na niską wartość, subtelny ruch myszy, uznany za „zamarcia” przez obserwatorów ludzkich, zostanie uznany za „brak zamarcia” przez ImageFZ. I odwrotnie, jeśli kryterium zostanie ustawione na wysoką wartość, ruch myszy, oceniony jako „brak zamarcia” przez obserwatorów ludzkich, zostanie uznany za „zamarcia” przez ImageFZ (Rysunki 5C, 5F oraz 5I). Zatem w celu uzyskania najwiarygodniejszych wyników każdy parametr programu ImageFZ powinien zostać skalibrowany przy użyciu danych uzyskanych poprzez obserwacje ludzkie w każdym środowisku testowym.

Dodatkowo porównaliśmy wyniki uzyskane przez obserwatora ludzkiego, przy użyciu komputerowego systemu pomiarowego opartego na wiązkach światła (system Freeze Monitor), z wynikami uzyskanymi za pomocą ImageFZ (patrz Rycina 6). Obserwator nie wiedział, do której grupy zabiegowej przypisane są zwierzęta, ani nie znał wyników oceny ImageFZ. W odniesieniu do ustawień parametrów systemu Freeze Monitor zastosowaliśmy trzy miary procentowego zamarcia z wcześniej zwalidowanego systemu30. W skrócie, mierzono liczbę 10-sekundowych interwałów, w których zwierzęta potrzebowały więcej niż 1 lub 2 s na przekroczenie pierwszej nowej wiązki w interwale (odpowiednio 1sec 10sec i 2sec 10sec) oraz latencję między początkiem każdego 5-sekundowego interwału a przerwaniem trzeciej nowej wiązki w tym interwale (Latency3). Obliczono procent interwałów, podczas których mysz wykazywała zamarcie, lub procent całkowitego czasu wymaganego do przerwania trzeciej wiązki światła.

Procenty zamarcia mierzone w każdym systemie przedstawiono na Rysunku 6. Grupy porównano za pomocą dwuczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) z powtarzanymi pomiarami, a następnie przeprowadzono testy t (patrz Tabela 1). Procenty zamarcia zmierzone za pomocą ImageFZ (Rysunek 6B) były bardziej zbliżone do tych ocenianych poprzez obserwację ludzką (Rysunek 6A) niż dane uzyskane przy użyciu systemu opartego na wiązkach fotokomórek (Rysunki 6C-E). Procenty zamarcia mierzone programem ImageFZ w każdym teście były silnie skorelowane z tymi ocenianymi poprzez obserwację ludzką (warunkowanie, r=0,947; test kontekstowy, r=0,970; test sygnałowy, r=0,934), podczas gdy korelacje między procentami zamarcia mierzonymi za pomocą komputerowego systemu pomiarowego opartego na wiązkach fotokomórek (1sec 10sec, 2sec 10sec lub Latency3) a obserwatorem ludzkim były niższe (warunkowanie, r=0,503, 0,593 i 0,761; test kontekstowy, r=0,772, 0,819 i 0,912) w porównaniu do korelacji między procentami zamarcia mierzonymi za pomocą ImageFZ a obserwacją ludzką (Rysunki 7A i 7B). Dodatkowo Rysunek 7 wykazuje, że różnice między procentami zamarcia uzyskanymi poprzez obserwację ludzką a za pomocą ImageFZ dla każdej myszy były najmniejszymi różnicami. Wyniki te wskazują, że procenty zamarcia mierzone za pomocą ImageFZ były zbliżone do tych uzyskanych poprzez obserwację ludzką oraz że ImageFZ charakteryzuje się wysoką dokładnością w pomiarze poziomu zamarcia.

Układy eksperymentalne badania zachowania zwierząt, przedstawiające komory, kratki, generator wstrząsów i dźwiękoszczelny pokój.
Rysunek 1. Aparatura do testu warunkowania lękowego kontekstowego i sygnałowego. (A) Akrylowa kwadratowa komora do warunkowania i testu kontekstowego, (B) metalowe kratki na białej plastikowej podłodze dla myszy czarnych, agouti lub rozjaśnionych brązowych (góra) oraz przewodzące prąd czarne metalowe kratki na czarnej plastikowej podłodze dla myszy białych (dół); powiększone obrazy kratek znajdują się w prawym panelu, (C) generator białego szumu/tonu oraz generator wstrząsów, (D) dźwiękoszczelny pokój oraz (E) akrylowa trójkątna komora z płaską podłogą do testu sygnałowego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

Schemat testu warunkowania lękowego kontekstowego i sygnałowego; prezentacja CS/US, konfiguracja eksperymentu, oś czasu.
Rysunek 2. Schematyczne przedstawienie protokołu. (A) Przegląd testu warunkowania lękowego kontekstowego i sygnałowego, (B) warunkowanie, (C) test kontekstowy oraz (D) test sygnałowy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

Proces analizy ruchu z wykorzystaniem progowania binarnego i operacji XOR dla zachowania zamierania; schemat eksperymentu.
Rysunek 3. Analiza obrazu za pomocą programu ImageFZ. Dla każdej pary następujących po sobie obrazów program ImageFZ oblicza wielkość obszaru (pikseli), przez który poruszała się mysz. Gdy obszar ten znajduje się poniżej określonego progu (np. 30 pikseli), zachowanie jest oceniane jako „zamieranie” (freezing). Gdy wielkość obszaru jest równa lub przekracza próg, zachowanie jest uznawane za „brak zamierania” (non-freezing). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

Równowaga statyczna; wykresy rozrzutu; tempo obserwacji ludzkiej vs ImageFZ; wyniki analizy korelacji.
Rysunek 4. Porównanie procentowej ilości zamarcia obliczonej z obrazów o różnych częstotliwościach klatek przy użyciu ImageFZ z wartościami zmierzonymi poprzez obserwację ludzką. Testy warunkowania lękowego przeprowadzono na samcach myszy C57BL/6J (n=5). Podczas testów dwóch obserwatorów oceniało zachowanie zamarcia. Jednocześnie rejestrowano obrazy na żywo z częstotliwością 4 fps przy użyciu programu ImageFZ. Pliki zarejestrowane przy 4 fps zostały pomniejszone po ekstrakcji klatek, aby odpowiadały obrazom zarejestrowanym przy 1 fps lub 2 fps. Wartości parametru „Rate (frame/sec)” ustawiono na 1, 2 lub 4 fps, a procentowe wartości zamarcia w każdym 60-sekundowym przedziale obliczono z plików obrazów za pomocą analizy offline w programie ImageFZ. Każda kropka reprezentuje procent zamarcia dla każdego 60-sekundowego przedziału. Obliczono współczynniki korelacji Pearsona między danymi uzyskanymi z obserwacji ludzkiej a analizą ImageFZ. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

Wykresy rozrzutu korelacji dla ImageFZ i obserwacji ludzkiej w testach warunkowania, kontekstu i z sygnałem.
Rysunek 5. Porównanie procentowych wartości zamarcia obliczonych z obrazów dla różnych wartości kryterium zamarcia przy użyciu ImageFZ oraz wartości zmierzonych podczas obserwacji ludzkiej. Testy warunkowania lękowego przeprowadzono z użyciem samców myszy C57BL/6J (n=5). Podczas testów dwóch obserwatorów rejestrowało zachowania zamarcia, a obrazy na żywo były przechwytywane za pomocą programu ImageFZ. Procent zamarcia w każdym 60-sekundowym przedziale czasowym obliczono z obrazów (1 klatka/s) poprzez analizę offline w programie ImageFZ, ustawiając wartości parametru „Freezing criterion (pixels)” na 20, 30 lub 40 pikseli. Każda kropka reprezentuje procent zamarcia dla każdego 60-sekundowego przedziału. Dla każdego testu obliczono współczynniki korelacji Pearsona pomiędzy danymi uzyskanymi z obserwacji ludzkiej a analizą ImageFZ. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

Wykresy porównujące zachowania zamierania u osobników warunkowanych i niewarunkowanych w czasie.
Rycina 6. Procenty zamierania mierzono przy użyciu systemów zautomatyzowanych oraz obserwacji ludzkiej w grupach niewarunkowanych i warunkowanych samców myszy C57BL/6J (n=5 w każdej grupie). (A) obserwacja ludzka, (B) ImageFZ, (C) system Freeze Monitor 1 (1sec 10sec), (D) system Freeze Monitor 2 (2sec 10sec) oraz (E) system Freeze Monitor 3 (Latency3). Porównania grup przeprowadzono za pomocą dwuczynnikowej analizy wariancji z powtarzanymi pomiarami (two-way repeated measures ANOVA), a następnie testów t (grupa niewarunkowana vs. grupa warunkowana, *, P<0.05; †, p<0.01). Dane uzyskane za pomocą ImageFZ były zbliżone do danych ocenianych poprzez obserwację ludzką. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

Korelacje i histogramy porównujące ImageFZ, Freeze Monitor oraz obserwacje ludzkie w analizie zamierania.
Rycina 7. Korelacja i rozkład częstości różnic między procentami zamierania zmierzonymi za pomocą systemów zautomatyzowanych oraz obserwacji ludzkiej. (A-B) Przedstawiono wykresy rozrzutu oraz współczynniki korelacji Pearsona pomiędzy procentami zamierania ocenianymi przez systemy zautomatyzowane a obserwacje ludzkie. Procenty zamierania obliczone przy użyciu ImageFZ były silnie skorelowane z tymi uzyskanymi w drodze obserwacji ludzkiej. (C-F) Występowanie różnic mniejszych niż 10% między procentami zamierania uzyskanymi z systemów zautomatyzowanych a obserwacjami ludzkimi było najwyższe w przypadku porównania danych analizowanych za pomocą ImageFZ z danymi analizowanymi przez obserwatora. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

Analizy ANOVA
WarunekCzasWarunek x Czas
Dzień 1 (kondycjonowanie)
CzłowiekF(1,8)=28,53, p=0,0007F(7,56)=20,79, p<0.0001F(7,56)=16,58, p<0.0001
ImageFZF(1,8)=13,97, p=0,0057F(7,56)=21,40, p<0.0001F(7,56)=11,69, p<0.0001
Monitor zamrażania (1 s 10 s)F(1,8)=5,16, p=0,0528F(7,56)=2,39, p=0,0329F(7,56)=0,72, p=0,6572
Monitor zamrażania (2 sek 10 sek)F(1,8)=4,07, p=0,0782F(7,56)=3,44, p=0,0039F(7,56)=1,52, p=0,1803
Monitor zamrażania (Latency3)F(1,8)=4,44, p=0,0682F(7,56)=9,94, p<0.0001F(7,56)=4,33, p=0,0007
Dzień 2 (kontekst)
CzłowiekF(1,8)=42,94, p=0,0002F(4,32)=1,91, p=0,1336F(4,32)=1,48, p=0,2302
ImageFZF(1,8)=49,61, p=0,0001F(4,32)=2,06, p=0,1087F(4,32)=0,83, p=0,5174
Monitor zamrażania (1 s–10 s)F(1,8)=20,28, p=0,002F(4,32)=1,63, p=0,1918F(4,32)=0,55, p=0,6997
Monitor zamrażania (2 s – 10 s)F(1,8)=40,20, p=0,0002F(4,32)=2,66, p=0,0504F(4,32)=1,20, p=0,3306
Monitor zamrażania (Latency3)F(1,8)=35,30, p=0,0003F(4,32)=2,49, p=0,0626F(4,32)=1,09, p=0,3793

Tabela 1. Porównania statystyczne.

Dyskusja

Kontekstowy i sygnalizowany test warunkowania strachu jest jednym z najczęściej stosowanych paradygmatów do oceny uczenia się i pamięci. Ten test jest formą warunkowania Pawłowa, w którym dokonuje się skojarzenia między kontekstem i/lub bodźcem warunkowym (wskazówka słuchowa) a bodźcem awersyjnym (elektryczny wstrząs stopą). Po nawet pojedynczym sparowaniu sygnału kontekstowego/słuchowego i wstrząsu stopą, myszy wykazują długotrwałe zamrożenie w obliczu kontekstu lub wskazówki. W tym teście zachowanie zamrożenia jest używane jako wskaźnik pamięci strachu. Badania farmakologiczne i badania nad zmianami chorobowymi wykazały, że tworzenie, konsolidacja i odzyskiwanie pamięci są regulowane przez kilka regionów mózgu, takich jak ciało migdałowate, hipokamp i kora przedczołowa3,33-35. Ponadto badania genetyki molekularnej wykazały rolę określonych genów i cząsteczek zaangażowanych w uczenie się i pamięć w tych regionach mózgu przy użyciu genetycznie zmodyfikowanych myszy36. Dlatego ten test jest prosty i przydatny do badania neurobiologicznych podstaw uczenia się i pamięci strachu. W tym artykule filmowym przedstawiliśmy nasz protokół, aby zapewnić eksperymentatorom szczegółowe informacje umożliwiające zrozumienie i łatwe wykonanie testu.

Zachowanie związane z zamrożeniem określono ilościowo poprzez bezpośrednią obserwację przez eksperymentatorów na ludziach. Oczekuje się, że dobrze wyszkolony eksperymentator uzyska wiarygodne, stabilne wyniki we wszystkich obserwacjach. Jednak metoda ta wiąże się z potencjalnymi problemami, takimi jak różnice w metodzie obserwacyjnej, stronniczość obserwatora i proste błędy w kwantyfikacji, co utrudnia bezpośrednie porównanie wyników od niezależnych eksperymentatorów i różnych laboratoriów. Zastosowano również zautomatyzowany komputerowy system pomiarowy oparty na promieniach słonecznych26,30-32. Jednak system ten stwarza również potencjalne problemy w pomiarze zachowań związanych z zamarzaniem. Ze względu na rozmieszczenie czujników, system ten może nie być w stanie wykryć niewielkich ruchów głowy, które zwykle byłyby oceniane jako "aktywne" przez obserwację człowieka. Ponadto drżenie podczas zamrażania można uznać za niezamarzające, ponieważ gdy zwierzę zamarza, w wyniku drżenia obserwuje się przerywane przerwy w wiązce światła. Jako alternatywną metodę opracowano zautomatyzowane systemy analizy obrazów i wideo17-20,37,38. Anagnostaras i wsp.37 opisało kilka systemów z programami do analizy obrazu, które mają dobrą trafność i dobrze zamrażają wyniki17,20,37-38. Jednak większość tych systemów i programów analitycznych musi być pozyskiwana od dostawców komercyjnych i jest zazwyczaj kosztowna. Opracowaliśmy oprogramowanie ImageFZ do analizy zachowań związanych z zamarzaniem, a program ten jest rozpowszechniany jako darmowy program. ImageFZ wykrywa mysz jako ciało pikseli (cząsteczkę) i rozróżnia subtelne ruchy myszy jako "zamrożenie" lub "niezamrożenie" w zależności od ilości obszaru nienakładających się obszarów między cząstkami każdej pary kolejnych obrazów. Jak pokazują reprezentatywne wyniki, pomiary za pomocą programu ImageFZ są zgodne lub dokładniejsze niż uzyskane przy użyciu innych metod. W ten sposób program ImageFZ automatycznie mierzy zachowanie, które ludzcy obserwatorzy oceniają jako zamrożenie, przy użyciu zdefiniowanych kryteriów. Ponadto program ImageFZ oblicza przebytą odległość (cm) przed, w trakcie i po ekspozycji na wstrząsy stóp, ułatwiając ocenę wrażliwości na wstrząsy i analizę zachowania podczas zamarzania.

Między laboratoriami istnieją różnice metodologiczne. Różnice te mogą powodować trudności w porównywaniu danych między laboratoriami i powielaniu wyników w różnych laboratoriach. Aby uzyskać bardziej stabilne i porównywalne dane, konieczna jest standaryzacja protokołu testowego w jak największym stopniu. System analizy z ImageFZ prowadzi do automatyzacji procedur testowych, co może przyczynić się do standaryzacji protokołów stosowanych w laboratoriach.

Podczas analizy zachowań związanych z zamrożeniem należy wziąć pod uwagę kilka reakcji behawioralnych. Po pierwsze, gdy zwierzęta znajdują się w przerażającej sytuacji, mogą uciec zamiast zamarznąć39. Ucieczka jest jedną z reakcji strachu, a jej wystąpienie doprowadzi do niedoszacowania pamięci strachu. Po drugie, zamrażanie może zależeć od ogólnego poziomu aktywności, a poziom aktywności u myszy eksperymentalnych i kontrolnych musi zostać zbadany. Na przykład, chociaż myszy pozbawione receptora muskarynowego acetylocholiny M1 wykazywały obniżony poziom zamrażania w porównaniu z myszami typu dzikiego, różne testy behawioralne wykazały, że wyniki można przypisać ich fenotypowi nadpobudliwości, a nie upośledzeniupamięci. ImageFZ oblicza odległość (cm) przebytą przez obiekty. Dane są dostępne w celu zbadania, czy istnieją różnice w ogólnych poziomach aktywności między uczestnikami. Jeśli istnieje różnica w przebytym dystansie w grupie, jednym z możliwych podejść do problemu jest rozważenie dystansu przebytego w ciągu pierwszych 2 minut treningu jako aktywności wyjściowej i zastosowanie współczynnika tłumienia (współczynnik tłumienia = (aktywność podczas testowania)/(aktywność podczas linii bazowej + aktywność podczas testowania)) jako drugorzędny wskaźnik strachu17,40. Wreszcie, różnica we wrażliwości na ból, wywołująca zmiany w reaktywności na elektryczny wstrząs stopy, jeśli występuje, może skutkować zmianami w zachowaniu podczas zamarzania. ImageFZ oblicza również szczegółowo przebytą odległość (cm) od 2 sekund przed ekspozycją na wstrząs stopy o długości 2 sekund do 2 sekund po jego ekspozycji (przez 6 sekund), co można wykorzystać jako wskaźnik wrażliwości na wstrząsy.

Systemy analizy wideo zostały opracowane w celu pomiaru zamarzania myszy albinosów, czarnych, agouti i rozcieńczonych brązowych. ImageFZ wykorzystuje czarną tacę podłogową i czarne siatki do badania białych myszy (patrz rysunek 1B). Czarne siatki są wykonane ze specjalnie przetworzonych metali pokrytych czarną farbą i mają przewodność elektryczną podobną do niepowlekanych siatek metalowych, które są zwykle używane do czarnych myszy. ImageFZ analizuje również zachowanie zamarzania u szczurów i innych gryzoni poprzez dostosowanie parametrów programu. W obecnej wersji ImageFZ zachowanie obiektu jest rejestrowane za pomocą kamery wideo umieszczonej na górnej ścianie w celu analizy zamrożenia. ImageFZ może być również używany w konfiguracji, w której obrazy są rejestrowane z boku komory. Ponadto ImageFZ steruje maksymalnie 4 aparatami. Ta funkcja pozwala badaczowi na jednoczesne badanie 4 myszy, oszczędzając czas i zmniejszając potencjalne wpływy wynikające z różnic w czasie wykonania każdego obiektu i kolejności testowania zachowania. W ten sposób ImageFZ upraszcza procedurę testowania i analizy zachowań związanych z zamrażaniem, a program ten ułatwia testowanie przy mniejszym nakładzie pracy i bez żadnego szkolenia w zakresie eksperymentów behawioralnych.

W laboratorium Miyakawa oceniliśmy ponad 110 szczepów genetycznie modyfikowanych myszy i myszy kontrolnych typu dzikiego w kontekście, w teście warunkowania strachu kontekstowego i sygnalizacyjnego, wykorzystując system analizy wideo w celu wyjaśnienia wpływu danego genu na uczenie się i pamięć41-42. Uzyskaliśmy duży zestaw surowych danych dla ponad 5000 myszy. Surowe dane, które zostały wykorzystane w opublikowanych artykułach naukowych4-16 , są zawarte w "Bazie danych fenotypów myszy" jako publiczna baza danych (URL: http://www.mouse-phenotype.org/). Niniejszy artykuł filmowy zawiera szczegółowe informacje dotyczące szczegółów naszej procedury eksperymentalnej i pomaga w zrozumieniu sytuacji testowej.

Oświadczenia

Potwierdzamy, że nie ma żadnych znanych konfliktów interesów związanych z tą publikacją i nie było znaczącego wsparcia finansowego dla tej pracy, które mogłoby wpłynąć na jej wynik.

Podziękowania

Niektóre z pokazanych tutaj danych zostały uzyskane w laboratorium dr Jacqueline N. Crawley w Narodowym Instytucie Zdrowia Psychicznego Stanów Zjednoczonych i chcielibyśmy jej podziękować za umożliwienie nam pokazania danych w artykule. Dziękujemy również Kazuo Nakanishi za pomoc w opracowaniu programu ImageFZ do analizy behawioralnej. Badania te były wspierane przez Grant-in-Aid for Scientific Research (B) (21300121), Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Comprehensive Brain Science Network) z Ministerstwa Edukacji, Nauki, Sportu i Kultury Japonii, grant z Neuroinformatics Japan Center (NIJC) oraz granty z CREST Japońskiej Agencji Nauki i Technologii (JST).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Program ImageFZOpracowany przez Tsuyoshi MiyakawaTen program jest dostępny za pośrednictwem O'Hara & Co., Tokio, Japonia i do bezpłatnego pobrania pod adresem http://www.mouse-phenotype.org/. To oprogramowanie działa w 32-bitowym systemie Windows XP/Vista/7. 
Komora kondycjonowaniaO' Hara & Co., JaponiaCL-3002LDo myszy.
Komora testowaO' Hara & Co., JaponiaCLT-3002LDo myszy.
InterfejsO' Hara & Co., JaponiaCL-1040Interfejs zawiera generator białego szumu/tonów, który może być sterowany przez program ImageFZ.
Mieszany generator wstrząsówO' Hara & Co., JaponiaSGA-2040Generator wstrząsów może być sterowany przez program ImageFZ.
Tester siatki wstrząsowej (amperomierz)O' Hara & Co., JaponiaSG-T
Urządzenie do przechwytywania wideo USBXLR8USB2IVOSX
Poczwórny rozdzielacz obrazuBezprzewodowy Tsukamoto Co., Ltd., Japonia400AS
Dźwiękoszczelny pokójO' Hara & Co., JaponiaCL-4210
Monitor zamarzaniaSan Diego Instruments, Inc., CA, USAMatryca fotoskopowa 16 x 16  ( rozstaw 2,5 cm)

Bibliografia

  1. Crawley, J. N. What's wrong with my mouse: behavioral phenotyping of transgenic and knockout mice. , John Wiley & Sons. New York. (2007).
  2. Fanselow, M. S., Poulos, A. M. The neuroscience of mammalian associative learning. Annu. Rev. Psychol. 56, 207-234 (2005).
  3. LeDoux, J. E. Emotion circuits in the brain. Annu. Rev. Neurosci. 23, 155-184 (2000).
  4. Nakajima, R., et al. Comprehensive behavioral phenotyping of calpastatin-knockout mice. Mol. Brain. 1, 7 (2008).
  5. Ikeda, M., et al. Identification of YWHAE, a gene encoding 14-3-3epsilon, as a possible susceptibility gene for schizophrenia. Hum. Mol. Genet. 17, 3212-3222 (2008).
  6. Sakae, N., et al. Mice lacking the schizophrenia-associated protein FEZ1 manifest hyperactivity and enhanced responsiveness to psychostimulants. Hum. Mol. Genet. 17, 3191-3203 (2008).
  7. Fukuda, E., et al. Down-regulation of protocadherin-alpha A isoforms in mice changes contextual fear conditioning and spatial working memory. Eur. J. Neurosci. 28, 1362-1376 (2008).
  8. Imayoshi, I., et al. Roles of continuous neurogenesis in the structural and functional integrity of the adult forebrain. Nat. Neurosci. 11, 1153-1161 (2008).
  9. Nakatani, J., et al. Abnormal behavior in a chromosome-engineered mouse model for human 15q11-13 duplication seen in autism. Cell. 137, 1235-1246 (2009).
  10. Takao, K., et al. Comprehensive behavioral analysis of calcium/calmodulin-dependent protein kinase IV Knockout mice. PLoS ONE. 5, (2010).
  11. Tamada, K., et al. Decreased exploratory activity in a mouse model of 15q duplication syndrome; implications for disturbance of serotonin signaling. PLoS ONE. 5, (2010).
  12. Watanabe, Y., et al. Relaxin-3-deficient mice showed slight alteration in anxiety-related behavior. Front. Behav. Neurosci. 5, 50 (2011).
  13. Takeuchi, H., et al. P301S mutant human tau transgenic mice manifest early symptoms of human tauopathies with dementia and altered sensorimotor gating. PLoS ONE. 6, (2011).
  14. Koshimizu, H., et al. Adenomatous polyposis coli heterozygous knockout mice display hypoactivity and age-dependent working memory deficits. Front. Behav. Neurosci. 5, 85 (2011).
  15. Yao, I., Takao, K., Miyakawa, T., Ito, S., Setou, M. Synaptic E3 ligase SCRAPPER in contextual fear conditioning: extensive behavioral phenotyping of Scrapper heterozygote and overexpressing mutant mice. PLoS ONE. 6, (2011).
  16. Shoji, H., et al. Comprehensive behavioral analysis of ENU-induced Disc1-Q31L and -L100P mutant mice. BMC Res. Notes. 5, 108 (2012).
  17. Anagnostaras, S. G., Josselyn, S. A., Frankland, P. W., Silva, A. J. Computer-assisted behavioral assessment of Pavlovian fear conditioning in mice. Learn. Mem. 7, 58-72 (2000).
  18. Miyakawa, T., Yamada, M., Duttaroy, A., Wess, J. Hyperactivity and intact hippocampus-dependent learning in mice lacking the M1 muscarinic acetylcholine receptor. J. Neurosci. 21, 5239-5250 (2001).
  19. Marchand, A. R., Luck, D., DiScala, G. Evaluation of an improved automated analysis of freezing behaviour in rats and its use in trace fear conditioning. J. Neurosci. Methods. 126, 145-153 (2003).
  20. Kopec, C. D., et al. A robust automated method to analyze rodent motion during fear conditioning. Neuropharmacology. 52, 228-233 (2007).
  21. Wehner, J. M., et al. Quantitative trait locus analysis of contextual fear conditioning in mice. Nat. Genet. 17, 331-334 (1997).
  22. Quirk, G. J., Armony, J. L., LeDoux, J. E. Fear conditioning enhances different temporal components of tone-evoked spike trains in auditory cortex and lateral amygdala. Neuron. 19, 613-624 (1997).
  23. Chaudhury, D., Christopher, S. C. Circadian modulation of learning and memory in fear-conditioned mice. Behav. Brain Res. 133, 95-108 (2002).
  24. Valentinuzzi, V. S., et al. Effect of circadian phase on context and cued fear conditioning in C57BL/6J mice. Learn. Behav. 29, 133-142 (2001).
  25. Frankland, P. W., Bontempi, B. The organization of recent and remote memories. Nat. Rev. Neurosci. 6, 119-130 (2005).
  26. Contarino, A., Baca, L., Kennelly, A., Gold, L. H. Automated assessment of conditioning parameters for context and cued fear in mice. Learn. Mem. 9, 89-96 (2002).
  27. Kinney, J. W., et al. Deficits in trace cued fear conditioning in galanin-treated rats and galanin-overexpressing transgenic mice. Learn. Mem. 9, 178-190 (2002).
  28. Hefner, K., Holmes, A. Ontogeny of fear-, anxiety- and depression-related behavior across adolescence in C57BL/6J mice. Behav. Brain Res. 176, 210-215 (2007).
  29. Wellman, C. L., et al. Impaired stress-coping and fear extinction and abnormal corticolimbic morphology in serotonin transporter knock-out mice. J. Neurosci. 27, 684-691 (2007).
  30. Valentinuzzi, V. S., et al. Automated measurement of mouse freezing behavior and its use for quantitative trait locus analysis of contextual fear conditioning in (BALB/cJ × C57BL/6J)F2 mice. Learn. Mem. 5, 391-403 (1998).
  31. Valentinuzzi, V. S., et al. Effect of circadian phase on context and cued fear conditioning in C57BL/6J mice. Learn. Behav. 29, 133-142 (2001).
  32. Bothe, G. W. M., Bolivar, V. J., Vedder, M. J., Geistfeld, J. G. Genetic and behavioral differences among five inbred mouse strains commonly used in the production of transgenic and knockout mice. Genes Brain Behav. 3, 149-157 (2004).
  33. Chen, C., Kim, J. J., Thompson, R. F., Tonegawa, S. Hippocampal lesions impair contextual fear conditioning in two strains of mice. Behav. Neurosci. 110, 1177-1180 (1996).
  34. Anagnostaras, S. G., Gale, G. D., Fanselow, M. S. Hippocampus and contextual fear conditioning: Recent controversies and advances. Hippocampus. 11, 8-17 (2001).
  35. Akirav, I., Maroun, M. The role of the medial prefrontal cortex-amygdala circuit in stress effects on the extinction of fear. Neural Plast. , 1-11 (2007).
  36. Johansen, J. P., Cain, C. K., Ostroff, L. E., LeDoux, J. E. Molecular mechanisms of fear learning and memory. Cell. 147, 509-524 (2011).
  37. Anagnostaras, S. G., et al. Automated assessment of pavlovian conditioned freezing and shock reactivity in mice using the video freeze system. Front. Behav. Neurosci. 4, (2010).
  38. Pham, J., Cabrera, S. M., Sanchis-Segura, C., Wood, M. A. Automated scoring of fear-related behavior using EthoVision software. J. Neurosci. Methods. 178, 323-326 (2009).
  39. Blanchard, D. C., Blanchard, R. J. Crouching as an index of fear. J. Comp. Physiol. Psychol. 67, 370-375 (1969).
  40. Frankland, P. W., Bontempi, B., Talton, L. E., Kaczmarek, L., Silva, A. J. The involvement of the anterior cingulate cortex in remote contextual fear memory. Science. 304, 881-883 (2004).
  41. Takao, K., Miyakawa, T. Investigating gene-to-behavior pathways in psychiatric disorders: the use of a comprehensive behavioral test battery on genetically engineered mice. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1086, 144-159 (2006).
  42. Takao, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. Impact of brain-behavior phenotypying of genetically-engineered mice on research of neuropsychiatric disorders. Neurosci. Res. 58, 124-132 (2007).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Kontekstowe warunkowanie l kiemanaliza zachowania zamieraniaoprogramowanie ImageFZprezentacja sygna u s uchowegowstrz s elektryczny stopytest behawioralny myszyzautomatyzowana analiza zachowaniaustawienia progowe

Powiązane artykuły