Kontekstowy i sygnalizowany test warunkowania strachu przy użyciu systemu analizy wideo u myszy

Summary

Ten artykuł przedstawia protokół dla kontekstowego i podpowiedzianego testu warunkowania strachu przy użyciu systemu analizy wideo do oceny uczenia się strachu i pamięci u myszy.

Abstract

Test warunkowania strachu kontekstowego i podpowiedzianego jest jednym z testów behawioralnych, które oceniają zdolność myszy do uczenia się i zapamiętywania związku między sygnałami środowiskowymi a doświadczeniami awersyjnymi. W tym teście myszy umieszcza się w komorze kondycjonującej i podaje się im porcje bodźca warunkowego (sygnał słuchowy) i awersyjnego bodźca bezwarunkowego (elektryczny wstrząs stopą). Po pewnym czasie opóźnienia myszy są poddawane działaniu tej samej komory kondycjonującej i komory o innym kształcie z prezentacją sygnału słuchowego. Zachowanie podczas testu jest mierzone jako wskaźnik pamięci strachu. Aby automatycznie analizować zachowanie, opracowaliśmy system analizy wideo za pomocą aplikacji ImageFZ, która jest dostępna do bezpłatnego pobrania na stronie http://www.mouse-phenotype.org/. Tutaj, aby pokazać szczegóły naszego protokołu, demonstrujemy naszą procedurę dla kontekstowego i sygnalizowanego testu warunkowania strachu na myszach C57BL/6J przy użyciu systemu ImageFZ. Ponadto zweryfikowaliśmy działanie naszego protokołu i systemu analizy wideo, porównując czas zamrażania zmierzony przez system ImageFZ lub komputerowy system pomiarowy oparty na promieniach słonecznych z czasem ocenionym przez ludzkiego obserwatora. Jak pokazują nasze reprezentatywne wyniki, dane uzyskane przez ImageFZ były podobne do tych analizowanych przez ludzkiego obserwatora, co wskazuje, że analiza behawioralna przy użyciu systemu ImageFZ jest wysoce wiarygodna. Niniejszy artykuł filmowy zawiera szczegółowe informacje dotyczące procedur testowych i pomoże w zrozumieniu sytuacji eksperymentalnej.

Introduction

Kontekstowy i sygnalizowany test warunkowania strachu jest paradygmatem behawioralnym używanym do oceny asocjacyjnego uczenia się strachu i pamięci u gryzoni^1-3. Test ten jest szeroko stosowany do zrozumienia neurobiologicznych mechanizmów uczenia się strachu i pamięci u myszy transgenicznych i nokautujących^1,4-16. Zachowanie zamrożenia, które definiuje się jako całkowity bezruch z wyjątkiem oddychania, jest powszechną reakcją na sytuacje lękowe. W tym paradygmacie behawioralnym, po tym, jak zwierzęta są wystawione na połączenie sygnału słuchowego z elektrycznym wstrząsem stopy, reagują na bodziec wywołujący strach, wykazując zachowanie zamrożenia, które jest mierzone jako wskaźnik asocjacyjnego uczenia się strachu i pamięci. Ten test wymaga mniej wyszukanego sprzętu, mniejszego wysiłku fizycznego badacza i znacznie mniej czasu na trening myszy niż inne zadania związane z uczeniem się i pamięcią; Zwykle wymaga około 5-10 minut dziennie na mysz przez 2 dni. Chociaż procedura testowa jest prosta i zajmuje niewiele czasu, badacz musi uważnie obserwować i mierzyć zachowanie myszy; W związku z tym opracowano kilka zautomatyzowanych systemów pomiarowych do przeprowadzania analizy behawioralnej^17-20. Nasz system analizy wideo, który opracowaliśmy za pomocą oprogramowania ImageFZ, pozwala nam łatwo analizować zamarzanie i uzyskiwać wysoce wiarygodne wyniki. Ten artykuł zawiera szczegółowe informacje na temat naszej procedury testowania i opisuje, jak korzystać z oprogramowania ImageFZ.

Protocol

Wszystkie eksperymenty powinny być przeprowadzane zgodnie z wytycznymi i protokołami ustalonymi przez lokalne Komitety ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania.

1. Ustawienie aparatury

1. Aparaturą do badania kondycjonowania i kontekstu jest kwadratowa komora z elektryzowaną podłogą siatkową, źródłem dźwięku i skalibrowanym generatorem wstrząsów. Stosowane są różne rozmiary komór, o wymiarach od 54 cm x 27 cm x 30 cm ²¹ do 25 cm x 35 cm x 30 cm ²². W tym protokole aparat składa się z akrylowej kwadratowej komory (33 cm x 25 cm x 28 cm; przezroczysta na przedniej i tylnej ścianie; biała na ścianach bocznych) z metalowymi kratkami (o średnicy 0,2 cm, oddalona od siebie o 0,5 cm) pokrytą przezroczystą akrylową pokrywą (ryc. 1A). Konieczne jest umieszczenie komory na białej akrylowej podłodze (Rysunek 1B) w celu przeanalizowania zachowania czarnych, agouti lub rozcieńczonych brązowych myszy, ponieważ system analizy obrazu za pomocą oprogramowania ImageFZ (dostępnego do bezpłatnego pobrania, patrz Tabela materiałów/odczynników) odróżnia ciemny obiekt od białego tła na każdym przechwyconym obrazie wideo. Myszy albinosy można również testować za pomocą czarnych metalowych siatek i czarnej akrylowej podłogi (ryc. 1B). Lampy z diodami elektroluminescencyjnymi (LED) są przymocowane do sufitu nad urządzeniem. Podłoga z siatki jest oświetlona światłem LED o natężeniu 100 luksów. Głośnik podłączony do generatora białego szumu/tonu (rysunek 1C) jest zamontowany na suficie 5 cm nad pokrywą, aby przedstawić wskazówkę dźwiękową (biały szum, 55 dB) jako bodziec warunkowany (CS). Siatki są podłączone do generatora wstrząsów (rysunek 1C) w celu dostarczenia elektrycznego wstrząsu stopowego jako bodźca bezwarunkowego (US). Komora testowa jest umieszczona w dźwiękoszczelnym pomieszczeniu (170 cm x 210 cm x 200 cm) (rysunek 1D) w celu zminimalizowania hałasu zewnętrznego podczas testów. Ten warunek uniemożliwia również myszom, które nie są obecnie poddawane testowi, usłyszenie sygnału słuchowego lub wokalizacji myszy testowych.
2. Aparatura do testu z sygnałem składa się z komory, która ma inne właściwości niż komora kondycjonująca, co zapewnia nowy kontekst. Konieczna jest zmiana sygnałów sensorycznych tak bardzo, jak to możliwe, tak aby mysz postrzegała nowy kontekst jako niezwiązany z komorą kondycyjną. Ogólnie rzecz biorąc, stosuje się pudełko o innym kształcie lub trójkątną komorę. Ponadto mysz ma również zapewnione różne sygnały świetlne i/lub węchowe. W tym protokole aparat jest akrylową trójkątną komorą (33 cm x 29 cm x 32 cm; biała na każdej bocznej ścianie) z płaską, białą podłogą dla czarnych, agouti lub rozcieńczonych brązowych myszy lub płaską, czarną podłogą dla myszy albinosów, pokrytą przezroczystą akrylową pokrywą (ryc. 1E). Światła LED są przymocowane do sufitu nad aparatem. Poziom oświetlenia podłogi jest ustawiony na 30 luksów. Głośnik jest zamontowany na suficie 5 cm nad pokrywą, aby zapewnić sygnał dźwiękowy, który jest taki sam, jak ten, który jest dostarczany myszom w czasie kondycjonowania. Komora trójkątna znajduje się w innym pomieszczeniu dźwiękoszczelnym niż pomieszczenie, w którym wykonywane są testy kondycjonowania i kontekstu.
3. Każda komora jest wyposażona w zamontowaną na suficie kamerę CCD (Charge Coupled Device) łączącą się z komputerem z systemem Windows za pomocą poczwórnego rozdzielacza wideo i urządzenia USB do przechwytywania obrazu w celu monitorowania zachowania myszy, a obrazy urządzenia i myszy są przechwytywane i analizowane przez program użytkowy ImageFZ (patrz Protokół 6). Generatory białego szumu i wstrząsów nożnych są automatycznie sterowane przez oprogramowanie ImageFZ; Czas rozpoczęcia i czas trwania białego szumu i wstrząsów nożnych musi być zapisany w pliku tekstowym (zobacz przykładowy plik tekstowy "simple-cond" pokazany na filmie, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat tego, jak parametry są zapisywane w pliku), który jest wczytywany do aplikacji.
4. Przed rozpoczęciem każdego testu akrylowe ściany i podłogi są wycierane ręcznikiem nasączonym bardzo podchlorawym wodą (pH 6-7), a siatki są czyszczone 70% etanolem, aby zapobiec odchyleniu opartemu na sygnałach węchowych. Kratki są przecierane etanolem zamiast super podchloraną wodą, aby zapewnić, że kratki nie zmniejszają swojej przewodności elektrycznej z powodu rdzy.

2. Przygotowanie zwierząt

1. Ogólnie rzecz biorąc, od dwóch do czterech myszy w klatce trzyma się w pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze (23±2 °C) z 12-godzinnym cyklem światła/ciemności (np. światła włączają się o 7:00 rano).
2. W tym protokole, w celu zmniejszenia możliwego wpływu transportu w klatkach na zachowanie i przystosowania myszy do środowiska eksperymentalnego, klatki zawierające myszy są przenoszone z pomieszczenia do przetrzymywania zwierząt do dźwiękoszczelnej poczekalni przylegającej do dźwiękoszczelnego pomieszczenia testowego co najmniej 30 minut przed rozpoczęciem każdego testu.
3. Wszystkie eksperymenty (Rysunek 2A) powinny być wykonywane w tym samym okresie czasu w fazie jasnej lub ciemnej każdego dnia, aby zminimalizować różnice behawioralne wynikające z testowania w różnych momentach^23,24. W tym protokole wszystkie eksperymenty są przeprowadzane między 1 godziną po nadejściu fazy światła a 1 godziną przed nadejściem fazy ciemnej (od 8:00 do 18:00 w fazie światła). Jeśli dostępne jest tylko jedno urządzenie, myszy z każdego genotypu powinny być testowane w przeciwnej kolejności, aby zmniejszyć potencjalny wpływ czasu eksperymentu i kolejności testowania badanych na wyniki behawioralne. ImageFZ może sterować maksymalnie 4 aparatami. Testowanie 4 myszy jednocześnie przy użyciu 4 aparatów w przeciwwadze pozwala badaczowi zaoszczędzić czas i zmniejsza możliwy wpływ parametrów eksperymentalnych na zachowanie myszy.

3. Kondycjonowanie

1. Myszy umieszcza się w komorze kondycjonującej, a myszy zazwyczaj mogą swobodnie eksplorować komorę przez 120 sekund. Następnie sygnał słuchowy, taki jak biały szum, ton i klik dźwiękowy, jest prezentowany jako CS przez 30 sekund, a wstrząs stopowy o natężeniu 0,1-0,8 mA jest podawany myszom jako US w ciągu ostatnich 2 sekund dźwięku. Prezentacja parowania CS-US jest powtarzana w celu wzmocnienia stowarzyszenia. Myszy pozostawia się w komorze na pewien czas po ostatniej prezentacji, aby jeszcze bardziej ustalić związek między kontekstem komory a doświadczeniem awersyjnym. W tym protokole, po 120 sekundach swobodnej eksploracji, przez 30 sekund prezentowana jest wskazówka dźwiękowa (biały szum, 55 dB), a wstrząs nożny o natężeniu 0,3 mA jest dostarczany w sposób ciągły przez ostatnie 2 sekundy białego szumu. Po 90 sekundach para sygnału słuchowego z wstrząsem stopy jest ponownie podawana badanym. Prezentacja CS-US jest powtarzana trzy razy na sesję (120, 240 i 360 sekund po rozpoczęciu kondycjonowania) (Rysunek 2B). Po ostatnim wstrząsie stopy myszy pozostawia się w komorach w spokoju przez 90 sekund.
2. Przed rozpoczęciem sesji kondycjonowania uruchom aplikację ImageFZ, wybierz menu wtyczek "Kondycjonowanie FZ i FZ Online (4 komory)" i ustaw wartości parametrów krok po kroku w następujący sposób.
   1. Krok 1: Identyfikator projektu. Określ folder, w którym chcesz przechowywać pliki danych.
   2. Krok 2: Nazwa sesji. Wpisz dowolne słowa, np. datę eksperymentu, w polu "Sesja" i wybierz referencyjny plik tekstowy, w którym zapisana jest godzina rozpoczęcia i czas trwania białego szumu i wstrząsu stopy, w polu "Odniesienie". Przykładowy plik tekstowy jest pokazany w filmie.
   3. Krok 3: Ustawienia parametrów. Wprowadź wartości parametrów w każdym polu w następujący sposób.
      1. Szybkość (klatka/s): szybkość akwizycji obrazu, np. 1 klatka/s.
      2. Czas trwania (s): w przypadku kondycjonowania całkowity czas trwania wynosi 480 sek.
      3. Czas trwania kosza (s): np. 60 sek.; dane są analizowane w każdym bloku 60 sek.
      4. Rozmiar obiektu - min (piksele): ImageFZ wykrywa mysz i szum jako czarne cząsteczki (pewną masę pikseli) na białym tle na każdym obrazie. Gdy powierzchnia czarnej cząstki (pikseli) jest mniejsza niż wartość "Rozmiar obiektu – min (piksele)" (np. 100 pikseli), cząstki są traktowane jako szum i są wyłączane z analizy obrazu.
      5. Rozmiar obiektu - maksimum (piksele): gdy rozmiary czarnych cząstek są większe niż rozmiar wartości "Rozmiar obiektu – maksimum (piksele)", cząstki są wykluczane z analizy.
      6. Wymiary ramy - szerokość/wysokość (cm): wymiar komory, tj. 33 cm szerokości i 25 cm wysokości.
      7. Kryterium zamrażania (piksele): np. 30 pikseli, szczegóły znajdują się w Protokole 6.
      8. Czas zamrożenia - min (s): np. 2 sekundy; jeśli żaden ruch myszy nie zostanie wykryty tylko przez mniej niż 2 sekundy, jego zachowanie nie jest liczone jako "zamrożenie".
      9. Częstotliwość wstrząsów (klatka/s): patrz szczegóły w Protokole 6.
   4. Krok 4: Identyfikator podmiotu. Wprowadź dane identyfikacyjne podmiotu.
   5. Krok 5: Ustawienia aparatu. Kontroluj jasność i kontrast przechwyconego obrazu.
   6. Krok 6: Ustawienia progowe. Dostosuj wartości progowe, aby wykrywać czarną mysz jako czarne piksele na białym tle na każdym obrazie i oceniać zachowanie myszy jako "zamrożenie" lub "niezamrożenie" (patrz szczegóły w Protokole 6). Aby przeanalizować mysz albinosa, kliknij pole wyboru "tryb odwrócenia" i odpowiednio dostosuj wartości progowe.
   7. Krok 7: Ustaw pole klatki. Określ pole każdej komory, którą chcesz przechwycić. Po kliknięciu przycisku prostokąta w przyborniku, narysuj prostokąt wokół podłogi komory w oknie obrazu na żywo. Następnie wybierz numer komory i kliknij przycisk "Ustaw". Na koniec kliknij przycisk "Zakończ".
3. Po ustawieniu ustawień parametrów należy przeprowadzić test przygotowawczy na myszach treningowych (myszy nie używane jako testery) przed pierwszym testem dnia, aby określić, czy system analizy obrazu i generatory białego szumu/wstrząsów działają bez problemów.
4. Przenieś domową klatkę zawierającą myszy ćwiczebne do dźwiękoszczelnego pomieszczenia testowego z sąsiedniej poczekalni i umieść każdą mysz w komorze kondycjonalnej. Natychmiast po umieszczeniu myszy w komorze kliknij przycisk start ImageFZ. Oprogramowanie aplikacyjne będzie prezentować myszom sygnały dźwiękowe i/lub elektryczne wstrząsy stóp w kolejności określonej w pliku referencyjnym.
5. Po upływie 480 sekund zwróć myszy do ich klatki domowej i odłóż klatkę na półkę w pomieszczeniu do trzymania.
6. Dokładnie wyczyść komory. Następnie kliknij przycisk "Następna analiza" i powtórz kroki 3.2.4-3.6 dla myszy testowych.
7. ImageFZ przechowuje obrazy na żywo i obrazy trasowania w formacie TIFF. Program pozwala nam na przeprowadzenie analizy offline w celu ponownej analizy obrazów przy użyciu zmodyfikowanych wartości parametrów. Jeśli przeprowadzasz analizę w trybie offline, wybierz menu wtyczki "Fear Conditioning and FZ Offline" i wybierz folder danych, który chcesz ponownie przeanalizować. Następnie ponownie wprowadź wartości parametrów i kliknij przycisk "Zakończ".

4. Test kontekstowy

1. Po zakończeniu sesji warunkowania myszy są wracane do tej samej komory kondycjonowania i oceniane pod kątem zachowania zamrażającego w celu zmierzenia kontekstowo uwarunkowanego strachu (test kontekstowy). Odstęp czasu między kondycjonowaniem a testem kontekstowym jest zazwyczaj ustalany na 24 godziny. W tym protokole, w celu oceny pamięci najnowszej i pamięci zdalnej (mierzonej w teście odpowiednio 1 dzień i ponad 28 dni po kondycjonowaniu)²⁵, myszy są poddawane testowi kontekstowemu około 24 godziny i 30 dni po sesji kondycjonowania. Myszy umieszcza się w komorze kondycjonującej i pozwala się im swobodnie eksplorować komorę przez 300 sekund bez prezentacji CS i US (ryc. 2C).
2. Uruchomić program ImageFZ i ustawić wartości parametrów aplikacji w taki sam sposób, jak w kondycjonowaniu (patrz sekcja 3.2.3); należy jednak zmodyfikować czas trwania tego testu na 300 sekund i wybrać referencyjny plik tekstowy do testu kontekstowego. Po zmianie ustawienia należy przeprowadzić test przygotowawczy z użyciem myszy ćwiczebnych w celu sprawdzenia systemu ImageFZ.
3. Umieść każdą mysz w komorze kondycjonowania i kliknij przycisk start. Po upływie 300 sekund włóż myszy z powrotem do ich domowej klatki i pozostaw klatkę w spokoju do momentu rozpoczęcia testu z sygnałem.
4. Wyczyść komory. Następnie kliknij przycisk "Następna analiza" i powtórz kroki 4.3-4.4 na myszach testowych.

5. Test Cued

1. Test Cued jest przeprowadzany w tym samym dniu, w którym przeprowadzono test kontekstowy lub w dniu następnym. W tym teście myszy są umieszczane w innej komorze testowej o bardzo różnych właściwościach, zapewniając nowy kontekst, który nie jest związany z komorą kondycjonującą przez 3 minuty. Pod koniec pierwszych 3 minut sygnał dźwiękowy, który jest prezentowany w momencie kondycjonowania, jest podawany myszom przez 3 minuty w nowym środowisku kontekstowym. W tym protokole test cued jest wykonywany kilka godzin po teście kontekstowym. Myszy mogą eksplorować trójkątną komorę przez 360 sekund. W ciągu pierwszych 3 minut nie jest prezentowany ani CS, ani US, a następnie CS (biały szum 55 dB) jest prezentowany przez ostatnie 3 minuty.
2. Uruchom oprogramowanie ImageFZ i ustaw wartości parametrów w taki sam sposób, jak w kondycjonowaniu, z wyjątkiem modyfikacji czasu trwania testu na 360 sekund i wybrania referencyjnego pliku tekstowego dla testu cued. Po dostosowaniu ustawienia należy przeprowadzić test przygotowawczy przy użyciu myszy ćwiczebnej w celu sprawdzenia systemu ImageFZ.
3. Umieść każdą mysz w trójkątnej komorze i kliknij przycisk Start. Po upływie 360 sekund włóż myszy z powrotem do klatki domowej i odłóż klatkę na półkę w pomieszczeniu do przetrzymywania.
4. Wyczyść komory. Następnie kliknij przycisk "Następna analiza" i powtórz kroki 5.3-5.4 na myszach testowych.
5. Aby dokładniej przetestować pamięć zdalną, powtórz protokoły 4-5 około 30 dni po sesji kondycjonowania (Rysunek 2A).

6. Analiza obrazu

1. Automatyczne pobieranie i analizowanie danych za pomocą ImageFZ. Ta aplikacja jest oparta na domenie publicznej programie ImageJ (opracowanym przez Wayne'a Rasbanda z National Institutes of Health i dostępnym pod adresem http://rsb.info.nih.gov/ij/), zmodyfikowanym przez Tsuyoshi Miyakawa (aplikacja ImageFZ, dostępna do bezpłatnego pobrania, patrz Tabela materiałów/odczynników).
2. We wszystkich eksperymentach należy rejestrować obrazy z określoną liczbą klatek na sekundę (np. 1 kl./s) za pomocą funkcji ImageFZ za pomocą urządzenia USB do przechwytywania wideo, w tym kamery wideo. Aby zmierzyć przebytą odległość od kolejnych obrazów, dostosuj wartość "progu minimalnego" programu (np. 80 pikseli), która jest ustawiona na segmentację obrazów na czarną cząstkę (mysz) i białe tło. Przebyta odległość jest obliczana na podstawie odległości między każdym zestawem współrzędnych x-y środka ciężkości cząstki na kolejnych obrazach.
3. Aby zmierzyć zachowanie zamrożenia kolejnych obrazów, dostosuj wartość "progu min (xor)" programu (np. 160 pikseli), która jest ustawiona na segmentację obrazów na czarną cząstkę (mysz) i tło, a następnie oblicz ilość obszaru (pikseli) nienakładających się obszarów między cząstkami każdej pary kolejnych obrazów. Dostosuj wartość za pomocą suwaka narzędzia próg, aż cząstka na każdym obrazie będzie pasować do kształtu całej obudowy myszy z wyjątkiem ogona. Jeśli obszar obszaru nienakładającego się na siebie jest poniżej wartości "kryterium zamrożenia" (np. 30 pikseli), zachowanie to uważa się za "zamrożenie" (rysunek 3), które jest ogólnie definiowane jako całkowity brak jakiegokolwiek ruchu z wyjątkiem oddychania i bicia serca. Gdy obszar przekroczy tę wartość, zachowanie jest uważane za "niezamarzające" (rysunek 3). Ocena powinna być dokonana w oparciu o definicję zamrażania. Myszy czasami wykazują subtelny ruch i chwilowy bezruch, co może nie być uważane za zachowanie zastygające w bezruchu, które odzwierciedla strach. Bezruch trwający przez krótki czas (np. krótszy niż 2 sekundy), który prawdopodobnie różni się od przejawu lęku, można wykluczyć z analizy, ustalając próg czasowy zamrożenia. Aby ustawić próg czasowy, wprowadź wartość "Czas zamrożenia – min (s)" (np. 2 sekundy).
4. Program ImageFZ automatycznie oblicza przebytą odległość (cm) i procent zamarznięcia. Wyniki są zapisywane w plikach tekstowych, a obrazy aktywne i obrazy trasowania są przechowywane w formacie TIFF. Aby zmierzyć przebytą odległość (cm) jako wskaźnik wrażliwości na wstrząsy elektryczne, program ImageFZ rejestruje również obrazy z dużą liczbą klatek na sekundę (np. 4 kl./s) przez 6 sekund, mierzoną od 2 sekund przed dostarczeniem 2-sekundowego wstrząsu stopą do 2 sekund po wstrząsie stopy podczas analizy online. Aby ustawić liczbę klatek na sekundę dla przechwytywania obrazu przed, w trakcie i po wstrząsie nożnym, wprowadź wartość w polu "Szybkość wstrząsów (klatka/s)". Po analizie online przeprowadź analizę offline, wybierając menu wtyczki "FZ Shock Offline", aby uzyskać dane dotyczące przebytej odległości.
5. Wartości parametrów programu ImageFZ powinny być zoptymalizowane tak, aby generować wyniki podobne do tych uzyskiwanych przez obserwatorów w testach przygotowawczych. W przypadku ręcznej oceny zachowanie zamarzania jest mierzone w sposób ciągły za pomocą stopera i programu rejestrującego zdarzenia lub procedury natychmiastowego próbkowania czasu co 3-10 sekund, podczas analizy za pomocą oprogramowania ImageFZ. Obserwację behawioralną zazwyczaj przeprowadza dwóch obserwatorów. Aby dostosować wartości parametrów programu ImageFZ w celu zapewnienia, że wyniki analizy obrazu są zgodne z wynikami obserwatorów, należy przeprowadzić analizę programu ImageFZ w trybie offline, modyfikując wartości "progu minimalnego (xor)" i "kryterium zamrażania". Aby przeprowadzić analizę w trybie offline, wybierz menu wtyczki "FZ Offline" i wprowadź dowolne wartości parametrów.

7. Rozwiązywanie problemów

1. W jaki sposób można pobrać i zainstalować program ImageFZ?
   Program ImageFZ jest dostępny do bezpłatnego pobrania z naszej strony internetowej (patrz Tabela materiałów/odczynników) i działa na komputerze z systemem Windows. Pobierz folder zip dla ImageFZ i zainstaluj oprogramowanie na swoim komputerze. Zobacz plik "readme.txt", aby uzyskać szczegółowe informacje na temat instalacji i postępuj zgodnie z instrukcjami krok po kroku.
2. Dlaczego wyświetlany jest komunikat o błędzie "Błąd ustawienia urządzenia przechwytującego"?
   Sprawdź podłączenie kamery i instalację sterownika urządzenia USB do przechwytywania obrazu. Jeśli nie ma problemu z ustawieniami, oprogramowanie ImageFZ może nie działać z urządzeniem do przechwytywania obrazu. Zapoznaj się z plikiem "readme.txt" dotyczącym odpowiedniego urządzenia do użytku z oprogramowaniem ImageFZ.
3. ImageFZ nie może wykryć całego ciała myszy jako cząstki.
   Ustaw wartość "threshold min" i/lub "threshold min (xor)" niższą niż bieżąca wartość. Jeśli ImageFZ nie może wykryć myszy w określonym miejscu, np. w rogu komory testowej, mogą istnieć niewystarczające warunki testowe, takie jak równomiernie oświetlona podłoga lub lekko kontrastująca różnica między myszą a tłem. Aby rozwiązać ten problem, dostosuj wartości parametrów (np. jasność i kontrast obrazu na żywo oraz wartości progowe) ImageFZ, kontroluj liczbę i położenie świateł lub użyj białego tła dla czarnej myszy.
4. Przechwytywanie obrazu z dużą liczbą klatek na sekundę spowalnia komputer podczas analizy online.
   Ustaw liczbę klatek na sekundę na wartość niższą niż bieżąca częstotliwość i przeprowadź analizę online. Analiza ImageFZ, polegająca na akwizycji obrazu z prędkością 1 kl./s, jest wystarczająca do dokładnego pomiaru zamarzania, jak pokazano w sekcji dotyczącej reprezentatywnych wyników.
5. Wyniki analizy ImageFZ nie zgadzają się z wynikami oceny ludzkiej.
   Sprawdź zapisany obraz i pliki wyników oceny. Jeśli ImageFZ zawyża wartość zamrożenia, ustaw "kryterium zamrażania" na wartość niższą niż bieżąca wartość i przeprowadź analizę w trybie offline. Jeśli ImageFZ nie docenia zamrożenia, ustaw "kryterium zamrażania" na wartość wyższą niż bieżąca wartość.
6. W eksperymentach optogenetycznych i elektrofizjologicznych in vivo światłowodowy przymocowany do głowy myszy zakłóca ocenę zamarzania.
   Pokryj na biało, aby uzyskać czarną mysz i zmieniaj położenie i kąt kamery, aż nie zostaną wykryte.
7. Co jest potrzebne do analizy offline?
   Utwórz folder o nazwie "Image_FZ" w katalogu głównym programu ImageFZ. W tym folderze utwórz podfoldery "Obrazy" i "Sesje". Przenieś 8-bitowy obraz w skali szarości do folderu "Obrazy" i utwórz plik tekstowy, w którym nazwa pliku obrazu jest zapisana w folderze "Sesje". Następnie uruchom analizę offline ImageFZ i postępuj zgodnie z instrukcjami programu.

Results

W teście warunkowania strachu, eksperymentatorzy na ludziach zwykli określać ilościowo zachowanie podczas zamrażania poprzez pracochłonną bezpośrednią obserwację^26-29, ale ostatnio do automatycznego pomiaru zachowania zamrażania użyto pomiarów komputerowych opartych na promieniach fotograficznych (np. system 'Freeze Monitor') i systemów analizujących obraz^26,30-32. ImageFZ to zautomatyzowany system analizy obrazu, który daje wyniki porównywalne z wynikami uzyskanymi w wyniku obserwacji człowieka, jak opisano poniżej. W tym miejscu porównaliśmy wyniki obserwacji człowieka z wynikami analizy ImageFZ przy różnych parametrach: "Szybkość (klatka/s)" i "Kryterium zamrażania (piksele)". W tym eksperymencie wykorzystano pięć samców myszy C57BL / 6J (średnia masa ciała ± SD (g), 31,4±3,55; średnia wielkość ciała ± SD (piksele), 351,6±62,2) w wieku 15-27 tygodni. Obserwacja człowieka została dokonana za pomocą programu rejestrującego zdarzenia (program Macintosh OS9); Naciśnięcie, które trwało przez 2 sekundy lub dłużej, gdy mysz wykazywała brak ruchu, było uważane za "zamrożenie". Procent zamarzania był obliczany co 60 sekund w każdym teście i wykorzystywany do analiz korelacji. Procent zamrożenia uzyskany przez 2 obserwatorów (niezawodność między obserwatorami, dla warunkowania, r = 0,879; dla testu kontekstowego, r = 0,957; dla testu cued, r = 0,866, dla wszystkich przypadków, r = 0,888) został uśredniony, aby wygenerować wynik ludzki. Zbadano korelacje między procentami zamrożenia mierzonymi za pomocą ImageFZ przy każdej liczbie klatek na sekundę (tj. 1, 2 i 4 kl./s) a tymi uzyskanymi za pomocą obserwacji ludzi. Jak pokazano na rysunku 4, procenty zamrożenia obliczone za pomocą ImageFZ (1, 2 i 4 kl./s) były silnie skorelowane ze średnią wartością uzyskaną z pomiarów 2 obserwatorów. Warto zauważyć, że przechwytywanie obrazów z większą liczbą klatek na sekundę nie zawsze daje najlepszą korelację. Analiza obrazu przy 1 kl./s przyniosła wyniki podobne do tych uzyskanych od ludzkich obserwatorów w każdym teście. Zbadano korelacje między procentami zamrożenia mierzonymi za pomocą obserwacji prowadzonych przez ludzi i przy użyciu ImageFZ w każdym z warunków "kryterium zamrożenia (piksele)" (tj. 20, 30 i 40 pikseli). Procenty zamrożenia obliczone za pomocą ImageFZ przy "kryterium zamrożenia (piksele)" wynoszącym 20, 30 i 40 pikseli były we wszystkich przypadkach silnie skorelowane z tymi uzyskanymi na podstawie obserwacji prowadzonych przez ludzi (rysunek 5). Jak pokazano na rysunku 5D, gdy kryterium zamrażania jest ustawione na niską wartość, subtelny ruch myszy, uznany przez obserwatorów za "zamrożony", zostanie uznany za "niezamarzający" przy użyciu ImageFZ. I odwrotnie, jeśli kryterium jest ustawione na wysoką wartość, ruch myszy, oceniony przez ludzkich obserwatorów jako "niezamarzający", zostanie uznany za "zamrożenie" przy użyciu ImageFZ (rys. 5C, 5F i 5I). W związku z tym, aby uzyskać najbardziej wiarygodne wyniki, każdy parametr programu ImageFZ powinien być kalibrowany przy użyciu danych uzyskanych w wyniku obserwacji ludzkich w każdym środowisku testowym.

Ponadto, porównaliśmy wyniki wygenerowane przez ludzkiego obserwatora, przy użyciu komputerowego systemu pomiarowego opartego na promieniu słonecznym (system Freeze Monitor), z tymi uzyskanymi za pomocą ImageFZ (zobacz Rysunek 6). Ludzki obserwator był ślepy na grupę leczoną i wyniki punktacji ImageFZ. Do ustawień parametrów systemu Freeze Monitor użyliśmy 3 miar procentowego zamrożenia z wcześniej zwalidowanego systemu³⁰. Krótko mówiąc, zmierzono liczbę 10-sekundowych interwałów, w których zwierzęta potrzebowały więcej niż 1 lub 2 sekundy, aby przejść przez pierwszą nową wiązkę przedziału (odpowiednio 1 sekunda 10 sekund i 2 sekundy 10 sekund) oraz opóźnienie między początkiem każdego 5-sekundowego interwału a trzecim nowym przerwaniem wiązki w tym przedziale (Latency3). Obliczono procenty interwałów, w których mysz zamarzała, lub procent całkowitego czasu potrzebnego do przerwania trzeciej wiązki światła.

Procenty zamrożenia mierzone w każdym systemie są zilustrowane na rysunku 6. Grupy porównano za pomocą dwukierunkowych powtarzanych pomiarów ANOVA, a następnie testów t (patrz Tabela 1). Procenty zamarzania zmierzone za pomocą ImageFZ (Rysunek 6B) były bardziej podobne do tych uzyskanych za pomocą obserwacji człowieka (Rysunek 6A) niż dane uzyskane za pomocą systemu opartego na promieniach słonecznych (Rysunki 6C-E). Procenty zamrożenia zmierzone za pomocą programu ImageFZ w każdym teście były silnie skorelowane z tymi uzyskanymi na podstawie obserwacji człowieka (warunkowanie, r = 0,947; test kontekstowy r = 0,970; test cued, r = 0,934), podczas gdy korelacje między procentami zamarzania zmierzonymi za pomocą komputerowego systemu pomiarowego opartego na promieniu słonecznym (1 s 10 sekund, 2 sekundy 10 sekund lub opóźnienie3) a ludzkim obserwatorem były niższe (warunkowanie, r = 0,503, 0,593 i 0,761; test kontekstowy, r = 0,772, 0,819 i 0,912) w porównaniu z korelacjami między procentami zamarzania mierzonymi za pomocą ImageFZ a obserwacją człowieka (ryc. 7A i 7B). Ponadto rysunek 7 pokazuje, że różnice między procentami zamrożenia uzyskanymi w wyniku obserwacji człowieka i użycia ImageFZ u każdej myszy były najmniejszymi różnicami. Wyniki te wykazały, że procenty zamarzania mierzone za pomocą ImageFZ były podobne do tych uzyskanych w wyniku obserwacji przez człowieka i że ImageFZ jest bardzo dokładny przy pomiarze stopnia zamrożenia.

Rysunek 1. Aparatura do testu warunkowania strachu kontekstowego i sygnalizowanego. (A) akrylowa kwadratowa komora do badania kondycjonowania i kontekstu, (B) metalowe kratki na białej plastikowej podłodze dla czarnych, agouti lub rozcieńczonych brązowych myszy (na górze) i elektryczne czarne metalowe siatki na czarnej plastikowej podłodze dla białych myszy (na dole); Powiększone obrazy siatek są pokazane w prawym panelu, (C) generator białego szumu/tonów i generator wstrząsów, (D) dźwiękoszczelne pomieszczenie oraz (E) akrylowa trójkątna komora z płaską podłogą do testu cued. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

Rysunek 2. Schematyczne przedstawienie protokołu. (A) Przegląd testu warunkowania strachu kontekstowego i podpowiedzianego, (B) warunkowania, (C) testu kontekstu i (D) testu sygnalizowanego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

Rysunek 3. Analiza obrazu za pomocą oprogramowania ImageFZ. Dla każdej pary kolejnych obrazów ilość obszaru (pikseli), przez który poruszała się mysz, jest obliczana przez ImageFZ. Gdy obszar ten znajduje się poniżej pewnego progu (np. 30 pikseli), zachowanie jest oceniane jako "zamrożenie". Gdy ilość obszaru jest równa lub przekracza próg, zachowanie jest uważane za "niezamarzające". Kliknij tutaj, aby zobaczyć większy obraz.

Rysunek 4. Porównanie procentów zamrożenia obliczonych na podstawie obrazów o różnej liczbie klatek na sekundę przy użyciu ImageFZ z wartościami zmierzonymi za pomocą obserwacji przez człowieka. Testy warunkowania strachu przeprowadzono na samcach myszy C57BL/6J (n=5). Podczas testów dwóch obserwatorów oceniło zachowanie podczas zamarzania. Jednocześnie obrazy na żywo były rejestrowane z prędkością 4 kl./s za pomocą programu ImageFZ. Pliki przechwycone z szybkością 4 kl./s zostały zmniejszone po wyodrębnieniu klatek, aby odpowiadały obrazom zarejestrowanym z szybkością 1 kl./s lub 2 kl./s. Wartości parametrów "Szybkość (klatka/s)" zostały ustawione na 1, 2 lub 4 kl./s, a wartości procentowe zamrożenia w każdym 60-sekundowym przedziale zostały obliczone na podstawie plików graficznych przy użyciu analizy offline ImageFZ. Każda kropka reprezentuje procent zamrożenia każdego 60-sekundowego przedziału. Obliczono współczynniki korelacji Pearsona między danymi uzyskanymi z obserwacji człowieka a analizą ImageFZ. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większy obraz.

Rysunek 5. Porównano procenty zamrożenia obliczone na podstawie obrazów przy różnych wartościach kryteriów zamrażania za pomocą ImageFZ i te zmierzone za pomocą obserwacji ludzi. Testy warunkowania strachu przeprowadzono na samcach myszy C57BL/6J (n=5). Podczas testów dwóch obserwatorów zarejestrowało zachowanie zamarzania, a obrazy na żywo zostały uchwycone za pomocą programu ImageFZ. Procenty zamrożenia w każdym 60-sekundowym przedziale zostały obliczone na podstawie obrazów (1 klatka/s) za pomocą analizy offline ImageFZ, ustawiając wartości parametrów "Kryterium zamrażania (piksele)" na 20, 30 lub 40 pikseli. Każda kropka reprezentuje procent zamrożenia każdego 60-sekundowego przedziału. W każdym teście obliczono współczynniki korelacji Pearsona między danymi uzyskanymi z obserwacji człowieka a analizą ImageFZ. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większy obraz.

Rysunek 6. Procenty zamrażania mierzono za pomocą zautomatyzowanych systemów i obserwacji ludzi w bezwarunkowych i kondycjonowanych grupach samców myszy C57BL / 6J (n = 5, każda grupa). (A) Obserwacja przez człowieka, (B) ImageFZ, (C) System monitorowania zamrażania 1 (1 s 10 s), (D) system monitorowania zamrażania 2 (2 s 10 s) i (E) system monitorowania zamrażania 3 (opóźnienie3). Porównania grup przeprowadzono przy użyciu dwukierunkowych powtarzanych pomiarów ANOVA, a następnie testów t (grupa bezwarunkowa vs. grupa uwarunkowana, *, P<0,05; †, p<0,01). Dane uzyskane za pomocą ImageFZ były podobne do tych uzyskanych za pomocą obserwacji człowieka. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większy obraz.

Rysunek 7. Korelacja i rozkład częstości różnic między procentami zamrożenia, mierzonych za pomocą systemów automatycznych i obserwacji człowieka. Punkty A-B) Pokazano wykresy punktowe i współczynniki korelacji Pearsona między procentami zamrożenia uzyskanymi przez zautomatyzowane systemy a obserwacją człowieka. Procenty zamrożenia, obliczone za pomocą ImageFZ, były silnie skorelowane z tymi uzyskanymi przez obserwację człowieka. (C-F) Występowanie mniejszej niż 10% różnicy między procentami zamrożenia uzyskanymi z systemów automatycznych a obserwacją człowieka było najwyższe, gdy dane analizowane za pomocą ImageFZ porównano z danymi analizowanymi za pomocą obserwacji człowieka. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

	Analizy ANOVA
	warunek	Godzina	Warunek x czas
Dzień 1 (kondycjonowanie)
ludzki	F(1,8)=28,53, p=0,0007	F(7,56)=20,79, p<0,0001	F(7,56)=16,58, p<0,0001
ImageFZ (ImageFZ)	F(1,8)=13,97, p=0,0057	F(7,56)=21,40, p<0,0001	F(7,56)=11,69, p<0,0001
Monitor zamrożenia (1 s 10 sek)	F(1,8)=5,16, p=0,0528	F(7,56)=2,39, p=0,0329	F(7,56)=0,72, p=0,6572
Monitor zamrożenia (2 s 10 s)	F(1,8)=4,07, p=0,0782	F(7,56)=3,44, p=0,0039	F(7,56)=1,52, p=0,1803
Monitor zamrożenia (opóźnienie3)	F(1,8)=4,44, p=0,0682	F(7,56)=9,94, p<0,0001	F(7,56)=4,33, p=0,0007
Dzień 2 (kontekst)
ludzki	F(1,8)=42,94, p=0,0002	F(4,32)=1,91, p=0,1336	F(4,32)=1,48, p=0,2302
ImageFZ (ImageFZ)	F(1,8)=49,61, p=0,0001	F(4,32)=2,06, p=0,1087	F(4,32)=0,83, p=0,5174
Monitor zamrożenia (1 s 10 sek)	F(1,8)=20,28, p=0,002	F(4,32)=1,63, p=0,1918	F(4,32)=0,55, p=0,6997
Monitor zamrożenia (2 s 10 s)	F(1,8)=40,20, p=0,0002	F(4,32)=2,66, p=0,0504	F(4,32)=1,20, p=0,3306
Monitor zamrożenia (opóźnienie3)	F(1,8)=35,30, p=0,0003	F(4,32)=2,49, p=0,0626	F(4,32)=1,09, p=0,3793

Tabela 1. Porównania statystyk.

Discussion

Kontekstowy i sygnalizowany test warunkowania strachu jest jednym z najczęściej stosowanych paradygmatów do oceny uczenia się i pamięci. Ten test jest formą warunkowania Pawłowa, w którym dokonuje się skojarzenia między kontekstem i/lub bodźcem warunkowym (wskazówka słuchowa) a bodźcem awersyjnym (elektryczny wstrząs stopą). Po nawet pojedynczym sparowaniu sygnału kontekstowego/słuchowego i wstrząsu stopą, myszy wykazują długotrwałe zamrożenie w obliczu kontekstu lub wskazówki. W tym teście zachowanie zamrożenia jest używane jako wskaźnik pamięci strachu. Badania farmakologiczne i badania nad zmianami chorobowymi wykazały, że tworzenie, konsolidacja i odzyskiwanie pamięci są regulowane przez kilka regionów mózgu, takich jak ciało migdałowate, hipokamp i kora przedczołowa^3,33-35. Ponadto badania genetyki molekularnej wykazały rolę określonych genów i cząsteczek zaangażowanych w uczenie się i pamięć w tych regionach mózgu przy użyciu genetycznie zmodyfikowanych myszy³⁶. Dlatego ten test jest prosty i przydatny do badania neurobiologicznych podstaw uczenia się i pamięci strachu. W tym artykule filmowym przedstawiliśmy nasz protokół, aby zapewnić eksperymentatorom szczegółowe informacje umożliwiające zrozumienie i łatwe wykonanie testu.

Zachowanie związane z zamrożeniem określono ilościowo poprzez bezpośrednią obserwację przez eksperymentatorów na ludziach. Oczekuje się, że dobrze wyszkolony eksperymentator uzyska wiarygodne, stabilne wyniki we wszystkich obserwacjach. Jednak metoda ta wiąże się z potencjalnymi problemami, takimi jak różnice w metodzie obserwacyjnej, stronniczość obserwatora i proste błędy w kwantyfikacji, co utrudnia bezpośrednie porównanie wyników od niezależnych eksperymentatorów i różnych laboratoriów. Zastosowano również zautomatyzowany komputerowy system pomiarowy oparty na promieniach słonecznych^26,30-32. Jednak system ten stwarza również potencjalne problemy w pomiarze zachowań związanych z zamarzaniem. Ze względu na rozmieszczenie czujników, system ten może nie być w stanie wykryć niewielkich ruchów głowy, które zwykle byłyby oceniane jako "aktywne" przez obserwację człowieka. Ponadto drżenie podczas zamrażania można uznać za niezamarzające, ponieważ gdy zwierzę zamarza, w wyniku drżenia obserwuje się przerywane przerwy w wiązce światła. Jako alternatywną metodę opracowano zautomatyzowane systemy analizy obrazów i wideo^17-20,37,38. Anagnostaras i wsp.³⁷ opisało kilka systemów z programami do analizy obrazu, które mają dobrą trafność i dobrze zamrażają wyniki^17,20,37-38. Jednak większość tych systemów i programów analitycznych musi być pozyskiwana od dostawców komercyjnych i jest zazwyczaj kosztowna. Opracowaliśmy oprogramowanie ImageFZ do analizy zachowań związanych z zamarzaniem, a program ten jest rozpowszechniany jako darmowy program. ImageFZ wykrywa mysz jako ciało pikseli (cząsteczkę) i rozróżnia subtelne ruchy myszy jako "zamrożenie" lub "niezamrożenie" w zależności od ilości obszaru nienakładających się obszarów między cząstkami każdej pary kolejnych obrazów. Jak pokazują reprezentatywne wyniki, pomiary za pomocą programu ImageFZ są zgodne lub dokładniejsze niż uzyskane przy użyciu innych metod. W ten sposób program ImageFZ automatycznie mierzy zachowanie, które ludzcy obserwatorzy oceniają jako zamrożenie, przy użyciu zdefiniowanych kryteriów. Ponadto program ImageFZ oblicza przebytą odległość (cm) przed, w trakcie i po ekspozycji na wstrząsy stóp, ułatwiając ocenę wrażliwości na wstrząsy i analizę zachowania podczas zamarzania.

Między laboratoriami istnieją różnice metodologiczne. Różnice te mogą powodować trudności w porównywaniu danych między laboratoriami i powielaniu wyników w różnych laboratoriach. Aby uzyskać bardziej stabilne i porównywalne dane, konieczna jest standaryzacja protokołu testowego w jak największym stopniu. System analizy z ImageFZ prowadzi do automatyzacji procedur testowych, co może przyczynić się do standaryzacji protokołów stosowanych w laboratoriach.

Podczas analizy zachowań związanych z zamrożeniem należy wziąć pod uwagę kilka reakcji behawioralnych. Po pierwsze, gdy zwierzęta znajdują się w przerażającej sytuacji, mogą uciec zamiast zamarznąć³⁹. Ucieczka jest jedną z reakcji strachu, a jej wystąpienie doprowadzi do niedoszacowania pamięci strachu. Po drugie, zamrażanie może zależeć od ogólnego poziomu aktywności, a poziom aktywności u myszy eksperymentalnych i kontrolnych musi zostać zbadany. Na przykład, chociaż myszy pozbawione receptora muskarynowego acetylocholiny M1 wykazywały obniżony poziom zamrażania w porównaniu z myszami typu dzikiego, różne testy behawioralne wykazały, że wyniki można przypisać ich fenotypowi nadpobudliwości, a nie upośledzeniu^pamięci. ImageFZ oblicza odległość (cm) przebytą przez obiekty. Dane są dostępne w celu zbadania, czy istnieją różnice w ogólnych poziomach aktywności między uczestnikami. Jeśli istnieje różnica w przebytym dystansie w grupie, jednym z możliwych podejść do problemu jest rozważenie dystansu przebytego w ciągu pierwszych 2 minut treningu jako aktywności wyjściowej i zastosowanie współczynnika tłumienia (współczynnik tłumienia = (aktywność podczas testowania)/(aktywność podczas linii bazowej + aktywność podczas testowania)) jako drugorzędny wskaźnik strachu^17,40. Wreszcie, różnica we wrażliwości na ból, wywołująca zmiany w reaktywności na elektryczny wstrząs stopy, jeśli występuje, może skutkować zmianami w zachowaniu podczas zamarzania. ImageFZ oblicza również szczegółowo przebytą odległość (cm) od 2 sekund przed ekspozycją na wstrząs stopy o długości 2 sekund do 2 sekund po jego ekspozycji (przez 6 sekund), co można wykorzystać jako wskaźnik wrażliwości na wstrząsy.

Systemy analizy wideo zostały opracowane w celu pomiaru zamarzania myszy albinosów, czarnych, agouti i rozcieńczonych brązowych. ImageFZ wykorzystuje czarną tacę podłogową i czarne siatki do badania białych myszy (patrz rysunek 1B). Czarne siatki są wykonane ze specjalnie przetworzonych metali pokrytych czarną farbą i mają przewodność elektryczną podobną do niepowlekanych siatek metalowych, które są zwykle używane do czarnych myszy. ImageFZ analizuje również zachowanie zamarzania u szczurów i innych gryzoni poprzez dostosowanie parametrów programu. W obecnej wersji ImageFZ zachowanie obiektu jest rejestrowane za pomocą kamery wideo umieszczonej na górnej ścianie w celu analizy zamrożenia. ImageFZ może być również używany w konfiguracji, w której obrazy są rejestrowane z boku komory. Ponadto ImageFZ steruje maksymalnie 4 aparatami. Ta funkcja pozwala badaczowi na jednoczesne badanie 4 myszy, oszczędzając czas i zmniejszając potencjalne wpływy wynikające z różnic w czasie wykonania każdego obiektu i kolejności testowania zachowania. W ten sposób ImageFZ upraszcza procedurę testowania i analizy zachowań związanych z zamrażaniem, a program ten ułatwia testowanie przy mniejszym nakładzie pracy i bez żadnego szkolenia w zakresie eksperymentów behawioralnych.

W laboratorium Miyakawa oceniliśmy ponad 110 szczepów genetycznie modyfikowanych myszy i myszy kontrolnych typu dzikiego w kontekście, w teście warunkowania strachu kontekstowego i sygnalizacyjnego, wykorzystując system analizy wideo w celu wyjaśnienia wpływu danego genu na uczenie się i pamięć^41-42. Uzyskaliśmy duży zestaw surowych danych dla ponad 5000 myszy. Surowe dane, które zostały wykorzystane w opublikowanych artykułach naukowych^4-16 , są zawarte w "Bazie danych fenotypów myszy" jako publiczna baza danych (URL: http://www.mouse-phenotype.org/). Niniejszy artykuł filmowy zawiera szczegółowe informacje dotyczące szczegółów naszej procedury eksperymentalnej i pomaga w zrozumieniu sytuacji testowej.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Program ImageFZ	Opracowany przez Tsuyoshi Miyakawa		Ten program jest dostępny za pośrednictwem O'Hara & Co., Tokio, Japonia i do bezpłatnego pobrania pod adresem http://www.mouse-phenotype.org/. To oprogramowanie działa w 32-bitowym systemie Windows XP/Vista/7.
Komora kondycjonowania	O' Hara & Co., Japonia	CL-3002L	Do myszy.
Komora testowa	O' Hara & Co., Japonia	CLT-3002L	Do myszy.
Interfejs	O' Hara & Co., Japonia	CL-1040	Interfejs zawiera generator białego szumu/tonów, który może być sterowany przez program ImageFZ.
Mieszany generator wstrząsów	O' Hara & Co., Japonia	SGA-2040	Generator wstrząsów może być sterowany przez program ImageFZ.
Tester siatki wstrząsowej (amperomierz)	O' Hara & Co., Japonia	SG-T
Urządzenie do przechwytywania wideo USB	XLR8	USB2IVOSX
Poczwórny rozdzielacz obrazu	Bezprzewodowy Tsukamoto Co., Ltd., Japonia	400AS
Dźwiękoszczelny pokój	O' Hara & Co., Japonia	CL-4210
Monitor zamarzania	San Diego Instruments, Inc., CA, USA		Matryca fotoskopowa 16 x 16  ( rozstaw 2,5 cm)