Caenorhabditis elegans to użyteczny model do badania funkcji wielonienasyconych kwasów tłuszczowych w rozwoju i fizjologii. Protokół ten opisuje skuteczną metodę uzupełniania diety C. elegans w wielonienasycone kwasy tłuszczowe.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Suplementacja diety wielonienasyconych kwasów tłuszczowych w Caenorhabditis elegans
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Kwasy tłuszczowe są niezbędne dla wielu funkcji komórkowych. Służą jako wydajne cząsteczki magazynujące energię, tworzą hydrofobowy rdzeń błon i uczestniczą w różnych szlakach sygnałowych. Caenorhabditis elegans syntetyzuje wszystkie enzymy niezbędne do produkcji szeregu kwasów tłuszczowych omega-6 i omega-3. To, w połączeniu z prostą anatomią i szeregiem dostępnych narzędzi genetycznych, sprawia, że jest to atrakcyjny model do badania funkcji kwasów tłuszczowych. W celu zbadania szlaków genetycznych, które pośredniczą w fizjologicznym działaniu dietetycznych kwasów tłuszczowych, opracowaliśmy metodę uzupełniania diety C. elegans w nienasycone kwasy tłuszczowe. Suplementacja jest skutecznym sposobem na zmianę składu kwasów tłuszczowych robaków i może być również stosowana do ratowania defektów w mutantach z niedoborem kwasów tłuszczowych. Nasza metoda wykorzystuje agar z pożywką wzrostową nicieni (NGM) uzupełnioną solami sodowymi kwasów tłuszczowych. Kwasy tłuszczowe w uzupełnionych płytkach zostają włączone do błon bakteryjnego źródła pożywienia, które jest następnie pobierane przez C. elegans, które żywią się uzupełnionymi bakteriami. Opisujemy również protokół chromatografii gazowej w celu monitorowania zmian w składzie kwasów tłuszczowych, które zachodzą w suplementowanych robakach. Jest to skuteczny sposób na uzupełnienie diety zarówno dużych, jak i małych populacji C. elegans, pozwalający na szereg zastosowań tej metody.
Wprowadzenie
Kwasy tłuszczowe są niezbędnymi składnikami strukturalnymi błon, jak również efektywnymi cząsteczkami magazynującymi energię. Dodatkowo kwasy tłuszczowe mogą być oddzielane od błon komórkowych przez lipazy i modyfikowane enzymatycznie w celu wytworzenia efektorów sygnałowych1. Naturalnie występujące wielonienasycone kwasy tłuszczowe (PUFA) zawierają dwa lub więcej podwójnych wiązań cis. Kwasy tłuszczowe omega-3 i kwasy tłuszczowe omega-6 różnią się od siebie na podstawie pozycji wiązań podwójnych w odniesieniu do metylowego końca kwasu tłuszczowego. Zdrowa dieta wymaga zarówno kwasów tłuszczowych omega-6, jak i omega-3. Jednak diety zachodnie są sz....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wielonienasycone kwasy tłuszczowe są wrażliwe na ciepło, światło i tlen. Dlatego podczas przygotowywania płytek do suplementacji kwasów tłuszczowych należy zachować ostrożność, aby kwasy tłuszczowe nie były narażone na nadmierne ciepło i światło. Pożywka NGM zawierająca 0,1% tergitolu (NP-40) jest sterylizowana w autoklawie i częściowo schładzana, po czym dodaje się sole sodowe kwasów tłuszczowych przy ciągłym mieszaniu. Talerze pozostawia się do wyschnięcia w ciemności. Wychwyt kwasów tłuszczowych przez C. elegans hodowany na tych płytkach można następnie monitorować za pomocą chromatografii gazowej.
1. Przygotowanie pożywek z dodat....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Suplementacja diety C. elegans jest ograniczona zdolnością bakteryjnego źródła pożywienia do pobierania i wbudowywania kwasów tłuszczowych w błonę bakteryjną. Aby określić zdolność E. coli OP50 do asymilacji różnych kwasów tłuszczowych do swoich błon, szczep OP50 wysiano na podłoża bez suplementów oraz z kwasem stearynowym (18:0), oleinianem sodu (18:1n-9) i DGLA sodu (20:3n-6) w stężeniach 0,1 mM i 0,3 mM. Płytki suszono w temperaturze pokojowej przez 2 dni w ciemności, a następnie inkubowano w 20 °C p.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W tym artykule opisano metodę suplementacji C. elegans dietetycznymi nienasyconymi kwasami tłuszczowymi. Jak wspomniano powyżej, należy zachować ostrożność przy przygotowywaniu płytek z dodatkiem PUFA, ponieważ reaktywny charakter wiązań podwójnych w PUFA powoduje, że te kwasy tłuszczowe są wrażliwe na utlenianie pod wpływem ciepła i światła11. Aby uniknąć utleniania, ważne jest, aby dodać PUFA do płynnego podłoża agarowego po schłodzeniu podłoża do 55 °C i przechowywaniu płytek w ciemnym otoczeniu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Dziękujemy Chrisowi Websterowi za przeprowadzenie wstępnych eksperymentów pokazanych na rysunku 3 reprezentatywnych wyników oraz Jasonowi Wattsowi i Chrisowi Websterowi za pomocne komentarze do manuskryptu. Finansowanie tego badania zostało zapewnione z grantu z National Institutes of Health (USA) (R01DK074114) dla JLW. Niektóre szczepy nicieni użyte w tej pracy zostały dostarczone przez Centrum Genetyki Caenorhabditis, które jest finansowane przez Biuro Programów Infrastruktury Badawczej NIH (P40 OD010440).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Bacto-Agar | Difco | 214010 | |
| Trypton | Difco | 211705 | |
| NaCl | J.T. Baker | 3624-05 | |
| Tergitol | Sigma | NP40S-500mL | |
| Cholesterol | Sigma | C8667-25G | (5 mg / ml w etanolu) |
| MgSO4 | J.T. Baker | 2504-01 | |
| CaCl2 | J.T. Baker | 1311-01 | |
| K2HPO4 | J.T. Baker | 3254-05 | |
| KH2PO4 | J.T. Baker | 3246-05 | |
| Dihomogamma linolenianu sodu | NuCHEK | S-1143 | |
| Ciepła sterylna woda | Millipore | ||
| Sterylna woda do zbierania robaków | |||
| Woda wolna od nukleaz do roztworu podstawowego DGLA | Ambion | AM9932 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-25 | 100 mg/ml w wodzie (do płytek RNAi) |
| Izopropylo-beta-D-tiogalaktopiranozyd (IPTG) | Gold Biotechnology | 12481C100 | 1 M w wodzie (do płytek RNAi) |
| HSO4 | J.T. Baker | 9681-03 | |
| Metanol | Fisher Scientific | A452-4 | |
| Heksan | Fisher Scientific | H302-4 | |
| diamindinofenylindol (DAPI) | Sigma | D9542 | |
| VectaShield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Szklana kolba | Corning | 4980-2L | |
| Autoklawowalne butelki szklane z mieszadłami | Fisherbrand | FB-800 | |
| Autoklawalny szklany cylinder z podziałką | Fisherbrand | 08-557 | |
| Płytka mieszająca | VWR | 97042-642 | |
| Kąpiel wodna w 55+ ° C | Precyzja Naukowa Inc. | 66551 | |
| Zakrętka Fiolka z brązowego szkła | Sun SRI | 200 494 | |
| Zbiornik | |||
| Automatyczna pomoc do pipet | Pipeta-Aid | P-90297 | |
| Sterylne pipety serologiczne (25 ml) | Corning | 4489 | |
| Palnik Bunsena | VWR | 89038-534 | |
| Mikroskop preparacyjny | Leica | ||
| Rurka ze szkła silanizowanego | Thermo Scientific | STT-13100-S | do detrywatizacji FAME |
| Zakrętki z PTFE | Kimble-Chase | 1493015D | |
| Wirówka kliniczna | Fiolka zaciskana IEC | ||
| GC | SUN SRi | 200 000 | |
| GC Wkładka do fiolki | SUN SRi | 200 232 | |
| GC Nasadka na fiolkę | Chromatograf gazowy SUN SRi | 200 100 | |
| spektrometrii mas | Agilent | 7890A | |
| Kolumna | |||
| do chromatografii gazowej Kolumna do chromatografii gazowej | Suppelco | SP 2380 | 30 m x 0,25 mm kolumna kapilarna z topionej krzemionki |
Bibliografia
- Haeggstrom, J. Z., Funk, C. D. Lipoxygenase and leukotriene pathways: biochemistry, biology, and roles in disease. Chem. Rev. 111, 5866-5898 (2011).
- de Lorgeril, M., Salen, P. New insights into the health effects of dietary satu....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
