Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Metody identyfikacji rezonansów NMR 13C-dimetylo-N-końcowej aminy na redukcyjnie metylowanych białkach

5.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50875

⸱

12 grudnia 2013

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Louisiana State University

W tym artykule

Podsumowanie

Opisano dwie metody przypisywania sygnałów magnetycznego rezonansu jądrowego α- i ε-dimetyloaminy redukcyjnie 13C-metylowanej N-końcowej lizyny. Jedna metoda wykorzystuje selektywność reakcji metylacji redukcyjnej wywołanej pH, a druga wykorzystuje aminopeptydazę do selektywnego usuwania N-końcowej lizyny.

Streszczenie

Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) jest sprawdzoną techniką do badań struktury białek i dynamiki. Aby badać białka za pomocą NMR, stabilne izotopy magnetyczne są zwykle włączane metabolicznie, aby poprawić czułość i umożliwić sekwencyjne przypisanie rezonansu. Redukcyjna 13C-metylacja jest alternatywną metodą znakowania białek, które nie są podatne na nadmierną ekspresję gospodarza bakteryjnego, najczęstszą metodę włączania izotopów. Redukcyjna 13C-metylacja to reakcja chemiczna przeprowadzana w łagodnych warunkach, która modyfikuje pierwszorzędowe grupy aminowe białka (grupy lizynowe ε-aminowe i N-końcową grupę α-aminową) do 13grup C-dimetyloaminowych. Modyfikacja nie zmienia struktury i funkcji większości białek, co czyni ją realną alternatywą dla znakowania metabolicznego. Ponieważ redukcyjna metylacja 13C dodaje rzadkie, izotopowe znaczniki, tradycyjne metody przypisywania sygnałów NMR nie mają zastosowania. Opracowano alternatywną metodę przypisywania wykorzystującą spektrometrię mas (MS) w celu pomocy w przypisywaniu sygnałów NMR białka 13C-dimetyloaminy. Metoda opiera się na częściowym i różnych ilościach znakowania 13C w każdej pierwszorzędowej grupie aminowej. Jedno ograniczenie metody pojawia się, gdy N-końcową resztą białka jest lizyna, ponieważ grupy α- i ε-dimetyloaminowe Lys1 nie mogą być indywidualnie mierzone za pomocą MS. Aby obejść to ograniczenie, opisano dwie metody identyfikacji rezonansu NMR 13C-dimetyloamin związanych zarówno z N-końcową α-aminą, jak i łańcuchem bocznym ε-aminy. Sygnały NMR N-końcowej α-dimetyloaminy i ε-dimetyloaminy o łańcuchu bocznym lizozymu białka jaja kurzego, Lys1, są identyfikowane w heterojądrowych widmach koherencji pojedynczegokwantu 1 H-13C.

Wprowadzenie

Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) jest cennym narzędziem wyjaśniającym strukturę białek1. Spektroskopia NMR może być stosowana do określania struktury roztworu białka w jego stanie natywnym. Aby przezwyciężyć niską naturalną obfitość stabilnych izotopów magnetycznych, konieczne jest włączenie 13C i 15N do interesującego nas białka. Najpowszechniejszą stosowaną metodą jest ekspresja rekombinowana w bakteryjnym gospodarzu2-3. Jednak dwie wady nadmiernej ekspresji gospodarza bakteryjnego to to, że nie może on wytwarzać modyfikacji potranslacyjnych i nie działa dla wszystkich białek3-4. Gdy ekspresja bakterii nie jest realną drogą produkcji białek, można zastosować nadmierną ekspresję w gospodarzach niebakteryjnych, ale znakowanie izotopowe jest trudne i kosztowne5. Alternatywne metody ekspresji do włączania izotopów 13C i 15N do białek do analizy NMR obejmują rzadkie techniki znakowania z użyciem prekursorów metabolicznych do znakowania metylu6 i pojedynczych aminokwasów 13C, 15N7-9. Chemicznym podejściem do rzadkiego znakowania zastosowanym w tym artykule jest dobrze ugruntowana redukcyjna reakcja metylacji 13C (ryc. 1), w której pierwszorzędowe grupy aminowe na białku - N-końcowa α-amina i lizyna, ε-aminy o łańcuchu bocznym - są metylowane. Po utworzeniu monometyloamin amina łatwo ulega ponownej metylacji, ze względu na wyższą wartość pKa, tworząc dimetyloaminy.

Redukcyjna metylacja została po raz pierwszy wprowadzona jako metoda chemicznej modyfikacji białek przez Meansa i Feeneya10. Zaletą tej reakcji jest jej szerokie zastosowanie i łagodne warunki reakcji przy buforowanym, fizjologicznym pH i niskich temperaturach11,12. W obecności formaldehydu i czynnika redukującego, takiego jak kompleks dimetyloamino-boranu (DMAB), grupy ε-aminowe lizyny i N-końcowa grupa α-aminowa są selektywnie metylowane w celu wytworzenia amin dimetylanowych. Chociaż wiadomo, że formaldehyd sieciuje białka poprzez tworzenie mostków metylenowych, proces ten jest blokowany przez środek redukujący13,14.

Redukcyjna metylacja została z powodzeniem wykorzystana do badania białek zarówno za pomocą NMR, jak i krystalografii rentgenowskiej. Metylacja redukcyjna jest stosowana w celu ułatwienia krystalizacji białek, które w przeciwnym razie byłyby trudne do opanowania15. Lizozym białka jaja kurzego był pierwszym białkiem skrystalizowanym w postaci dimetylowanej. Średnia kwadratowa różnica między ciężkimi atomami w metylowanych i niemetylowanych strukturach lizozymu wynosi 0,40 A16. Porównanie to pokazuje, że struktura białka może zostać zachowana po redukcyjnej metylacji, co sprawia, że reakcja jest realnym, znakowanym narzędziem do wyjaśniania struktury.

Używając 13formaldehydu znakowanego C w reakcji redukcyjnej metylacji, powstaje 13C-dimetylonowych amin. 13C-dimetyloamin to sondy wykrywalne przez NMR, które są szeroko stosowane do badania dynamiki, struktury i funkcji białek. NMR i redukcyjna metylacja 13C zostały wykorzystane do badania interakcji białko-ligand i białko-białko dla receptora adrenergicznego17 β2, rybonukleazy A18, lizozymu19, białka genu fd 520 i cytochromu c21. Podobnie badano właściwości strukturalne i funkcjonalne redukcyjnie 13C-metylowanej rybonukleazy A22, lizozymu23, białka genu fd 524, ferredoksyny Clostridium pasteurianum 25, fragmentu Fc IgG26, apolipoproteiny A-I27 i MIP-1α28 Dynamika 13grup C-dimetyloaminowych została zbadana na konkanawalinie A29-30 i kalmodulinie31.

Mimo że redukcyjna metylacja 13C była szeroko stosowana do badania białek za pomocą NMR, metoda znakowania zawsze była ograniczona przez trudności w przypisywaniu rezonansów NMR26. Większość strategii przypisywania redukcyjnie 13C-metylowanych białek opierała się na niewielkiej liczbie miejsc,20,28 znanych właściwościach strukturalnych11,19,23,26,31,32. lub rozległe modyfikacje genetyczne33. W żadnym z tych badań nie przypisano wszystkich 13pików C-dimetyloaminy, z wyjątkiem badania kalmoduliny, w którym piki zostały przypisane przez mutagenezę ukierunkowaną na miejsce każdej lizyny33. W badaniu tworzenia dimerów MIP-1α po raz pierwszy zgłoszono zastosowanie spektrometrii mas (MS) w celu pomocy w przypisaniu NMR redukcyjnie 13C-metylowanych amin28. Do identyfikacji lizyny na granicy faz dimeru wykorzystano matrycowo wspomaganą desorpcję laserową i jonizację czasu przelotu (MALDI-TOF) MS. Częściowo metylowane lizyny ludzkich peptydów tryptycznych MIP-1α zidentyfikowano ze stwardnieniem rozsianym i skorelowano z pojawieniem się sygnałów mono- i dimetyloaminy nienaruszonego białka obserwowanych w widmach 2D 1 H-13C HSQC NMR28. Nasza grupa rozszerzyła zakres stosowania stwardnienia rozsianego i przedstawiła metodę przypisywania, która nie wymaga wcześniejszej wiedzy na temat struktury lub właściwości białka innych niż sekwencja aminokwasów34. Ta metoda ma zastosowanie do większości białek. Jednym z wyjątków jest sytuacja, gdy białko ma N-końcową lizynę, ponieważ profil izotopowy MS N-końcowych C-dimetyloamin lizyny α i ε-13nie może być niezależnie zmierzony.

Tutaj prezentujemy dwie metody, jedną chemiczną i jedną enzymatyczną, do identyfikacji N-końcowej α-dimetyloaminy oraz miejsc o łańcuchu bocznym ε-dimetyloaminy N-końcowej reszty lizyny. Pierwsza metoda została zainspirowana przez Córdova i wsp.którzy wykorzystali pH do kontrolowania selektywności acetylacji białek35. Reakcja faworyzuje N-końcową α-aminę o niskim pH i ε-aminy o łańcuchu bocznym o wysokim pH, co pozwala na rozróżnienie grup białkowych α- i ε-aminowych w ich badaniach za pomocą elektroforezy kapilarnej35. Pokazujemy, w jaki sposób wysokie i niskie pH jest wykorzystywane do zmiany znakowania grup aminokwasów białkowych za pomocą redukcyjnej reakcji metylacji 13C i umożliwia zastosowanie strategii przypisywania wspomaganego przez MS. Druga metoda przypisywania N-końcowych α- i ε-13C-dimetyloaminy wykorzystuje selektywne usuwanie N-końcowych reszt za pomocą rekombinowanej aminopeptydazy Aeromonas proteolytica.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Redukcyjna metylacja lizozymu

  1. Przygotować 500 ml 50 mM buforu fosforanu sodu o pH 7,5. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
  2. Oznacz trzy probówki mikrowirówkowe o pojemności 1 ml dla próbki w pełni znakowanej (FLS), próbki częściowo znakowanej o niskim pH (LpH) i próbki częściowo znakowanej o wysokim pH (HpH).
  3. Odważyć 10 mg lizozymu i rozpuścić w 2 ml buforu fosforanu sodu w celu uzyskania roztworu wodnego o stężeniu 5 mg/ml. Przykryć probówki folią aluminiową, aby chronić formaldehyd przed degradacją spowodowaną ekspozycją na światło. Do każdej probówki dodać 500 μl roztworu lizozymu.
  4. Przygotować świeże 1,0 M roztwory kompleksu dimetyloamino-boranu (DMAB) i 13C-formaldehydu. Przechowywać w temperaturze 0 °C.
  5. W przypadku próbki w pełni znakowanej należy zastosować stosunek molowy 1:10 (amina reaktywna: formaldehyd), a w przypadku próbek częściowo znakowanych należy użyć stosunku 1:5. Alternatywnie współczynnik ten można zoptymalizować. Na przykład, aby zobaczyć dominację piku C-dimetyloaminy α-13przy niskim pH, wymagany był stosunek 2:7.
  6. Dodaj 6,1 μl 1,0 M DMAB do FLS, dodaj 3,2 μl 1,0 M DMAB do LpH i HpH i delikatnie odwiruj. Następnie dodać 12,3 μl 1,0 M 13C-formaldehydu do FLS i 6,1 μl 1,0 M 13C-formaldehydu do LpH i HpH. Wstrząsać mieszaninami reakcyjnymi w temperaturze 4 °C przez 2 godziny.
  7. Dodać kolejną podwielokrotność 1,0 M DMAB i 13C-formaldehydu, jak w poprzednim kroku, i wstrząsnąć mieszaniną reakcyjną przez noc w temperaturze 4 °C, uzyskując całkowity czas reakcji wynoszący 18-24 godziny.
  8. Wymienić bufor próbki na fosforan o pH 7,5 w celu usunięcia nadmiaru odczynników i produktów ubocznych za pomocą filtra odśrodkowego (odcięcie masy cząsteczkowej 3 kDa).
  9. W przypadku częściowo znakowanych próbek, redukcyjnie metylować próbki o pH 7,5 z formaldehydem o naturalnej obfitości, aby uzyskać jednorodnie zmodyfikowane białko. Przygotować nowe 1,0 M roztwory DMAB i formaldehydu o naturalnej obfitości.
  10. Przykryj probówki z próbkami folią, dodaj 6,1 μl DMAB do LpH i HpH i delikatnie odwiruj. Następnie dodaj 12,3 μl formaldehydu o naturalnej obfitości. Wytrząsać mieszaniny reakcyjne w temperaturze 4 °C przez 2 godziny.
  11. Dodać kolejną porcję 1,0 M DMAB i formaldehydu o naturalnej obfitości, jak w poprzednim kroku, i wstrząsnąć mieszaninami reakcyjnymi przez noc w temperaturze 4 °C, uzyskując całkowity czas reakcji wynoszący 18–24 godziny. Następnie należy przeprowadzić wymianę buforową w krokach 2.5–2.6 i przechowywać 50 μg próbek w temperaturze -20 °C dla MS.

2. Przygotowanie próbki do analizy NMR

  1. Przygotować 2,0 M roztwór buforowy boranu sodu o pH 8,5 wH2O.
  2. Dodać 375 μl 2,0 M roztworu buforowego boranu sodu do czterech stożkowych probówek o pojemności 15 ml. Parafilm wierzchołków i. Umieścić kolbę w kolbie liofilizacyjnej i zamrozić próbkę.
  3. Umieść zamrożoną próbkę na liofilizatorze do wyschnięcia. Usuń po wyschnięciu.
  4. Za pomocą pipety dodać 15 mlD2Odo każdej probówki i wymieszać.
  5. Oznaczyć trzy filtry odśrodkowe o pojemności 4 ml (odcięcie masy cząsteczkowej 3 kDa) za pomocą FLS, LpH i HpH. Dodać odpowiednią próbkę do probówek filtracyjnych (~500 μl). Do każdej probówki dodać 3,0 ml 50 mM buforu boranu sodu o pH 8,5. Sporządzić probówkę równoważącą dla trzeciej probówki i zagęścić próbki do 500 μl za pomocą wirówki z wirnikiem o stałym kącie nachylenia 35° w temperaturze 4 °C i 7 500 rcf.
  6. Opróżnij syfon pod każdym filtrem. Dodać kolejne 3,0 ml buforu do próbek i ponownie zagęścić próbki do 500 μl. Powtórz krok 2.5 4x.
  7. Korzystając z testu białkowego kwasu bicinchoninowego (BCA)36, oznacz stężenie każdej próbki. Rozcieńczyć próbki lizozymu 50 mM buforem boranu sodu, aby otrzymać próbki o wielkości 150 μM.
  8. Przenieś 530 μl do probówki NMR 5 mm lub 250 μM do probówki o dopasowanej podatności magnetycznej 5 mm.
  9. Przygotować 80 mM roztwór podstawowy 1,2-dichloroetanu-13 C2 w D2O. Przechowywać ten roztwór podstawowy w temperaturze -80 °C. Rozcieńczyć do 24 mM w 80 μl i przenieść do współosiowej probówki w celu użycia jako odniesienie w analizie NMR. Analizować próbki za pomocą NMR. Uwaga: Uruchom 1D 1 H-13C HSQC i zintegruj obszary pików dla każdego rezonansu. Obszary pików powinny być takie same dla w pełni oznakowanej próbki.

3. Degradacja lizozymu przez aminopeptydazę

  1. Przygotować 5 mg/ml roztworu lizozymu w ultraczystej wodzie.
  2. Dodać 250 μl roztworu lizozymu do czystej, 1 ml probówki wirówkowej.
  3. Dodać 25 μl 0,1 M roztworu trycyny o pH 8,0 i 6 μl roztworu aminopeptydazy Aeromonas proteolytica.
  4. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 6 godzin.
  5. Dodać dodatkowe 6 μl roztworu aminopeptydazy o stężeniu 2,16 μg/ml do próbki, aby uzyskać stosunek 1:50 molowy aminopeptydazy do lizozymu. Inkubować przez 20 godzin w temperaturze 37 °C.
  6. Odsolić 30 μl próbki za pomocą kolumny wirowej C18 (zgodnie z protokołem producenta). Przechowywać w temperaturze -20 °C do analizy MALDI MS.
  7. Przygotować pozostałą próbkę białka do NMR zgodnie z opisem w protokole 2).

4. Przygotowanie próbek do spektrometrii mas

  1. Korzystając z 50 μg próbki zarezerwowanej w kroku 2.3, wymienić bufor na 100 mM wodorowęglanu amonu o pH 8,0 i zagęścić do około 50 μl za pomocą filtra odśrodkowego o pojemności 1 ml (granica masy cząsteczkowej 3 kDa). Przenieść próbkę do probówki wirówkowej o pojemności 1 ml i zawinąć w folię aluminiową.
  2. Dodać 2,0 μl 500 mM ditiotreitolu w celu zmniejszenia wiązań dwusiarczkowych. Inkubować roztwór w temperaturze 60 °C przez 1 godzinę.
  3. Dodać 2 μl świeżo przygotowanego 500 mM jodoacetamidu, aby alkilować grupy tiolowe. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
  4. Usunąć folię i dodać 1,0 μl 500 mM roztworu ditiotreitolu w celu wygaszenia reakcji.
  5. Dodaj 2,0 μg trypsyny do sekwencjonowania, aby strawić białko. Inkubować mieszaninę w temperaturze 37 °C przez 16-24 godzin.
  6. Dodawaj TFA, aż pH spadnie poniżej 2, aby ugasić trawienie. (Można również stosować kwas mrówkowy i octowy)
  7. Odsolić próbkę na kolumnie wirowej C18 i wymyć białko w 80% acetonitrylu/0,1% TFA. Wysuszyć próbkę za pomocą koncentratora próżniowego.
  8. Rozpuść próbkę w 5,0 μl 50% acetonitrylu/0,1% TFA do analizy MALDI MS. Zmieszać równe objętości odtworzonej próbki i nasycony roztwór roztworu matrycowego kwasu 2,5-dihydroksybenzoesowego na płytce tarczowej MALDI. Przeanalizować próbki na MALDI MS. Uwaga: Użyj tandemowego MS, aby potwierdzić tożsamość pików peptydów. Wygładź widma masowe i przeanalizuj. Dla każdego peptydu zawierającego dimetyloaminę należy określić intensywność piku i powierzchnię piku każdego izotopu w profilu. Oblicz procent 13C-inkorporacji, jak opisano poprzednio34.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Metylacja redukcyjna i pH

pH-indukowana chemoselektywna redukcja 13Reakcję C-metylacji wykazano w przypadku lizozymu. Przy niskim pH reakcja preferuje N–terminalna grupa $\alpha$-aminowa nad grupami $\varepsilon$-aminowymi w łańcuchach bocznych i odwrotnie przy wysokim pH. W roztworze grupy aminowe białka znajdują się w stanie równowagi między wolną aminą a sprzężonym kwasem, co można regulować za pomocą pH. Optymalny zakres pH dla tej reakcji zależy od zastosowanego środka re...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przypisanie sygnałów NMR redukcyjnie 13C-metylowanych białek jest konieczne, aby w pełni wykorzystać tę metodę znakowania izotopowego. Wykorzystanie MS do pomocy w przypisywaniu sygnałów NMR poprzez korelację częściowych danych 13C-inkorporacji jest obiecującą techniką. Przewagą tej techniki nad innymi metodami przypisywania jest to, że potrzebna jest tylko pierwszorzędowa sekwencja aminokwasów. Metoda przypisywania wspomagana przez MS jest ograniczona, gdy N-końcowy aminokwas jest lizyną, ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie mamy nic do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie zostało wsparte przez Nagrodę Numer R00RR024105 od National Center For Research Resources, National Institute of Health.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AcetonitrylSigma34851
Filtr odśrodkowy Amicon Ultra 4 ml (3k MWCO)Fisher ScientificUFC800308 (8pk)
AminopeptydazaCreative BiomartAminopeptydaza-86A
Wodorowęglan amonuSigmaA6141
Siarczan amonuSigmaA5132
Kompleks boran-dimetyloaminaSigma 180238Przed użyciem przygotuj świeży 1 M roztwór.
Kwas borowySigmaB6768
Insulina trzustka bydlęcaSigmaI5500
C18 Kolumny obrotoweThermo Scientific89870
Tlenek deuteruCambridge Isotope LaboratoriesDLM-4-100
1,2-dichloroetano-13C2Sigma71432180 mM roztwór podstawowy przechowywany w temperaturze -80 stopni Celsjusza. Używany jako odniesienie w widmach NMR przy 24 mM.
Formaldehyd (36,5% wag./wt)Sigma33220Przygotuj świeży 1 M roztwór przed użyciem.
13C-formaldehyd (99%)Cambridge Isotope LaboratoriesCLM-806-1Przed użyciem przygotuj świeży 1 M roztwór.
Lizozym (białko jaja kurzego)SigmaL6376
Fosforan sodu (dwuzasadowy siedmiowodny)SigmaS9390
Fosforan sodu (monozasadowy)SigmaS9638
TricineSigmaT0377
Kwas trifluorooctowySigma302031
700 MHz Varian VNMRS z sondą 5 mm HCN 5922Agilent Technologie
Bruker UltrafleXtreme MALDI TOF/TOFBruker

Bibliografia

  1. Bax, A., Grzesiek, S. Methodological Advances in Protein NMR. Accounts of Chemical Research. 26 (4), 131-138 (1993).
  2. Shimba, N., Yamada, N., Yokoyama, K., Suzuki, E. Enzymatic Labeling of Arbitrary Proteins. Analytical Biochemistry. 301 (1), 123-127 (2002).
  3. Palomares, L., Estrada-Moncada, S., Ramírez, O. Production of Recombinant Proteins. Recombinant Gene Expression. Balbás, P., Lorence, A. 267, Humana Press. New York City, New York, USA. 15-51 (2004).
  4. Graslund, S., et al. Protein Production and Purification. Nature Methods. 5 (2), 135-146 (2008).
  5. Terwilliger, T. C., Stuart, D., Yokoyama, S. Lessons from Structural Genomics. Annual Review of Biophysics. 38, 371-383 (2009).
  6. Goto, N. K., Kay, L. E. New Developments in Isotope Labeling Strategies for Protein Solution NMR Spectroscopy. Curr. Opin. Struct. Biol. 10 (5), 585-592 (2000).
  7. Lian, L., Middleton, D. Labelling Approaches for Protein Structural Studies by Solution-State and Solid-State NMR. Progress in Nuclear Magn. Reson. Spectroscopy. 39 (3), 171-190 (2001).
  8. Mason, A., Siarheyeva, A., Haase, W., Lorch, M., van Veen, H., Glaubitz, C. Amino Acid Type Selective Isotope Labelling of the Multidrug ABC Transporter LmrA for Solid-State NMR Studies. Febs Lett. 568 (1-3), 117-121 (2004).
  9. Chen, C., et al. Preparation of Amino-Acid-Type Selective Isotope Labeling of Protein Expressed in Pichia pastoris. Proteins:Structure Function and Bioinformatics. 62 (1), 279-287 (2006).
  10. Means, G., Feeney, R. Reductive Alkylation of Amino Groups in Proteins. Biochem. 7 (6), 2192 (1968).
  11. Jentoft, J. E., Jentoft, N., Gerken, T. A., Dearborn , D. G. C-13 NMR-Studies of Ribonuclease-A Methylated With Formaldehyde-C-13. J. Biol. Chem. 254 (11), 4366-4370 (1979).
  12. Rayment, I. Reductive alkylation of lysine residues to alter crystallization properties of proteins. Macromolecular Crystallography, Pt A. 276 (97), 171-179 (1997).
  13. French, D., Edsall, J. T. The Reactions of Formaldehyde with Amino Acids and Proteins. Adv. Protein Chem. 2, 277-335 (1945).
  14. Jentoft, N., Dearborn, D. G. Labeling of Proteins by Reductive Methylation Using Sodium Cyanoborohydride. J. Biol. Chem. 254 (11), 4359-4365 (1979).
  15. Walter, T., et al. Lysine Methylation as a Routine Rescue Strategy for Protein Crystallization. Struct. 14 (11), 1617-1622 (2006).
  16. Rypniewski, W., Holden, H., Rayment, I. Structural Consequences of Reductive Methylation of Lysine Residues in Hen Egg-White Lysozyme - An X-ray Analysis at 1.8-Angstrom Resolution. Biochem. 32 (37), 9851-9858 (1993).
  17. Bokoch, M. P., et al. Ligand-specific regulation of the extracellular surface of a G-protein-coupled receptor. Nat. 463 (7277), (2010).
  18. Jentoft, J., Gerken, T., Jentoft, N., Dearborn, D. C-13] Methylated Ribonuclease-A - C-13 NMR Studies of the Interaction of Lysine 41 with Active Site. 256 (1), 231-236 (1981).
  19. Sherry, A., Teherani, J. Physical Studies of C-13-Methylated Concanavalin A - pH and Co2+-Induced Nuclear Magn. Reson. Shifts. J. Biol. Chem. 258 (14), 8663-8669 (1983).
  20. Dick, L., Sherry, A., Newkirk, M., Gray, D. Reductive Methylation and C-13 NMR Studies of the Lysyl Residues of fd Gene 5 Protein - Lysines 24, 46, and 69 May be Involved in Nucleic Acid Binding. J. Biol. Chem. 263 (35), 18864-18872 Forthcoming.
  21. Moore, G. R., et al. N-epsilon,N-epsilon-dimethyl-lysine cytochrome c as an NMR probe for lysine involvement in protein-protein complex formation. Biochem. J. 332, 439-449 (1998).
  22. Jentoft, J. E., Gerken, T. A., Jentoft, N., Dearborn, D. G. Studies of the Active-Site Lysine of Ribonuclease-A By C-13 NMR. Biophys. J. 25 (2), 56 (1979).
  23. Gerken, T., Jentoft, J., Jentoft, N., Dearborn, D. Intramolecular Interactions of Amino Groups in C-13 Reductively Methylated Hen Egg-White Lysozyme. J. Biol. Chem. 257 (6), 2894-2900 (1982).
  24. Dick, L. R., Geraldes, C., Sherry, A. D., Gray, C. W., Gray, D. M. C-13 NMR of Methylated Lysines of fd Gene-5 Protein - Evidence for A Conformational Change Involving Lysine-24 Upon Binding of A Negatively Charged Lanthanide Chelate. Biochem. 28 (19), 7896-7904 (1989).
  25. Gluck, M., Sweeney, W. V. C-13-NMR of Clostridium-Pasteurianum Ferredoxin After Reductive Methylation of the Amines Using C-13 Formaldehyde. Biochimica Et Biophysica Acta. 1038 (2), 146-151 (1990).
  26. Jentoft, J. E. Reductive Methylation and C-13 Nuclear-Magnetic-Resonance in Structure-Function Studies of Fc Fragment and Its Subfragments. Methods in Enzymology. 203, 261-295 (1991).
  27. Sparks, D., Phillips, M., Lundkatz, S. The Conformation of Apolipoprotein A-I in Discoidal and Spherical Recombinant High Density Lipoprotein Particles - C-13 NMR Studies of Lysine Ionization. J. Biol. Chem. 267 (36), 25830-25838 (1992).
  28. Ashfield, J., et al. Chemical Modification of a Variant of Human MIP-1 Alpha, Implications for Dimer Structure. Protein Science. 9 (10), 2047-2053 (2000).
  29. Goux, W., Teherani, J., Sherry, A. Amine Inversion in Proteins - A C-13-NMR Study of Proton Exchange and Nitrogen Inversion Rates in N-Epsilon,N-Epsilon,N-Alpha,N-Alpha-[C-13]Tetramethyllysine, N-Epsilon,N-Epsilon,N-Alpha,N-Alpha[C-13]Tetramethyllysine Methyl-Ester, and Reductively Methylated Concanavalin-A. Biophysical Chemistry. 19 (4), 363-373 (1984).
  30. Sherry, A. D., Keepers, J., James, T. L., Teherani, J. Methyl Motions in C-13 Methylated Concanavalin-as Studied by C-13 Magnetic-Resonance Relaxation Techniques. Biochemistry. 23 (14), 3181-3185 (1984).
  31. Huque, M., Vogel, H. C-13 NMR Studies of the Lysine Side Chains of Calmodulin and Its Proteolytic Fragments. Journal of Protein Chemistry. 12 (6), 695-707 (1993).
  32. Brown, L., Bradbury, J. Proton-Magnetic-Resonance Studies of Lysine Residues of Ribonuclease-A. Eur. J. Biochem. 54 (1), 219-227 (1975).
  33. Zhang, M., Vogel, H. Determination of the Side Chain pKa Values of the Lysine Residues in Calmodulin. J. Biol. Chem. 268 (30), 22420-22428 (1993).
  34. Macnaughtan, M., Kane, A., Mass Prestegard, J. Spectrometry Assisted Assignment of NMR Resonances in Reductively C-13-Methylated Proteins. J. Am. Chem. Soc. 127 (50), 17626-17627 (2005).
  35. Cordova, E., Gao, J., Whitesides, G. M. Noncovalent Polycationic Coatings for Capillaries in Capillary Electrophoresis of Proteins. Anal. Chem. 69 (7), 1370-1379 (1997).
  36. Smith, P. K., et al. Measurement of Protein Using Bicinchoninic Acid. Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
  37. Larda, S. T., Bokoch, M. P., Evanics, F., Prosser, R. S. Lysine methylation strategies for characterizing protein conformations by NMR. J. Biomolec. NMR. 54 (2), 199-209 (2012).
  38. Bradbury, J. H., Brown, L. R. Determination of Dissociation Constants of Lysine Residues of Lysozyme by Proton-Magnetic-Resonance Spectroscopy. Eur. J. Biochem. 40 (2), 565-576 (1973).
  39. Frey, S. T., Guilmet, S. L., Egan, R. G., Bennett, A., Soltau, S. R., Holz, R. C. Immobilization of the Aminopeptidase from Aeromonas proteolytica on Mg2+/Al3+ Layered Double Hydroxide Particles. Acs Appl. Mater., & Interfaces. 2 (10), 2828-2832 (2010).
  40. Poncz, L., Dearborn, D. G. The Resistance to Tryptic Hydrolysis of Peptide-Bonds Adjacent to N-epsilon,N-Dimethyllysyl Residues. J. Biol. Chem. 258 (3), 1844-1850 (1983).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Przypisanie sygnałów NMRredukcyjna metylacja C13znakowanie białekanaliza spektrometrią masmodyfikacja lizozymuheterojądrowa pojedyncza korelacja kwantowadegradacja aminopeptydaząprocedura wymiany buforuwbudowywanie izotopów węgladetekcja aminy N-końcowej
Metody identyfikacji rezonansów NMR 13C-dimetylo-N-końcowej aminy na redukcyjnie metylowanych białkach
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.